专利名称：可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及一种利用生物工程方法构建可用于生产低双乙酰啤酒的基因工 程菌株的方法。
背景技术：
在啤酒酿造过程中，双乙酰是影响啤酒质量的关键因素，也是决定啤酒成熟 与否的重要指标，因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要
的。a-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质a-乙 酰乳酸迅速分解为乙偶姻，从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量。随着对a-乙 酰乳酸脱羧酶研究的不断深入及其在分子生物学技术上的发展，构建a-乙酰乳 酸脱羧酶酶活较高，能迅速将a-乙酰乳酸转化为乙偶姻，从而降低双乙酰含量、 縮短啤酒熟化期的啤酒酵母基因工程菌已成为必然趋势。酿酒酵母体内不含有 ALDC，因此，外源引入ALDC
发明内容
本发明的目的是提供一种通过基因克隆技术在酿酒酵母工业用菌株中外源 引入ALDC，使其参与酿酒酵母体内的代谢途径，降低双乙酰的含量，构建低 双乙酰的酿酒酵母基因工程菌株。
上述的目的通过以下的技术方案实现
可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括选取 工业用酿酒酵母菌株，进行a—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC 重组质粒的构建、重组质粒脱氧核糖核酸DNApYC6/CT-ALDC的构建、获得 含有a—乙酰乳酸脱羧酶ALDC酿酒酵母、重组质粒pYC6/CT-ALDC转化酿 酒酵母HDY-01该酵母保藏于CCTCC保藏号M 207162。
所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，所述的a— 乙酰乳酸脱羧酶力ZZ^的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建
5根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌^:Z C基因序列(L04470),设计一对特 异性引物，在5'端引物和3'端引物分别加上内切酶及^ I和"狐〃 I的识 别位点，该引物由上海生工有限公司合成，浓度2 0D;
上游5，ACT GAATTC ATGAMCGAGAAAGCAACATT fc。f I
下游3，CAT GGATCC TTATTCAGGGCTTCCTTCAGT A孤# I
以枯草芽孢杆菌为模板直接进行菌落PCR， 94t:变性5分钟，94'C变性30秒， 53'C退火30秒，72'C延伸1分钟，35个循环，PCR产物与T-vector的连接后，转 化到大肠杆菌感受态细胞"i^"中，提取重组子质粒，获得重组质粒pGM-ALDC， 该质粒中含有ALDC基因片段。
所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，所述的重组 质粒DNA pYC6/CT-ALDC的构建将pGM- ALDC和pYC6/CT分别用fco W I和 丑azz7" I双酶切后再进行连接。将连接产物转化到大肠杆菌/W5"，并将阳性 克隆扩增，进行质粒DNA的提取，并进行PCR验证。获得pYC6/CT-ALDC重组质 粒。
所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，含有ALDC酿 酒酵母的获得pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01:
利用醋酸锂转化法，将HDY-01菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线， 将单菌落接种于10毫升YPD液体培养基，30'C每分钟180转摇床培养过夜，测 定菌液的OD值，使其稀释至50毫升时OD6。。达到0.4，继续培养2-4小时，将 酵母菌培养液在无菌条件下室温1500克离心5分钟，弃上清，加入40毫升1 XTE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500克离心5分钟弃上清，加入2毫升IX LiAc/0.5XTE溶液，悬浮沉淀后，室温放置10分钟，在一无菌离心管中分别加 入100iiL经过处理的酵母菌悬液，100 ug变性鲑精DNA， lugpYC-ALDCDNA， 700u 11 XLiAc/40%PEG-4000/1 XTE混合，同时取另一无菌离心管，分别加入
