专利名称：五种十字花科蔬菜提取物复合制剂制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物提取物，具体地说，本发明是一种五种十字花科 蔬菜提取制剂，该提取制剂的制备方法及该制剂的多种应用。
背景技术：
目前，随着社会进步和经济发展，人类对自身的健康日益关注。 全球居民的健康消费逐年攀升，对营养保健品的需求十分旺盛。在按
国际标准划分的15类国际化产业中，医药保健是世界贸易增长最快 的五个行业之一保健食品的销售额每年以13%的速度增长。据国内贸 易局公布的全国食品日用品监测最新结果，保健滋补品的销量在连锁 超市中已名列第二位。这表明，随着生活水平的日益提高，为健康、 为长寿而"食"已成为人们生活中的重要内容。
随着经济的发展以及人民生活水平的提高，百姓对食物的需求基 本上已由"吃得饱"转变为"吃得好"。国内贸易局所属的中华全国 商业信息中心在对全国连锁店经营的全部商品销售额的调查中发现， 30种居民日常消费的主要品种销售额占总销售额的34.9 7%，排在 前5位的品种依次为速冻食品、保健滋补品、休闲食品、饼干和食 用油，而且与上次调整结果相比，在连锁店销售总额增加的产品中， 保健滋补品名列第一。
据国内贸易局公布的全国食品日用品监测最新结果，保健滋补品 的销量在连锁超市中已名列第二位。这表明，随着生活水平的日益提 高，为健康、为长寿而"食"已成为人们生活中的重要内容。
据国外资料显示，全球保健食品己占整个食品销售的5%，达上
千亿美元，而且每年都以相当速度增长。美国目前的保健食品销售额 达750亿美元，占食品销售额的1/3;日本近两年的保健品销售额为
15000亿日元，年产保健品3000多种；欧洲的保健食品也有2000余 种，销售额以每年17%的速度递增。据调査，欧美国家的消费者平均 用于保健品方面的花费占其总支出的2%以上，而中国只占0.07%， 具有极大的发展空间。
目前市场上已经出现以蔬菜为主要原料，具有一定基础理论研究 的产品，如番茄红素、大蒜提取物。
大蒜提取物的有效成分是大蒜素；产品规格1% 2% 4%;检 测方法HPLC;大蒜素具有免疫调节、抗氧化、调解血脂等作用。4 %含量的大蒜提取物市场价格为1200元/公斤，国内年产量超过100 吨，大部分出口，产地集中在山东等地。原料主要用于保健食品，保 健功能集中在调节免疫、调节血脂、抗氧化等功能。
番茄红素是一种类胡萝卜素，番茄红素具有很强的抗氧化作用， 是目前广受国内外市场欢迎的抗氧化防衰老保健品。番茄红素含量 为5% 40%的粉状天然番茄红素。4-6%的番茄红素原料价格在 2500-3000元/kg左右。而高纯度的蕃茄红素更是难以满足市场的需 求。番茄红素的生产工艺方法是提取法，该法在世界上目前使用最广 泛，但其耗费成本大，产量低，难以生产高纯度番茄红素，每公斤含 量5%的番茄红素其生产成本就达1000 1500元。而且还受到季节和 地域资源的限制。目前具有中型生产能力的厂家年生产量仅为2吨， 厂家也都集中在新疆一带。全世界番茄及番茄制品的主要产地集中在 美国、意大利、西班牙、希腊、智利和中国这几个国家之中。而中国 番茄加工总装备能力和产量90%都在新疆，新疆番茄日处理能力达
到5.5万吨以上。年产量约70吨左右。做为蔬菜提取物，番茄红素 是最为成功的一个产品。原料主要用于生产保健食品，截至目前国家
食品药品监督管理局批准以番茄红素的产共计有175个品种，其只要
功能集中在抗氧化和免疫调节。
