专利名称：：一步三重rt-pcr快速检测百合三种病毒的方法一步三重RT-PCR快速检测百合三种病毒的方法
技术领域：
-本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及快速检测百合三种病毒的方法。技术背景百合三种病毒LMoV、LSV和CMV是造成百合经济减产的主要原因，快速检测是否带有所述病毒，以便及时采取对策，挽回经济损失是上上之策。利用生物技术检测病毒的方法包括l)酶联免疫吸附法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)。它是将抗原—抗体免疫反应和酶高效催化过程有机结合在固相载体表面完成反应的一项综合技术。2)反转录PCR技术(RT-PCR)和简并引物反转录PCR技术(IC-RT-PCR)。先将mRNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR，然后再利用其它检测方法(如电泳、核酸探针等)对经扩增的病毒核酸进行检测。3)基因芯片技术是将无数预先设计好的寡核苷酸、cDNA、基因组(Genomic)DNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交，通过荧光共聚焦显微镜扫描，利用计算机对每一个探针上的杂交信号作检测、分析，从而反映目的材料中大量基因表达图谱对样品的序列信息进行高效的解读和分析，大规模获取相关生物信息。上述方法中存在如下问题1)以血清学方法为基础的检测技术是在实际生产中应用最广泛，操作简便，可用于大量样品的检测，但是相对该方法需要制备抗血清，常出现假阴性的结果，检测灵敏度和准确性有待提高。2)现有(IC-)RT-PCR大多一次只能检测一种病毒，多重RT-PCR可以检测出三种百合主要病毒，但是，假阴性反应几率很高，更关键的是现有RT-PCR—般不能确定扩增出的条带是否是假阳性。已有的多重RT-PCR，是将cDNA第一链的合成(反转录)与多重PCR二个步骤分开，耗时较长。己有的其他植物病毒种类的一步法RT-PCR均只能一次检测一种病毒，而且大多数需要使用RNA提取试剂盒，或通过SephadexG-50-80微柱。费用高、过程复杂不能检测超低病毒含量样品，容易出现漏检。3)基因芯片技术为植物病毒的控制提供一条新的捷径，但是，目前检测百合病毒的芯片技术不够成熟，芯片制作成本非常高，尚不适宜实际检测需要。现有技术中还没有一次能检测上述三种病毒的方法。
发明内容针对上述的现有技术的缺陷，本发明提供一种检测方法，能一次同时检测出上述三种病毒，步骤少，效率高，结果精准可靠。一步三重RT-PCR快速检测百合三种病毒的方法，包括cDNA的合成与三重RT-PCR扩增步骤，其特征在于，所述三重RT-PCR扩增体系中含有下列三对引物CMV1:5'-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG，CMV2:5'-TCAGACTGGGAGCACTCCG;LSV1:5'-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG，LSV2:5'-TTTGTGTATCGATGATTTCGG;LMoV1:5，-GCAAATGAGACACTTAACGCT，LMoVl:5'-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG..所述RT-PCR扩增条件为30个循环，72'C延伸5min,最后于4'C结束。所述三重RT-PCR扩增体系中加入的是总RNA提取物，cDNA的合成与三重RT-PCR扩增体系是一步完成的。所述cDNA的合成条件为42。C下反转录30min，95°C4min，94。C20s，52°C30s，72。C40s，72。C5min，30个循环。该方法中还包括假阳性检测步骤，所述假阳性检测是将PCR产物回收、纯化、重组质粒、PCR鉴定、再序列比对确定。RT-PCR技术，由于PCR是对DNA的体外扩增，而植物病毒大部分为RNA，所以先将mRNA反转录为cDNA再以cDNA为模板进行PCR，然后再利用其他检测方法(如电泳、核酸探针等)对经扩增的病毒核酸进行检测。多重RT-PCR是在一个单一反应体系中加入一对以上的特异引物对，从而同时扩增多个序列的反应过程。本发明针对CMV、LMoV和LSV三种病毒外壳蛋白CP基因保守序列设计了三对引物，利用该方法扩增不同的目的片段。引物序列分别是CMV:上游引物5，-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG及下游引物5'-TCAGACTGGGAGCACTCCG;LMoV:上游引物5，-GCAAATGAGACACTTAACGCT及下游引物5'-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG;LSV:上游引物5'-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG及下游引物5'-TTTGTGTATCGATGATTTCGG。由于本发明所选引物特异性非常强，本发明所提取的植物总RNA不需要先转录成cDNA再加入到RT-PCR扩增体系中，cDNA第一链的合成(反转录)与多重PCR—步完成，不需要过柱，一次能检测三种病毒，减少步骤，提高效率；通过特异序列比对验证扩增目标的真实性，以确保检验的准确性和可靠性，并在实验成本上远低于现在实验阶段的百合基因芯片技术。本发明方法具有高特异性、高灵敏度，高效率、低成本的特点，适合较大量样品的分析。