专利名称：一种基因免疫制备人类Ⅰ型胸苷激酶单克隆抗体的新方法
技术领域：
本发明涉及一种基因免疫制备人类I型胸苷激酶单克隆抗体的方法，既是采用基因工程 和分子免疫学技术，通过对人类I型胸苷激酶基因的克隆和真核分泌型载体的重组构建所实 施的一种基因免疫制备人类I型胸苷激酶单克隆抗体的新方法。该方法所制备的单克隆抗体 应属于基因工程类产品。
背景技术：
关于人胸腺嘧啶脱氧核苷激酶I型(hTKl)的技术背景hTKl，其中文名称是人胸腺嘧啶 脱氧核苷激酶I型，而中文简称则是人胸苷激酶I型；它的英文名称是Human thymidine kinase,而英文简称则是hTKl;它的酶学中文命名是三磷酸腺苷或腺苷三磷酸胸苷5-磷酸 转移酶，EC. 2. 7. 1. 21，激酶，而它的酶学英文命名则为ATP:thymidine
5-phosphotransferase, EC. 2. 7. 1.21。早在上个世纪就有学者指出，DNA在合成之前，胸腺 嘧啶脱氧核苷(TdR)被摄入细胞并在转化成TMP时必须经过磷酸化激酶的催化。事实上，通过 从真核和原核生物分离和部分纯化所得到的TK的酶学实验中也确认了磷酸化反应过程必须有 TK酶的催化。人细胞中的hTK主要以两种同工酶的形式存在，即hTKl和hTK2。 hTKl主要存在 于细胞质中，而hTK2则主要存在于亚细胞结构的线粒体中。由于其中一种同工酶大量存在于 胚胎组织，也有学者分别称它们为胚胎TK (Fetal TK)和成人TK (Adult TK)。有研究发现，胚 胎TK是与细胞的分裂相关，存在于细胞质中，称之为hTKl;而成人TK存在于线粒体中，它 的表达与细胞周期无关，又称之为hTK2。或者将hTKl称为细胞质胸苷激酶，hTK2称为线粒体 胸苷激酶。通常，hTKl基因定位在于染色体17q23. 2-q25. 3，靠近于半乳糖激酶；而hTK2基因则 定位于染色体16q22-q23. 1。关于hTKl的结构，在上个世纪80年代就有学者完成了人TK1基因 编码区域的cDNA分子克隆，并且完成了其序列分析。研究表明，从人宫颈癌(HeLa)提取 hTKl，其单体的转录编码为分子量2. 4万并具高度保守区域的核苷激酶，hTKl全酶是分子量为 96000道尔顿的四聚体，等电点聚焦免疫电泳测得其等电点为8. 3-8. 5。 hTKl的四聚体中每一 单体a螺旋/e折叠区域组成与ATP酶家系类似，有一p-环是hTKl酶活性调节区域，即底物反
应区域。四聚体中e折叠区域有一锌原子与e折叠区域连接。在这e -丝状带折叠的底部，
干链变宽成为一个套索闭环，是dTTP负责TKl活性反馈抑制调节的的区域，但TK1这套索环结 构是不同于其它脱氧核苷酸激酶。hTKl是存在于机体中的重要激酶之一，其主要生理和生化
作用是它作为一种胸腺嘧啶脱氧核苷代谢及补救途径的激酶，在三磷酸腺苷或腺苷三磷酸 (ATP)作为供体和二价镁离子(Mg2+)参与的条件下，迅速催化脱氧胸苷(thymidine, Thd)转变 为一腺胸苷酸(TMP)。因此，hTKl是与细胞增殖、分化和细胞周期密切相关的激酶，也被认 为是机体合成DNA的关键酶之一。然而，hTKl酶并不是机体必需的一种激酶提供体内细胞 DNA合成所需要的前体物dTMP，但与体内合成途径比较，TKl酶合成dTMP是直接采用细胞中核 甘酸再循环方式，在增殖细胞和肿瘤细胞中，具有活性催化的功能的四聚体细胞质胸苷激酶 (TK1)。正如前叙，TKl的催化反应过程是在ATP作为供体和二价镁离子(Mg^)参与的条件下 ，催化脱氧胸苷(Thd)生成一腺胸苷酸(TMP)，这种磷酸化方式是唯一的通途引入Thd到DNA合 成代谢中，又被称之为一种嘧啶补救合成的DNA的关键酶和S-期特殊酶。hTK作为一种激酶是 胸苷参与DNA合成的关键酶，它能可逆性催化胸腺嘧啶脱氧核苷与磷酸脱氧核苷之间的转化， 它能真实而客观地反映着细胞的增殖状况，而其中与细胞增殖关系最为密切相关的是hTKl 。 正是由于hTKl与细胞分裂密切相关，在细胞分裂G1期含量较低，到S期后逐渐升高，至G2期达到 最高，因此，编码hTKl的mRNA及其所表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。可以说， TK1水平的高低与DNA在细胞周期的S期DNA合成速度密切相关。 一般情况下，所观察到正常增 殖细胞TK1的水平在细胞周期的G1和S期交界处开始升高，随着细胞进入G1晚期，TK1酶的水 平逐渐急剧上升，直至S和G2期交界处，但在肿瘤细胞中，这种高TK1水平从S晚期一直持续 到M早期。