与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法

文档序号:436171阅读:243来源:国知局
专利名称:与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法
技术领域
本发明涉及与甜瓜白粉病抗性基因/^-^^紧密连锁的特异片段及其获 得方法,属于生物技术领域。
背景技术
甜瓜为葫芦科黄瓜属(C"c腿i's /7 e^ L.)—年生蔓生草本植物,是一 种国内外广泛栽培的重要经济作物。我国已有3000多年的甜瓜栽培历史, 是世界上最早栽培甜瓜的国家之一,也是目前世界上甜瓜栽培面积最大、 产量最高的国家。
白粉病是危害甜瓜生产的一种世界性病害,在许多国家和地区都有发 生,严重影响甜瓜的产量和品质,甚至会造成绝产,引起了世界各国的广 泛重视。白粉病主要由瓜单囊壳菌(&力aerof力ecs /Wi^z'/7ea)和二孢白 粉菌(f/yw'p力e "c力07^ces/7/历)引起。目前人们已较深入地对病原菌的 致病性、传播途径、预防措施等进行了研究,也为寻找相关抗源基因做了 大量工作,但白粉病菌的危害还是有不断发展的趋势,开展抗病品种的选 育是解决这一问题的有效途径。因此,对瓜类白粉病抗病育种的研究已成 为育种工作的主要目标之一。
传统育种方式费时费力,需要非常大的群体对白粉病菌的抗性进行严 格筛选。利用与抗病性状紧密连锁的特异标记片段进行品种筛选,可大大 縮短传统育种的研究周期,加速目标基因的转移。目前,与抗病性状紧密 连锁的特异标记片段的获得主要来源于各种分子标记技术,如随机扩增多 态性DNA (RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星DNA或简单重复序列(SSR)、特异序列扩增(SCAR)、单核苷酸多态性(SNP)等。其中, RAPD和AFLP标记技术检测易受环境条件的影响而造成实验结果重现性差, SCAR和SNP标记技术需要利用已知DNA序列设计特异引物进行扩增,而 SSR标记技术具有重复性好,标记稳定可靠,便于统计等优点,是目前实 际应用中比较稳定的标记工具,而且利用SSR标记技术获得的特异片段序 列也是开发SCAR和SNP等其他分子标记的重要基础。因此,本项研究拟 利用SSR标记技术寻找与甜瓜白粉病抗性基因紧密连锁的特异标记片段, 这将是今后进行甜瓜白粉病抗性分子育种的基础,而由此获得的扩增序列 又是开发SCAR和SNP等特异分子标记的基础。

发明内容
本发明的目的在于提供一种与甜瓜白粉病抗性基因/fe-i^紧密连锁的 特异片段,该特异片段可用于甜瓜抗白粉病分子标记辅助育种中。 本发明的另一个目的是提供这种特异片段的获得方法。 为实现上述目的,本发明采用如下技术方案
一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段,其具有序列
表中SEQ ID N0:1 4所述的DNA序列。
序列表中SEQ ID N0:1为抗病特异扩增片段SSR509-172的序列; 序列表中SEQ ID N0:2为抗病特异扩增片段SSR510-98的序列; 序列表中SEQ ID N0:3为感病特异扩增片段SSR509-170的序列; 序列表中SEQ ID N0:4为感病特异扩增片段SSR510-104的序列。 一种与甜瓜白粉病抗性基因/^-2,紧密连锁的特异片段的获得方法,
所述方法包括如下步骤
(1)与甜瓜白粉病抗性基因/to-i^紧密连锁的特异片段的筛选提取
基因组DNA,使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应,对PCR产物进行电泳分析;通过BSA法,寻找与甜瓜白粉病抗性基因/fe-2尸紧密连锁的特 异SSR片段,测定连锁距离并验证连锁关系;
(2)与甜瓜白粉病抗性基因P迈-^,紧密连锁的特异扩增序列的获得 对SSR产物进行回收、克隆和测序,获得特异片段序列。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因i^紧密连锁的特异片段的获得
方法,所述步骤(1)中SSR引物为SSR引物509和SSR引物510;
所述SSR引物509上游引物序列为5, -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3,, 509下游引物序列为5, - CAAAAAGCATCAAAATGGTTG -3,。