6100PL经过处理的酵母菌悬液，100ng变性鲑精DNA， 700u llXLiAc/40%PEG -4000/1XTE混合，作为对照，30'C反应30分钟，加8uLDMS0原液，混合均 匀，40'C水浴7分钟，在每分钟13000转离心10秒，弃上清，1XTE洗涤沉淀 两次(加lmLTE洗涤,14000rpm离心10s,吸取上清)，加入0-100 u L1XTE， 稀释后涂布于含有Blasticidin的平板上30'C培养2天。 这个技术方案有以下有益效果
通过本发明，成功构建了酿酒酵母的低双乙酰产生菌1—27。 l一27经过连 续15天发酵实验证明，其双乙酰含量和乙醛含量均较出发菌株有所降低。
表达重组子的验证
将转化的菌株涂布在含有50ng/mL的Blasticidin YPD平板上时，将未转 化的菌株也涂布在相同浓度的Blasticidin YPD平板上作为负对照，原始菌株 '由于不含Blasticidin抗性基因而对Blasticidin敏感，不能在含有 Blasticidin的平板上生长，而转化菌株由于含有Blasticidin抗性基因而能 够在含有Blasticidin的平板上生长。则可在长出的菌落中挑取阳性克隆传代 五次，以保证其遗传稳定。
本发明的含有ALDC酿酒酵母重组子1一27的性能
重组子ALDC酶活的测定
根据乙偶姻在碱性条件下可以与肌酸和a -萘酚的混合物反应生成红色的 物质，在一定的范围内生成的红色物质的吸光值和乙偶姻的含量成正比的原理， 测定a -乙酰乳酸脱羧酶的活性。 一个单位酶活(1U)定义为在30'C， pH6. 0的反 应条件下，l分钟使a-乙酰乳酸脱羧形成lumol乙偶姻的酶量。重组子经 1OmL0 -半乳糖诱导培养基诱导在30°C、 160r/min、培养24h后，转接入lOOmL YPD培养基中扩大培养，离心收集菌体，0.85XNaCl洗涤2次后悬浮，超声波破 碎(冰浴，全程5min作用10s间隔30s功率600w)，离心除去菌体碎片取上清， 200 y L酶样与200 n L底物混合在30。C水浴20min，加入4. 6mL显色剂室温放 置50min， 522nm下测定吸光值。
有四个重组子表达了 ALDC酶活，分别为1-27 (0.0081±0. 00018 U/mL)、1-34 (0.0072±0. 00027 U/mL)、 3-4 (0. 0054±0. 00024 U/mL)、 3-12 (0.0049 ±0.00047 U/mL)。
重组子1—27产酶条件的优化
利用单因素(时间12， 24， 36， 48， 60， 72h，；温度25， 28, 30, 33°C; 接种量2%， 4%， 6%， 8%， 10%;培养基麦芽汁，YPD)和正交试验设计，优化重
组子i一27的最佳产酶条件。接种量和温度是影响^:z c产酶的关键因子，其次
为培养时间。培养时间为36h，培养温度为3(TC，接种量为10%为y4Z"C最适产 酶条件。对此最适条件进行验证表明，在36h， 30'C,1096接种量的条件下，酶活 达到0. 0087 U/mL。
出发菌株、l一27的发酵试验
菌株1-27和出发菌株在培养时间为36h，培养温度为30'C，接种量为10% 的条件下经过扩大培养后，以396的接种量转接入700mL麦芽汁培养基中，用封 口膜封口，保证厌氧条件，13-C静止培养，每隔1天取样测各发酵参数，包括 双乙酰，乙醛等。
结果显示，在整个发酵过程中的从起始到最终，转化菌株1一27发酵液中 的双乙酰含量都要比原始菌株低，转化菌株最大值为0.04806ppm，最小值为 0. 01872ppm。原始菌株最大值为0. 05578ppm，最小值为0. 01826ppm。在发酵第 八天转化菌株的双乙酰含量达到0.02494ppm，最终的双乙酰含量达到 0. 01788卯m。
原始菌株与转化菌株1_27在整个发酵过程中发酵液中的乙醛含量无明显 区别，且含量均小于10ppm。
由此可见，转化菌株体内的ALDC发挥了作用，它使转化菌株双乙酰的含量 有了下将，同时，乙醛的含量也没有超出阈值，说明我们构建的低双乙酰酵母 已经成功。
本发明的
具体实施例方式
实施例1:
用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括选取工业用酿酒酵母菌株，进行ot—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重
组质粒的构建、重组质粒脱氧核糖核酸DNApYC6/CT-ALDC的构建、获得含 有a-乙酰乳酸脱羧酶ALDC酿酒酵母、重组质粒pYC6/CT-ALDC转化酿酒 酵母HDY-Ol。
专利用菌种
酿酒酵母1—27 ( 5^cc力aro/z rces cerew'w'ae)CCTCC M 207162保藏 日期2007年10月16日。
30 。C培养在YPD培养基中，其成分为1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄 糖，2%琼脂粉，121'C灭菌30min;