大量离体试验结果表明，TK1在增殖细胞和肿瘤细胞周期调控代谢过程具有特殊的 意义。通常， 一些非增殖细胞的TK1和健康人血清和组织中TK1，其含量极微或检测不到，而 在异常增殖细胞或恶性肿瘤患者中，TK1酶伴随着肿瘤细胞数的急剧增殖而升高。不同来组 织增殖细胞中细胞周期与TK1信使RNA (TKlmRNA)的表达关系是复杂的，mRNA的剪切和翻译也 是随细胞生长状态变化的，推测TK1水平主要是通过翻译后调控机制发挥作用。而且，已有 研究表明，增殖细胞生长的不同时期，TKl活性的调控则主要是通过dTTP反馈抑制途径和底 物循环方式进行调节的。正是由于TK1与细胞异常增殖和肿瘤细胞表达密切相关，即在非增 殖细胞和健康人血清中，含量极微或检测不到，而在恶性肿瘤患者中伴随着肿瘤细胞的急剧 增殖而升高等特征，使学术界对TK1的研究引起了广泛的关注和重视，并认为TK1有可能作为 一种有价值的血清学细胞增殖标记物来检测增殖细胞的增殖活性，适用于恶性肿瘤的细胞增 殖度检测。特别是已有文献表明，TK1的活性在肿瘤细胞大于总量的95。/。，而TK2低于5。/。，在 正常健康人的血清中检测很低或不可以检测，因此采用检测血清TK活性将评估肿瘤增殖的恶 性程度。hTKl在细胞异常增生时含量或活性增高，特别是在细胞增生旺盛的早期恶性肿瘤患 者的体液或血液中更是显著增高，且hTKl水平的高低与恶性肿瘤的切除和复发呈降低和升高的趋势。曾有学者曾采用12种人癌组织进行免疫组化分析，发现TK1均呈现阳性结果，这初步 证明了癌症患者与TK1活力或含量增高有关，且进一步试验也证明，随着肿瘤细胞增殖速度明 显提高，TK1活力增强，DNA合成速度加快，从而促进了肿瘤细胞的进一步增殖，形成一个病情 不断加重的恶性循环。关于TK1的稳定性，大多数报道认为TK1的稳定性欠佳，而且在组织或 细胞萃取液中的TK1的稳定性也较差，即使是在4'C环境条件下也不稳定，这可能与TK1四聚 体结构降解有关。如保存在-2(TC以下，TKl活性可以稳定l-3星期。纯化的TK1或重组人TK1 则需要保存在-8(TC冷藏环境。当然，TK1在血清中保存是稳定的，通常在-2(TC条件下可保 存5年以上，其之所以稳定的可能原因，被认为是TK1在血清中是与其它蛋白质形成一大分子 稳定的复合物有关。不过，关于血清TK1的结构和性质仍然是不清楚的，其中包括这酶在细 胞内被破坏或者是由细胞以活性或非活性的状态被分泌出去。为了进一步研究及临床诊断和 治疗的需要，有学者设法从相关癌组织或癌细胞对TK1进行提取分离制备。但采用生物化学 的方式进行提取制备不仅十分繁琐且得不偿失。为此国内外学者(包括我们自己的研究团队 )采用基因工程的方法制备TK1和TK1单克隆抗体的制备。
目前制备hTKl单克隆抗体方法的技术背景用杂交瘤成功制备单克隆抗体技术发明至今 已有30多年的历史，到目前为止单克隆抗体的种类非常繁多，已广泛地用于生命科学等领域， 特别是用于临床相关疾病的诊断和治疗，以及生物制品的生产和纯化等。以往常规制备单克 隆抗体的方法主要是从相关的细胞或组织中提取抗原或购买商品抗原用于免疫实验动物。抗 原的来源不同其生物学性质有很多差别，特别是一些真核细胞表达的蛋白质在制备和纯化过 程中使用的试剂影响蛋白质的空间结构，由此导致蛋白质的免疫原性的改变。用于制备抗体 的抗原来源是影响抗体产生的关键问题，有些抗原来源非常困难，甚至没有商品试剂，也没有 标准品，在这种情况下制备单克隆抗体比较复杂，首先需要鉴定提取的抗原是否正确，否则 免疫原错误必导致抗体的错误；因此，抗原是制备抗体的关键问题。随着分子生物学技术的 发展，得到任何一个已知蛋白质的基因序列，且克隆基因和进行基因工程表达已是一个十分成 熟的技术，所以大量的基因工程制备的蛋白质非常多，用于免疫动物也非常方便，许多生物公 司均可以提供一定数量的纯化蛋白质，只是价格较高，另外不同公司的产品和实验人员制备的 蛋白质在某些性质上还有差别，有时同一种蛋白质在免疫原性上差别很大，甚至与生理条件 下天然蛋白的免疫原性相差甚远；由于蛋白质的空间结构(一级结构以上)在抗原制备过程 中发生改变导致有些抗原性丢失，或暴露出非生理条件下的抗原决定簇。因为抗体用于诊断 和治疗等过程时，抗体识别的抗原是天然结构，是具有一定空间结构的单体或多聚体，所以 制备抗体的理想蛋白质抗原应该是具有天然结构的蛋白质，另外对于真核细胞产生的蛋白质
