专利名称：：一种来源于纳豆的脂肪酶抑制剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种脂肪酶抑制剂及其用途，特别涉及一种来源于纳豆的脂肪酶抑制剂及其用途。
背景技术：
：随着经济的发展、人们生活水平的提高以及生活方式的改变，肥胖已成为全球成年人最大的慢性疾病。据研究报道，肥胖与许多现代疾病直接相关，肥胖者患心脑血管疾病、糖尿病、高血压、冠心病、胆囊疾病、痛风、呼吸道疾病、和某些肿瘤的风险很大，而高血脂、内脏脂肪更是诸多生活习惯病的元凶，因此肥胖不仅影响人的外观体型，而且严重威胁到了人类的健康。目前，美国FDA只批准了2种药物可以长期用于肥胖症治疗西布曲明(Sibutramine)和奥利司他(Orlistat)。西布曲明是一种单胺类神经递质再摄取抑制剂，它作用于中枢神经系统以减食而降低体重，但该药可能引起患者血压升高、心率加快，且不能用于冠心病、心率失常和卒中等病史的患者中，使该药应用受到限制。肥胖症和高胆固醇血症在一定程度上与脂肪摄入有关，饮食脂肪在胃肠道被脂肪酶尤其是胰脂肪酶水解为脂肪酸和甘油三酯才能被人体吸收。因此，对胰脂肪酶的抑制可以导致对脂肪吸收的抑制，进而达到减肥降脂的目的。
发明内容本发明的一个目的在于公开一种来源于枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)微生物，尤其是纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto或Bacillusnatto)的脂肪酶抑制剂，本发明的另一个目的在于公开这种脂肪酶抑制剂的制备方法及用途。本发明目的是通过如下技术方案实现的本发明脂肪酶抑制剂的制备方法如下将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)，在琼脂斜面培养基上进行活化培养，培养温度30-40°C，培养时间为16-48小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养16-48小时；再将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养16-144小时，或移至液体发酵培养基中培养16-144小时，培养温度为30-4(TC，液体培养pH控制范围4-9,即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离对于固体发酵，在上述培养物中加入1-5重量倍的50%-95%乙醇，超声30-90分钟，滤出提取液，再加入1-3重量倍的50%-95%乙醇，第二次超声30-90分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用6(TC-9(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，将浓縮液用1-4倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用5(TC-9(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓縮物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用8(TC-IO(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓缩液；将浓缩液用l-3倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用5(TC-9(TC水浴减压旋转蒸发浓縮氯仿萃取液，浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；湿菌体沉淀放_10°C--3(TC冰箱冷冻15-30小时，置室温解冻后加入l-3倍体积倍甲醇，超声提取2次，每次30-90分钟；合并两次提取液，用4(TC-7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓縮物。本发明脂肪酶抑制剂的优选制备方法如下将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)，在琼脂斜面培养基上进行活化，培养温度37'C土rC，培养时间为22-26小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养20-24小时；将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养68-96小时，或移至液体发酵培养基中培养68-96小时，培养温度均为37。C土rC，液体发酵pH控制范围为4.5-8.5,即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离对于固体发酵，在上述培养物中加入2.5重量倍的95%乙醇，超声60分钟，滤出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超声60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用8(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，将浓縮液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用70。