大蒜提取物和番茄红素都是单一成分，作为以单一成为原料的产 品要实现效果必须添加量增加，势必导致成本上升，副作用增大。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提出了一种多种十字花科蔬菜复合提 取制剂，并提出了该提取制剂的制备方法和多种应用。
本发明所采用的具体技术方案是
一种由异硫氰酸酯类、吲哚类、硫酮类化合物组成的组合物，由 多种十字花科蔬菜的组合物中提取。所述的十字花科蔬菜的组合物是 花椰菜、花茎菜、甘兰、大白菜和球茎甘兰的组合。
十字花科蔬菜的组合物中，各十字花科蔬菜优选采用相等的重 量。S卩花椰菜、花茎菜、甘兰、大白菜和球茎甘兰的重量比是
1:1:1:2:1。
上述的组合物的制备方法，其特征在于
A. 将各十字花科蔬菜清洗后以压榨机打浆，获得叶蛋白浆液； 将叶蛋白浆液过滤后再进行打浆；
B. 离心步骤A所得的液体混合放置真空离心机，调制4000 转/分钟，温度为20度，时间为20分钟，收集沉淀物；
C. 真空干燥将收集沉淀物放置干燥箱，温度35'C，干燥时间 15 16小时后即得。本发明是利用"多种十字花科蔬菜"进行有效成分提取，十字花 科蔬菜包括花椰菜、花茎甘蓝、球茎甘蓝、大白菜、结球甘蓝。这些 蔬菜中含有多种微量元素、膳食纤维、胡萝卜素、植物类黄酮等多种 化合物。利用现代萃取技术分离浓缩方式，发明人从多种十字花科蔬 菜中萃取、分离、提取异硫氰酸酯类、吲哚类、硫酮类化合物。发明
人为了说明的方便，把这三种物质的英文縮写简称"提取物"。经现 代科学研究这些物质具有明显的抗氧化、调节免疫和预防肿瘤的作 用。本发明根据植物化学，从植物中提取有效成分，明确有效成分作 用机理，经过试验验证并进行了临床前期所需的药物代谢动力学试 验、毒理学试验、功能学试验，稳定性良好、无毒副作用、功能明显， 具有安全性、可靠性、有效性、质量可控性，并且符合保健食品管理 办法，作为一种新型植物化学功效原料，可作为保健食原料，也可以 作为药物进行深度开发，具有良好的市场发展前景和技术扩展空间。 十字花科内的蔬菜包括花椰菜、花茎甘蓝、大白菜、甘蓝和球茎 甘蓝的球茎或汤菜高含很多化合物包括异硫氰酸盐、吲哚类、二硫代 硫醇类化合物、黄酮类化合物、酚类及蛋白酶抑制物等，发明人分别 对这些化合物进行了细胞和动物实验。结果表明，这些化合物都有增 强细胞免疫功能、增强巨噬细胞的吞噬能力、增强体液免疫能力、促
进淋巴细胞因子增强淋巴细胞DNA和DNA多聚酶的活力。据统计， 在饮食中多食十字花蔬菜的人疾病的发生率比没有食用或少食用者 要少的多，这一现象在试验动物中更加明确。
提取物能明显增强调节能力，促进胸腺、脾脏等免疫器官的生长 和血清蛋白的合成。试验证明，异硫氰酸盐所致小鼠迟发性超敏反应 增强；小鼠血清半数溶血值显著增高；小鼠廓清试验和小鼠单核-巨
噬细胞吞噬指数显著高于对照组。
提取物中富含许多种抗氧化物和提高免疫调节能力。采用生物技 术分离和浓縮方式，从五种十字花科蔬菜品种中通过分离、萃取、提 纯、分析分离和浓縮过程制取高含二硫代硫酮类，吲哚类，异硫氰酸 盐类化合物的提取制剂，其中代硫酮类，吲哚类，异硫氰酸盐类化合 物具有良好的抑制肿瘤的作用，除此之外提取物进行了动物抗氧化酶 活力试验、动物生存试验、细胞免疫功能试验、体液免疫功能试验、 巨噬细胞功能试验。结果试验表明，过氧化脂质和抗氧化酶均为阳性， 可以证明受试物具有抗氧化作用，并提示具有延缓衰老的功能；在细 胞免疫功能试验、体液免疫功能试验、巨噬细胞功能试验结果中，功 能试验结果均为阳性，即可判定该试验具有免疫调节作用。
