专利名称：一种双羰基还原酶、其基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种双羰基还原酶的
基因；同时涉及该基因在催化手性醇合成中的应用。
背景技术：
手性醇是一类重要的中间体化合物，广泛应用于手性药物和其他手性精细 化学品的合成。目前，采用生物催化合成这类化合物是一种有效的方法，即 将含有羰基的底物通过特定的酶催化还原为相应的手性醇。
然而，当底物中含有两个或两个以上手性羰基时，生物催化反应会因为酶 的立体选择性问题而带来较大的困难。以3， 5-双羰基-6苄氧基-己酸乙酯为 例，该化合物的e， Y位上含有两个羰基，存在立体选择性问题。对此，美 国发明专禾!J US5324662报道了一种微生物 J"'we"6fl"e/" cfl/coace"c"s ATCC33305能立体选择性地还原上述底物，反应式如下
Acinetobacter
I II II II calcoaceticus
- u ATCC33305
但该发明专利并没有分离出其中的活性酶和基因。随后，Guo等人在文献 Tetrahedron: Asymmetry, 2006， 17， P.1589-1602中报道了在^c/if"o6fl"er sp.SC13874中存在三种不同的羰基还原酶并对其进行了纯化，其中，还原酶
ni表现出了与整体微生物相似的催化活性和底物选择性。虽然上述文献给出
了三段短肽序列，但对该酶的完整基因及蛋白质序列尚一无所知。此外，对 于该酶是否能直接催化双羰基一步直接还原成单一手性双羟基产物也无直接 证据。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的基因及其蛋白质序列，其可以通过基因表达后大量产生具有高度立体选择性的双羰基还原酶，用以直接还原在e, Y位
上含有双羰基的己酸酯类生成单一非对映异构体的手性双醇。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是 一种双羰基还原酶的基因，
它的核苷酸序列与SEQ ID NO.l具有80。/。以上的同源性。
进一步的技术方案是，双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列如SEQ ID
NO.l所示。
一种双羰基还原酶，由与SEQ ID NO.2具有80%以上的同源性的氨基酸 序列组成。
进一步的技术方案，所述双羰基还原酶，由SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列组成。
上述双羰基还原酶在催化双羰基化合物还原成双羟基产物反应中作为催 化剂的应用。
所述双羰基化合物由以下化学通式表达
其中，W选自芳香基、烷基、环垸基、垸基取代的芳香基、卤素取代的 芳香基、芳烷杂环基、环状杂垸基或环状杂垸化垸基； W选自烷基、环垸基、卤垸基或卤环烷基。 所述的双羟基产物由以下化学通式表达
其中，Ri是芳香基、垸基、环垸基、垸基取代的芳香基、卤素取代的芳 香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基； R"是垸基、环烷基、卤垸基或卤化烷基。
其制备方法是从Jc/wCo6fl"er ca/cofl""c"s ATCC33305的基因组中克 隆双羰基还原酶的基因；应用合适的表达载体将该基因在大肠杆菌中有效地表达重组蛋白质；采用合适的检测方法测定该酶的催化功能和性质。
上述技术方案中，所述的基因是指由四种核苷酸碱基排列组合成一定长度 的序列；所述的蛋白质是指由20种氨基酸排列组合成一定长度的序列；所述 的酶是指具有催化活性的蛋白质。
根据现有的公共知识，任何基因经操作或改造后再接到各种表达载体上， 然后导入宿主细胞中，其启动子在适当的诱导剂或外界条件变化时可诱导产 生过量的蛋白质。用于表达的载体既可来源于商业途径，也可来自通过DNA 重组技术构建。宿主细胞可以是像大肠杆菌、链霉菌等原核细胞，也可以是 像酵母菌、CHO等真核细胞。
任何基因通过DNA重组技术可以改变其序列，从而产生各种不同的突变 体。这些突变体所表达的蛋白质通常具有类似的性质。当基因或蛋白质序列 达到一定的同源性时，它们所表达的蛋白质的性质随同源性增加而更为相似。 本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。当同源性达到80%以上时， 类似基因所表达的蛋白质将会具有催化双羰基化合物还原为双羟基化合物的 性质。
