专利名称：：基于根霉菌的l-乳酸铵的连续生产方法
技术领域：
：本发明涉及L—乳酸铵的的生产方法，尤其涉及一种L-乳酸铵的发酵生产方法。
背景技术：
：乳酸是重要的有机酸，广泛存在于生物体内，发酵法可以产生D-乳酸、L-乳酸两种旋光异构体。由于人体和许多生物体只含有L-乳酸脱氢酶，因此只能代谢利用其中的L-乳酸，而D-乳酸则不能被人体降解。世界卫生组织由此提倡使用L-乳酸作为食品添加剂和内服药，取代目前普遍使用的DL-乳酸。此外，L-乳酸，L-乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、农业和化学工业。尤其近几年，人们利用L-乳酸聚合生成的聚L-乳酸生物降解塑料、绿色包装材料及家用和农用薄膜，用以解决日益严重的环境污染问题，引起了世界的广泛关注，应用前景十分广阔。目前L-乳酸已成为市场急需的产品，被称为"化工产品中沉睡的巨人"，因此其应用前景无法估量。目前生产乳酸一般是通过称之为乳酸菌的细菌来进行，如CN1097635C和CN1306091A公开的技术，其中主要有乳酸杆菌属(/^toZ)od//2^)、乳球菌属(/a"ococc船)等在适当培养基和工艺条件下进行发酵的，利用这些菌体发酵时，发酵转化率较高，一般大于90%，但所需要的培养基条件复杂，生产成本较高，容易消旋得到DL-乳酸，同时由于菌体较小，其与发酵液的分离也比较困难。另一种发酵乳酸常用的方法是利用根霉菌属的丝状真菌进行L-乳酸的发酵。通常为有氧发酵，但其对糖转化率较低，一般在70-85%左右，其培养条件简单，添加的微量元素少，选育高糖化水平的菌株可以直接利用淀粉水解液发酵。整个过程发酵液比较清,杂质少，有利于乳酸的分离过程。例如Hang等(YuRC，YangYD.KineticsofdirectfermentationofagriculturalcommoditiestoL(+)-lacticacidbyi/z/zo/w07zae，Biotechnol-lett,1989，ll(8):597-600)对米根霉直接发酵农产品生产L-乳酸进行研究，以碳酸l丐为中和剂，每千克粗淀粉原料(玉米)可生成350g以上的L-乳酸。曹本昌等人(曹本昌，徐建林，匡群.根霉发酵L-乳酸。食品与发酵工业,1991,(1):37-40)选育了一株产L-乳酸的根霉JSMI-R73，在500升发酵罐，当口服葡萄糖浓度为10%时产酸70g/L，13%时产酸101g/L以上，该菌可以玉米粉作为培养基，当玉米粉浓度为12%时产酸70g/L以上，20%时产酸105g/L以上，其中L-乳酸的纯度最高达99n/。；蒋明珠等人(蒋明珠，吴芷萍，许孟琴等.L-乳酸发酵的研究，微生物学报，1991，31,41-47)以根霉R-47为菌种，在摇瓶培养条件下，初始葡萄糖浓度为15%、产L-乳酸达118.4g/L，对糖的转化率达78.9%;虞东胜等人(虞东胜，周晓燕，王健等.米根霉发酵生产L-乳酸，工业微生物，2000,30(3):4-7)以米根霉Rs928为菌种葡萄糖为发酵碳源，在60t发酵罐中，当总糖平均浓度为174g/L时，发酵61h产L-乳酸140g/L，对糖转化率为80.4%。以上工艺均为用碳酸钙中和发酵，在分离时将会产生大量的硫酸钙废渣，很难实现清洁生产。而且其为分批发酵，菌种利用率不高，转化率也上不去，发酵强度也比较低。在L-乳酸的发酵过程中，菌丝体会形成小球状，块状和丝状，不同的菌种通过不同的培养方法可以获得不同的形态，而其中小球体和丝状体研究比较多，如使用米根霉NRRL395(及/^卬wW7加eNRRL395)，在以木糖为前培养基进行培养生成直径l-2mm的小颗粒。以该小颗粒为种子Soccol等(C.R.Soccol，B.Marin，M.Raimbaut;ApplMicrobiolbiotechnol41,86-290(1991))用葡萄糖为原料，碳酸钙为中和剂进行了发酵，发酵以后过滤获得的颗粒可以再次发酵实现了菌体的再利用，但是在连续使用3次后，该菌株的发酵性能大大下降。