专利名称：一种用微生物发酵技术生产复合胆红素盐的方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，用微生物发酵技术生产复合胆红素盐的方法。
背景技术：
天然牛黄作为传统名贵中药材，是中成药的重要原料。长期以来，药源紧缺，难以满足 临床用药的需要，大量牛黄依赖进口。为此，为解决天然牛黄资源紧缺问题，医药专家一直 在寻找牛黄的替代品，自1972年国家陆续批准了3个牛黄代用品，g卩人工牛黄、培植牛黄和 体外培育牛黄。目前作为天然牛黄原料的替代用品，除了培植牛黄外，其他都是在牛体外生 产的产品，而医药市场也是以在牛体外生产的产品为主。天然牛黄形成的过程是一个生命历 程，天然牛黄的替代用品无论从机理、工艺、成分、结构还是药效等方面，都试图与天然牛 黄接近。研究表明，无论是胆红素钙结石还是胆固醇结石，都与胆汁中胆汁酸盐减少有关， 其胆酸受细菌的影响也是较严重的，牛黄中几乎不存在游离胆酸的吸收峰，而主要是牛磺酸 和甘氨酸结合的胆汁酸，游离胆酸不是牛黄的主要成分，更不是成石的原因。体外胆汁中的 胆红素是极不稳定的，极容易被破坏，牛磺胆酸钠的存在可使胆红素钙盐沉淀颗粒变小，颗
粒的聚集程度减小。还有，胆汁中的所有的有机和无机成分是在一个复杂和共生的环境下存 在并逐步交织在一起，最终形成特有的复杂成分和结构。而现在上市的体外生产的牛黄代用 产品，其原理与天然牛黄形成相背离，其所谓的工艺与天然牛黄的形成过程完全不同，成分 中包括胆红素盐、胆酸、以及去氧胆酸等的复合胆红素盐均是直接加入的，所以实质是化学 方法制备的牛黄代用品。所以复合胆红素盐的科学合理的制备是牛黄代用品最关键的技术和 工艺。
现有的天然牛黄代用品中复合胆红素盐的制作方法中存在以下不足 一、复合胆红素盐
中成分的形成与胆汁发酵不同步，不是一个生物生长过程。二、以胆红素钙为主要成分的复
合胆红素盐的形成过程是一个化学反应过程；胆酸类物质是直接添加游离的化学纯。三、即 使有胆汁的发酵，但其过程与包括以胆红素钙为主要成分的复合胆红素盐和胆酸类物质形成 过程是分离的。四、胆汁中的细菌的生长繁殖不是一个自然的过程，而是运用单一或者几种 筛选出的菌株进行接种发酵。五、现行的牛黄代用品所谓的品质控制是基于其质量标准的型 式检测，所以其满足的是检测指标而已。
发明内容
本发明目的旨在提供一种用微生物发酵技术生产复合胆红素盐的方法，弥补现有天然牛 黄的替代品中制作复合胆红素盐关键技术的诸多缺陷不足，使其不只是满足所谓的品质控制 是基于其质量标准的检测指标等型式检测，而是从机理、工艺、成分、结构、药效等方面更 与天然牛黄接近，使天然牛黄的替代品发挥起应有的作用。
鉴于上述目的得以实现，本发明提供的技术方案如下-
本复合胆红素盐的制作方法，是用新鲜牛胆汁与牛黄的相关成分组成发酵底料配方和发 酵补料配方，发酵底料在发酵罐开放自然环境下染菌发酵，经过补料分批培养发酵，使复合 胆红素盐逐步形成，用蒸气灭菌沉淀、蒸发浓缩、喷雾干燥为成品复合胆红素盐。
上述制作工艺中，发酵底料配方为新鲜牛胆汁500-1000ml、牛磺酸5-10g。其优选配 方为新鲜牛胆汁600ml、牛磺酸5g。新鲜牛胆汁是指新鲜得到或新鲜得到并置于2-4'C冷 藏保存的胆汁。上述制作工艺中，新鲜牛胆汁直接加入牛磺酸组成底料发酵液。
上述制作工艺中，发酵补料配方为新鲜牛胆汁1000-1500ml、牛磺酸5-10g、胆红素 35-50g、胆酸5-15、去氧胆酸3-8g、氢氧化钙10-20g、硫酸锌l-2g、硫酸镁l-2g。其优选 配方为新鲜牛胆汁1200ml、牛磺酸8g、胆红素40g、胆酸10、去氧胆酸5g、氢氧化钙15g、 硫酸锌lg、硫酸镁lg。