图l:多重RT-PCR特异性实验结果M:核酸分子量标准；1，2,3是含单种病毒的样品(1:CMV;2:LMoV;3:LSV);4，是含有两种病毒的样品(4:CMV+LSV;5:LMoV+LSV);6含有三种病毒的样品(CMV+LMoV+LSV);7:健康植株叶片。图2:RNA模板不同稀释倍数的多重RT-PCR扩增M:核酸分子量标准；RNA模板稀释倍数1:101倍，2:102倍，3:103倍，4:104倍，5:105倍，6:106倍，7:107倍，8:108倍，9:109倍。具体实施方式实施例1针对CMV、LMoV和LSV三种病毒外壳蛋白CP基因保守序列设计了三对引物，利用该方法扩增不同的目的片段。引物序列分别是-CMV:上游引物5，-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG及下游引物5'-TCAGACTGGGAGCACTCCG;LMoV:上游引物5，-GCAAATGAGACACTTAACGCT及下游引物5'-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG;LSV:上游引物5，-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG及下游引物5，-TTTGTGTATCGATGATTTCGG。1.植物总RNA提取与cDNA第一链的合成称取新鲜病叶50mg,在1.5mL的印pendorf管中，加入少量液氮，用干净灭菌的玻璃棒迅速磨碎，加500uL病毒抽提液0.5MpH8.0的Tris-HCI，2%PVP-40，1%PEG6000，0.8%NaCI和0.05%Tween20。继续研磨混匀，从中取10uL用抽提液再稀释50~100倍后即为工作液(RT-PCR的模板)。2.多重RT-PCR扩增1)反应体系.-总RNA提取物5.0pLOligodTPrimer(0.5ng/pL)0.5|xLSSII反转录酶(20U4iL)0第Rnaseinhibitor(40U4iL)0単TaqPCRbuffer(内含1.5画ol/LMgCl2)2.5pLdNTP(200Mmol/L)Taq酶(5U/fiL)O抓引物CMV,/CMV2(5pmo1)0.5nL引物LSV,/LSV2(5pmoD引物LMoV,/LMoV2(5pmo1)0.5nL0取13^L25pLPCR程序PCR程序42°C反转录30min，95'C4min，94°C20s，52°C30s，72。C40s，72°C5min，30个循环。反应在PCR扩增仪(PTC-100programmablethermalcontroller,MJ.reseachInc)上进行30个循环，72。C延伸5min，最后于4。C结束。2)反应产物的电泳检测扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5XTBE，电压100V，PCR产物上样量为6pL,用凝胶成像仪GelDoc1000凝胶分析仪(Bio-Rad)扫描并产生TIFF图象，经图象分析软件(QUANTYONE)进行分析。(见图1)从图1中可以看出，本发明方法能一次性检测出百合的三种主要病毒(CMV、LMoV、LSV)，且扩增产物特异性强，条带清晰易区分和切割。3)多重RT-PCR检测的灵敏度将cDNA模板依次按1:10，102，103……109倍稀释，进行百合三种病毒(CMV，LMoV，LSV)的多重RT-PCR扩增。(见图2)结论该方法可以从稀释至10"^l(y5倍的cDNA模板中检测到三种病毒，其灵敏度较现常用的ELISA方法提高了103~104倍。3.PCR产物的回收、纯化取PCR产物6(mL，进行1%琼脂糖凝胶电泳，当各特异条带充分分离时，在紫外灯下切胶纯化。PCR产物纯化步骤按照TaKaRaAgaroseGelDNApurificationKit试剂盒的操作说明进行具体操作如下1)用干净的刀片将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶上切至EP管，尽量切除多余凝胶；2)切碎胶块，称量胶块重量，计算胶块体积。向胶块中加入胶块融化液DR-1Buffer。均匀混合后75t:加热融化胶块。不断温和的上下翻转离心管，使胶块充分融化；3)向上述胶块融化液中加入DR-1Buffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer,均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇；4)将上述操作溶液转移至SpinColumn,12,000rpm离心1分钟，弃滤液；5)将500ml的RinseA加入SpinColumn,12,000rpm离心30秒，弃滤液；6)将700ml的RinseB加入SpinColumn,12,000rpm离心30秒，弃滤液；7)重复操作步骤6);8)将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在膜中央处加入25pL的灭菌蒸馏水(60°C)室温静置1分钟；9)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。取lpLPCR纯化产物与LoadingBuffer混勾，1%琼脂糖凝胶电泳检测。4.DNA片断的连接使用Promega公司pGEM-TeasyVector载体，在0.5mL离心管中依次加入以下体系，轻轻混匀，低速离心后于4'C连接过夜。