截短gst蛋白热诱导融合表达质粒及其制备方法

专利名称：截短gst蛋白热诱导融合表达质粒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及采用日本血吸虫菲律宾株26 kDa谷胱甘肽 -S-转移酶(Sj26GST)核心蛋白(188氨基酸组成)作为短肽(8肽 18肽)生物合成载体， 专供抗原表位作图定位及其表位基序鉴定用的大肠杆菌热诱导GST188重组表达质粒 pXXGST-l和pXXGST-2及其制备方法。
技术背景蛋白分子上的线性B细胞表位(B cell epitope, BCE)是其抗原性的基础。详细地绘制 特定抗原的表位图谱及精细鉴定其抗体识别基序，对蛋白质的结构和功能研究，对疾病的 诊断、定点修饰蛋白质分子以降低蛋白质药物的免疫原性、设计无毒副作用的合成肽疫苗， 特别是研制充分有效的多表位合成肽疫苗具有科学和应用的意义。因此，对获得其抗体的 已知蛋白进行线性表位基序鉴定，或制备特异抗体对靶蛋白抗原线性表位扫描作图 (Epitope mapping) —直是蛋白质化学、医学和分子生物学，特别是疫苗学领域内重要研 究内容之一。长期以来，抗原表位作图或定位的技术一直在发展中。早期的表位鉴定主要用化学降 解或酶解蛋白质的方法，或水解抗原-抗体复合物，然后对用不同生化方法收集的短肽片段 进行蛋白印迹或ELESA检测，也可进行HPLC/质谱分析或短肽氨基酸测序，最终确定表 位肽段或抗体结合位点。虽然有成功的实例，但它们操作十分繁琐，影响结果判定的因素 也多，所以近年来很少采用。短肽化学合成技术的形成，特别是上世纪八十年代中期发展的聚苯乙烯针 (polypropylene pin)多肽合成技术(Gensen HM， et al. : Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single acid, Tfeti h""'园，81: 3998-4002， 1984)和聚苯乙烯网袋(polypropylene mesh bag)合 成技术(Houghten RA. : General method for the the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificith of antigen—antibody interaction at the level of individual amino acids, 尸roc 7VaW〃誠 82: 5131-5135， 1985)的建立，，使抗体识别表位的鉴定有了很大的进展。前者的特点是肽合成过程大大简化，后者的特点是该针洗涤完全，可重复使用，且针上的肽可直接转入酶标板中进行ELESA测 定。这一化学合成肽探针扫描技术的最大优点是可合成覆盖全长蛋白序列前后片段互有9肽或10肽重叠的18肽或20肽进行用ELESA方法的表位肽鉴定；在需精细BCE基序的场 合，则可合成覆盖已鉴定的18肽的前后互有7个氨基酸残基(aa)重叠的8肽片段，根 据与特异单抗反应的肽片段数确定最小表位基序，也能以丙氨酸残基逐一取代BCE基序中 的残基，确定该表位的关键残基。虽然用化学合成肽方法仍然是目前BCE扫描鉴定的经典 方法，但由于肽合成费用高，检测需要特殊仪器设备，因而限制了其广泛应用。随着分子生物学技术的进步，八十年代中期也建立了基因亚克隆表位鉴定法(Mehra V， et al. : Efficient mapping of protein antigenic determinants, 尸roc ;Va〃 y4cac/ 5"cj' 〃W， 83: 7013-7017， 1986)，。该方法的要点是将靶基因用DNA酶随机切割成200 1 000碱基大小不等的片段，并将它们亚克隆重组插入Xgtll表达载体，然后用特异的单抗 筛选免疫反应阳性的克隆并进行DNA测序，最后依据那些插入片段共有的核苷酸序列推断 出该单抗识别的BCE基序。因为酶切条件不易控制，不易获得足以比较推断的BCE基序的 不同长度片段亚克隆，操作也繁琐，所以应用该方法鉴定靶蛋白BCE的报道迄今屈指可数。