专利名称：一种博莱霉素的发酵培养基及发酵方法
技术领域：
本发明属于博莱霉素的生产领域，特别涉及一种产生博莱霉素的发酵培 养基及发酵方法。
背景技术：
由于环境的恶化和不健康的生活习惯，世界范围内的肿瘤发病率持续增
高。从1996年以来全球每年新确诊的肿瘤患者均在1030万人以上，到1999 年底全球肿瘤患者总数已逾4000万人。世界卫生组织2001年报道，世界癌 症发病率和死亡率比1990年上升了 22%，今后20年还将上升大约50%。
博莱霉素(Bleomycin)是一族具有独特结构和作用的广谱抗菌抗肿瘤 抗生素，对多种肿瘤疾病有效，并且不引起白细胞减少，不抑制机体免疫功 能，不损伤造血系统。博莱霉素杀伤肿瘤细胞的机制是在体内与铁和氧结合 形成复合物，然后与染色体作用进攻DNA靶点，引发DNA降解反应，从 而通过抑制肿瘤细胞DNA合成，达到抗肿瘤的效果。所以开发博莱霉素具 有重要的现实意义。
博莱霉素是轮枝链霉菌(&wptomj;c" ve^"7/M)经生物发酵(通常包 括斜面培养、种子培养和发酵培养)所得的一类抗生素的总称，由十余种分 子结构相近的活性组分组成，主要组份为A2， B2。美国药典规定用于临床 的博莱霉素，其组分A2为A2和B2总量的55 70。/。，组分B2为25 320/。， A2和B2总量占整个博莱霉素发酵产物>90%。然而在实际科研和生产中， 有的博莱霉素产生菌发酵产生的博莱霉素组分B2过高，A2， B2两组分的 比例达不到美国药典要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是提供一种新的生产博莱霉素的发酵培养
基，该发酵培养基可提高产物组分中A2对B2的比例，使之符合美国药典 的要求。
本发明还要解决的技术问题就是提供一种提高博莱霉素产物组分中A2 对B2的比例的发酵方法。
本发明人在试验时惊奇地发现在博莱霉素产生菌发酵培养过程中添加 特定氨基酸——甲硫氨酸或其盐可明显提高A2/B2比例，而且还能提高A2 和B2的总量。
因此，本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案可以是 一种 发酵生产博莱霉素的发酵培养基，其中该发酵培养基中包含甲硫氨酸或其盐。
根据本发明，所述的发酵生产博莱霉素的发酵培养基中的其它成分和含 量可以同现有的常规的发酵生产博莱霉素的发酵培养基；换言之，本发明发 酵培养基是在现有培养基基础上在其中添加甲硫氨酸或其盐。本发明所述的 甲硫氨酸或其盐，可以是纯甲硫氨酸或甲硫氨酸盐，但并不限于此，也可以 是以甲硫氨酸或其盐为重要成分的物质。
根据本发明，较佳的，所述的甲硫氨酸或其盐的含量是0.1-1克(按 甲硫氨酸计)/升发酵培养基。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案可以是 一种博莱霉 素的发酵方法，其包括在发酵培养基中添加甲硫氨酸或其盐，即采用本发明 上述的发酵培养基。
根据本发明，所述的发酵方法中的其它原料、步骤和条件，如博莱霉素 产生菌斜面培养、种子培养的步骤以及发酵培养的温度、时间等均同现有技 术。
根据本发明，采用所述的发酵培养基的时间，换言之，在现有发酵培养
4基中添加甲硫氨酸或其盐的时间优选在发酵第3天至第6天中的任何一天或 几天，可以更好地提高组分A2/B2和A2加B2的总量。所述的甲硫氨酸或 其盐的添加总量按甲硫氨酸计优选0.1-1克/升发酵培养基。 相比于现有技术，本发明的优点如下
本发明在发酵过程中向发酵培养基中添加甲硫氨酸或其盐，结果提高了 发酵产物中组分A2对组分B2比例，使之直接达到相关药典所规定的博莱 霉素临床使用标准。同时，本发明中，A2和B2的总产量也大于现有技术中 A2和B2的总产量，这对实际生产有着重要意义。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建 议的条件。实施例中除特别说明外，所用的百分比都是重量体积百分比 (g/100ml)。