C水浴减压旋转蒸发浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓缩物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用80-10(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液；将浓縮液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓缩氯仿萃取液，浓縮至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-2(TC冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入2-3体积倍甲醇，超声提取2次，每次60分钟；合并两次提取液，用60'C水浴减压旋转蒸发浓缩至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓縮物。其中，上述培养基可以包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，优选葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆饼粉、花生粉、花生饼粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆，固体培养优选大豆，液体培养优选大豆蛋白胨；营养无机盐包括但不限于磷酸盐磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙，优选磷酸氢钠、氯化钙和硫酸镁。其中，上述提取分离技术中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶剂可以用其他水不混溶剂如乙酸丁酯、二氯甲垸等，或水可混溶剂丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、异丙醇等代替。本发明的脂肪酶抑制剂是通过培养枯草芽孢杆菌属微生物(Bacillussubtilis)尤其是纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto或Bacillusnatto)来获得，包括枯草芽孢杆菌属微生物的诱变育种菌种；本发明是通过抑制脂肪酶活性而达到减肥降脂的目的，其新颖性在于①该脂肪酶抑制剂来源于食用纳豆，对人体没有毒副作用；②该脂肪酶抑制剂选择性地作用于胃肠道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而对蛋白酶和淀粉酶等没有抑制作用。下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。实验例1:本发明纳豆脂肪酶抑制剂对脂肪酶抑制作用实验1、制备样品溶液定量称取上述纳豆提取物(或浓縮物)1.000克，用5毫升95%乙醇溶液溶解，不溶物离心去除，再用95%乙醇适当稀释，稀释浓度见表1，取稀释液1毫升按照下述脂肪酶活力抑制率的测定方法检测。2、脂肪酶活力抑制率的测定A.准备试剂、橄榄油乳液及测定酶液橄榄油乳化液的制备取橄榄油12ml与阿拉伯树胶22.5g，研磨均匀，加水研磨至300ml，用18000转/min的匀质机乳化2次，每次3分钟；取乳剂在显微镜下检查，9(Fq乳粒的直径在3Mto以下，并不得有10Mm的乳粒，即可；牛胆盐溶液的制备精密称取牛胆盐8.0g，置于50ml烧杯中，以水溶解，转移至100ml容量瓶中定容；O.lmol/L氢氧化钠溶液的制备精密称取氢氧化钠2.0g，加水溶解定容至500ml;三羟甲基氨基甲垸缓冲液制备取三羟甲基氨基甲烷3.030g，用0.1mol/L盐酸溶液调pH值至8.0，加水至500ml，摇匀，再调节pH值至8.0;脂肪酶溶液的制备精密称取胰脂肪酶(SIGMA:L3126)于容量瓶中，用冷却至5。C以下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶100活力单位的溶液，作为酶原液备用；绘制标准曲线时，将酶原液用三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至不同梯度90u/ml、80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml的测定酶液；Ou/ml的测定酶液(酶空白)是在水浴中煮沸15-30分钟的酶原液。B.建立脂肪酶测活体系1)95%乙醇为样品空白溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液2ml与水10ml，置100ml三角瓶中，力卩95%乙醇溶液lml,用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;2)样品溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液2ml与水10ml，置100ml三角瓶中，加lml上述样品溶液，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0。C.绘制脂肪酶抑制率"Y%"与pH变化幅度"ApH"关系标准曲线绘制标准曲线时，先将不同梯度的测定酶液换算成对应的抑制率，抑制率换算公式-Y(%)二(X。-Xn)/XoY(%)—表示脂肪酶抑制率X。