在某些情况下还要考虑糖基化对蛋白质的影响。有些蛋白质是否糖基化将影响蛋白质的免疫 原性；由于原核细胞没有糖基化系统，因此通过大肠杆菌基因工程制备的抗原没有糖基化， 所以有些必须糖基化的蛋白质抗原不能用大肠杆菌制备，糖基化对有些抗原是必需的，其影 响抗原的决定簇，因此有些免疫原必须来源于真核细胞(从细胞中提取或真核细胞表达)。 人TK1是细胞合成DNA必备的激酶，其存在细胞内，是一个非分泌性蛋白。TK1基因的开放读 码框架是702个核苷酸，除去终止密码外可以编码233个氨基酸的蛋白质；目前认为TK1没有 信号肽结构，因此不能分泌到细胞外，是否有糖基化位点尚不清楚。由于目前没有TK1的纯 商品试剂，所以关于TK1的单克隆抗体制备的文献很少，还没有一个非常理想的TK1单克隆抗 体。目前已有报道，TK1单克隆抗体的文献均是采用原核细胞表达的方式，用大肠杆菌表达 的TK1或从细胞提取的TK1作为抗原，包括我们前期的工作，即严格按照无菌操作规程，取新 鲜抗凝血用淋巴细胞分离液分离出该抗凝血中的白细胞，用頂DM培养基稀释成一定数量的白 细胞置于细胞培养瓶后，加入十二烷基氟波酯(TPA)，然后置于二氧化碳C02培养箱中进行细 胞培养后离心收获细胞。同时传代HeLa细胞至长成单层后加入氨基碟呤后置于二氧化碳C02 培养箱中培养，并同步化至S期后直接提取其RNA。紧接着，再进行人外周血白细胞和HeLa细 胞RNA制备，即将诱导后的白细胞和HeLa细胞分别加入Trizol试剂，轻轻混合均匀后，加入 三氯甲烷(氯仿)，再次轻轻混合均匀后，立即置于高速冷冻离心机中，并以高速离心10分 钟，取出离心管，吸出上层水相，再次加入等体积的三氯甲烷(氯仿)，轻轻混合均匀，再 以高速离心10分钟，取上清液体，立即加入等体积的异丙醇，轻轻混合均匀后，置于低温冰 箱中过夜，次日再高速离心10分钟，弃去上清液体，用乙醇洗涤沉淀一次，置于室温中自然 干燥后，于每个样品中加入DEPC处理的水悬浮其沉淀；再采用逆转录PC財广增TKlcDNA，即 根据TK1序列和载体的多克隆位点设计引物(引物1和引物2)，引物TKl中含有EcoR頂每切点 ;引物TK2含有Xho頂每切点。通过一系列逆转录后，充分混合均匀其反应液，并置于PCR仪上 进行扩增。然后，即可进行TA克隆，并用TA克隆试剂进行连接和连接反应液转化大肠杆菌 JM109，并用氯化钙处理JM109，取其加入到连接液中再处理后，离心留取液体，混匀沉淀，将 菌液涂于含有X-gal和IPTG的LB培养皿上培养过夜，挑取白色菌落再接种于LB平皿上培养过 夜，用质粒提取试剂盒进行质粒DNA提取。然后，再对hTKl重组TA克隆的酶切鉴定和DNA序列 分析，再将hTKl PET28a+重组质粒在E.Coli B L21 DE3中表达hTKl融合蛋白，最后，应 hTKl PcDNA3重组质粒基因免疫小鼠及hTKl基因蛋白表达和纯化最后，再用纯化抗原免疫 动物制备hTKl单克隆抗体，即取Balb/c小鼠，在小鼠股四头肌处注入IOO y l质粒混合液三周 后再免疫。以后，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，最后，再用此杂交瘤细
胞注入Balb/C小鼠腹腔制备含TKl单克隆抗体的小鼠腹水，并从中获得纯化的HTK1单克隆抗体 。由于提取TK1的过程比较复杂，在提取的过程中将影响TK1的分子构型，由此可能导致TK1 的某些抗原决定簇消失，这将影响抗TK1天然构型抗体的产生，特别是影响高亲和力和高特 异性抗体的出现；为此本项研究采用了基因免疫的方法制备TK1单克隆抗体。本发明采用可 以分泌的载体(由于TK1没有信号肽)与TK1基因重组，然后用重组的载体进行基因免疫制备 TK1单克隆抗体。基因免疫已在(除TK1以外)许多蛋白制备抗体获得成功；但是选择的载体 有很多差别，对于有信号肽的蛋白质可以选择普通的真核表达载体即可以免疫出抗体；但无 信号肽结构的蛋白质必须用分泌型载体；许多文献报道已证明了这一点，并且证明了基因免 疫制备抗体具有很多优点，首先蛋白质抗原是通过载体携带的基因在动物体内表达，其表达 的蛋白质是天然构型的蛋白质分子，因此免疫原的天然抗原决定簇没有丢失，同时也不需要 纯化抗原需要的烦琐步骤和高额的费用，通过基因免疫制备抗体已有很多成功的例子，如凝 血酶调节蛋白，丙型肝炎病毒，HBV，人溶菌酶，肝特异新基因FF456，人CD34抗原胞外区，人 BLyS，人CD154等，并且有些报道是用基因免疫诱导抗体，观察基因免疫对感染因子的保护作 用。因此基因免疫制备单克隆抗体是一个非常实用的技术，特别是抗原来源困难的情况下， 以及结构复杂和有糖基化的分子。目前的分子生物学技术非常成熟，载体系统也非常方便， 所以未来制备抗体可能均用基因免疫的方法。本项发明是将TK1基因重组入分泌型表达载体 pSecTag2/Hygro B，通过重组质粒在动物肌肉细胞内表达人TK1蛋白质抗原刺激动物产生抗体 。通过基因免疫的方法制备出高亲和力的多个TK1的单克隆抗体。