至于表位扫描鉴定原理与化学合成肽法和基因亚克隆法相似的随机化学合成肽库法 (Jung G and Beck-Sickinger AG: Multiple peptide synthesis methods and their applications. *《，C力棚// t W 31: 367-486, 1992; Geysen HM and Mason TJ:Screening chemically synthesized peptide libraries for biologically-relevant molecules. Bioorg Med Chem Lett. 3: 397-404， 1993)和基因工程肽库法/称噬菌体表 位展示文库法(Scott JK and Smith GP: Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 249: 386-390， 1990)，前者肽库含有各种可能序列的短肽，方便用 单抗和多抗筛选，但结合肽需要测序分析；后者则是将编码6肽/8肽的大量合成DNA片段 混合物重组插入噬菌体基因组，使之以融合蛋白形式表达在外壳蛋白的氨基端，再用生物 素或酶标记的抗体筛选特异的噬菌体，挑取阳性斑扩增后进行DNA测序推断出氨基酸序列。 很显然，它们的应用也存在很大的局限性，因为两者建库要求高、工作量大、成本高且表 位筛选鉴定麻烦，另外还需要肽库质谱仪/测序仪，购买商品化的合成肽库或噬菌体表达 肽库费用也昂贵，所以这些因素均非普通实验室或课题组所能面对或承受。另外，也有不少实验室采用通过相关计算机软件，分别从肽段亲水性、分子接触可及 性、肽链骨架可塑性以及电荷分步等角度预测抗原表位(H叩pTP， Woods KR: Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. /Voci\to/」ok/<Sci {778(6): 3824-8, 1981; Kyte J, Doolittle RP: A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol, 157(l):105-32， 1982; Welling GW， et al,: Prediction of sequential antigenic regions in proteins, f朋5"^e", 188(2) : 215-8, 1985; KarplusPA, Schultz GE: Prediction of chain flexibility in proteins. 7Viaft/rw/^"5r/za/加,72(2):212-213， 1985.)，然后根据预测结果化学合成相应肽段作为免疫原，继而用免疫血清检测其是否能 识别靶抗原。虽然预测合成肽能产生可识别天然抗原的抗血清，但已有资料表明该天然抗 原免疫血清未必一定存在可结合预测序列的抗体，换言之，计算机预测的表位序列存在不 确定性，需要进一步验证。以上概述表明扫描鉴定抗原表位已有多种方法可供选择，但由于这样那样的缺陷，或 存在技术和设备条件的限制，而且多数离不开需具备特异单克隆抗体(单抗)或抗天然抗 原多克隆抗体(多抗)的先决条件。因此，以上种种方法显然都不适宜在一般实验室的广 泛应用。2004年为检测抗hCG多表位嵌合肽抗血清中是否存在抗各嵌入BCE抗体，我们曾经构 建了在Stv蛋白羧基端插入的人绒毛膜促性腺激素(hCG)卩亚基三个不同BCE单表位短肽 (short peptide, SP)的pTSA18/Stv_SP重组质粒，结果IPTG诱导表达的单表位融合蛋 白用Western blot检测都能被它们的单抗或多抗特异识别，进而提示可建立以一高表达 蛋白为载体的生物合成肽表位扫描鉴定技术[徐万祥等.人绒毛膜促性腺激素(3亚基单一 B-细胞表位(p5、 p9或P8)融合蛋白的表达和纯化.主激工^^学艰，20 (1): 49-53， 2004]。 随后华荣虹等报道了利用IPTG诱导的pGEX-6P-l质粒表达GST-SP融合蛋白法，扫描鉴定 了严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的BCE[华荣虹等.SARS冠状病毒S蛋白 受体结合结构域的表达及其表位作图.生激众学与主激#^^_^展，32 (11): 1030-1037， 2005]。根据我们多年实践，无论是使用表达Stv或GST融合蛋白的pTSA18和PGEX_4T等重 组质粒，不加IPTG诱导的场合都时常有"泄漏表达"(Leaky expression)现象，这一情 况显然妨碍我们对SDS-PAGE凝胶上Stv-8肽融合蛋白是否表达的判定，那样势必先需要 通过插入片段的DNA测序，才能确定所挑取一组阳性克隆是否是含目的插入基因编码片段 的重组质粒克隆。因此为了节约测序所需的时间和费用(鉴定表位基序后对产生印迹反应 的克隆仍需要测序验证)，也为了进一步检验118个残基组成的Stv核心蛋白(Stvll8)是 否是合适的短肽融合表达的载体，我们构建了可表达融合短肽的热诱导型pSY621/Stv-l 重组质粒(命名为pXXStv-1)和可作为检测对照(仅表达Stv118)的pXXStv-2重组质粒 (已申请国家发明专利，申请号200710043264.5)。