本发明所涉及的基因是通过DNA重组技术从细菌Jc/"W"a"w sp.ATCC33305的染色体中克隆，并经连接在pET22b(+)表达载体后在大肠杆 菌中过量表达。经过量表达的双羰基还原酶在SDS-PAGE上呈现的分子量约 为30KD，其最佳反应pH为6.0，有效作用的pH范围为4.5 7.0，并且在20 5(TC均具备良好的催化活性。
由于上述技术方案的使用，本发明的有益效果是
利用本发明的基因进行表达，获得双羰基还原酶，在辅酶NADH或 NADPH或再生体系存在的情况下，该酶能有效地催化双羰基化合物的还原， 例如使3， 5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯直接生成3R， 5S-二羟基-6-苄氧基-己 酸乙酯，同时该生物催化反应具备高度立体选择性，产物的ee值达99.5%以 上，de值也达99.5%以上。如此高效和高选择性的双羰基还原反应尚无先例。
图1是实施例二中双羰基还原酶过量表达的SDS-PAGE分析；图2是实施例二中双羰基还原酶过量表达与时间的关系； 图3是实施例四中双羰基还原酶的最适pH范围； 图4是实施例五中双羰基还原酶的最适反应温度； 图5是实施例三中产物光学纯度的HPLC分析图谱；
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一双羰基还原酶基因的克隆
1. 菌种及培养条件
菌种Jc/"e勿6fl"ef m. ATCC33305从美国ATCC购得并按说明在培养基 中生长，生长后的菌种于甘油冻存管在-7(tc保存。
甘油冻存管用LB培养基(基本组分每升含10g胰蛋白胨，5g酵母提取 物，10g NaCl)在37'C， 250rpm条件下培养20小时，然后离心收集细菌， 用SDS加溶菌酶的方法破细胞后，用酚-氯仿方法获得基因组DNA。
2. 基因的克隆
根据双羰基还原酶已知N-末端部分的氨基酸序列TGITNVTV(引物NO.l: 5'-ACIGGIATIACIAAYGTIACIGTI-3')和已知中间肽序歹U GELAPAK (引物 NO.2: 5'-GGIGARCTRGCICCIGCIAAR-3')设计随机引物组，其中"A"， "G"， "C"， "T"， "I"分别代表腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、脱氧腺苷； "R"=A+G和"Y，^C+T。利用这对引物和v4cZne^6a"" ATCC33305基因组 DNA扩增获得双羰基还原酶基因基因片段，其PCR扩增条件如下94'C1分 钟；94'c 30秒，45°c 30秒，72°c 30秒(30个循环)，最后72°c 5 min。利用 凝胶回收试剂盒(Axygen Scientific, Inc.,美国)从琼脂糖凝胶上回收分子 量大约为350bp的PCR片段，并且连接到克隆载体pTOPO-TA中。通过DNA 序列分析发现该基因编码的氨基酸序列与已知的双羰基还原酶的肽段序列组 成相吻合，但不是全长的完整基因。
为了得到完整的基因序列，采用质粒文库构建试剂盒构建Xc/"Wo^"er M. ATCC33305的DNA文库，然后用地高辛标记的上述双羰基还原酶-特异 PCR片段为探针在42'C杂交18小时。经洗脱后，用抗地高辛抗体进行检测，然后用碱裂解法从细菌中提取获得基因组DNA。用一系列的限制性内切酶对 上述DNA进行酶切，经Kpnl酶切和电泳后可以分离得到一个全长约5.2kb 并含完整双羰基还原酶基因的DNA片段，并从胶上回收此DNA片段。根据 已经测定序列的PCR片段合成引物，经相同的PCR反应条件得到完整双羰基 还原酶基因的5'和3'序列。经上海英俊生物技术公司测序后，得到全长 849bp的双羰基还原酶基因，其翻译后的蛋白质序列由283个氨基酸组成。
实施例二 双羰基还原酶的表达
为了便于双羰基还原酶基因的表达，在寡聚核苷酸引物的5，和3，末端设 计了兼容的限制性酶切位点。其引物对为引物N0.3 (5，-ATACGTGCCATATGACCGGCATCACGAATGTCACCGTTCT 3，) 和引物N0.4