所述SSR引物510上游引物序列为5, -TTTCACTTTTTCCCGCCG -3,, 510下游引物序列为5, - AATGGAAAAGGGAAGTGCAA -3'。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因尸历-2尸紧密连锁的特异片段的获得 方法,其中,所述步骤(1)中的提取基因组DNA是指将1.5克叶片在液 氮中研磨成粉末,加入9ml 2。/oCTAB提取液,混匀65。C水浴1小时;从水 浴中取出离心管,加1/3体积5M醋酸钾,混匀冰浴20分钟;加入等体积 氯仿/异戊醇抽提两次;取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA;洗涤缓冲液 洗涤一次,吹干,加TE缓冲液溶解;加入RNase A使其终浓度达100 ii g/ml, 混匀37t:水浴l小时;用等体积氯仿/异戊醇抽提;取上清,加入l/2体 积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA; 70%乙醇洗涤沉淀,吹干, 加适量ddH20溶解DNA。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因尸历-2,紧密连锁的特异片段的获得 方法,其中,所述步骤(1)中的PCR反应条件是25ul的反应体系中含 有2. 5ullOX buffer, 2. 0 u 1 25mM MgCh, 2. 0 w 1 2. 5mM dNTP, 1U Taq DNA聚合酶,30ngSSR引物,50 ng模板DNA;反应程序为,94。C预变性 5min,然后94°C1 rain, 52°C1 min, 72°C2 min下循环35次,72。C延伸7min后保存在4X:条件下。
上述的一种与甜瓜白粉病抗性基因/^-i^紧密连锁的特异片段的获得 方法,其中,所述步骤(2)中的SSR产物的回收、克隆和测序是指用 Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的SSR特异片段,然后连接 到pGEM@-T Vector Easy载体上,将重组质粒DNA用Ecoi I进行酶切 处理,用SSR-PCR验证扩增产物,观察扩增出的片段是否与原来的目 的片段和酶切片段一致,并测序。
本发明应用简单重复序列(Simple Sequence R印eat, SSR)技术, 在甜瓜重组自交系(Recombinant Inbred Line, RIL)群体中采用混合分 组分析法(Bulked Segregating Analysis, BSA)筛选了与甜瓜白粉病抗 性基因户历-^^紧密连锁的SSR特异片段,并将SSR特异片段克隆测序获得 了特异扩增序列。
本发明的优点是本发明获得的SSR特异片段具有重复性好,标记稳 定可靠,便于统计等优点,其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明,以使公众对发 明内容有整体和充分的了解,而并非对本发明保护范围的限定。前述部分 已经充分公开了本发明可以实施的保护范围,因此凡依照本发明公开内容 进行的任何本领域公知的等同替换,均属于对本发明的侵犯。


图1为引物SSR509和510对抗感亲本、F,、抗感池DNA扩增结果图; 图2为引物SSR509对重组自交系群体的PCR扩增结果图; 图3为引物SSR510对重组自交系群体的PCR扩增结果图; 图4为引物SSR509对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图; 图5为引物SSR510对甜瓜种质资源的PCR扩增结果图。
具体实施例方式
实施例与甜瓜白粉病抗性基因尸历-i^紧密连锁的特异片段及其扩增 序列的获得
一、材料和方法 1. 1材料
供试材料亲本为日本类型甜瓜材料K7-1和典型的新疆哈密瓜株系
K7-2。两材料均由新疆农科院吴明珠院士提供。父本K7-1为日本高抗白 粉病材料,母本K7-2高感白粉病,为典型的新疆哈密瓜,果实糖度高, 肉质脆,货架期长,有特殊的芳香味。以二者为亲本进行杂交,从它们的 杂交后代F,材料中随机抽样自交,通过单粒传获得F^重组自交系构成RIL 群体,共106个株系,用于特异片段及序列研究。
为进一步验证获得的标记,还采用了本实验室特有的120份优良甜瓜 种质资源,其中13份抗病种质资源,107份感病种质资源。
1. 2研究方法
1.2.1基因组DNA的提取