此专利申请中提供了用构建的 pSY621/Stv-l质粒表达系列短肽适用性，以及用抗重组靶蛋白多抗鉴定人卵透明带蛋白线 性BCE基序可靠性的实例。相比前述目前应用最多的化学合成肽法，此生物合成(融合表达)肽表位鉴定法优点明显，如用抗重组蛋白多抗也能开展表位扫描作图；鉴定费用花费少，1个残基的DNA 正负链片段合成费用仅约是1个残基合成的1/20;操作相对更简便，分子克隆、表达和蛋 白印迹鉴定等都是目前成熟的技术， 一般实验室都能开展；构建的克隆能保存备用，鉴定 结果明确且可重复检验等。但生物合成肽表位鉴定法尚处于发展初期阶段，仍然有许多需 要改进的地方，如短肽生物合成载体的选择及其截取长度的确定等。 发明内容本发明的目的在于提供一种截短GST蛋白热诱导融合表达质粒及其制备方法，以便实 现短肽的生物合成。建立抗原表位鉴定原理或特征，与化学合成肽法和基因亚克隆法相似，但短肽合成花 费大幅度降低且操作更方便，因而适宜在大多数实验室应用生物合成肽法，本发明选用由 188 aa组成的新型截短GST188蛋白为载体，在大肠杆菌热诱导表达系统表达短肽融合蛋 白的pXXGST-l重组质粒，以及用作表达对照的热诱导型pXXGST-2重组质粒，从而实现短 肽生物合成的目的，专供抗原线性表位扫描作图定位以及表位基序鉴定用。本发明利用本专利申请人构建的pSY621原核表达质粒(图1)和依据GST基因公开信 息，通过基因工程构建热诱导pXXGST-l和pXXGST-2重组质粒，并用于进行短肽融合表达， 并验证先前已鉴定的huZP3上一个线性BCE基序，它们的构建(制备)具体步骤如下(1) 设计PCR引物，从pGEX-4T-质粒中扩增出编码GST蛋白H88基因的大片段，该 大片断在5'-和3'-端分别带BamH I和Sal I的限制酶酶切位点；(2) 利用DNA重组技术，将目的GST基因扩增片段插入用EcoR I和BamH I双酶切 的pSY621质粒，获得的pSY621-GST重组质粒转化大肠杆菌宿主菌，在加Amp的LB平板 上挑取它们的重组克隆，进行DNA测序(上海联合基因集团公司)；(3) 合成两端为Sal I和Pst I粘性末端中间带TAATAG双终止密码子的二条互补DNA 片段，将之退火复性后重组插入基因测序正确并经双酶切的PSY621-GST中Sal I和Pst I 位点之间，连接液转化TG1宿主菌，再次外送DNA测序验证的重组质粒，命名为pXXGST-l， 其核苷酸序列为SEQ. ID. N03;(4)以pXXGST-1质粒为模板，用设计的一对PCR引物扩增在GST编码基因3'-端后添 加TAA终止密码子的GST188基因片段，用EcoR I和BamH I限制酶双酶切的扩增大片段， 被重组插入用同样二个酶双酶切的pSY621质粒，测序正确重组质粒被新命名为pXXGST-2; 其核苷酸序列为SEQ.ID.N04，具体为pXXGST-1质粒的核苷酸的序列SEQ.ID.N03中GGATCCGTCGAC后|TAATAG l双终止密码子去除，但在GGATCCGTCGAC前插入一个 TAA终止密码子；(5)基于先前用pXXStv(118)-1鉴定出huZP3"""'肽段中存在一个基序为ENWNAEK,184 的抗原表位结果(专利申请号200710043264.5)，再将以前合成的huZP3177—19°的相互各重 叠7个残基的系列8肽编码基因片段，将之退火复性后分别重组插入pXXGST-l的BamH I 和Sal I位点，抽取转化菌TG1的pXXGST-1/短肽质粒，再次转化大肠杆菌BL21宿主菌， 热诱导后通过SDS-PAGE检测各GST短肽融合表达，以此确认pXXGST-1/短肽重组子和各 GST-短肽的表达，最后用兔抗huZP3'77—348抗血清和兔抗huZP3172"87合成肽抗血清进行 Western blot试验，确认先前表位鉴定结果和pXXGST-1用于短肽生物合成和抗原表位鉴 定的适用性。