1、 ^"C的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建
根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌JZZ C基因序列(L04470),设计一对特 异性引物，在5'端引物和3'端引物分别加上fco) I和万azz7^1的识别位点。 该引物由上海生工有限公司合成，浓度20D。 上游5，ACT GMTTC ATGAAACGAGAAAGCMCATT ￡cof I 下游3， CAT GGATCC TTATTCAGGGCTTCCTTCAGT 肠# I
以枯草芽孢杆菌为模板直接进行菌落PCR, 94。C变性5min， 94。C变性30s， 53。C退火30s， 72。C延伸lmin， 35个循环。PCR产物与T-vector的连接后，转化 到大肠杆菌感受态细胞ZW5ff中，提取重组子质粒，获得重组质粒pGM-ALDC。该 质粒中含有ALDC基因片段。
2、 重组质粒DNA pYC6/CT-ALDC的构建
将pGM- ALDC和pYC6/CT分别用fco # I和^ # I双酶切后再进行连接。 将连接产物转化到大肠杆菌/W5ff,并将阳性克隆扩增，进行质粒DNA的提取， 并进行PCR验证。获得pYC6/CT-ALDC重组质粒。
3、 含有ALDC酿酒酵母的获得pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01利用醋酸锂转化法。将HDY-Ol菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线， 将单菌落接种于10mLYPD液体培养基，30'C180rpm摇床培养过夜。测定菌液的 OD值，使其稀释至50mL时0D6。。达到0.4，继续培养2-4h。将酵母菌培养液在 无菌条件下室温1500g离心5min弃上清，加入40mLl X TE溶液将沉淀悬浮洗涤, 1500g离心5min弃上清，加入2mll XLiAc/O. 5XTE溶液，悬浮沉淀后，室温 放置10min。在一无菌离心管中分别加入100微升经过处理的酵母菌悬液，100 微克变性鲑精DNA， lug pYC-ALDC DNA， 700 u 11X LiAc/40%PEG-4000/1X TE 混合。同时取另一无菌离心管,分别加入100 u L经过处理的酵母菌悬液，100 !i g 变性鲑精DNA， 700u llXLiAc/40%PEG -4000/1XTE混合，作为对照。30。C反 应30min，加8 u LDMSO原液，混合均匀，40。C水浴7min, 13000rpm离心10s 弃上清，1XTE洗涤沉淀两次(加lmLTE洗涤，14000rpm离心10s，吸取上清)， 加入0-100uLlXTE，稀释后涂布于含有Blasticidin的平板上30。C培养2d。
权利要求
1. 一种可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，其组成包括选取工业用酿酒酵母菌株，其特征是进行α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建、重组质粒脱氧核糖核酸DNA pYC6/CT-ALDC的构建，获得含有α—乙酰乳酸脱羧酶ALDC酿酒酵母，重组质粒pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01，该酵母保藏于CCTCC保藏号M207162。
2. 根据权要求1所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法， 其特征是所述的a—乙酰乳酸脱羧酶JZZ C的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构 建过程包括根据GenBank登录的枯草芽孢杆菌力ZZ C基因序列(L04470)，设计一对特 异性引物，在5'端引物和3，端引物分别加上内切酶^bov I和i9a/z7^I的识 别位点，该引物由上海生工有限公司合成，浓度2 0D;上游5，ACT GAATTC ATGAAACGAGAAAGCAACATT下游3， CAT GGATCC TTATTCAGGGCTTCCTTCAGT 細# I以枯草芽孢杆菌为模板直接进行菌落PCR， 94'C变性5分钟，94'C变性30秒， 53。C退火30秒，72。C延伸l分钟，35个循环，PCR产物与T-vector的连接后，转 化到大肠杆菌感受态细胞/W5"中，提取重组子质粒，获得重组质粒pGM-ALDC， 该质粒中含有ALDC基因片段。