参照Murry等(1980)的方法(Murray M, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J]. Nucl Acid Res, 1980, 8: 668-673.)加以改进后进行DNA提取。
将1. 5克叶片在液氮中研磨成粉末,加入9ml 2%CTAB提取液(2% CTAB, 1.4mMNaCl, lOOmM Tris-HC1 pH8. 0, 20mM EDTA pH8. 0, 1% PVP-40, 0.2% e-巯基乙醇),混匀65t:水浴l小时;从水浴中取出离心管,加l/3体积 5M醋酸钾,混匀,冰浴20分钟;加入等体积氯仿/异戊醇(24: 1)抽提 两次;取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA;洗涤缓冲液(76%乙醇,lOmM 乙酸铵)洗涤一次,吹干,加TE缓冲液(10raMTris-HC1, lmMEDTA, pH7.4)溶解;加入RNase A使其终浓度达100ug/ml,混匀37'C水浴1小时;用 等体积氯仿/异戊醇(24: 1)抽提;取上清,加入1/2体积7.5M醋酸铵 和2倍体积无水乙醇沉淀DNA; 70%乙醇洗涤沉淀,吹干,加适量ddH20溶 解纖。
DNA浓度用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201,日本)以OD260值 测定,并用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。 1.2.2 PCR扩增与产物的检测
25u 1的反应体系中含有2. 5u 1 10X buffer, 2. OiU 25mM MgCl2, 2. OiU 2. 5mM dNTP, 1U Taq DNA聚合酶,30 ng弓|物,50 ng模板DNA。 Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司。dNTP购自上海Sangon公 司。SSR引物由北京奥科生物公司合成。
反应程序为,94。C预变性5min,然后94。Clmin, 52。Clmin, 72。C2min 下循环35次,72。C延伸7min后保存在4'C条件下。PCR仪为美国Biorad 公司制造的PTC-100。
取扩增产物与载样缓冲液(98%甲酰胺,10 mM EDTA, 0. 25%溴酚兰, 0. 25%二甲苯青)各5 W混合,94C变性5 min,立即置于冰上冷却。每 个样品取5 W上样,采用6%聚丙烯酰胺凝胶、75 W恒功率电泳分离,至 二甲苯青指示剂跑到胶的2/3处结束电泳。银染显现结果并分析。
1. 2. 3特异扩增PCR产物与白粉病抗性基因的连锁关系
银染显现PCR扩增产物后,对电泳谱带进行分析。来自父本K7-1的 纯合带型记为"a",来自母本K7-2的纯合带型记为"b",模糊不清或 者丢失的带记为"-"。利用Joinmap3. 0软件分析特异扩增PCR产物与 白粉病抗性基因的连锁关系。
1.2.4特异扩增序列的获得确定PCR扩增产物与白粉病抗性基因存在紧密连锁关系后,用ddH20 将胶板冲洗干净,用刀片切取差异条带,浸泡在高盐缓冲液中(20%乙醇, 1MLiCl, 10mMTris) 24h,然后氯仿抽提,乙醇沉淀后吹干,溶于ddH20 中,取5Ml用作模板在与选择性扩增相同的PCR条件下重新扩增。产物在 1.5%的琼脂糖上检测,如果确定为目标带,采用博奥生物公司的凝胶回收 纯化试剂盒Gene-Clean对目的片段进行纯化。PCR产物与载体的连接采用 Promega公司的PGEM-T easy Vector系统。参照《分子克隆实验指南》中 的方法进行重组质粒的转化与筛选。利用天根生物公司的质粒小提试剂盒 提取重组质粒,采用酶切方法与PCR法对其进行检测。将经过PCR和酶切 检测为阳性克隆的质粒送于北京奥科生物公司进行测序并提供结果。
1.2.5父本、母本、Fi和重组自交系苗期抗病接种鉴定
1. 2. 5. 1白粉病菌源及接种菌源制备
从国家蔬菜工程技术研究中心四季青农场收集南瓜上的白粉病菌,采 用孢子悬浮液喷雾法接种于西葫芦幼苗上纯化繁殖后,用于白粉病的接种 鉴定。
用毛笔刷取西葫芦病叶叶片上的孢子置于无菌水的烧杯中,搅拌均匀 配制孢子悬浮液,血球计数板计数分生孢子数。接种浓度为2.0X1()5个孢
子/mL。
1.2. 5.2苗期抗病接种鉴定