上述制作工艺中，新鲜牛胆汁加入其他补料成分，并加入同比例的蒸馏水充分搅拌后组 成补料发酵液。
上述制作工艺中，上述底料发酵液和补料发酵液在不锈钢的配料罐中完成；发酵在不锈 钢的发酵罐中进行。
上述制作工艺中，将底料发酵液在温度30-45'C的开放自然环境下染菌并进行发酵，发 酵周期为48-72小时，发酵过程在30-60转/分进行转动搅拌。其中的细菌包括大肠杆菌、肠 球菌但不限于以上细菌范围。优选温度为4(TC，转速为60转/分。
上述制作工艺中，底料发酵后进行两次间歇地补料发酵；第一次在底料发酵后进行，发 酵36-48小时后进行第二次在补料发酵，温度仍在30-45。C范围内，发酵过程在30-60转/分 进行转动搅拌。优选温度、转速同上。
上述制作工艺中，第二次在补料料发酵48小时后结束发酵，是发酵罐升温到60-65'C继 续搅拌20-30分钟，继续升温到90-10(TC继续搅拌15-30分钟后，冷却，冷却后见大量的棕 红色沉淀物。在升温过程中继续进行转动搅拌。
上述制作工艺中，将升温并冷却后发酵物过滤放入真空旋转蒸发装置中，减压至一0.8 Mpa 一0.9Mpa，在65-75'C恒温条件下蒸发浓縮，至含固量达到30-40%结束。
上述制作工艺中，将浓縮液在0.1 Mpa压力条件下，进口温度130-140"、塔内温度 100-ll(TC、出口温度70-85。C，进行喷雾干燥，最终得到粉状复合胆红素盐产品。
上述制作工艺中，最终产品检测指标为胆红素>35%、游离胆红素《0.7、灰分《10%、水 分《10%.
本发明与现有的复合胆红素盐的制作方法相比具备其优势如下 一、本发明制造的复合 胆红素盐与天然牛黄形成的原理相一致。二、本发明制造的复合胆红素盐中的成分是在生物、 生化过程中形成的，不是化工原料简单的混合和堆积。三、胆汁中的细菌的生长繁殖发酵是 一个自然的过程，与体内细菌感染和繁殖一致。四、检测指标和品质控制不是简单得满足型 式检测，而是发酵前、中的静态配方指标与发酵中的动态过程相交织，最终达到发酵后产品 的品质控制。
具体实施例方式
本发明通过下列具体方案得以实施，所述的实施案例并不局限于案例的具体内容。 案例l:将新鲜牛胆汁6000 ml加入牛磺酸50g在不锈钢配料罐中组成底料发酵液后道入不 锈钢的发酵罐中，在温度4(TC的开放自然环境下染菌并进行发酵60小时，发酵过程在45转/ 分进行转动搅f丰。再用新鲜牛胆汁12000ml加入牛磺酸80g、胆红素400g、胆酸100g、去氧胆 酸50g、氢氧化钙150g、硫酸锌10g、硫酸镁10g，并加入同比例的蒸馏水充分搅拌后组成 25000ml，底料发酵结束加入补料发酵液12500ml发酵48小时后，进行第二次补料12500ml继续 发酵48小时发酵，温度仍在4(TC范围内，发酵过程在60转/分进行转动搅拌。发酵结束后，将 发酵罐升温到65。C继续搅拌30分钟，再继续升温到10(TC继续搅拌30分钟后，冷却，并冷却后 发酵物过滤放入真空旋转蒸发装置中，减压至一0.8Mpa，在65'C恒温条件下蒸发浓縮，至含 固量达到35%结束，将浓缩液在O. 1 Mpa压力条件下，进口温度13(TC、塔内温度10(TC、出口 温度70。C，进行喷雾干燥，最终得到1000g士100g粉状复合胆红素盐产品。最终产品检测指标 为胆红素>36%、游离胆红素《0. 7、灰分《10%、水分《10%。
案例2:将新鲜牛胆汁18000 ml加入牛磺酸200g在不锈钢配料罐中组成底料发酵液后道入