实施例1
斜面和种子培养用博莱霉素产生菌轮枝链霉菌ATCC15003的传斜面 (斜面培养基为燕麦粉4.0%，琼脂2.2%和葡萄糖0.2%)，温度28。C，培 养10天，用这斜面传种子在3(TC， 48小时培养，摇床转速220rpm，摇瓶 装量100ml/750ml (种子培养基为玉米浆3.0%，糊精1.0%，黄豆粉2.5%， 葡萄糖1.0°/0,酵母粉0.3o/o和KH2P04 0.10/0， pH6.5)。
发酵培养然后再接发酵接种量5v/v%， 30°C，摇床转速220rpm，摇瓶 装量100ml〃50ml， 9天发酵，(发酵培养基为玉米浆0.75%， KH2PO40.1%， 糊精5.5%， MgSO40.06%，黄豆粉3.5%， NaNO30.2%，葡萄糖1%和CuS04 0.01%， pH 6.8)。最后用高效液相色谱(HPLC)方法检测博莱霉素的单位 (参见美国药典25版)。
在发酵培养第3天在发酵培养基中加入甲硫氨酸(每升培养基加1克)，发酵结束后测得博莱霉素A2占博莱霉素A2和B2总量的65%(w/w)，博莱 霉素B2占博莱霉素A2和B2总量的27%(w/w)。而没有加甲硫氨酸的对照 组(其它工艺步骤和条件同实施例1)中，A2占A2和B2总量的49%(w/w)， B2占A2和B2总量的43%(w/w)。添加甲硫氨酸后发酵产生的A2和B2的 总量为105pg/ml发酵产物，大于对照组A2和B2的总量96pg/ml发酵产物。 实施例2
在发酵培养第4天在发酵培养基中加入甲硫氨酸(每升培养基加0.1克)， 余同实施例1。发酵结束后测得博莱霉素A2占博莱霉素A2和B2总量的 63%, B2占A2和B2总量的30%。添加甲硫氨酸后发酵产生的A2和B2的 总量大于原A2和B2的总量。
实施例3
在发酵培养第6天在发酵培养基中加入甲硫氨酸(每升培养基加0.5克)， 余同实施例1。发酵结束后测得博莱霉素A2占博莱霉素A2和B2总量的 65.5%(w/w)， B2占A2和B2总量的26.5%(w/w)。添加甲硫氨酸后发酵产生 的A2和B2的总量大于原A2和B2的总量。
实施例4
在发酵培养第4、 5天在每升发酵培养基中分别加入0.2克甲硫氨酸，余 同实施例1。发酵结束后测得博莱霉素A2占博莱霉素A2和B2总量的 62%(w/w)， B2占A2和B2总量的31.5%(w/w)。添加甲硫氨酸后发酵产生的 A2和B2的总量大于原A2和B2的总量。
实施例5
在发酵培养第2~4天在每升发酵培养基中分别加入0.2克(第2天)、0.1 克(第3天)和0.3克(第4天)甲硫氨酸，余同实施例l。发酵结束后测 得博莱霉素A2占博莱霉素A2和B2总量的67%(w/w)， B2占A2和B2总 量的27%(w/w)。添加甲硫氨酸后发酵产生的A2和B2的总量大于原A2和 B2的总量。
权利要求
1、一种发酵生产博莱霉素的发酵培养基，其特征在于，该发酵培养基中包含甲硫氨酸或其盐。
2、 根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的甲硫氨酸或其盐的含量按甲硫氨酸计是0.1~1克/升发酵培养基。
3、 一种博莱霉素的发酵生产方法，其特征在于，其包括在发酵培养基中添加甲硫氨酸或其盐。
4、 根据权利要求3所述的发酵生产方法，其特征在于，所述的添加时间是发酵第3天至第6天中的任何一天或几天。
5、 根据权利要求3或4所述的发酵生产方法，其特征在于，所述的甲硫氨酸或其盐的添加总量按甲硫氨酸计是0.1~1克/升发酵培养基。
全文摘要
本发明公开了一种博莱霉素的发酵培养基及发酵方法。其中发酵培养基中包含甲硫氨酸或其盐，不仅可提高发酵液中博莱霉素组分A2对B2的比例，使之符合美国药典的要求，还可以提高组分A2和B2的总量。
文档编号C12N1/20GK101463331SQ20071017279
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者垚 刘, 李继安, 陈代杰 申请人:上海医药工业研究院