一表示酶原液浓度(u/ml)Xn—表示不同稀释度的酶液浓度(u/ml);设定酶浓度为零时，抑制率为100%;设定酶原液浓度的抑制率为0，将酶原液按一定梯度稀释成90u/ml、80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml的测定酶液，则对应的抑制率Y呢分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%;按照标准曲线绘制法绘制标准曲线，本发明的标准曲线绘制法如下将上述95%乙醇空白溶液脂肪酶测活体系在37'C水浴中保温10分钟，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;精密量取上述不同梯度浓度的测定酶液l体积份，分别加至空白溶液测活体系中，在37°。水浴中准确反应5分钟，同时记录反应前后pH值，并计算反应前后pH差值；用酶浓度为100u/ml时反应前后的pH差值，分别减去酶浓度为90u/ml、80u/ml、70u/ml、60u/ml、50u/ml、40u/ml、30u/ml、20u/ml、10u/ml、0u/ml时反应前后的pH差值，即得到对应不同抑制率的pH变化幅度"ApH"值；以抑制率为纵坐标，"ApH"值为横坐标,绘制脂肪酶抑制率"Y%"与pH变化幅度"△pH"关系标准曲线，并得到95%为空白样品溶液的脂肪酶抑制率计算公式。D.测定方法及样品溶液脂肪酶抑制率的计算空白溶液测定将上述95%乙醇空白溶液脂肪酶测活体系在37'C水浴中保温10分钟，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;精密量取酶原液lml加至空白溶液测活体系中，在37t:水浴中准确反应5分钟，同时记录反应前后pH值，并计算空白溶液反应前后的pH差值，记为A1;另取在水浴中煮沸15-30分钟的上述酶原液1体积份，照上述方法测定作酶空白对照，pH差值记为A0;则空白溶液酶反应的pH变化值为AA二A1-AO;样品溶液测定:将样品溶液脂肪酶测活体系在37"C水浴中保温10分钟，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;精密量取酶原液1体积份加至样品溶液测活体系中，在37'C水浴中准确反应5分钟，同时记录反应前后pH值，并计算样品溶液反应前后的pH差值，记为Bl;另取在水浴中煮沸15-30分钟的上述酶原液1体积份，照上述方法测定作酶空白对照，pH差值记为B0;则样品溶液酶反应的pH变化值为AB-B1-B0;测定样品的脂肪酶抑制率的计算用空白溶液酶反应的PH变化值(AA)减去样品溶液酶反应的pH变化值(AB),即得到空白溶液与样品溶液酶反应的"ApH"值，即ApH二AA—AB，将此"ApH"值代入上述相应的空白溶液的脂肪酶抑制率计算公式，即求得测定样品的脂肪酶抑制率，结果见表1:表l纳豆提取物的脂肪酶活力抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>实验例2:本发明纳豆脂肪酶抑制剂对脂肪酶抑制作用实验定量称取上述纳豆提取物(或浓縮物)1.000克，用5毫升95%乙醇溶液溶解，不溶物离心去除，再用95%乙醇适当稀释，稀释浓度见表2，取稀释液1毫升按照下述脂肪酶活力抑制率的测定方法检测。2、脂肪酶活力抑制率的测定A.准备试剂、橄榄油乳液及测定酶液三羟甲基氨基甲垸缓冲液制备取三羟甲基氨基甲垸3.030g，用0.1mol/L盐酸溶液调pH值至8.5，加水约500ml，摇匀，再调节pH值至8.5，定容至500ml;橄榄油乳化液的制备取橄榄油12ml与阿拉伯树胶22.5g，研磨均匀，加水研磨至300ml，用18000转/min的匀质机乳化2次，每次3分钟；取乳剂在显微镜下检查，90%乳粒的直径在3陶以下，并不得有10Mm的乳粒，即可；牛胆盐溶液的制备精密称取牛胆盐8.0g，置于50ml烧杯中，以水溶解，转移至100ml容量瓶中定容；0.lmol/L氢氧化钠溶液的制备精密称取氢氧化钠2.0g，加水溶解定容至500ml;脂肪酶溶液的制备精密称取胰脂肪酶(SIGMA:L3126)于容量瓶中，用冷却至5。C以下的三羟甲基氨基甲垸缓冲液溶解，制成每lml中含胰脂肪酶100活力单位的溶液，作为测定酶液备用。B.建立脂肪酶测活体系1).空白溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、896牛胆盐溶液2ml与水10ml，置100ml三角瓶中，加甲醇溶液lml，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;2).样品溶液脂肪酶测活体系取橄榄油乳液25ml、8%牛胆盐溶液21111与水10ml，置100ml三角瓶中，加样品溶液lml，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0。C.脂肪酶活力的测定及抑制率的计算1)空白溶液脂肪酶活力的测定将上述空白溶液脂肪酶测活体系在37'C水浴中保温10分钟，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;精密量取上述测定酶液lml,在37。C水浴中准确反应10分钟，立即加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0.lmol/L氢氧化钠滴定液滴定至测定体系溶液变为粉色，记录消耗0.1mol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)，记为A1。另取在水浴中煮沸15分钟的测定酶液lml，按照上述方法测定作为酶空白对照，记录消耗0.lmol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)记为A0。2)样品溶液脂肪酶活力的测定将上述样品溶液脂肪酶测活体系在37。