丝状体的研究集中在使用特殊的介质使霉菌不会聚集成团，降低传质过程阻力，从而实现发酵转化率的提高。如EnochY.Park等(EnochY.Park,YuukoKosakai,MitsuyasuOkabe.EfficientProductionofL-(+)-LacticAcidUsingMycelialCotton-likeFloesofi/z/zo;ms1inanAir-LiftBioreactor.Biotechnol.Prog.1998,14，699-704)采用添加矿物质使之分散形成了丝状体，并通过气升式发酵罐进行了发酵获得了104.6g/L和87。/。的转化率。但是丝状菌体容易老化，不容易实现连续化发酵。另外为了抑制所产生的乳酸对pH值的影响，要添加适当的中和剂来控制pH的降低，通常使用的pH控制剂为碳酸钙、氢氧化钙、氢氧化钠等，目前所知大多数用根霉属发酵的采用碳酸钙作为中和剂，而该中和剂给后续分离过程带来了麻烦，会生成大量的硫酸钙废渣，为此，冈部满康(冈部满康，CN1254016A)筛选了耐氨性L-乳酸生产菌朋/zo;^取MK96-U56发酵生产乳酸，用气泡塔型发酵设备，流加氨水中和L-乳酸，其发酵产酸率可达到81g/L，转化率77.4%，而且可以实现连续化发酵生产。但其发酵产酸率还比较低，而且需要特定的耐氨型L-乳酸生产菌株和特定的发酵设备，实现工业化成本比较高。
发明内容本发明的目的是提供一种基于根霉菌的L一乳酸铵的连续高产速生产方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。本发明的方法，包括如下步骤(1)种子培养将根霉菌属中的任一种的孢子接入种子培养基进行有氧液体培养，培养温度为30-40°C，培养时间为1020hr，pH自然；所说的种子培养基的组分包括碳源、氮源、无机盐和水；所说的碳源选自大米淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、玉米粗粉、甘薯淀粉、甘薯粗粉、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜或秸秆水解物中的一种以上；所说的氮源选自尿素、硫酸铵、玉米浆、酵母提取物、鱼粉、麦芽提取物、硝酸钠或牛肉提取物中的一种以上；所说的无机盐选自磷酸盐和碳酸钙、硫酸镁、硫酸锌、氯化钾、氯化镁或硫酸亚铁中的一种以上，种子培养基中，磷酸盐的浓度为0.81.2g/L;所说的磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；优选的，种子培养基中，碳源的含量为6080g/L，氮源的含量为1.02.0g/L，无机盐的含量为0.20.4g/L;采用上述的高磷浓度种子培养基，培养后的菌体能耐受高浓度的游离乳酸的存在，最低pH可达1.5，同时菌丝体团聚成直径0.1-0.5mm的均匀细颗粒，该颗粒对氨的耐受也得到了很大的增强，使后续发酵过程使用氨作为中和剂成为现实；培养温度根据菌体而定，只要使菌体能正常生长并能发酵生产L-乳酸的任何温度均可，一般为30-40。C，优选32-36。C;种子培养基中接入的孢子个数优选为105-107个1，较优选2*106-4*106个/1^,更优选为3*106个1;所说的根霉菌属的菌种选自黑根霉(AWzop船m'g〃'cara)、爪哇根霉(W/Z;/avam'ctw)、高温根霉(//^teww;y附)、上海根霉(及/^/""g/w/era的、小麦曲根霉(及A.yhyd)、体根霉(i/.cWwenwX)、假华根霉(i/z.;wem/oc/z/wes^)、米丰艮霉(及/.or;;zae)、曰本根霉(/&./0/0"/)、东京根霉(i^/ow&"em的、少根根霉(i/.a^r//z船)或美丽根霉(及/.e/ege";y)等，优选的根霉菌为米根霉(//j.00;Zae);上述的菌种均为本领域公知的菌种，可以采用市售的商业化产品，或购自于中国微生物保藏中心。