4不锈钢的发酵罐中，在温度42'C的开放自然环境下染菌并进行发酵50小时，发酵过程在45转/ 分进行转动搅拌。再用新鲜牛胆汁36000ml加入牛磺酸250g、胆红素1250g、胆酸300g、去氧 胆酸120g、氢氧化钙400g、硫酸锌30g、硫酸镁30g，并加入同比例的蒸馏水充分搅拌后组成 80000ml，底料发酵结束加入补料发酵液40000ml发酵48小时后，进行第二次补料40000ml继续 发酵48小时发酵，温度仍在40'C范围内，发酵过程在60转/分进行转动搅拌。发酵结束后，将 发酵罐升温到6(TC继续搅拌30分钟，再继续升温到10(TC继续搅拌25分钟后，并冷却后发酵物 过滤放入真空旋转蒸发装置中，减压至一0.8Mpa，在70'C恒温条件下蒸发浓缩，至含固量达 到10%结束，将浓缩液在O. 1 Mpa压力条件下，进口温度135'C、塔内温度105'C、出口温度75 'C，进行喷雾干燥，最终得到3000g土200g粉状复合胆红素盐产品。最终产品检测指标为胆红 素》37%、游离胆红素《0. 7、灰分《10%、水分《8%。
案例3:将新鲜牛胆汁30000 ml加入牛磺酸300g在不锈钢配料罐中组成底料发酵液后道入 不锈钢的发酵罐中，在温度38'C的开放自然环境下染菌并进行发酵60小时，发酵过程在30转/ 分进行转动搅拌。再用新鲜牛胆汁60000ml加入牛磺酸350g、胆红素2000g、胆酸500g、去氧 胆酸200g、氢氧化钙700g、硫酸锌50g、硫酸镁40g，并加入同比例的蒸馏水充分搅拌后组成 130000ml，底料发酵结束加入补料发酵液65000ml发酵48小时后，进行第二次补料65000ml继 续发酵48小时发酵，温度仍在4(TC范围内，发酵过程在45转/分进行转动搅拌。发酵结束后， 将发酵罐升温到6(TC继续搅拌30分钟，再继续升温到10(TC继续搅拌25分钟后，冷却，冷却后 发酵物经过过滤放入真空旋转蒸发装置屮，减压至一0.8Mpa，在65'C恒温条件下蒸发浓縮， 至含固量达到38%结束，将浓縮液在O. 1 Mpa压力条件下，进口温度135。C、塔内温度102'C、 出口温度7(TC，进行喷雾干燥，最终得到5000g士400g粉状复合胆红素盐产品。最终产品检测 指标为胆红素5536%、游离胆红素《0.6、灰分《10%、水分《9%。
权利要求
1. 一种用微生物发酵技术生产复合胆红素盐的方法，其特征在于是用新鲜牛胆汁与牛黄的相关成分组成发酵底料配方和发酵补料配方，发酵底料在发酵罐开放自然环境下染菌发酵，经过补料分批培养发酵，使复合胆红素盐逐步形成，用蒸气灭菌沉淀、过滤、蒸发浓缩、喷雾干燥为成品复合胆红素盐。
2. 根据权利1要求的方法，其特征在于新鲜牛胆汁直接加入牛磺酸组成底料发酵液；发酵底 料配方为新鲜牛胆汁500-1000ml、牛磺酸5-10g。其优选配方为新鲜牛胆汁600 ml、牛 磺酸5g。新鲜牛胆汁是指新鲜得到或新鲜得到并置于2-4'C冷藏保存的胆汁。
3. 根据权利l要求的方法，其特征在于新鲜牛胆汁加入其他补料成分，并加入同比例的蒸馏 水充分搅拌后组成补料发酵液；发酵补料配方为新鲜牛胆汁1000-1500ml、牛磺酸5-10g、 胆红素35-50g、胆酸5-15、去氧胆酸3-8g、氢氧化钙10-20g、硫酸锌1-2g、硫酸镁l-2g。 其优选配方为新鲜牛胆汁1200ml、牛磺酸8g、胆红素40g、胆酸10、去氧胆酸5g、氢氧 化钙15g、硫酸锌lg、硫酸镁丄g。