目前关于TK1单克隆抗体制备文献不多，但在有限的文献中所显示的制备方法均是采用 传统的蛋白质抗原进行免疫，而这些抗原又大多来源于生物化学方法所提取的组织抗原，或 者采用原核细胞所表达的TK1蛋白进行免疫小鼠(包括我们的前期工作)。采用生物化学方法 所提取的组织TK1抗原，不仅操作繁琐，周期长，难度大，纯化极其复杂，需要消耗大量制备试剂 及人力物力和财力，而且即使能大量组织提取得到TK1，其得率也微乎其微，很难满足单克隆抗 体制备和实际应用的需要;采用原核细胞表达TK1蛋白制备其单克隆抗体虽然较从大量组织提 取得到TK1有明显进步和优点，但同样存在TK1抗原纯化难度较大，操作繁琐，技术复杂等问题 ;特别是由于目前国际上尚未见到TK1商品试剂，或标准抗原，因此各自报道的TK1单克隆抗 体制备方法及标准均无法统一，而且，TK1的特异性抗原决定簇在哪一段肽段上目前还是一个 未知数。因此，无论何种方法所纯化的TK1 (真核或原核来源)或多或少丢失某些有价值的抗 原决定簇，特别是TK1在生理条件下是多聚体，所以目前关于TK1单克隆抗体的研究还有待于 进一步深入，这是目前制备hTKl单克隆抗体方法的一些不足、缺陷及存在的问题，而只有克
服这些，才有可能统一TK1抗体的标准和制备出非常适用的TK1单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是针对背景技术中存在的缺点和问题加以改进、创新，特别是通过对胸苷 激酶基因克隆和真核分泌型载体重组技术，提供一种基因免疫制备人类I型胸苷激酶单克隆 抗体的新方法。
本发明的方法如下
将氨基喋呤处理的Hela细胞RNA作为原始模板，其中RNA经逆转录PCR获得TK1 cDNA，其 中TK1基因序列是用TK1 TA克隆双向测序获得。
本发明所述的TKl基因是通过HindIII和XhoI双酶切获得。所述的TK1基因通过定向连接 入真核分泌型载体比pSecTag2/Hygro B。所述的定向连接位点是HindIII和XhoI之间。所述 的重组质粒作为基因免疫制备TK1抗体的基因。所述的基因免疫是将权力5的重组质粒DNA注 入小鼠股四头肌。所述的注入的重组质粒在小鼠肌细胞中产生TK1蛋白。所述的TK1蛋白是可 以分泌到细胞外，并作为免疫原。所述的免疫原是TK1蛋白分子的天然结构。所述的TK1基因 免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合制成杂交瘤。所述的杂交瘤用重组原核表达的TK1筛选 。所述的产生TK1抗体的杂交瘤细胞于小鼠腹腔内大量制备抗体。所述的单克隆抗体用蛋白 G柱纯化。所述的纯化的单克隆抗体可以标记辣根过氧化物酶或荧光素。所述的抗体应用于 检测体液中的TK1。
本发明首先用Trizol试剂(一种从动物细胞和组织、细菌、真菌等提取总RNA的试剂盒) 从500万个Hela细胞(海拉细胞是一种人宫颈癌传代细胞)提取经氨基喋呤处理48小时的细胞 总核糖核酸(RNA)，纯化后用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解沉淀所得液体30 y 1 。该液体经 过逆转录PCR(在体外由酶促反应合成特异DNA片段的一种方法)可扩增出hTKl cDNA (cDNA是 指以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下形成的互补DNA);在TA克隆(即利用T叫聚合酶在每条 PC財广增产物的3'端自动添加一个3' -A突出端)后即可进行DNA序列分析，以鉴定经过PC財广 增后所形成的hTKl基因序列是否正确；然后，通过亚克隆接入pSecTag2/Hygro B载体(真核分 泌型载体pSecTag2/Hygro B)的HindIII (酶切位点)和XhoI (酶切位点)位点之间 (pSecTag/TKl)，插入片段表达的蛋白质可以从真核细胞中分泌到胞外。直接用pSecTag/TKl 重组质粒脱氧核糖核酸(DNA)免疫小鼠；再用骨髓瘤细胞和脾细胞融合制备杂交瘤；从制备出 的多株杂交瘤细胞株中进行筛选、配对，最后筛选出两株亲和力较高、结合位点不同、且能 产生抗TK1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;将所筛选出的这两株亲和力较高、结合位点不同、且 能产生抗hTKl单克隆抗体的两个杂交瘤细胞株，分别按照数量为5X1()5个杂交瘤细胞分别直