本发明提供的表达短肽融合蛋白的pXXGSG-1重组质粒和pXXGST-2重组质粒具有如下 特点1、 作为融合表达载体，在GST188羧基端连接不同8 18个残基短肽，都能恒定高表 达(短肽融合蛋白表达量占细菌总蛋白的10%左右，适合进行免疫印迹试验)；2、 在未进行热诱导的情况下，SDS-PAGE检测基本上看不到细菌总蛋白中目的短肽融 合蛋白的泄漏表达现象；3、 在使用抗重组靶蛋白抗血清的情况下，产生的短肽(8肽或18肽)融合蛋白印迹 带位于大肠杆菌二条分子量分别约为18 kDa和32 kDa的强抗原印迹带之间，因而不会影 响印迹结果判断；4、 同时使用仅表达GST188蛋白的pXXGST-2重组质粒，大规模进行抗原表位作图和 表位基序精细鉴定的场合，可进一步降低抗原表位鉴定费用，即，构建好GST-短肽重组质 粒后，无需都进行DNA测序筛选重组子，可先挑选加氨苄青霉素LB平板上生长克隆进行 热诱导表达，然后通过SDS-PAGE检测它们是否表达了短肽融合蛋白(相对GST188对照 条带，观察8肽或18肽有无约大于1 kDa或2 kDa的特异条带存在)，进而进行蛋白印迹 试验。最终只需将产生印迹的克隆或特异表达条带位置有疑问的克隆送测序。很显然，如 此也节省系统表位扫描鉴定的时间和工作量。本发明的内容进一步具体描述如下本发明提供能在大肠杆菌宿主菌中高表达GST-SP融合蛋白的热诱导表达质粒 pXXGST-l (图2)，供抗原表位扫描鉴定选择使用。pXXGST-l特点如下为了克服IPTG诱导型表达系统常常发生目的蛋白或融合蛋白"泄 漏表达"的情况，以利于挑取克隆经热诱导后细菌总蛋白的SDS-PAGE初步鉴定，即便于 判定在氨苄青霉素(Amp) LB平板上挑取的克隆是非载体质粒自连产物，同时在免疫印迹 试验中避免出现阴性对照也产生阳性结果，本发明选用了己经构建且能高表达外源蛋白的pSY621质粒(图1)[沈芸，应康，徐万祥，谢毅大肠杆菌高效表达载体pSY621的构建. 学叛(^^^^^^)，39(3):313 - 317, 2000]作为新构建重组pXXStv-l的载体质粒。 依据GST基因公开信息[Henkle KJ， et al. : Comparison of the cloned genes of the 26- and 28-kilodalton glutathione S-transferases of Schistosoma japonic咖and Schistosoma mansoni. 5ioc/ e/z/尸arasiZ^, 40(1): 23 — 34， 1990.]，〈乍为失豆月太融 合表达载体重组插入pSY621质粒的GST蛋白长度适宜，即，我们合成的GST核心蛋白基 因(编码188 aa，包括N端增加的1个起始密码子编码的甲硫氨酸残基)连同其C端BamH I酶切位点编码片段编码的甘氨酸和丝氨酸2个残基，热诱导后在SDS-PAGE凝胶上显示约 22kDa分子量的短肽蛋白条带(图7，图8)。如图6所示，在诱导菌总蛋白的SDS-PAGE染 色凝胶上，连接分别相差1个残基的7个系列重组克隆都稳定地高表达了 GST-8肽融合蛋 白(约占细菌总蛋白的10%)，而它们未热诱导的克隆则都未见"泄漏表达"条带。图7 则表明GST-huZP3'77—'"和GST-huZP3'78—185被印迹的条带正好位于两条大肠杆菌蛋白印迹特征 条带(约20kDa和31 kDa，用抗重组huZP3b蛋白抗血清的场合一般都会产生)之间，结 果易判断。显然在此位置，GST连接18肽(约增加l kDa)的印迹结果判断也不会受到其 前后二条大肠杆菌特征带的干扰。用抗huZP3172—187合成肽抗血清则无此问题，背景清晰(图 8)。以上构建的pXXGST-1质粒另一特点是，在载体蛋白GST18编码基因3'-端的Sal I - Pst I克隆位点后插入了 TAATAG终止密码子，以避免生物合成的靶短肽后续过多残基对特定抗 原抗体反应可能产生的干扰(若欲排除Sal I碱基编码的Val和Asp两个残基，可将TAA 或TAG加在所合成靶短肽编码基因片段3'-端后Sal I位点前，略增加6个DNA碱基合成 费用)。在怀疑8肽前BamH I碱基编码的Gly和Ser残基是否对鉴定的Gly-Ser后8肽表 位基序有影响(如图7的情况)，可在8肽编码片段的5'-端增加2或3个丙氨酸编码碱基 加以验证。本发明还提供一个在GST188蛋白编码基因3'-端尾BamH I前接上TAA终止密码子而 形成的热诱导型pXXGST-2质粒(图3)。在扫描鉴定靶抗原表位的场合，它们表达的分子 量约22 kDa的GST188蛋白，可先用于确认所选用单抗、多抗或抗重组蛋白多抗与之有无 交叉反应；也可用作通过SDS-PAGE鉴定pXXGST-1是否表达GST-8肽融合蛋白(分子量相 差1 kDa，在电泳后染色凝胶上可清楚辨别)的对照。通过此方法鉴定阳性重组克隆，随 后直接进行Western blot检验，以节约DNA测序费用和时间。本发明提供的热诱导型pXXGST-1和pXXGST-2质粒，在它们的EcoR I和BaraH I或其 后其他克隆位点重组插入带ATG起始密码子的外源基因，可热诱导直接表达其他目的蛋白。