5. 1.提取物的生物活性测定
试验检验及检验试剂和设备要求均按照国家药品管理检验规 定实施并制定。
5. 1. 1.谷光苷肽活性测定
谷光苷肽(GSH，巯基)含量是根据分光光度计测定法测定。细 胞被均浆大碎后悬浮在0.1M磷酸缓冲液包含0.005M EDTA中 (PH8.0)，离心10000转30分钟(4C)。上清夜用来测定谷光苷肽 含量。蛋白质含量标准测定是根据(BRADFORD)方法(BIO RAD)。 5. 1. 2.谷光苷肽转移酶的活性测定
谷光苷肽转移酶的活性测定是根据分光光度计法。以lMml-氯 甲烷-2， 4-二硝基苯(CDNB)作为低物，lmM谷胱苷肽作为反应物， 测定形成谷胱苷肽与CDNB轭合物的比率(结果见表一)。 表一 谷胱甘肽，谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性测定
种 还原状谷胱甘肽谷胱甘肽还原酶谷胱甘肽-S-转移酶
(nmol/mg)(umol. min/mg)(umol/min/mg)
对照 花椰菜 花茎甘兰 甘兰(圆白菜) 大白菜 球茎甘兰 五种混合物1: l 24. 98+-0. 47 8. 54+-0.61 9. 82+-0. 59 8. 05+-0. 37 7. 98+-0. 42 9. 35+-0. 73 10.35+-0.3952. 8+-6. 4 103. 2+-7. 5 110.2+-8.3 101. 9+-5. 9 98. 3+-6. 4 107. 4+-8. 7 111. 3+-9. 422. 9+-3. 7 48. 4+-4. 4 50. 4+-4. 2 49. 3+-3.9 44. 7+-5. 3 47. 2+-6. 1 49. 8十-5. 3
5. 1. 3.苯还原酶的测定(根据二种生物和生化方法测定酶的 活性)
生化测定苯还原酶的活性测定是根据ERNSTER方法，在电子 受体2， 6-二氯靛酚(DCPIP)和牛血清蛋白条件下，用分光光度计 测定NADPH的氧化量。或者NADH还原2， 6 二氯靛酚的量。活性 单位以nmol/min/mg蛋白为单位，减去抑制物双香豆素的读数，结
果见表一。
细胞方法测定。利用小鼠肝瘤细胞作为诱导对象。根据其植物提 取物对诱导生长在培养板中的细胞的苯还原酶的能力来测定。根据 LONG等人的方法。诱导活性单位定义 一定数量的细胞(10000) 在150微升培养基内可提高二期减毒酶(苯还原酶)活性一倍的诱导 物量称为一活性单位。
表二 提取物诱导苯还原酶活性的测定
对照*
1. 23
740
样品
诱导苯还原酶单位
菜)
球茎甘兰 五种混合物(1:1 2)
细胞学方法(单位/克) *105 2. 37 3.95 2. 15
2. 82
3. 10
4. 32
生物化学方法(nmol/min/mg 蛋白) 1350 4200 1210 1900 2100 3460
菜菜白菜
椰茎圆白
花花c大
兰
甘
*对照采用非十字花科蔬菜的混合物* 综上所述实验表明
1) 、生物活性测定结果表明(见表一和表二)，十字花科蔬菜具 有比对照(非十字花科蔬菜)高得多谷胱苷肽，谷胱苷肽还原酶和转 移酶量。谷胱苷肽是细胞内最重要的非蛋白硫醇，其担当了保护细胞 免受自由基、氧化剂、药物及外来化学物质的电中间体侵犯。所以提 高谷胱苷肽含量就可以提高细胞防癌能力。
2) 、与对照相比每种十字花科蔬菜可提高诱导苯还原酶的活性