接注入两组小鼠腹腔内制备含有hTKl特异性单克隆抗体的腹水;待这些受试小鼠腹腔内的腹 水达到一定程度后，即可分别用注射针头抽出这两株杂交瘤细胞所产生的亲和力高和特异性 强的抗TK1单克隆抗体的小鼠腹水；将收集的这些小鼠腹水用冷冻高速离心机以大于 12000rpm/min以上的速度离心5-10分钟，弃除沉淀，其上清液采用正辛酸一硫酸胺法分别进行 提取，并用蛋白G柱亲和层析纯化，可得到经过纯化的两种结合位点不同的TK1单克隆抗体;纯 化后的这两种hTKl单克隆抗体分别用蛋白定量试剂(BCA)定量抗体，最后，经过十二烷基磺酸 钠(SDS) -PAGE (聚丙烯酰胺)凝胶电泳法检测其抗体纯度；同时，进行抗体的IgG类型，亚类鉴定 ，以及抗体的结合位点和亲和力测定等;之后，置于低温冰箱中保存，即可备为后续应用。
本发明的原理从HeLa细胞获得TKl基因序列，经DNA序列分析确定TK1 cDNA的正确编码 序列；用限制性内切酶同时酶切TK1基因片段和载体(真核分泌型表达载体pSecTag2/Hygro B)，用连接酶定向克隆入载体；构建成TKl的分泌型表达载体(pSecTag/TKl)，重组载体转入细 胞内获得表达，并且重组的TK1蛋白质分泌到细胞外；分泌的TK1作为抗原刺激小鼠产生抗体； 通过细胞融合技术将产生抗体鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，经HAT选择培养克隆出杂交 瘤细胞；再经克隆化选择培养和筛选出产生TK1抗体的阳性杂交瘤细胞；克隆化彻底的阳性 杂交瘤经扩大培养后冻存和小鼠腹腔注射;用蛋白G试剂从小鼠腹水中纯化TK1的单克隆抗体 ;然后鉴定和分装保存。
本发明的主要技术构思:本发明技术构思主要分为三个部分:第一部分:采用基因工程技 术及分子生物学和分子免疫学技术，克隆hTKl的cDNA、并进行其核苷酸序列分析;第二部分 利用真核分泌型载体重组和构建hTKl基因；第三部分:采用基因免疫的方法制备高特异性和高 亲和力的hTKl单克隆抗体。
TK1是一个细胞内的激酶，分子结构上没有信号肽，天然生理条件下是一个四聚体的蛋 白质，因此其结构非常复杂。用纯化的抗原免疫动物能够制备出抗体，但是由于免疫原的分 子结构复杂，目前所有报道的TK1抗原和抗体还无统一标准。能够用于诊断和治疗的最佳抗 原靶点不清楚。所以，本项发明是用真核分泌型载体携带TK1基因完整开放读码框架进行 TK1单克隆抗体的制备。本发明重组TK1的真核表达载体直接注入到受试小鼠的肌肉组织之中 ，使这些受试小鼠的肌肉细胞直接产生人TK1蛋白及TK1抗原，然后促使这些TK1蛋白及TK1抗 原直接分泌到细胞外，并由此诱导这些小鼠产生TK1抗体。由此可见，在理论上分泌的TK1是 完整的天然结构，其诱导产生的抗体对应于TK1的生理结构，所以基因免疫制备的单克隆抗 体具有识别天然结构的TK1，更适用诊断和治疗，以及TK1系统的标准化和统一标准。而且， 按照本发明所制备的TK1单克隆抗体具有制备更加简便，操作更加方便，产量得率更大，周期更
短等特点，而且，目前国际上尚未见到通过对人I型胸苷激酶基因的克隆和真核分泌型载体的 重组构建实施基因免疫制备人I型胸苷激酶单克隆抗体的方法。 本发明所能达到的有益效果
① 本发明制备的TK1单克隆抗体，应该具有更高的亲和力及更高的特异性，
而这些却是建立相应检测技术和测定方法的重要基础。
② 本发明制备的TK1单克隆抗体具有与人体TK1抗原更为接近的免疫学反应，因此，更适 用于研制临床相关肿瘤标志物诊断的试剂盒。
③ 本发明制备的TK1单克隆抗体为重组TK1的真核表达载体直接注入到受试小鼠的肌肉组 织之中，使这些受试小鼠的肌肉细胞直接产生人TK1蛋白及TK1抗原，然后促使这些TK1蛋白 及TK1抗原直接分泌到细胞外，并由此诱导这些小鼠产生TK1抗体，其分泌的TK1是完整的天 然结构，其诱导产生的抗体对应于TK1的生理结构，因此，基因免疫制备的单克隆抗体具有 天然免疫的特点和识别天然结构的TK1，因此，有可能用于临床相关疾病治疗的新耙点。
④ 以及TK1系统的标准化和统一标准。基因免疫产生的天然抗体，因此，更容易统一和 规范TK1分子和抗体的标准化，为该学科的发展和技术进步提供最为科学和规范的技术方法