父本、母本、F,和重组自交系F^的106个株系,各取20粒种子,设2 次重复,1次重复10株苗。种子用纱布包好,55'C温汤浸种消毒后,再浸 泡4h,置于28t:恒温培养箱中催芽18小时,播于装有灭菌营养土的72 孔穴盘中,生长于空调温室内,昼/夜温度为25 28。C/18 20。C。子叶展 平后,采用孢子粉喷雾法接种5". /"">&e3小种2F,接种12至15天充分发病后开始调查抗感反应。
1. 2. 5. 3苗期抗病接种鉴定的分级标准
共分6级。0级整株没有任何病斑;l级仅子叶有很少量病斑;2 级仅子叶有较多病斑或子叶有病斑,茎上有很少量病斑;3级子叶有 很多病斑,茎上有少量病斑;4级子叶和茎上布满病斑;5级植株死亡。
1.2. 5.4父本、母本、Fj口重组自交系苗期抗感表现型的确定标准 根据病情指数DI确定父本、母本、F和重组自交系的抗感表现型。 病情指数DI"S级别X株数)X100/ (总株数X6)。 病情指数大于40定为感病,小于40定为抗病。 二、结果与分析
2.1甜瓜白粉病抗性基因/^-i^遗传规律分析
对抗病亲本K7-1、感病亲本K7-2、 F,、重组自交系F^的106个株系进
行苗期抗病接种鉴定,按照白粉病病情分级标准调查每个株系的发病率并 计算病情指数。结果表明,K7-1、 K7-2和F,的病情指数分别是0. 00、 93. 03 和3.44,分别表现为抗病、感病、抗病,说明甜瓜K7-l对白粉病 5. /Wi^V^s生理小种2F的抗性是由显性基因控制。而重组自交系的抗病 鉴定结果表明106个株系有58个抗病株系和48个感病株系,分离比符合 1: 1的理论比例,卡平方检验x^0.94〈a2。我,二3.84,表明甜瓜K7-1对 白粉病S/w力'^V7M生理小种2F的抗性为一对基因控制。综合双亲、F 和重组自交系的106个株系的苗期抗病鉴定结果,甜瓜K7-l对白粉病 S. fuliginea生理小种2F的抗性受一对显性基因尸/z -2尸控制。
2. 2与甜瓜白粉病抗性基因/^-2,紧密连锁的特异片段 采用集团混合分析法获得与甜瓜白粉病抗性基因尸历-^尸紧密连锁的特异片段。
根据重组自交系苗期抗病鉴定结果,各取5份纯合的抗感株系DNA混
合构建抗感基因池。以抗病亲本K7-1、感病亲本K7-2、 F,和抗感基因池为 模板,对660对SSR引物组合进行PCR扩增,筛选出能在双亲和抗感基因 池之间产生明显差异条带的引物组合。660对SSR引物序列来自于目前已 经发表的论文(Danin-Poleg-2001, Genzalo et al. 2005, Joobeur T et al, 2004, Fazio et al. 2002 )和根据互连网中甜瓜EST信息库 (http:〃melon. bti. Cornell, edu) 自行设计。
集团混合分析结果显示,660对SSR引物中只有引物SSR509和SSR510 的抗感亲本扩增条带与抗感池的扩增谱带一致,如图1所示,图l为引物 SSR509和SSR510对抗感亲本、Fl、抗感池的PCR扩增结果。(M. 30-330bp marker; 1,6. K7-2; 2,7. K7-1; 3,8. F,; 4,9.抗病基因池;5, 10.感病 基因池)
所述SSR引物509上游引物序列为5, -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3,, 509下游引物序列为5, - CAAAAAGCATCAAAATGGTTG -3'。
所述SSR引物510上游引物序列为5, -TTTCACTTTTTCCCGCCG-3,, 510下游引物序列为5' - AATGGAAAAGGGAAGTGCAA -3'。
将抗病亲本K7-l利用引物SSR509和SSR510进行PCR扩增获得的抗 病特异扩增片段分别定名为SSR509-172和SSR510-98。将感病亲本K7-2 利用引物SSR509和SSR510进行PCR扩增获得的感病特异扩增片段分别定 名为SSR509-170和SSR510-104。
利用引物SSR509和SSR510分别对106个重组自交系的株系进行PCR 扩增。
引物SSR509的PCR扩增中,如图2所示,图2为引物SSR509对重组自交系群体的PCR扩增结果图(1: K7-1; 2: K7-2; 3-57: RIL株系)。58 个抗病株系中有56个株系只扩增出SSR509-172抗病特异片段,2个抗病 株系同时扩增出SSR509-172抗病特异片段和SSR509-170感病特异片段, &和FH两代苗期抗病接种鉴定结果显示这2个抗病株系为杂合株系,因此 PCR扩增结果与田间抗病鉴定结果一致。48个感病株系中有47个株系只 扩增出SSR509-170感病特异片段,1个株系扩增出SSR509-172抗病特异 片段,即106个重组自交系株系中只有1个交换株系。经Joinmap3.0软 件分析,抗病特异片段SSR509-172与甜瓜白粉病抗性基因尸"-i"尸的连锁 距离为lcm,呈现紧密连锁关系。