3.5-6.5倍。如果把五种十字花科蔬菜按照l:l比例混合后使用，诱导 活性可提高6.8倍因为各种蔬菜中之化合物种类和含量均不同。在按 照科学的比例混合后制成提取物后诱导活性提高近10倍，显然是增 加了化合物之间的协同作用，同时可以大大减少使用的量，减少副作用。
5. 2.提取物防癌效应测试
主要技术与性能指标
项目的主要技术指标
提取物中谷光苷肽含量
提取物中所含谷光苷肽-S-转移酶的活性
提取物中所含谷光苷肽还原酶活性
提取物中所含苯还原酶的活性
提取物安全性(Ic50)
提取物防癌细胞水平效应
提取物防癌动物水平效应
5. 2. 1.提取物防癌效应的细胞水平测试
利用人体及动物细胞作为防癌的效应实验，结果(见表三)。结果表明提取物在低浓度时(50毫克/毫升)可以部分抑制癌变，当高
于500毫克/毫升以上，其抑制性大大提高，可以达到85%-100%，提
取物对烟草浓縮物所引起的癌变有明显的抑制作用。
表三提取物对烟草浓縮物NNK所引起的大鼠细胞癌变的抑制
_处理及使用浓度_细胞癌变数
盐水aoo微升/毫升) 5
提取物(100毫克/毫升) 0 NNK (5毫克/毫升) 21 提取物(50毫克/毫升)+NNK (5毫克/毫升) 11 提取物(500毫克/毫升)+NNK (5毫克/毫升) 5
提取物(1000毫克/毫升)+NNK (5毫克/毫升)_1
^U勿(5000毫克/毫升)+NNK (5毫克/毫升) 5
5. 2. 2.提取物动物体内安全性测试
提取物毒性测试用MTT测试方法确定提取物对人体HT29细胞 的Ic50是8.4克/107的，动物口服一次毒性测试结果表明小鼠大约在 35克/公斤，大鼠在57克/公斤，家兔在20克/公斤，狗在28克/公斤 范围见表四。实验表明，在有效防癌作用的计量范围(动物实验在l 克/公斤)并没有任何细胞杀伤和其他副作用。提取物是一种非常安 全的自然半合成防癌制剂。
提取物对细胞和动物体的毒性测定
品种数量半死浓度 (LD50)
人体HT29细胞1078. 4克/107
小鼠2335. 1克/公斤
大鼠1956. 7克/公斤
家兔519. 4克/公斤
狗328. 3克/公斤
综上所述实验表明
1)、生物活性测定结果表明(见表一和表二)，十字花科蔬菜具 有比对照(非十字花科蔬菜)高得多谷胱苷肽，谷胱苷肽还原酶和转 移酶量。谷胱苷肽是细胞内最重要的非蛋白硫醇，其担当了保护细胞 免受自由基、氧化剂、药物及外来化学物质的电中间体侵犯。所以提 高谷胱苷肽含量就可以提高细胞防癌能力。
2)、与对照相比每种十字花科蔬菜可提高诱导苯还原酶的活性
3.5-6.5倍。如果把五种十字花科蔬菜按照1:1比例混合后使用，诱导 活性可提高6.8倍因为各种蔬菜中之化合物种类和含量均不同。在按 照科学的比例混合后制成提取物后诱导活性提高近10倍，显然是增 加了化合物之间的协同作用，同时可以大大减少使用的量，减少副作 用。
具体实施方式
实施例1
1. 选料选择无腐烂、无挤压破损，去除根叶。
2. 清洗清洗、沥水，称重(3200g)，花椰菜、花茎菜、甘兰、 大白菜和球茎甘兰各640克。
3. 打浆加水(蒸馏水或纯净水)4500ml，粉碎，打浆(时间
根据颗粒大小程度掌握，使其完全溶解于水中)。叶蛋白主要由青绿 植物茎、叶中的细胞内呈溶解状态的细胞质蛋白和叶绿体内的基质蛋 白组成，存在于细胞壁内。因此，要获得叶蛋白，必须采取粉碎或打 浆的办法破坏细胞壁。试验证明，粉碎得越细，叶蛋白的提取率越高。 一般用锤式打浆机或粉碎机来进行打浆。通过压榨机挤压出绿色汁 液，生产中有时将粉碎与压搾在一机内完成。为把汁液从草渣中充分 榨取出来，压榨前可加入5% 10%的水分进行稀释后挤压，或先直接 压榨，然后加入适当水分搅拌后，再进行第二次压榨。目前小型加工 机具是甘蔗压榨机，大量生产则采用螺旋压榨机进行。