PXXGST-1质粒也可诱导表达与GST118融合的其他目的蛋白。另外，在无特异单抗或多抗 的情况下，以上GST热诱导表达质粒也为靶蛋白表位扫描作图提供了便利和实施可能性， 即可先通过PCR分段扩增2 3个靶蛋白编码基因大片段，分别重组插入GST188质粒进 行融合蛋白表达，电泳割胶回收(干燥研磨或电洗脱后)直接免疫动物。此外，以Stvl08 或Stvll8蛋白为载体(己另外申请发明专利)构建对应的2 3个靶蛋白编码基因大片 段(表达产物用作检测抗GST融合蛋白抗血清抗体滴度时的抗原)，并构建表达相邻互有9 aa重叠的系列Stv-18肽融合蛋白，继而用收集确认的抗GST-靶大片段抗血清，进行覆盖 大片段蛋白序列的表位扫描作图。必要的话，就确定的表位肽构建相邻互有7 aa重叠的 系列Stv-8肽，作进一步最小BCE基序鉴定。(若选用Stv蛋白作为载体，融合表达靶蛋 白大片段后制备抗血清，抗体滴度测定和表位扫描鉴定则需要使用GST蛋白为融合表达载 体。这也就是为什么需要另外构建GST热诱导融合表达的原因。)本发明也提供了借助PXXGST-1质粒验证一 BCE基序的应用实例，g卩，用之表达相邻 片段均重叠7 aa的系列GST-8肽融合蛋白，并用兔抗重组人卵透明带-3(human zona pellucida-3， huZP3)蛋白177_348抗血清和兔抗huZP3172—187合成肽抗血清，确证了先前用 Stvl18-SPs鉴定的huZP3上一个线性BCE基序(EENWNAE178—184 )。


图1为pSY621原核热诱导质粒示意图。 图2为构建的pXXGST-l质粒示意图。注图中BamH I和Sal I为目的短肽编码基因片段的重组插入克隆位点。 图3为构建的pXXGST-2质粒示意图。注与pXXGST-1质粒比较，不同点仅是Sal I位点后无TAATAG终止密码子，并在GST188 编码基因3'-端尾BamH I位点前增加一个TAA终止密码子。图4为huZP3m—19°系列GST188-8肽表达的SDS-PAGE检测图。1，预染蛋白分子量标准；2 15，未诱导和诱导的MEENWNAE177—184、 EE雨NAEK178—1S5、 E丽NAEKR》186、丽NAEKRS18。-187、 WNAEKRSP18'—188、 NAEKRSPT182-189和AEKRSPTF,柳诱导菌总蛋白。注图中箭头分别指示各表达的8肽融合蛋白。在细菌总蛋白上样量基本一致的情况 下，未热诱导对照栏都未见目的短肽融合蛋白明显泄漏表达，热诱导栏都能看到表达量基 本一致的靶短肽融合蛋白高表达。图5为huZP3177—^系列GST-8肽表达的SDS-PAGE检测(A)和用抗重组huZP3177—348抗 血清的免疫印迹(B)图。1，未诱导的GST-MEE丽NAE177—184工程菌总蛋白；2，预染蛋白分子量标准；3 9，诱导的GST-MEENWNAE177-184、 -EENWNAEK178-185、 -ENWNAEKR179-186、-隨NAEKRS18。—187、 -WNAEKRSP"、 NAEKRSPT182—189和AEKRSPTF183—'9°工程菌总蛋白；10，诱导的GST188工程菌总蛋白。注图5A中箭头分别指示各表达的8肽融合蛋白。图5B中在各目的8肽融合蛋白上 方均存在大肠杆菌抗原特征印迹条带，在特征印迹条带的下方，唯见3和4栏中箭头指示 的MEENWNAE177—184和EENWNAEK'78—185融合蛋白与兔抗重组huZP3肽"，抗血清产生清晰的印迹 条带，依据两者共有残基顺序，可判定EENWNAE178—w基序为huZP3蛋白的一个线性BCE。图6为huZP3'77—19°系列GST-8肽表达的SDS-PAGE检测(A)和用抗huZP3172—187合成肽 抗血清的免疫印迹(B)图。注各栏上样蛋白样品同图5标注。表位鉴定结果与图5的一致，但背景清晰，无 大肠杆菌抗原特征印迹条带。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而 非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D. W.拉塞尔编著黄培堂等译的第三版《分子克隆实验室手册》(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和.莱恩编著沈关心等译的《抗体技术实验指南》(科 学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商所建议的条件进行。 材料和方法1. 