(2)将步骤(1)获得的产物，接入发酵培养基中进行有氧液体发酵培养，温度为3236°C,培养时间为2040小时，在培养的同时加入氨水或氨气，控制培养体系的pH为58，优选5~6，然后加入流加培养基，并出料，获得发酵产物，然后从发酵产物中收集目标产物乳酸铵；步骤(1)获得的产物接入发酵培养基的量为0.050.10L/L发酵培养基；优选的，将发酵产物过滤，并将过滤后的残留部分返回发酵罐进行发酵，过滤液中乳酸铵的浓度保持在4-6%之间，在上述条件下该发酵产生乳酸铵的速度达到了10g/L.h以上，过滤后的滤液先经过螯合树脂去除(^2+、Mg2+、Zi^+等易在碱性条件下析出的金属离子，然后通过低渗透膜组成的电渗析进行分离乳酸铵，并将含有葡萄糖的电渗析残液重新返回发酵罐中继续进行发酵，电渗析阶段获得重量浓度为2030%(W%)的乳酸铵溶液。整个过程对淀粉的转化率达到了85%以上，分离阶段收率在90%以上，平均产酸达到9.8%,最高达到10.35%，所说的螯合树脂可采用市售产品，如商品牌号有DowexA-l、Chelex-lOO、DiaionCR-IO、KT-1及国产的D401等；所说的低渗透膜组成的电渗析为市售产品，如上海化工厂牌号为3361-BW阳膜和3362-BW阴膜的产品；所说的氨水的重量浓度优选为2028%;本发明优选采用连续发酵进行培养，理由如下本发明中菌体为颗粒状小球体，具有一定的直径，不需要固定就非常容易过滤，因此只需要在发酵罐体出料口添加一个一定孔径的筛网就可以实现料液和菌丝体的分离，方便实现发酵液的自动分流。同时该菌体有良好的重复利用性，可以连续利用300小时以上而产酸不会明显降低，而一般的菌体尤其是丝状体其老化速度比较快。所说的发酵培养基和流加培养基的组分包括碳源、氮源、无机盐和水；所说的碳源选自大米淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、玉米粗粉、甘薯淀粉、甘薯粗粉、麦芽糖、糖蜜或秸秆水解物中的一种以上；所说的氮源选自尿素、硫酸铵、玉米桨、酵母提取物、鱼粉、麦芽提取物、硝酸钠或牛肉提取物中的一种以上；所说的无机盐选自磷酸盐、碳酸钙、硫酸镁、硫酸锌、氯化钾、氯化镁或硫酸亚铁中的一种以上；所说的磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；；优选的，发酵培养基中，碳源的含量为110140g/L，氮源的含量为L02.0g/L，无机盐的含量为0.20.4g/L;优选的，在种子培养基和发酵培养基中还包括含量为0.20.5g/L的消泡剂，消泡剂是大豆油、聚醚多元醇或硅氧烷等；在种子培养和发酵培养过程中，优选通入空气或纯氧中的一种以上，通入气体后，培养液中氧的体积浓度DO为8.412.6%;优选的，种子培养采用气流搅拌培养，如EnochY.Park(EnochY.Park,YuukoKosakai,andMitsuyasuOkabe.EfficientProductionofL-(+)陽LacticAcidUsingMycelialCotton-likeFloesofi/z/zopwso，aeinanAir-LiftBioreactor.Biotechnol.Prog.1998，14，699-704)报道的培养方法，可以控制菌丝体的完整性，利于生成细小颗粒而不会缠绕到搅拌轴上被打碎；优选的，发酵过程釆用通气机械搅拌培养，发酵培养由于都是细小颗粒而不存在缠绕的问题，且可以强化传质过程，有利于发酵的快速进行和产物的有效分离；培养温度根据菌体而定，只要使菌体能正常生长并能发酵生产L-乳酸的任何温度均可，优选30-4(TC，更优选32-36。C;本发明采用高磷浓度种子培养基，通过培养获得了较高耐氨性能的菌体，从而可以采用氨水或氨气进行中和，获得乳酸铵。