G-3')，分别带有NdeI和BamHI酶切位点。以5.2 kb Kpnl DNA片断作为模板， 引物N0.3和引物N0.4为引物对，进行PCR扩增。经琼脂糖凝胶电泳后，用凝 胶回试剂盒回收得到连接引物的目的基因。用NdeI和BamHI分别将目的基因 和pET22b(+)质粒同时进行酶切，T4DNA连接酶进行连接反应，经纯化后将 连接产物转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株的感受态中，涂布于含有100ug/ ml氨苄青霉素的LB培养平皿中，37 'C培养过夜。挑取上述培养平皿上的单 菌落接种于25mL含氨苄青霉素(100iig/ml)的LB液体培养基内，37'C过夜培 养，取500ul接种到50mL含氨苄青霉素的新鲜LB液体培养基内，37'C振荡培 养至OD6oonm值约为0.8时，加入IPTG至终浓度分别为1000uM， 500uM， 200uM和50uM，在2(TC下进行诱导表达，并且设立空白载体pET22b(+)对照和 不加IPTG诱导剂的阴性对照。诱导12h后，取出菌液，13， 500rpm/min离心 收集菌体。然后再用高压细胞破碎仪破碎细胞，13， 500离心40miii获得上清 液和沉淀用垂直电泳仪进行SDS — PAGE检测。结果发现50uM IPTG浓度时诱 导表达双羰基还原酶的量最多。为确定是否可溶性表达，将含有重组质粒的大 肠杆菌BL21 (DE3)在IPTG终浓度为50uM， 15'C条件下诱导表达，并且设立空 白载体pET22b(+)对照和不加IPTG诱导剂的阴性对照。诱导时每隔2小时，每组取1.5ml菌液，离心称重，以考察诱导时间对酶表达量的影响。诱导14小时 后收集菌体，离心称重，然后再用高压细胞破碎仪破碎细胞，13, 500离心40min 获得上清液和沉淀用垂直电泳仪进行SDS—PAGE检测以确定该酶是否为可溶 性表达。取20ul上清液用lXSDS上样缓冲液80ul进行处理，收集的菌体和破 碎后的菌体沉淀均用重量X100的1XSDS上样缓冲液处理，上样量均为15ul， 标准分子量的蛋白质购自于美国Sigma公司。SDS — PAGE的胶浓度为15y。，先 60V进行浓縮电泳，再改为150V进行分离电泳。结果表明随着诱导时间的增长， 双羰基还原酶的表达量逐渐增加，大约在诱导12小时后达到最大表达量。并且 在此条件下，大部分双羰基还原酶(分子量30kD)表达在可溶性部分。
参见图l，双羰基还原酶过量表达的SDS-PAGE分析。15% SDS-PAGE分 析IPTG诱导时间对双羰基还原酶(30KD)表达的影响泳道l为不同分子量 的蛋白质标准品。泳道2， 3， 4， 5， 6， 7， 8分别是IPTG诱导后0 h, 2 h， 6 h， 8 h， 10 h， 12 h， 14 h。
参见图2，双羰基还原酶过量表达与时间的关系。15%SDS-PAGE:泳道l 为不同分子量的蛋白质标准品；泳道2和3分别是含空白载体pET22b(+)诱导和 不诱导的全菌蛋白；4和5分别表示含重组质粒不诱导和IPTG诱导；6是含重组 质粒经IPTG诱导后大肠杆菌的上清液；7是含重组质粒经诱导后大肠杆菌的沉 淀。
实施例三双羰基还原酶的活性测定
双羰基还原酶的活性是通过HPLC和紫外吸收的两种方法来进行的测定， 其测定的方法和结果如下 1 HPLC方法
该方法用的反应体系是
双羰基底物 2.5mM NAD+ 0.5 mM
甲酸脱氢酶 2U
甲酸钠 200 mM
双羰基还原酶 0.1-2 mg用0.1M的pH 6.0磷酸盐缓冲液补到最终体积为0.5ml。反应在28T， 200rpm的条件下进行18h后，用同等体积的乙醇终止。混匀，离心5min,上 清液用于HPLC(日本岛津)检测，洗脱溶剂为A.含0.1%TFA的水；B.含 0.1。/。TFA的乙腈。HPLC洗脱的梯度为20 — 90% B,梯度时间为12min。其 酶的活力以得到1" g产物所需要酶的量为1个单位。参见附图5所示，为产 物光学纯度的HPLC分析图谱，3R， 5S-双羟基产物的保留时间为23.6分钟， 而其他光学异构体的保留时间在17—22分钟之间。通过HPLC数据分析其活 力为49.80ng/h/mg蛋白质。
2 紫外分析方法
该方法的反应体系为
双羰基底物 0.25mM NADH 0.15mM 双羰基还原酶 5 iil
0.1M ， pH6.0磷酸缓冲液 2950 ul
该方法是利用恒温紫外仪UV-1700(日本岛津)检测NADH在340nm吸光 度的降低来测定酶的活性。其活力单位定义是在30 °C, pH6.0条件下 A340^/min下降。以每分钟氧化l U mole NADH所需的酶量为1个单位。通 过计算得到该酶的活力为37.45U/ml。
实施例四双羰基还原酶的最佳pH
参见附图3，利用恒温紫外仪UV-1700(日本岛津)检测在室温条件下， 不同pH缓冲液中NADH在340nm吸光度的降低来测定不同pH条件下双羰 基还原酶的活性，从而确定双羰基还原酶最适反应pH。其反应体系为
双羰基底物 0.25mM
NADH 0.15mM
双羰基还原酶 5ul
0.1M ，不同pH缓冲液 2950 ul
双羰基还原酶在不同pH缓冲液中具有不同的活性，在pH6.0的磷酸缓冲 液中该酶的活力最高，因此双羰基还原酶最佳反应pH为6.0。实施例五双羰基还原酶的最佳温度