C水浴中保温10分钟，用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至9.0;精密量取上述测定酶液lml，在37。C水浴中准确反应10分钟，立即加入95%乙醇30ml，加入2滴酚酞指示液，用0.lmol/L氢氧化钠滴定液滴定至测定体系溶液变为粉色，记录消耗0.lmol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)，记为B1。另取在水浴中煮沸15分钟的测定酶液lml，按照上述方法测定作为酶空白对照，消耗0.lmol/L氢氧化钠滴定液的量(ml)，记为B0。测定样品脂肪酶抑制率的计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>结果见表2:表2纳豆提取物的脂肪酶活力抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实验例3:本发明纳豆脂肪酶抑制剂对肥胖大鼠的减肥作用实验实验材料供试药品纳豆乙酸乙酯萃取物，临用时以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成每毫升含纳豆乙酸乙酯萃取物100毫克的混悬液(以下称N-1);纳豆甲醇提取物，临用时以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成每毫升含纳豆甲醇提取物100毫克的混悬液(以下称N-2);阳性对照药物为西药赛尼可(罗氏制药有限公司生产，批号B1603)，临用时以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成每毫升含0rlistat5毫克的混悬液(以下称0rlistat)。实验动物Wistar大鼠100只，雌雄兼用，体重90士10g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验方法1、胖动物模型的制作将100只大鼠随机分两组，一组18只，用普通饲料喂养，简称正常对照组；另一组82只，用高脂饲料喂养，简称高脂组；共喂养4周；造模期间动物室温度20*€-28°(:，相对湿度40±15%，自由光照，自由摄取食物和水；每周测量一次体重和体长；大鼠肥胖判断标准经高脂饲料喂养4周后大鼠体重超过普通饲料喂养大鼠体重的20%作为单纯性肥胖模型实验大鼠。2、词料组成1)普通词料(100g):豆饼粉25g、玉米粉40g，酵母2g、麸子粉15g、鱼粉8g、骨粉2g、面粉7.5g、食盐0.5g。2)高脂饲料每50g普通饲料中再加奶粉5g、猪油12g、鸡蛋20g、香油2g、花生5g、鲜黄豆芽50g混匀烘干。3、分组方法本实验将动物分为5组，每组12只，共选出合格大鼠60只。从普通词料组中随机选取12只作为正常对照组(以下称A组)；从高脂组造模成功的大鼠中随机选取48只，分成4组(以下称B、C、D、E组)，每组12只，其中B组为肥胖模型组，C组为阳性对照药Orlistat,D组为N-1，E组为N-2。4、给药方法灌胃给药，每日二次，每日9:00-10:00点和18:00-19:00点各给药一次。药物以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度，连续灌胃4周，正常对照组和高脂模型组给等量(容积)的O.5%羧甲基纤维素钠溶液。动物室温度20°C-28°。，相对湿度40±15%，自由光照，自由摄取食物和水。5、观察指标比较不同实验组大鼠在体重、体长、Lee's指数、脂肪垫重量的差别。1)重的测定每周定时称大鼠体重(g);2)体长的测定处死前，用乙醚麻醉大鼠，准确测量体长(从鼻至肝门的长度)；3)Lee，s指数测定Lee，s指数二体重(g)1/3X10V体长(cm)4)脂肪垫的测定在实验结束时，处死动物后剥离出附睾脂肪垫全部脂肪，称脂肪重。实验结果纳豆脂肪酶抑制剂对单纯性肥胖大鼠体重、Lee's指数和内脏脂肪垫的影响见表3表3纳豆脂肪酶抑制剂N-1、N-2对肥胖大鼠体重、Lee's指数和内脏脂肪垫的影响(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注*与肥胖模型组相比较的t检验结果P<0.01从表3的实验结果可以看出，N-1和N-2对肥胖大鼠的体重、Lee's指数、内脏脂肪重量均有显著的抑制作用，与阳性对照药赛尼可(Orlistat)实验结果在a=0.05水平下没有显著性差异；说明从纳豆培养物中提取的脂肪酶抑制剂具有显著的减肥降脂作用。下述实施例均能实现上述实验例的效果具体实施方式实施例1:将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)在琼脂斜面培养基上进行活化，琼脂斜面培养基的成分为(g/L):蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水(或去离子水)加至1L，调节pH至7.0，取4ml分装于15ml试管，常规灭菌，斜面培养温度37。