⑤ 本发明制备的TK1单克隆抗体是由真核表达的质粒直接免疫动物获得，即通过其真核 分泌型载体携带TK1基因完整开放读码框架进行TK1单克隆抗体的制备，因此，使TK1分子真 正作为诊断肿瘤性疾病的指示分子。
⑥ 本发明制备的TK1单克隆抗体在制备方法上更有创新性和先进性，而且，在TK1单克隆 抗体技术上实施更加简单，操作更加容易，周期更加縮短，制备更易产业化和标准化。
本发明的主要技术特点是将人TKl基因重组入分泌型表达载体pSecTag2/Hygro B，用基 因免疫的方法免疫小鼠，成功制备可产生人TK1单克隆抗体的杂交瘤，此单克隆抗体可特异性 识别人TK1分子。
本发明的主要技术优点本发明采用的分泌型载体作为基因免疫的载体，其可以携带任 何基因片段用于基因免疫，不需要纯化蛋白的烦琐步骤，特别是对于没有信号肽结构的蛋白 质更为适用，并且诱导抗体产生的抗原是在小鼠体内产生的天然结构蛋白，其免疫产生的单 克隆抗体更易与天然生理条件下的TK1结合。
本发明的主要创新点本发明首次用分泌型载体基因免疫的方法制备出产人TK1单克隆 抗体的杂交瘤；免疫原是在小鼠体内产生的人TK1分子，因此免疫原更接近于TK1的天然生理 条件下的结构，成功制备出的抗体特异性识别TK1分子；得到杂交瘤细胞，使TK1的单克隆抗
体能够用杂交瘤大量生产。
具体实施例方式
实验材料Taq DNA聚合酶，dNTP， Oliga-dT，连接酶，(大连TAKARA公司)；逆转录 酶(Roche公司)；Trizol试剂，頂DM培养基(Invitrogen);小牛血清(杭州天津血研所 );Balb/c小鼠(吉林大学白求恩医学部动物室)；质粒DNA提取试剂盒和凝胶DNA回收试剂 盒(杭州Axygen公司)；蛋白胨和酵母粉(0X0ID);琼脂糖(西班牙)；丙烯酰胺，甲叉 双丙烯酰胺，过硫酸铵，TEMED (FLUKA) ; BCA蛋白定量试剂(Pierce公司)；HRP标记羊抗兔 IgG和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG (R and D SYSTEM)，人TK1原核表达蛋白(从表达人 TK1的大肠杆菌中提取)，人TKl抗体IgY (深圳华瑞同康生物技术有限公司)；蛋白G纯化胶
(BD公司);NBT禾口BCIP (Roche) ; Tris，蛋白酶K， RNA酶，氨基喋呤，0PD (Sigma); HAT和HT培养基(GIBC0);硫酸，磷酸盐等(北京化工厂)。
所需要用的全部仪器和设备PCR仪(Hybaid);低温离心机(德国贺力氏，Stratols )，二氧化碳培养箱(德国贺力氏，BB5060);加样器(法国Gilson， P20-P1000);倒置 显微镜(上海，H0508);生物安全柜(北京哈尔东联仪器制造有限公司，B2);酶标仪( Lybsystems dragon MK3);电泳设备(水平和垂直，上海天能)，凝胶成像系统(上海天 能GIS1000);核酸和蛋白检测仪(HITACHI, Genespec I);纯水机(德国SG) ; pH仪( Mettler320);天平(Satorius， BS110S);深低温冰箱(FORMA，)；液氮罐(成都液氮 容器厂，YDS-30-125)，超声细胞粉碎机(宁波新芝JY92-I1);普通离心机(北京医用离 心机厂，LD5-2A)。
实施例
①hTKl基因进行克隆及序列分析
l)逆转录PC財广增TKl cDNA:用可从动物细胞和组织、细菌、真菌等提取总提取总核糖 核酸(RNA)的Trizol试剂试剂盒从500万个Hela细胞中提取RNA，经氨甲喋呤处理48小时，并经 纯化后再用一种高效烷化剂-焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解沉淀得30 y 1 。由于DEPC可破坏 核糖核酸酶(RNase)活性，因此可去除RNase的污染。
在进行逆转录时，加入5倍缓冲液4y 1、引物01igo-dT(0. 5 y g/1 y 1) lyl、 10mMol/L浓度的脱氧核苷三磷酸(dNTP) :2y 1、 RNA:10yl、去离子水水2yl， 充分混匀，并置于7(TC恒温水浴10分钟；然后，再置于冰上2分钟；加入lul逆转录酶 (50U， Roche)，混匀，再置于42。C水浴90分钟，其逆转录体积共20yl。根据人TK1基因序列 设计一对引物