4. 根据权利1要求的方法，其特征在于上述底料发酵液和补料发酵液在不锈钢的配料罐中完 成，发酵在不锈钢的发酵罐中进行；将底料发酵液在温度30-45。C的开放自然环境下染菌并 进行发酵，发酵周期为48-72小时，发酵过程在30-60转/分进行转动搅拌。其中的细菌包括 大肠杆菌、肠球菌但不限于以上细菌范围。优选温度为4(TC，转速为60转/分。
5. 根据权利1要求的方法，其特征在于底料发酵后进行两次间歇地补料发酵；第一次在底料 发酵后进行，发酵36-48小时后进行第二次在补料发酵，温度仍在30-45i:范围内，发酵过 程在30-60转/分进行转动搅拌。优选温度、转速同上。
6. 根据权利1要求的方法，其特征在于第二次在补料料发酵48小时后结束发酵，是发酵罐 升温到60-65。C继续搅拌20-30分钟，继续升温到90-IO(TC继续搅拌15-30分钟后，冷却， 冷却后见大量的棕红色沉淀物，在升温过程中继续进行转动搅拌。
7. 根据权利l要求的方法，其特征在丁将升温并冷却后发酵物过滤后，放入真空旋转蒸发装 置中，减压至一O. 8Mpa^^ — 0.9Mpa，在65-75'C恒温条件下蒸发浓缩，至含固量达到30-40%。
8. 根据权利1要求的方法，其特征在于将浓缩液在0. 1 Mpa压力条件下，进口温度130-]40 °C、塔内温度100-ll(TC、出口温度70-85'C，进行喷雾干燥，最终得到粉状复合胆红素盐产 品。最终产品检测指标为胆红素》35t游离胆红素《0. 7、灰分《10%、水分《10%。
9. 根据权利1要求的方法，其特征在于将新鲜牛胆汁500-1000ml加入牛磺酸5_10g，在不 锈钢配料罐中组成底料发酵液后道入不锈钢的发酵罐中，在温度30-45'C的开放自然环境下 染菌并进行发酵48-72小时，发酵过程在30-60转/分进行转动搅拌。再用牛胆汁1000-1500nd 加入牛磺酸5-10g、胆红素35-50g、胆酸5-15、去氧胆酸3-8g、氢氧化钙10-20g、硫酸锌 l-2g、硫酸镁l-2g，并加入同比例的蒸馏水充分搅拌后组成1500-2500ml，底料发酵结束加 入补料发酵液800-1500ml发酵36-48小时后，进行第二次补料800-1500ml继续发酵36-48 小时发酵，温度仍在30-45'C范围内，发酵过程在30-60转/分进行转动搅拌。发酵结束后， 将发酵罐7I温到65'C继续搅拌20-30分钟，再继续升温到90-IOO'C继续搅拌15-30分钟后， 冷却过滤后，放入真空旋转蒸发装置中，减压至一0.8 Mpa 一0.9Mpa，在65-75。C恒温条件 下蒸发浓縮，至含固量达到30-40%结束，将浓缩液在0. 1 Mpa压力条件下，进口温度130-140 °C、塔内温度100-ll(TC、出口温度70-85'C，进行喷雾干燥，最终得到粉状复合胆红素盐产 品。最终产品检测指标为胆红素》35%、游离胆红素《0.7、灰分《10%、水分《10%。
全文摘要
提供一种用微生物发酵技术生产复合胆红素盐的方法。本发明弥补现有天然牛黄的替代品中制作复合胆红素盐关键技术的诸多缺陷不足，是用新鲜牛胆汁与牛黄的相关成分组成发酵底料配方和发酵补料配方，发酵底料在发酵罐开放自然环境下染菌发酵，经过补料分批培养发酵，使复合胆红素盐逐步形成，用蒸气灭菌沉淀、蒸发浓缩、喷雾干燥为成品复合胆红素盐。使其不只是满足所谓的品质控制(基于其质量标准的检测指标等型式检测)，而是从机理、工艺、成分、结构、药效等方面更与天然牛黄接近，使天然牛黄的替代品发挥起应有的药用价值和作用。
文档编号C12P17/18GK101469337SQ20071016905
公开日2009年7月1日 申请日期2007年12月28日 优先权日2007年12月28日
发明者杰 胡 申请人:杰 胡