操作简单，生产成本大幅度降低，所获得的乳酸铵可以通过电渗析过程很容易就从发酵液中分离，回收率高，从而能够克服现有技术采用碳酸钙中和所导致的产生大量的废渣、且回收率低的缺陷。具体实施例方式实施例1采用的菌种为米根霉(i/.0o^ae)3.819，购自中国微生物保藏中心；将米根霉(i^oo^M)3.819的孢子接入种子培养基进行有氧液体培养，培养温度为35°C，培养时间为12小时，种子培养基中接入的孢子个数为3*106个化，通空气，通气速率为15L/min，种子培养基的组分和含量如表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>ZnS04-7H200.04所说的淀粉液化液为采用(x-淀粉酶对淀粉进行液化的液体，淀粉的重量含量为30%，如采用诺维信利可来耐高温淀粉酶Supra(LiquozymeSupra)根据其要求的工艺制备。培养温度为34'C，培养时间为42小时，在培养的同时加入重量浓度为20%的氨水，控制培养体系的pH为5.7，通空气，通气速率为13L/min，然后加入流加培养基，加料速度为lL/h，同时开始出料，出料速度也控制在1L/h。其中所出料液经储罐后当累计到2L时开始过滤，并将过滤后的残留部分返回发酵罐进行发酵。过滤液中乳酸铵的重量浓度保持在5%，在上述条件下该发酵产生乳酸铵的速度最高达到了lOgZL.h以上。经过滤后，先经过CR-10螯合树脂去除C^+、Mg2+、Z^+等易在碱性条件下析出的金属离子。然后通过低渗透膜组成的电渗析进行分离乳酸铵，并将含有葡萄糖的电渗析残液重新返回发酵罐中继续进行发酵，电渗析阶段获得24%(W%)的乳酸铵溶液。整个过程对淀粉的转化率达到了85%以上，分离阶段收率在90%以上。流加培养基的组分和含量如表3所示表3配料用量g/L淀粉液化液葡萄糖糖当量130(NH4)2S040.5KH2P040.05MgS04.7H200.15ZnS047H200.04所说的淀粉液化液为采用a-淀粉酶对淀粉进行液化的液体，淀粉的重量含量为30%，如采用诺维信利可来耐高温淀粉酶Supra(LiquozymeSupra)根据其要求的工艺制备。实施例2采用与实施例l相同的工艺步骤，其中所采用的菌种为东京根霉3.1179(iWz印^to"射"e"^)，购自中国微生物保藏中心；菌种培养和发酵培养时，通纯氧，通气速率为4L/min;发酵培养时，培养温度为34'C，培养时间为40小时，在培养的同时通入氨气，控制培养体系的pH为6.5;电渗析阶段获得23%(W%)的乳酸铵溶液。整个发酵过程对淀粉的转化率达到了80%，分离阶段收率在90%。种子培养基的组分和含量如表4:表4配料用量g/L葡萄糖60尿素2.00KH2P040.85MgS04.7H200.25ZnS04-7H200.03淀粉液化液30发酵培养基的组分和含量如表5所示表5配料用量g/L淀粉液化液葡萄糖糖当量120尿素1.00KH2P040.10MgS04.7H200.25ZnS04-7H200.03流加培养基的组分和含量如表6所示表6配料用量g/L淀粉液化液葡萄糖糖当量130尿素1.00KH2P040.10MgS04-7H200.25ZnS04'7H200.03消泡剂大豆油0.30权利要求1.基于根霉菌的L-乳酸铵的连续生产方法，其特征在于，包括如下步骤(1)种子培养将根霉菌属中的任一种的孢子接入种子培养基进行有氧液体培养，所说的种子培养基的组分包括碳源、氮源、无机盐和水，种子培养基中，磷酸盐的浓度为0.8～1.2g/L；(2)将步骤(1)获得的产物，接入发酵培养基中进行有氧液体发酵培养，在培养的同时加入氨水或氨气，控制培养体系的pH为5～8，然后加入流加培养基，并出料，获得发酵产物，然后从发酵产物中收集目标产物乳酸铵。