引物1 5-AGCTAAGCTTAGCTGCATTAACCTGCCCAC-3 引物2.5-TACTCTCGAGGTTGGCAGGGCTGCATTGCAGAATC-3 引物l引入Hindin酶切序列；引物2引入Xho頂每切序列 再进行PC財广增，即加入10倍缓冲液5y 1， dNTP(2. 5mMol/L) :4y 1， 引物l:lul (200ng)，弓l物2:lyl (200ng) ， cDNA:5 y 1， Taq酶1 y 1 (2. 5U)，去离子 水33 y 1; PC財广增液体积共50 y 1 。混匀，置PCR仪上扩增94。C60秒，55。C60秒，72°C 120秒， 共进行30个循环，最后补加72。C5分钟。然后，取10y 1 PCR产物于2。/。琼脂糖凝胶上电泳，切下 700bp位置的DNA条带，用凝胶回收试剂盒回收DNA片段用于TA克隆。
2)TA克隆和DNA序列分析纯化的PCR产物与pMD-18T载体重化大肠杆菌组，转JM109，涂布 于含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37"C培养过夜，次日挑取10个白色的单菌落扩大培养， 用质粒提取试剂盒纯化质粒，双酶切(HindIII和XhoI)鉴定插入片段，在所选的10个克隆中均 有插入片段，片段大小约为700bp。 TK1重组TA克隆(TA9)用T7和SP6引物双向测序，结果与 GenBank的TK1序列比较证明本次克隆的cDNA是人TKl基因，全长702个碱基。
② TK基因亚克隆入真核分泌型表达载体
采用真核分泌型表达载体pSecTag2/Hygro B (简称pSecTag2)，其可以将重组基因表达 的蛋白分泌到细胞外，由于TK1没有信号肽，所以选择分泌型载体是一最佳的方法。
用HindlII和XhoI分别酶切TKl/TA克隆质粒和pSecTag2质粒，用凝胶电泳和胶回收试剂 分别纯化TKl和pSecTag2的DNA片段，然后进行连接反应。连接反应体积共15 y 1 ，即10倍的连 接缓冲液1.5yl， TK1 DNA片段8. 0 y 1， PSecTag2 DNA:4.5yl，T4 DNA连接酶1.0yl。混匀 ，置4"C冰箱过夜；加入300 y 1感受态的大肠杆菌JM109，置冰浴中l小时，42"C水浴90秒，再于 冰水浴中5分钟;加LB培养基lml，混匀，置37'C培养1小时，离心收集沉淀，将沉淀的菌体涂于含 氨苄青霉素(50yg/ml)的LB琼脂培养基上，于37'C过夜培养。挑取10个菌落扩大培养，用试 剂盒小提质粒DNA，再用内切酶和电泳鉴定重组质粒，所挑选的10个质粒均含有TK1基因，电 泳显示可以切下大约700bp的DNA片段，同时在TKl片段中有一个Sf頂每切位点。TK1重组质粒 命名为pSecTag/TKl。
③ PSecTag/TKl DNA的大量制备
PSecTag/TKl重组菌于37。C活化培养过夜，然后接种于50ml的LB培养基中(含氨苄青霉素 50y g/ml)， 37r振荡培养5小时，再转入500mL培养基中继续培养5小时，离心回收菌体；按试剂 盒程序提取质粒DNA;在最后洗脱时选用无菌蒸馏水。纯化的质粒DNA用紫外分光光度计检测 纯度和定量.500ml培养的菌体可以提取400y g质粒DNA，冰箱中冻存备用。
④基因免疫制备TK1单克隆抗体
1) TKl基因免疫Balb/c小鼠免疫过程取4周龄Balb/c纯系
雌性小鼠3只(其中一只不免疫作为对照)，每只鼠两侧股四头肌分别注入50 y g pSecTag/TKl DNA (每侧50 y 1);对照鼠注入等量的生理盐水；每15天免疫一次，总共免疫5 次，第二次免疫后10天开始检测血清中抗体；于末次免疫后一周进行细胞融合。
2) TK1基因免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合:A:饲养细胞制备:Balb/C小鼠拉颈处 死，取其胸腺，置于10ml培养液中，在钢网上研磨分散细胞，弃大块组织，将细胞调成
5. 0X106/ml， 96孔培养板每孔100ul。 B:骨髓瘤细胞准备小鼠骨髓瘤细胞为NS1细胞株，融合 前细胞生长良好，细胞浓度为5Xl(^/ml。 C:细胞融合:2X1(/个骨髓瘤细胞与2X10S个细胞混匀 ，离心，弃上清，轻微振荡混匀，于37。C水浴中，在90秒内滴加lml 50。/。的PEG，然后滴加20ml无血 清培养基，离心，弃上清，再洗一次，加入15。/。血清的培养基20ml (含HAT)，混匀，每孔加入IOO y 1(原有100y l的饲养细胞)，同时设有单独脾细胞和单独骨髓瘤对照孔(12 L/每个)。4天后换 液；吸出100y 1，加入100y 1含15。/。血清HAT培养基；第三次换液时为HT培养基；每日观察细