引物SSR510扩增中,如图3所示,图3引物SSR510对重组自交系群 体的PCR扩增结果图(1: K7-l; 2: K7-2; 3-50: RIL株系;)。58个抗病 株系中有55个株系只扩增出SSR510-98抗病特异片段,2个抗病株系同时 扩增出SSR510-98抗病特异片段和SSR510-104感病特异片段,F 和R两 代苗期抗病接种鉴定结果显示这2个抗病株系为杂合株系,1个抗病株系 只扩增出SSR510-104感病特异片段,表明该抗病株系为交换株系。48个 感病株系中有47个株系只扩增出SSR510-104感病特异片段,1个感病株 系扩增出SSR510-98抗病特异片段,说明此感病株系也为交换株系。因此, 106个重组自交系株系中共有2个交换株系。经Joinmap3.0软件分析,抗 病特异片段SSR510-98与甜瓜白粉病抗性基因尸历-2F的连锁距离为3cM, 呈现紧密连锁关系。
为进一步确认抗病特异片段SSR509-172、 SSR510-98与甜瓜白粉病抗 性基因/^-2F的连锁关系,利用本实验室的120份优良甜瓜种质资源材料 进行验证。田间抗病鉴定结果显示120份甜瓜种质资源材料中有13个抗 病品种和107个感病品种。SSR509的PCR扩增结果显示,如图4所示,图4为引物SSR 509对甜 瓜种质资源的PCR扩增结果图;13个抗病品种中有4个品种扩增出 SSR509-172抗病特异片段,其余品种扩增出的谱带在另一位置;107个感 病品种中有101个扩增出SSR509-170感病特异片段,与田间抗病鉴定结 果吻合率为87. 5%。
SSR510扩增结果显示,如图5所示,图5为引物SSR510对甜瓜种质 资源的PCR扩增结果图;13个抗病品种中有4个品种扩增出SSR510-98抗 病特异片段,107个感病品种中有83个扩增出SSR510-104感病特异片段, 与田间调查结果的吻合率达到72. 5%。
上述PCR扩增结果进一步证实了抗病特异片段SSR509-172和 SSR510-98、感病特异片段SSR509-170和SSR510-104与甜瓜白粉病抗性 基因尸历-2,的紧密连锁关系,准确性高,说明上述标记片段在鉴别抗、感 病品种时有非常高的利用价值。
2.4特异片段的测序结果
将抗病特异扩增片段SSR509-172和SSR510-98和感病特异扩增片段 SSR509-170和SSR510-104进行测序。4个测序片段的两端分别有引物 SSR509和SSR510的上下游结合位点,且片段的大小与依分子量标准估计 的基本吻合,证实了测序片段的正确性。利用SSR引物509扩增得到的抗、 感特异片段长度分别为172bp和170bp,只有2个碱基"CT"的插入。利 用SSR引物510扩增得到的抗、感特异片段长度分别为98bp和102bp,只 有4个碱基"CTCT"的缺失。序列表
<110> 北京市农林科学院
<120>与甜瓜白粉病抗性基因/^-i^紧密连锁的特异片段及其获得方法
<130〉
〈160〉 4
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1 〈211> 172 〈212〉 腿
<213〉 葫戶科黄瓜属(C"c"肌、L.) <400〉 1
ctggccccct cctaaactaa acacagacgt ctcagaactg cacgactttc gtgcaaaggc 60 tttcagcttg ctctctattg ctggggtctc tggcttctgc caggttctct ctctctctct 120 ctctctctct ctctctctta aaagttaaaa tcaaccattt tgatgctttt tg 172
〈210〉 2
〈211> 98
〈212〉 匿 〈213>人工序列
〈400〉 2<formula>formula see original document page 16</formula>
权利要求
1、一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段,其特征在于,其具有序列表中SEQ ID NO1~4所述的DNA序列。