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的碳源选自大米淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、玉米粗粉、甘薯淀粉、甘薯粗粉、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜或秸秆水解物中的一种以上；所说的氮源选自尿素、硫酸铵、玉米浆、酵母提取物、鱼粉、麦芽提取物、硝酸钠或牛肉提取物中的一种以上；所说的无机盐选自磷酸盐和碳酸钙、硫酸镁、硫酸锌、氯化钾、氯化镁或硫酸亚铁中的一种以上；种子培养基中，碳源的含量为6080g/L,氮源的含量为1.02.0g/L，无机盐的含量为0.20.4g/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，从发酵产物中收集目标产物乳酸铵，包括如下步骤将发酵产物过滤，并将过滤后的残留部分返回发酵罐进行发酵，过滤液中乳酸铵的浓度保持在4-6%之间，过滤后的滤液先经过螯合树脂去除C^+、Mg2+、Zn2+等易在碱性条件下析出的金属离子，然后通过低渗透膜组成的电渗析进行分离乳酸铵，并将含有葡萄糖的电渗析残液重新返回发酵罐中继续进行发酵。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的氨水的重量浓度优选为2030%。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的发酵培养基和流加培养基的组分包括碳源、氮源、无机盐和水；所说的碳源选自大米淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、玉米粗粉、甘薯淀粉、甘薯粗粉、麦芽糖、糖蜜或秸秆水解物中的一种以上；所说的氮源选自尿素、硫酸铵、玉米浆、酵母提取物、鱼粉、麦芽提取物、硝酸钠或牛肉提取物中的一种以上；所说的无机盐选自磷酸盐、碳酸钙、硫酸镁、硫酸锌、氯化钾、氯化镁或硫酸亚铁中的一种以上。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所说的磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基中，碳源的含量为碳源的含量为110140g/L，氮源的含量为1.02.0g/L，无机盐的含量为0.20.4g/L。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在种子培养和发酵培养过程中，优选通入空气或纯氧中的一种以上，通入气体后，培养液中氧的体积浓度DO为8.412.6%。10.根据权利要求1~9任一项所述的方法，其特征在于，所说的根霉菌属的菌种选自黑根霉(iWzo/Wlym'gn'cara)、爪哇根霉(//2.yawm'c^)、高温根霉(朋.^mmm^)、上海裉霉(i/z.W朋g/w/m"5)、小麦曲根霉(i/.yhycZ)、体根霉(i/2.c/z/"e"s的、假华根霉(i/t/we"ctoc/7/"ew's)、米根霉(i/z.0A7zae)、日本*艮霉(及/y'apow.c^)、东京根霉rcmA:/"em7'力、少根根霉(i/.arrWzus)或美丽根霉(i/z.e/egera)。全文摘要本发明提供了一种基于根霉菌的L-乳酸铵的连续生产方法，包括如下步骤(1)种子培养将根霉菌属中的任一种的孢子接入种子培养基进行有氧液体培养，所说的种子培养基的组分包括碳源、氮源、无机盐和水，种子培养基中，磷酸盐的浓度为0.8～1.2g/L；(2)将步骤(1)获得的产物，接入发酵培养基中进行有氧液体发酵培养，在发酵过程通入氨水或氨气，维持培养体系的pH为5～8，然后流加培养基，同时出料，获得发酵产物，并通过连续分离技术从发酵产物中收集目标产物乳酸铵。本发明的方法操作简单，生产成本大幅度降低，乳酸铵从发酵液中分离容易，回收率高。文档编号C12P7/56GK101186934SQ200710170658公开日2008年5月28日申请日期2007年11月22日优先权日2007年11月22日发明者健王,邓兴良,黄房生申请人:上海氯碱化工股份有限公司