C，培养时间为24小时；用接种环取上述活化培养的斜面菌种于灭菌的种子培养基中，培养基成分为蛋白胨10g,牛肉膏lg，葡萄糖5g，(HH4)2S040.2g，MgS047H200.2g，K2HPO40.2g，加水至1L，pH7.2，取100ml装入500ml摇瓶，塞上棉塞或包上8层纱布后，常规灭菌，37°C下摇床培养24小时，摇床转速180转/分钟；将3瓶培养好的摇瓶种子液合并，共300ml，接种至装有60L生产(发酵)培养基的100L发酵罐内，生产培养基的成分为每升含大豆蛋白胨30g，葡萄糖15g，可溶性淀粉5g，Na2HP0412H203g，NaH2P042H20lg，MgS047H200.5g，CaCl20.2g,调pH7.5，常规灭菌，发酵罐通气量O.50.8VVM，搅拌转速300500转/分钟，培养温度37±1°C,pH控制在4-9之间，培养72小时；将培养72小时的发酵液离心，得离心清液58升和湿菌体沉淀1.82千克；离心清液用7(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液2.8升，将浓縮液用2倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液共16.5升，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮乙酸乙酯萃取液，浓縮至膏状，得乙酸乙酯萃取物；湿菌体沉淀放-2(TC冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入3.6升75%的乙醇回流提取2次，每次60分钟，合并两次提取液7.1升，用8(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得膏状乙醇提取浓縮物；采用常规方法，加入常规辅料，制成各种常规剂型，用于制备脂肪酶抑制剂。实施例2:将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)在琼脂斜面培养基上进行活化，琼脂斜面培养基的成分为(g/L):蛋白胨10g，酵母提取物3g，氯化钠10g，琼脂20g，蒸馏水(或去离子水)加至1L,调pH7.0，取4ml分装于15ml试管，常规灭菌，斜面培养温度37。C，培养时间为22小时；用接种环取上述活化培养的斜面菌种于灭菌的种子培养基中，培养基成分为大豆蛋白胨10g，酵母提取物lg，葡萄糖5g，(HH4)2S040.2g，MgS047H200.2g，K2HP040.2g，加水至1L,调pH7.0，取100ml装入500ml摇瓶，塞上棉塞或包上8层纱布后，常规灭菌；37"C下摇床培养，摇床转速220转/分钟，种子培养18小时；将6瓶培养好的摇瓶种子液合并，共600ml，接种至装有65L生产(发酵)培养基的100L发酵罐内，生产培养基的成分为每升含大豆蛋白胨35g，葡萄糖10g，糊精15g，K2HP0412H203g，KH2P042H20lg，MgS047H200.5g，CaCl20.2g，调pH7.5，常规灭菌，发酵罐通气量O.50.8VVM，搅拌转速300500转/分钟，培养温度37。C土rC，pH控制在4-9之间，培养48小时；将培养48小时的发酵液离心，得离心清液62升和湿菌体沉淀2.36千克；离心清液用9(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液3.l升，将浓縮液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液共18.2升，用8(TC水浴减压旋转蒸发浓縮氯仿萃取液，浓縮至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀匀浆后加入4.6升甲醇超声提取2次，每次60分钟，合并两次提取液9.0升，用6(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得膏状甲醇提取浓縮物；采用常规方法，加入常规辅料，制成各种常规剂型，用于制备脂肪酶抑制剂。实施例3:将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)保存在琼脂斜面培养基上进行活化，琼脂斜面培养基的成分为(g/L):蛋白胨10g，酵母提取物3g，牛肉膏3g,葡萄糖5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水(或去离子水)加至1L，调pH7.2,取5ml分装于15ml试管中，常规灭菌，斜面培养温度37"C，培养时间为22小时；用接种环取上述活化培养的斜面菌种于灭菌的种子培养基中，培养基成分为大豆蛋白胨10g,牛肉膏5g，葡萄糖5g，(HH4)2S040.2g，MgS047H200.2g，K2,40.2g，加水至1L，pH7.0，取100ml装入500ml摇瓶，塞上棉塞或包上8层纱布后，常规灭菌，37"C下摇床培养，摇床转速220转/分钟，种子培养20小时；将6瓶培养好的摇瓶种子液合并，共600ml，用无菌移液管吸取5毫升，接入装有已灭菌的200克大豆培养基的500毫升三角瓶中，包上8层无菌纱布，于37"C土rC培养72小时，大豆培养基为市售大豆加入5(TC温水浸泡16小时，将浸透的大豆去皮，沥去水分，装瓶，装量为湿重200克/500毫升三角瓶，包上8层纱布，共100个三角瓶，装有大豆培养基20千克，常规灭菌；将培养72小时的固体纳豆，加入50升95%乙醇，超声(40KHz，250W)60分钟，滤出提取液，再加入40升80%乙醇二次超声(40KHz,250W)60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液共88升；提取液用9(TC-10(TC水浴薄膜减压蒸发浓缩，得浓縮液3.5升，将浓縮液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液共25.5升，用70。C水浴减压旋转蒸发浓縮乙酸乙酯萃取液，浓縮至膏状，得乙酸乙酯萃取浓縮物；采用常规方法，加入常规辅料，制成各种常规剂型，用于制备脂肪酶抑制剂。