参见附图4,利用恒温紫外仪UV-1700(日本岛津)检测在pH6.0磷酸缓冲 液中，不同温度的条件下，反应体系中NADH在340nm吸光度的降低来测定 不同反应温度条件下双羰基还原酶的活性，从而确定双羰基还原酶最佳反应温 度。其反应体系为
双羰基底物 0.25ml^I
NADH 0.15mM
双羰基还原酶 5 ul
0.1M ， pH6.0磷酸缓冲液 2950 ul
双羰基还原酶的最适反应温度大约在40'C左右。
实施例七还原反应及反应产物鉴定
由于要对产物进行光学纯度检测，故该反应体系适当地增加了底物的浓 度，其反应体系如下'
双羰基底物 2mg/ml
NAD+ 0.5 mM
甲酸脱氢酶 4U/ml
双羰基还原酶 33.3ul
用0.1M的pH 6.0磷酸盐缓冲液补到最终体积为l.Oml。反应在28。C， 200rpm的条件下进行18h后，用同等体积的正己烷提取。有机相吹干后用乙 醇溶解，进行C18—HPLC分析。通过对双羟基产物的峰面积的计算得出底物 的转化率为100%。然后再用OD-RH手性分析柱(Daicel chemical industries, 美国)进行手性分析，洗脱溶剂为A.含0.1。/。TFA的水；B.含0.1%TFA的 乙腈，洗脱的梯度为B 20—25。/。，梯度时间为25分钟并在25% B保持5分钟。 经对产物峰面积的积分计算得3R, 5S-双羟基目标产物的de和ee值均为 100% 。<110>陈依军
<120>—种双羰基还原酶、其基因及其应用
<160> 2 <210> 1 <211> 852 <212> DNA
<213>双羰基还原酶(diketoreductase) <400> 1
atgaccggcatcacgaatgtcaccgttctcggaaccggcgtgctgggttcgcsg54
atcgcgttccagaccgcgttccacggcttcgccgtcaccgcgtacgacatc站c108
accgacgcgctcgacgccgccaagaagcgcttcgagggcctcgcggccgtgtac162
tcgcgggcgctgcagacggcgccgcgcagasggcgctgggcggc216
atccgctactccgacgacctggcgcaggccgtgaaggacgccgscctcgtcsitc270
gaggccgtgccggagagcctcgacctcaagcgcgacatctacscgaagctgggc324
gagctggcgccggcgaagacgatcttcgccscc站ctcctccsccctgctgccg378
agcg这cctggtcggctacaccggccggggcgacaagttcctcgccctgcacttc432
gcc站cc这cgtgtgggtgsaca^csccgccg这ggtgatgggcacgacgaagscc486
gsccccgsggtgtsccsgcsggtcgtcgagttcgcctccgcgatcgggatggtg540
ccgatcgagctgaagaaggaga^ggcgggctacgtgctcasctccctcctcgtc594
ccgctgctggatgcggcggccgagctgctggtggscggcatcgccgaccccgsg648
acgatcgacaagacgtggcgcatcggcacgggcgcacccsagggtccgtt702
atcttcgacatcgtcggcctcacgacggcccctcggtctccggc756
cccaagcagcgcgsgttcgccgcgtacctcscstcgsc站aggc810
aagctgggcctcgcgaccggcgagggcttctaccggtsctga 852
<210> 2 <211> 283 <212> PRT
<213>双羰基还原酶(diketoreductase) <400> 2
Met Thr Gly lie Thr Asn Val Thr Val Leu Gly Thr Gly Val Leu Gly
15 10 15
Ser Gin lie Ala Phe Gin Thr Ala Phe His Gly Phe Ala Val Thr Ala 20 25 30Tyr
Gly
Ala 65 Gin
lieu
Ala
Leu
Ala 145 Lys
Asp
lieu 50 Ala
lie
35
Ala
Asn Thr
Ala Val
Gin Lys Ala
Ala Val
Asp
Lys
Val 130 Asn
Leu
Thr 115 Gly
His
Thr Asp lie Gly Met