2、 一种与甜瓜白粉病抗性基因v^j,紧密连锁的特异片段的获得方 法,其特征在于,所述方法包括如下步骤(1) 与甜瓜白粉病抗性基因/fe-2尸紧密连锁的特异片段的筛选提取 基因组DNA,使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应,对PCR产物进行 电泳分析;通过BSA法,寻找与甜瓜白粉病抗性基因/^-2,紧密连锁的特 异SSR片段,测定连锁距离并验证连锁关系;(2) 与甜瓜白粉病抗性基因/^-2,紧密连锁的特异扩增序列的获得 对SSR产物进行回收、克隆和测序,获得特异片段序列。
3、 根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因i^紧密连 锁的特异片段的获得方法,其特征在于,所述步骤(1)中SSR引物为SSR 引物509和SSR引物510;所述SSR引物509上游引物序列为5, -CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3,, 509下游引物序列为5, -CAAAAAGCATCAAAATGGTTG -3,。所述SSR引物510上游引物序列为:5, -TTTCACTTTTTCCCGCCG -3,, 510下游引物序列为5, -AATGGAAAAGGGAAGTGCAA -3,。
4、 根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因尸历-^尸紧密连 锁的特异片段的获得方法,其特征在于,所述步骤(1)中的提取基因组 DNA是指将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末,加入9ml2y。CTAB提取液,混 匀65'C水浴1小时;从水浴中取出离心管,加1/3体积5M醋酸钾,混匀 冰浴20分钟;加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次;取上清加入2/3体积异 丙醇沉淀DNA;洗涤缓冲液洗涤一次,吹干,加TE缓冲液溶解;加入RNaseA使其终浓度达100 y g/ml,混匀37"C水浴1小时;用等体积氯仿/异戊醇 抽提;取上清,加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA; 70%乙醇洗漆沉淀,吹干,加适量ddH20溶解DNA。
5、 根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因/^-2,紧密连 锁的特异片段的获得方法,其特征在于,所述步骤(1)中的PCR反应条 件是25u 1的反应体系中含有2. 1 10X buffer, 2. 0 u 1 25mMMgCl2, 2.0ul 2. 5mM dNTP, 1U Taq DNA聚合酶,30 ng SSR引物,50 ng模板 DNA;反应程序为,94X:预变性5min,然后94°C lmin, 52°C lmin, 72°C 2min下循环35次,72。C延伸7min后保存在4。C条件下。
6、 根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因尸历-i^紧密连 锁的特异片段的获得方法,其特征在于,所述步骤(2)中的SSR产物的 回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的 SSR特异片段,然后连接到pGEM⑥-T Vector Easy载体上,将重组质 粒DNA用进行酶切处理,用SSR-PCR验证扩增产物,观察扩 增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致,并测序。
全文摘要
本发明公开了一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段,属于生物技术领域,其具有序列表中SEQ ID NO1~4所述的DNA序列。本发明的优点是本发明获得的SSR特异片段具有重复性好,标记稳定可靠,便于统计等优点,其特异扩增序列亦是开发其它特异标记的基础,并且在鉴别抗、感病品种时有非常高的利用价值。
文档编号C12N15/29GK101440366SQ20071017802
公开日2009年5月27日 申请日期2007年11月23日 优先权日2007年11月23日
发明者宫国义, 张海英, 芳 苏, 勇 许, 郭绍贵 申请人:北京市农林科学院
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