实施例4:将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)在琼脂斜面培养基上活化，琼脂斜面培养基的成分为(g/L):蛋白胨5.0g，牛肉浸粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂20g，蒸馏水(或去离子水)加至1.0L，pH7.0，取40ml分装于茄瓶，常规灭菌。斜面培养温度36'C，培养时间为28小时；用接种环取上述活化培养的斜面菌种于灭菌的种子培养基中，种子培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏lg，葡萄糖5g，(HH4)2S040.2g,MgS047H200.2g，K風0.2g，加水至1L，pH7.2，常规灭菌，取100ml装入500ml摇瓶，塞上棉塞或包上8层纱布后，常规灭菌；37'C士rC下摇床培养，摇床转速180转/分钟，种子培养24小时；将上述培养好的摇瓶种子液600ml(6瓶种子液合并)，接种至装有65L生产(发酵)培养基的100L发酵罐内，生产培养基的成分为每升含葡萄糖15g，可溶性淀粉5g，Na2HP0412H203g，NaH2P042H20lg，MgS047H200.5g，CaCl20.2g，用10%大豆浆配制，调pH6.8,常规灭菌，发酵罐通气量0.51.0VVM，搅拌转速300500转/分钟，培养温度37士rC，pH控制在4-9之间，培养144小时；将培养144小时的发酵液离心，得离心清液57升和湿菌体沉淀1.62千克；离心清液用9(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液3.5升，将浓縮液用3倍体积乙酸丁酯萃取二次，合并二次乙酸丁酯萃取液共19.5升，用70。C水浴减压旋转蒸发浓縮乙酸丁酯萃取液，浓縮至膏状，得乙酸丁酯萃取物；湿菌体沉淀用匀质机匀浆后加入三倍体积的95%乙醇超声提取60分钟，减压抽滤，滤饼再加入三倍体积的95%乙醇超声提取60分钟，抽滤，合并两次提取液8.5升，用8(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得膏状乙醇提取浓縮物；采用常规方法，加入常规辅料，制成各种常规剂型，用于制备脂肪酶抑制剂。实施例5:将纳豆芽孢杆菌(保藏于"中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心"，保藏号为CGMCC2186)在琼脂斜面培养基上活化，琼脂斜面培养基的成分为(g/L):蛋白胨5g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水(或去离子水)加至1L，调pH7.0，取4ml分装于15ml试管，常规灭菌。斜面培养温度4(TC，培养时间为18小时；用接种环取上述活化培养的斜面菌种于灭菌的种子培养基中，摇瓶种子培养基成分为蛋白胨10g，牛肉膏lg，葡萄糖5g，(HH4)2SO40.2g，MgS047H200.2g，K風0.2g，加水至1L，pH7.2,常规灭菌。取100ml装入500ml摇瓶，塞上棉塞或包上8层纱布后，常规灭菌，40。C下摇床培养，摇床转速180转/分钟，种子培养16小时；将上述培养好的种子液合并，用无菌移液管吸取3毫升，接入装有已灭菌的100克大豆培养基的500毫升三角瓶中，包上8层无菌纱布，于4(TC土rC培养24小时，大豆培养基为市售大豆加入9(TC热水浸泡4小时，将浸透的大豆去皮，沥去水分，装瓶，装量为湿重100克/500毫升三角瓶，包上8层纱布，共100个三角瓶，常规灭菌；将培养24小时的固体纳豆，加入30升7096乙醇，回流提取60分钟，滤出提取液，再加入20升70%乙醇二次回流提取30分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液共45升；提取液用80'C水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓缩液3.0升，将浓縮液用2-3倍体积二氯甲垸萃取三次，合并三次二氯甲垸萃取液共25.5升，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮二氯甲烷萃取液，浓縮至膏状，得二氯甲烷萃取浓縮物；采用常规方法，加入常规辅料，制成各种常规剂型，用于制备脂肪酶抑制剂。权利要求1、一种脂肪酶抑制剂，其特征在于该脂肪酶抑制剂来源于枯草芽孢杆菌属微生物，尤其是纳豆芽孢杆菌。2、如权利要求l所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于该脂肪酶抑制剂由如下方法制成将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化培养，培养温度30-40°C，培养时间为16-48小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养16-48小时；再将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养16-144小时，或移至液体发酵培养基中培养16-144小时，培养温度为30-4(TC，液体培养pH控制范围4-9，即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离；对于固体发酵，在上述培养物中加入1-5重量倍的50%-95%乙醇，超声30-90分钟，滤出提取液，再加入1-3重量倍的50%-95%乙醇，第二次超声30-90分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用6(TC-9(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，将浓縮液用l-4倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