4. 过滤两层纱布过滤脱水，液体残渣分离。液体5500ml， PH7.0，
呈绿色，浓烈蔬菜汁味道。液体待用。
5. 打浆将分离残渣加水4500ml，重复搅拌打浆，时间酌情。 用4层纱布沥出液体，液体量4500ml。
6. 离心两次液体混合放置真空离心机，调制4000转/分钟， 温度为20度，时间为20分钟。收集沉淀物(80ml，水分约30%) 待用。保留上清液进行检测。
7. 真空干燥将收集沉淀物放置干燥箱，温度35t:。观察干 燥程度，致完全干燥，时间约15小时。物品为墨绿色。粉碎(0.1 lmm)，过筛(100 120目)。
以上对本发明所提供的五种十字花科蔬菜复合提取制剂制备及 其应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实 施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方 法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的 思想，在具体实施方式
及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本 说明书内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1.一种由异硫氰酸酯类、吲哚类、硫酮类化合物组成的组合物，其特征在于由五种十字花科蔬菜中提取。
2. 根据权利要求1所述的由异硫氰酸酯类、吲哚类、硫酮类化 合物组成的组合物，其特征在于所述的十字花科蔬菜的组合物是花 椰菜、花茎菜、甘兰、大白菜和球茎甘兰的组合。
3. 根据权利要求1或2所述的由异硫氰酸酯类、吲哚类、硫酮类化合物组成的组合物，其特征在于所述的十字花科蔬菜的组合物 中，各十字花科蔬菜采用相等的重量。
4. 权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于A. 将清洗后以压榨机打浆，温水浴由3(TC加热至5(TC，获得叶 蛋白浆液；将叶蛋白浆液过滤后再进行打浆；B. 离心步骤A所得的液体混合放置真空离心机，调制4000 转/分钟，温度为20度，时间为20分钟，收集沉淀物；C. 低温真空浓縮干燥将收集沉淀物放置低温真空浓缩干燥箱， 温度0 4。C，干燥时间15 16小时后即得。
5. 权利要求1所述的组合物在制备抑制癌变的药物中的用途。
6. 权利要求1所述的组合物在制备免疫调节的药物中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种五种十字花科蔬菜提取物复合制剂制备方法和应用。该复合提取制剂由多种十字花科蔬菜的组合物中提取，这些十字花科蔬菜的组合物是花椰菜、花茎菜、甘兰、大白菜和球茎甘兰的组合。本发明还公开了组合物的提取方法。本发明所获得的制剂组合物能明显增强免疫调节能力，延缓衰老、抑制癌变，并且降低每种有效成份单独使用所带来的毒性作用，使提取物复合制剂更安全。
文档编号A23L1/28GK101181053SQ200710179769
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者艳 朱, 鑫 金 申请人:北京信志同创科技有限公司