3. 根据权要求1或2所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方 法，其特征是所述的重组质粒DNA pYC6/CT-ALDC的构建方法将pGM-ALDC 和pYC6/CT分别用fCO; I和5azzz^ I双酶切后再进行连接，将连接产物转化到 大肠杆菌/^5ff，并将阳性克隆扩增，进行质粒DM的提取，并进行PCR验证， 获得pYC6/CT-ALDC重组质粒。
4.根据权利要求1或2所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建 方法，其特征是含有ALDC酿酒酵母的获得方法，将pYC6/CT-ALDC转化酿酒 酵母HDY-01:利用醋酸锂转化法，将HDY-01菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线， 将单菌落接种于10毫升YPD液体培养基，3(TC每分钟180转摇床培养过夜，测 定菌液的0D值，使其稀释至50毫升时0D6。。达到0.4，继续培养2-4小时，将 酵母菌培养液在无菌条件下室温1500克离心5分钟，弃上清，加入40毫升1 XTE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500克离心5分钟弃上清，加入2毫升IX LiAc/0.5XTE溶液，悬浮沉淀后，室温放置IO分钟，在一无菌离心管中分别加 入100uL经过处理的酵母菌悬液，100 ug变性鲑精DNA， g pYC-ALDC DNA， 700u 11 XLiAc/40%PEG-4000/1 XTE混合，同时取另一无菌离心管，分别加入 100uL经过处理的酵母菌悬液，100ixg变性鲑精DNA， 700U 11 XLiAc/40%PEG -4000/1 XTE混合，作为对照，3(TC反应30分钟，加8yLDMS0原液，混合均 匀，40。C水浴7分钟，在每分钟13000转离心10秒，弃上清，1XTE洗涤沉淀 两次加lmLTE洗涤，14000rpm离心10s，吸取上清，加入0-100 u LlXTE，稀 释后涂布于含有Blasticidin的平板上30。C培养2天。
5.根据权利要求3所述的可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建 方法，其特征是含有ALDC酿酒酵母的获得pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母 丽-01利用醋酸锂转化法，将HDY-Ol菌株在YPD培养及上进行活化，三区划线， 将单菌落接种于10毫升YPD液体培养基，30。C每分钟180转摇床培养过夜，测 定菌液的OD值，使其稀释至50毫升时OD6。。达到0.4，继续培养2-4小时，将 酵母菌培养液在无菌条件下室温1500克离心5分钟，弃上清，加入40毫升1 XTE溶液将沉淀悬浮洗涤，1500克离心5分钟弃上清，加入2毫升IX LiAc/0.5XTE溶液，悬浮沉淀后，室温放置IO分钟，在一无菌离心管中分别加 入100uL经过处理的酵母菌悬液，100 ug变性鲑精DNA， 1 u g pYC-ALDC DNA，700ix 11XLiAc/4096PEG-4000/lXTE混合，同时取另一无菌离心管，分别加入 lOOuL经过处理的酵母菌悬液，lOOug变性鲑精DNA, 700u 11 XLiAc/40%PEG -4000/1 XTE混合，作为对照，3(TC反应30分钟，加8uLDMS0原液，混合均 匀，40。C水浴7分钟，在每分钟13000转离心10秒，弃上清，1XTE洗涤沉淀 两次，加lmLTE洗涤，14000rpm离心10s，吸取上清，加入0-100 u Ll XTE， 稀释后涂布于含有Blasticidin的平板上30。C培养2天。
全文摘要
可用于生产低双乙酰啤酒的基因工程菌株的构建方法，在啤酒酿造过程中，双乙酰是影响啤酒质量的关键因素，也是决定啤酒成熟与否的重要指标，因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要的。本发明的组成包括选取工业用酿酒酵母菌株，进行α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC的克隆及pGM-ALDC重组质粒的构建、重组质粒脱氧核糖核酸DNA pYC6/CT-ALDC的构建、获得含有α-乙酰乳酸脱羧酶ALDC酿酒酵母、重组质粒pYC6/CT-ALDC转化酿酒酵母HDY-01该酵母保藏于CCTCC保藏号M207162。使基因酵母菌株的乙醇、双乙酰和乙醛含量改变。
文档编号C12N1/19GK101451110SQ20071014473
公开日2009年6月10日 申请日期2007年12月4日 优先权日2007年12月4日
发明者凌宏志, 刚 宋, 平文祥, 葛菁萍, 丹 赵, 原 高 申请人:黑龙江大学