用5(TC-9(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓縮物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用8(TC-10(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液；将浓縮液用1-3倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C-9CTC水浴减压旋转蒸发浓縮氯仿萃取液，浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-10°C--3CTC冰箱冷冻15-30小时，置室温解冻后加入1-3倍体积倍甲醇，超声提取2次，每次30-90分钟；合并两次提取液，用40°C-70°C水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓縮物。3、如权利要求2所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于该脂肪酶抑制剂由如下方法制成将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化，培养温度37X:土rC，培养时间为22-26小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养20-24小时；将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养68-96小时，或移至液体发酵培养基中培养68-96小时，培养温度均为37'C士rC，液体发酵pH控制范围为4.5-8.5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离；对于固体发酵，在上述培养物中加入2，5重量倍的95%乙醇，超声60分钟，滤出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超声60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用80。C水浴薄膜减压蒸发浓縮，将浓縮液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓縮物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用80-100'C水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液；将浓縮液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮氯仿萃取液，浓縮至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-2(TC冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入2-3体积倍甲醇，超声提取2次，每次60分钟；合并两次提取液，用6(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓縮物。4、如权利要求2或3所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于培养基可以包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，优选葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆饼粉、花生粉、花生饼粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆，固体培养优选大豆，液体培养优选大豆蛋白胨；营养无机盐包括但不限于磷酸盐磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙，优选磷酸氢钠、氯化钙和硫酸镁。5、如权利要求2或3所述的脂肪酶抑制剂，其特征在于提取分离技术中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等溶剂可以用其他水不混溶剂如乙酸丁酯、二氯甲烷或水可混溶剂如丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、异丙醇代替。6、如权利要求l-3任一所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于该方法如下将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化培养，培养温度30-40。