热诱导表达质粒pSY621(图1)和大肠杆菌BL21 (DE3)菌株由复旦大学遗传工程国 家重点实验室构建和保藏。2. 含GST (Sj26)编码基因的pGEX-4T-2质粒购自Amersham Pharmacia Biotech公司。3. 限制性内切酶EcoR I、 BamH I、 Sal I和Pst I以及T4DNA连接酶购自日本TaKaRa Biotecchnology公司，Taq I DNA聚合酶为复旦大学遗传工程国家重点实验室产品，氨苄 青霉素(Amp)预染蛋白质低分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗(IgG /HRP)、 二氨基联苯胺(DAB)和硝酸纤维素膜购自华美生物工程公司产品。4. QIApr印spin minipr印Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒和 quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。5. 兔抗huZP3a和huZP3b抗血清由上海市计划生育科学研究所制备(徐万样，何亚 萍，洪爱真，季朝能，钱吉，王曙，谢毅.人卵透明带蛋白huZP3a22—176和huZP3"，肽段 在大肠杆菌中的表达及其纯化.4—遭^"_^^, 24:143-148, 2004;宋力雯,汪玉宝，倪崖,何 亚萍，洪爱真，Hinsch E， Hinsch KD,周思畅，袁玉英，石其贤，徐万祥.人卵透明带蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其其抗血清体外研制人精子-半透明带结合.主;^^j乾57: 682 - 688， 2005)和保藏。用与KLH载体蛋白偶联的ZPC172—187合成肽免疫新西兰白兔，制 备了兔抗ZPC172—187合成肽抗血清。PXXGST-1和pXXGST-2重组质粒制备的具体步骤如下1. GST118基因片段扩增GST188核心蛋白编码核苷酸顺序序列见SEQ ID NO: 1。对应的GST核心蛋白的氨基 酸顺序序列见SEQ ID NO. 2。先在计算机辅助下设计扩增GST'—188编码基因的二条正负链PCR引物，然后以pGEX-4T-2 质粒为模板，用二条合成引物PCR扩增(在94。C预变性3 min， 94"变性35 sec, 55°。退 火35 see,完成35个循环后72。C延伸60 sec)两端带EcoR I和BamH I的GST188 (564 bp) cDNA片段，经15%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，用EcoR I和BamH I限制酶酶切上述 PCR扩增片段，走15%琼脂糖凝胶电泳后割胶过柱回收备用；2. pSY621_GST188 (pXXGST-1)重组质粒构建 重组质粒pXXGST-1的核苷酸顺序序列见SEQ ID NO. 3。第一步，用EcoR I和BamH I先后酶切pSY621，将双酶切回收的GST188片段重组插 入pSY621质粒，连接液转化感受态TGI宿主菌，挑抗Amp阳性克隆送DNA测序，继而在3 ml的LB培养液中扩增培养测序正确的克隆，收集菌体抽提它的重组子质粒，用Sal I和 Pst I双酶切备用；第二步，将在Sal I和Pst I粘性末端中间添加TAATAG双终止密码子的正负链合成 短片段退火复性，重组插入上述双酶切质粒，转化感受态TGl宿主菌后挑抗Amp阳性克隆 送DNA测序，继而在3 ml的LB培养液中扩增培养测序正确的克隆，收集菌体抽提命名为 pXXGST-1的质粒，作为本发明制品放置于-20'C冰箱备用；3. pSY621-GST188 (pXXGST-2)重组质粒构建再次合成在GST188编码基因3'-端引入TAA终止密码子的一条负链PCR引物，借用前 述的目的基因扩增5'-端引物，PCR (条件同前)扩增以pXXGST-l为模板的两端为EcoR I 和BamH I的GST188编码基因片段，通过T4 DNA连接酶重组插入用EcoR I和BamH I双 酶切的pSY621，连接液转化感受态TGI宿主菌，在LB平板上挑取Amp抗性克隆送DNA测 序，分别转接测序正确的克隆于含A即的3 ml LB液中扩增培养，抽取命名为pXXGST-2 重组质粒，作为本发明制品放置于-20'C冰箱备用；4. 用pXXGST-1和pXXGST-2质粒的短肽融合表达法的一个线性抗原表位的鉴定 如前所述，我们在申请号为200710043264. 5的发明专利申请书中，已用pXXStv(118) -1鉴定出huZP3172—'81肽段中存在一个基序为ENWNAEK178—184的抗原表位。