2XLigationSolutionI5.OMLpGEM-T载体1.0HLPCR纯化产物3.(HCTVDNA连接酶(5U/pL)l.OPLTotal10叱5.重组质粒的转化将连接产物与Topl0感受态细胞(Tiangen)混合，取15CmL转化液涂LB琼脂平板。具体操作如下1)将5PL连接产物加入含有200PL感受态细胞，温和混匀，置冰上30min。2)42"热激90sec，迅速放回冰中，细胞冷却l-2min。3)加入37'C预热的800nL的LB液体培养基(未加Amp)，250rpm，37'C振荡培养60min。4)取出菌液，4'C，3000rpm离心5min。取上清50pL，加入30pLPTG(200mg/ml)和30pLX-Gal(20mg/ml)充分混合。5)将混合液均匀涂于含有Amp(0.1%)的LB琼脂平板，室温放置20-30min。待溶液被吸收后，倒置培养皿，37。C培养12-16h。6)设阳性和阴性对照。每次转化均设置阳性(己知质粒)和阴性(不加插人DNA的质粒载体自身连接反应物)对照。6.重组克隆的PCR鉴定挑取LB平板上的白色菌落，在盛有30WL无菌ddH20的Eppendorf管中振荡，制成悬浮菌液。95-C处理5min后离心，取5PL上清液作为模板进行PCR扩增。对阳性克隆应有目的片段被特异性扩增出来。PCR扩增反应体系如下:上清2，L10XPCRbuffer2.0叱dNTP(200pmol/L)1.6ML引物F(5pmo1)0.5叱引物R(5pmol)Taq酶(25UML)0.2l^LddH2013.2MLTotalOWL经PCR鉴定，挑取阳性菌落于3mLLB液体培养基中，37。C振荡培养。约12-16h后，取菌液0.5mL加入等体积甘油，混匀后-70'C保存，送测序。7.序列比对将所测序列与附录中的序列比对，以精准确定所含病毒种类，同时排除假阳性情况。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>841AAAASEQIDN03:CMV，序列号EF158110。i61121181241301361421481541601CTTCATGTTGACGTCGAGCACCAACGTATTCCCACATCTGGAGTGCTCCCAGTCTGASEQIDN04:CMV上游引物。5'-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG，SEQIDN05:CMV下游引物。5，-TCAGACTGGGAGCACTCCG;SEQIDN06:LSV上游引物。5，-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG，SEQIDN07:LSV下游引物。5，-TTTGTGTATCGATGATTTCGG;SEQIDN08:LMoV上游引物。5，-GCAAATGAGACACTTAACGCT，SEQIDN09:LMoV下游引物。5'-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG..权利要求1、一步三重RT-PCR快速检测百合三种病毒的方法，包括cDNA的合成与三重RT-PCR扩增步骤，其特征在于，所述三重RT-PCR扩增体系中含有下列三对引物CMV15’-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG，CMV25’-TCAGACTGGGAGCACTCCG；LSV15’-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG，LSV25’-TTTGTGTATCGATGATTTCGG；LMoV15’-GCAAATGAGACACTTAACGCT，LMoV15’-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG..2、根据权利要求1所述的方法，所述RT-PCR扩增条件为30个循环，72'C延伸5min，最后于4'C结束。3、根据权利要求1所述的方法，所述RT-PCR扩增体系中加入的是总RNA提取物，cDNA的合成与三重RT-PCR扩增体系是一步完成的。4、根据权利要求3所述的方法，所述cDNA的合成条件为42'C下反转录30ipin，95。C4min，94°C20s，52°C30s，72°C40s，72°C5min，30个循环。5、根据权利要求1所述的方法，所述该方法中还包括假阳性检测步骤。6、根据权利要求5所述的方法，所述假阳性检测是将PCR产物回收、纯化、重组质粒、PCR鉴定、再经序列比对确定。全文摘要本发明涉及“一步三重RT-PCR快速检测百合三种病毒的方法”，属病毒检测领域。一步三重RT-PCR快速检测百合三种病毒的方法，所述三重RT-PCR扩增体系中含有下列三对引物CMV1/CMV2，LSV1/LSV2，LMoV1/LMoV1。本发明所选引物特异性非常强，所提取的植物总RNA不需要先转录成cDNA，cDNA第一链的合成(反转录)与多重PCR一步完成，且一次能检测三种病毒，减少步骤，提高效率；通过特异序列比对验证扩增目标的真实性，以确保检验的准确性和可靠性。本发明方法具有高特异性、高灵敏度，高效率、低成本的特点，适合较大量样品的分析。文档编号C12Q1/70GK101220396SQ20071017869公开日2008年7月16日申请日期2007年12月4日优先权日2007年12月4日发明者博刘,春刘,徐榕雪,军明,汤庚国,王晓武,鼎穆申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所