C，培养时间为16-48小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养16-48小时；再将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养16-144小时，或移至液体发酵培养基中培养16-144小时，培养温度为30-4(TC,液体培养pH控制范围4-9,即可得到含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离；对于固体发酵，在上述培养物中加入卜5重量倍的50%-95%乙醇，超声30-90分钟，滤出提取液，再加入1-3重量倍的50%-95%乙醇，第二次超声30-90分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用6(TC-90'C水浴薄膜减压蒸发浓縮，将浓縮液用1-4倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用5(TC-9(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓縮物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用8(TC-10(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液；将浓縮液用1-3倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用50°C-9(TC水浴减压旋转蒸发浓縮氯仿萃取液，浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分的氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-10°C--3(TC冰箱冷冻15-30小时，置室温解冻后加入1-3倍体积倍甲醇，超声提取2次，每次30-90分钟；合并两次提取液，用40°C-70°C水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓縮物。7、如权利要求6所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于该方法如下将纳豆芽孢杆菌，在琼脂斜面培养基上进行活化，培养温度37t:士rc，培养时间为22-26小时；将活化后的纳豆芽孢杆菌转入种子培养基中培养20-24小时；将上述培养好的种子培养基中的种子液移至固体发酵培养基中培养68-96小时，或移至液体发酵培养基中培养68-96小时，培养温度均为37°C±1°C，液体发酵pH控制范围为4.5-8.5，即可得到含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物；再用已知的提取分离技术获取和分离对于固体发酵，在上述培养物中加入2.5重量倍的95%乙醇，超声60分钟,滤出提取液，再加入2重量倍的80%乙醇，第二次超声60分钟，滤出提取液，合并两次乙醇提取液；用80。C水浴薄膜减压蒸发浓缩，将浓縮液用2-3倍体积乙酸乙酯萃取三次，合并三次乙酸乙酯萃取液，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至膏状，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的乙酸乙酯萃取浓縮物；对于液体发酵，将上述培养物离心，得离心清液和湿菌体沉淀；离心清液用80-IO(TC水浴薄膜减压蒸发浓縮，得浓縮液；将浓縮液用2倍体积氯仿萃取三次，合并三次氯仿萃取液，用7(TC水浴减压旋转蒸发浓縮氯仿萃取液，浓縮至膏状，得氯仿萃取物；湿菌体沉淀放-2(TC冰箱冷冻24小时，置室温解冻后加入2-3体积倍甲醇，超声提取2次，每次60分钟；合并两次提取液，用6(TC水浴减压旋转蒸发浓縮至无醇味，得含有脂肪酶抑制活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的甲醇提取浓縮物。8、如权利要求6所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于培养基可以包含一种或多种碳源和一种或多种氮源和任选营养无机盐和/或微量元素碳源包括但不限于淀粉、葡萄糖、蔗糖、糊精、糖蜜、甘油，优选葡萄糖；氮源包括但不限于大豆、大豆粉、大豆饼粉、花生粉、花生饼粉、酵母提取物、牛肉提取物、蛋白胨、大豆蛋白胨、麦芽提取物、玉米浆，固体培养优选大豆，液体培养优选大豆蛋白胨；营养无机盐包括但不限于磷酸盐磷酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢铵、氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钾、硫酸铵、碳酸钙，优选磷酸氢钠、氯化钙和硫酸镁。9、如权利要求6所述的脂肪酶抑制剂的制备方法，其特征在于提取分离技术中所使用的乙醇、乙酸乙酯、氯仿、甲醇可以用乙酸丁酯、二氯甲垸水不混溶剂代替，或用丙酮、乙腈、正丙醇、正丁醇、异丙醇水可混溶剂代替。全文摘要本发明公开了一种枯草芽孢杆菌属(Bacillussubtilis)微生物，尤其是纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto或Bacillusnatto)的脂肪酶抑制剂及其制备方法和用途。该脂肪酶抑制剂是先将纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtilisnatto)活化培养，再用固体发酵或液体发酵的方法制成含有抑制脂肪酶的活性成分，即纳豆脂肪酶抑制素的培养物，再进行提取分离，最终制成脂肪酶抑制剂。本发明是通过抑制脂肪酶活性而达到减肥降脂的目的，其新颖性在于①该脂肪酶抑制剂来源于食用纳豆，对人体没有毒副作用；②该脂肪酶抑制剂选择性地作用于胃肠道脂肪酶尤其是胰脂肪酶，而对蛋白酶和淀粉酶等没有抑制作用。文档编号C12P21/02GK101397341SQ200710175440公开日2009年4月1日申请日期2007年9月29日优先权日2007年9月29日发明者何大林,段震文,郭树仁,闫雪秋申请人:北京北大维信生物科技有限公司