Iisu Asn
Val Asp 210 Gly Thr 225
lieu Thr
Ser 195 Gly
Lys Asp
85 Lys Arg 100
lie Phe
Tyx Thr
Val Trp
Pro Glu 165 Vsl Pro 180
lieu Leu
Asp
Tyr
Leu 70 Ala
Ala
Glu 55 Gly
Leu 40 Lys
Asp.Ala Ala Lys
Glu Val Ala
Gly lie Arg Asp Leu Val
Asp lie Tyr
Ala Thr
Gly
Val 150 Val
Arg 135 Asn
Asn i20 Gly
Thr 105 Ser
lie 90 Lys
Tyr
75
Glu
Gly 60 Ser
Lys Arg
45 Ala Ala
Asp Asp
Ala Val Pro
Leu Gly
Ser Thr Leu
Asp Lys Phe
Asn Thi: Ala
Tyx Gin Gin
lie Glu Leu
Val Pro
lie Ala Asp Gly Ala Pro
Thr
Glu Phe Ala
Gly Leu
Ala 275
Lys 230
Ala Tyr Asn
245 Ala Tyr Leu 260
Thr Gly Glu
Pro 215 Gly
Leu 200 Glu
Lys 185 lieu
Val 170 Lys
Glu 155 Val
Leu 140 Val
Glu Leu 110 Leu Pro 125
Ala lieu Met Gly
Glu Phe Ala
Glu Lys Ala Asp Ala Ala
Thr lie Asp
Pro Phe Glu
Ala 205 Lys Thr 220
Phe Asp
Gly
190
Glu
Phe Glu
Asp Gly
Leu Ala
80 Glu Ser 95
Ala Pro
Ser Asp
His Phe
Thr Thr 160 Ser Ala 175
Tyr Val I<eu lieu
Trp Arg lie
lie Ser Ser
Lys Gly
Glu
Phe 280
Asn 265 Tyr
Val 250 Tyr
Arg
lie 235
Ser Gly Pro lie Asp Lys Tyr
lie
Lys
Gly 270
Val Gly 240 Gin Arg 255
Lys Leu
权利要求
1. 一种双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。
2. 根据权利要求1所述的双羰基还原酶的基因，它^]核苷酸序列如SEQ ID NO.l所示。
3. —种双羰基还原酶，由与SEQIDN0.2具有80%以上的同源性的氨基 酸序列组成。
4. 根据权利要求3所述的双羰基还原酶，由SEQIDN0.2所示的氨基酸序列组成。 、
5. 权利要求3或4所述的双羰基还原酶在催化双羰基化合物还原成双羟 基产物反应中作为催化剂的应用。
6. 权利要求5所述的应用，其特征在于所述双羰基化合物由以下化学通式表达<formula>formula see original document page 2</formula>其中，'w选自芳香基、垸基、环垸基、垸基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂垸化垸基； W选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。
7. 权利要求5所述的应用，其特征在于所述的双羟基产物由以下化学 通式表达<formula>formula see original document page 2</formula>其中，W是芳香基、垸基、环垸基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳 香基、芳垸杂环基、环状杂垸基或环状杂烷化垸基； W是烷基、环烷基、卤烷基或卤化烷基。
全文摘要
本发明公开了一种双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。一种双羰基还原酶，由与SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。上述获得的双羰基还原酶可用于催化双羰基化合物还原成双羟基产物反应，具备高度的立体选择性。
文档编号C12N9/02GK101429514SQ20071013539
公开日2009年5月13日 申请日期2007年11月8日 优先权日2007年11月8日
发明者陈依军 申请人:陈依军