在此利用先前合成的 覆盖huZP3177—19°序列相邻肽段重叠7 aa的8肽编码基因片段(7对共14条正负链)，分别 两两退火复性，重组插入pXXGST-l质粒，以检验各GST188-短肽热诱导高表达融合蛋白的 稳定性。同时用兔抗重组huZP3"7，蛋白和抗huZP3172—187合成肽抗血清，检验了以截短 GST188蛋白为载体，通过短肽生物合成进行线性抗原表位鉴定的可行性和可靠性。第一步，先将1或2个0D的互补正负链片段(两端设计为BamH I和Sal I粘性末端) 用ddH20溶解成20 nmol/Vl储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10 pl储存液和20 ddH20于1. 5 ml Eppendorf管中，94。C水浴加热5 min,自然降至室温后，在15 pi反应体 积中吸入2 pi退火片段、1 pi约200 ng/^il经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒、 1 pi T4 DNA连接酶和其1.5 ial连接缓冲液，于16匸保温瓶中连接过夜；第二步，翌日连接液转化感受态BL21 (DE3)宿主菌(也可转化效率高的TG1宿主菌)， 涂布含Amp的LB平板上，于37'C培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆，转 接平板或扩增培养抽提质粒后外送进行DNA测序(此步可省略，只在蛋白印迹后，送相关 克隆进行DNA测序)，或于翌日晚各挑取二个克隆于含Amp的3 ml LB液中30'C振荡培养过夜，翌日晨按 1/50比例再分别转接于3 ml加Amp的LB液中振荡培养，待菌体0D值达到约0. 5时，将 培养温度调高至42。C热诱导表达4 h，离心收集的菌体加上样裂解液煮沸5 min，用于15 %SDS-PAGE检测。以pXXGST-2克隆诱导表达的GST188条带为对照，目的克隆表达条带在 后且两者相差约l kDa的，即可判断其为GST-短肽重组克隆(特异表达条带明显大于约3 kDa的，可能是合成片段中少合成l bp，以致TAA读框移码)；第三步通过SDS-PAGE检测或DNA测序确定GST-短肽重组克隆后，诱导表达的细菌 蛋白样品上样10 15pl (尽可能保持目的短肽表达量一致，以利印迹结果判断)，同时走 15%SDS-PAGE，电泳结束后， 一块凝胶用考马斯亮蓝染色(结果见图5A)， 一块进行硝酸 纤维素膜电转移约1.5 2 h (100 mA)，用丽春红染转印膜2 h，在目的短肽融合蛋白条 带处用针头打孔标记，然后用水冲洗掉丽春红染色；第四步印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液 洗涤四次，分别在8 10 ml反应液中加入30pl兔抗重组huZP3b177—348抗血清(一抗)， 室温反应2 h， PBS缓冲液洗膜后加入10 |il羊抗兔IgG /服P (二抗)，室温反应1 h，用 PBS缓冲液洗涤四次后进行DAB显色(结果见图7B)。重复以上第三和第四步操作，用2 pl兔抗huZP3m"^合成肽抗血清进行的免疫印迹 试验(结果见图5)。很显然，以上可专供短肽生物合成的pXXGST-l质粒的构建，特别是用它再次验证huZP3 一个已鉴定线性BCE基序的应用，为今后蛋白抗原表位的扫描鉴定提供了经济、操作相对 方便，可利用抗重组蛋白或其片段多抗进行表位作图，因而易在大多数实验室开展的可选 择研究方法和实验材料，也进而为抗原表位鉴定生物合成肽法的广泛应用奠定了良好的基 础。尽管本发明描述了抗原表位鉴定的具体应用例子，然而有一点对于相关领域研究技术 人员来说是显而易见的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本发明制品作各 种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本发明涉及的序列SEQ.ID.NO.l:重组插入的GST188的DNA正链序列 5，-ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTC GACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGT TGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTT TAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAA-3，SEQ.ID.N0.2: GST188核心蛋白一字简写的氨基酸序列M-S-P誦I-L隱G-Y-W誦K-I-K-G誦L-V隱Q-P誦T-R-L-L墨L-E-Y-L誦E-E-K-Y-E-E-H誦L-Y-E-R-D-E-G -D-K-W-R-N-K-K-F-E-L-G-L-E-F-P-N-L隱P-Y-Y小D隱G-D-V-K隱L-T-Q-S-M-A-I小R-Y-I-A-D-K-H-N-M-L-G-G-C-P國K-E-R-A-E-I-S-M-L-E-G-A-V國L-D-I-R誦Y-G-V-S-R誦I誦A-Y-SK-D-F-E-T-L-K_VDF_L-SK_L_PE_M-L-K_M-F-E-DR-L-C-HK-T-Y-L-N-G-D-H-V-T-H-P-D-F誦M-L-Y-D-A-L-D國V-V-L墨Y-M-D-P隱M-C-L誦D隱A國F-P-K誦L-V-C-F-KK-R-I-E-A誦I-P-0SEQ.ID.N0.3:重组质粒pXXGST-l的DNA正链序列(4196bp)<formula>formula see original document page 14</formula> <formula>formula see original document page 15</formula>GAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ.ID.N0.4:重组质粒pXXGST-2的DNA正链序列(4193 bp)，是将pXXGST-l正链序列SEQ.N03中GGATCCGTCGAC后^TAATAG l双终止密码子去除，但在GGATCCGTCGAC 前插入一个TAA终止密码子，其序列不再单独列出。
权利要求
1、一种截短GST蛋白热诱导融合表达质粒，其特征在于具有SEQ.ID.NO.3所示核苷酸序列，记为pXXGST-1。
2、 一种截短GST蛋白热诱导融合表达质粒，其特征在于具有SEQ. ID. NO. 4所示核苷 酸序列，记为pXXGST-2。
3、 一种如权利要求1所述的截短GST蛋白热诱导融合表达质粒的制备方法，其特征 在于具体步骤如下(1) 设计PCR引物，从pGEX-4T-质粒中扩增出编码GST蛋白188基因的大片段，该 大片断在5'-和3'-端分别带BamH I和Sal I的限制酶酶切位点；(2) 利用DNA重组技术，将目的GST基因扩增片段插入用EcoR I和BamH I双酶切 的pSY621质粒，获得的pSY621-GST重组质粒转化大肠杆菌宿主菌，在加Amp的LB平板 上挑取它们的重组克隆，进行DNA测序；(3) 合成两端为Sal I和Pst I粘性末端中间带TAATAG双终止密码子的二条互补DNA 片段，将之退火复性后重组插入基因测序正确并经双酶切的pSY621-GST中Sal I和Pst I 位点之间，连接液转化TG1宿主菌，再次外送DNA测序验证的重组质粒，命名为pXXGST-l， 其核苷酸序列为SEQ. ID. N03。
4、 一种如权利要求2所述的截短GST蛋白热诱导融合表达质粒的制备方法，其特征在 于具体步骤如下以权利要求3所述方法制备的pXXGST-1重组质粒为模板，用设计的一 对PCR引物扩增在GST编码基因3'-端后添加TAA终止密码子的GST188基因片段，用EcoR I和BamH I限制酶双酶切的扩增大片段，被重组插入用同样二个酶双酶切的pSY621质粒， 测序正确重组质粒被新命名为pXXGST-2;其核苷酸序列为SEQ. ID. N04。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体为一种截短GST蛋白热诱导融合表达重组质粒及其制备方法。本发明选用由188aa组成的新型截短GST188蛋白为载体，在大肠杆菌热诱导表达系统表达短肽融合蛋白的pXXGST-1重组质粒，以及用作表达对照的热诱导型pXXGST-2重组质粒，从而实现短肽生物合成的目的，专供抗原线性表位扫描作图定位以及表位基序鉴定用。本发明的实验证明GST188核心蛋白作为短肽生物表达载体以及在抗原表位扫描鉴定方面，特别是使用抗重组靶蛋白抗血清进行表位基序鉴定的适用性和应用性。
文档编号C12N15/70GK101215573SQ20071017330
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月27日 优先权日2007年12月27日
发明者何亚萍, 唐海平, 季朝能, 徐万祥, 毅 谢, 顾少华 申请人:上海市计划生育科学研究所;复旦大学;上海科学院