胞生长状态，io天左右出现克隆。
3) 杂交瘤培养上清TK1抗体的检测用直接ELISA检测杂交瘤培养上清中的抗体，用TK1抗 原包被ELISA板，加入培养上清，冲洗后加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，孵浴和冲洗后，加 显色底物OPD，然后测492nm的光密度，以高于阴性对照光密度2倍以上为阳性克隆。结果在融 合后两周的培养上清中有28孔显示TK1抗体阳性。选择效价高的几个孔进行克隆化。
4) 克隆化和扩大培养多克隆培养孔内的细胞采用有限稀释法进行克隆化，用含有HAT的 培养基制备小鼠胸腺细胞作为饲养细胞，多克隆孔内的细胞进行稀释至每孔含有IOO， IO和O个 细胞(100ul)，培养观察，对只有一个克隆杂交瘤的培养上清进行检测。选择阳性克隆转入 24孔培养板中进行扩大培养，每孔lml，培养5天后，加入4ml培养液，混匀，分入4个培养孔中，继 续培养5天，然后转入培养瓶中进行扩大培养，选择抗体阳性，且效价稳定的克隆进行进一步 扩大和冻存。结果得到两株结合位点不同、且稳定分泌TK1抗体的杂交瘤。
5) TKl单克隆抗体大量制备和纯化:Balb/C小鼠腹腔注入0. 5ml液体石蜡， 一周后每只小 鼠腹腔注入5X1()5个杂交瘤细胞，然后当有明显腹水形成时，针头穿刺放腹水。收集的腹水 12000rpm/min离心5分钟，弃除沉淀，其上清液采用正辛酸一硫酸胺法分别进行提取，并用蛋 白G柱亲和层析纯化，可得到经过纯化的两种结合位点不同的TK1单克隆抗体;将纯化后的TK1 单克隆抗体用蛋白定量试剂(BCA)定量抗体，分装保存。
6) TK1单克隆抗体的鉴定单克隆抗体特异性的鉴定:A:直接ELISA:TK1包被固相，加TK1腹
水，再抗体和酶标抗体。B:双抗体夹心ELISA:用腹水包被固相(1:200);加入不同浓度的 TK1，然后加碱性磷酸酶标记抗TKl的IgY，用碱性磷酸酶底物显色，测570nm的光密度。C:免疫 组化:制备HeLa细胞涂片，分成两组 一组为HeLa细胞；另一组为氨基喋呤诱导48小时的HeLa细 胞，EDTA消化培养的细胞，使其分散，用PBS洗一次，稀释成5X105/1111，每个细胞涂点为30 y 1; 室温干燥，丙酮固定5分钟，然后用1%的双氧水处理30分钟；再用3。/。的BSA封闭30分钟。然后 加抗体(l :400稀释，培养上清用原液)，孵浴和冲洗，加酶标抗体，冲洗后加DAB底物显色，光镜 下观察结果，同时用商品试剂盒对照进行。最后，经过十二烷基磺酸钠(SDS)-PAGE(聚丙烯酰 胺)凝胶电泳法检测其抗体纯度；同时，进行抗体的IgG类型、亚类鉴定、以及抗体的结合位 点和亲和力测定等。之后，置于低温冰箱中保存，即可备为后续应用。
(4)本发明操作的注意事项本发明制备的产生TK1抗体的杂交瘤细胞常规保存于液氮中 ，定期复苏和鉴定。杂交在小鼠体内诱导产生的腹水，以及后续纯化的抗体等均应保存于低 温，并且在应用时稀释中应含有O. 1%的牛血清白蛋白；长期保存腹水，或纯化的抗体应存于深 低温(摄氏零下70度)；每一个批次制备的抗体或腹水小样分装保存，避免反复冻融。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和 范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前题下，本领域的学者和研究人员对本发明的技 术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容， 已经全部记载在权利要求书中。
权利要求
1.一种基因免疫制备人类I型胸苷激酶单克隆抗体的新方法，其特征在于将氨基喋呤处理的Hela细胞RNA作为原始模板，其中RNA经逆转录PCR获得TK1 cDNA，其中TK1基因序列是用TK1 TA克隆双向测序获得。
全文摘要
本发明涉及一种基因免疫制备人类Ⅰ型胸苷激酶单克隆抗体的新方法。其具体方法是首先，从经过氨基喋呤处理的Hela细胞中提取RNA，经逆转录PCR扩增出TK1 cDNA，TA克隆后进行DNA序列分析，确定正确的TK1基因序列，然后亚克隆入pSecTag2/Hygro B载体的HindIII和XhoI位点之间(pSecTag/TK1)，插入片段表达的蛋白质可以从真核细胞中分泌到胞外。直接用pSecTag/TK1重组质粒DNA免疫小鼠，用骨髓瘤细胞和脾细胞融合制备杂交瘤，筛选出产抗TK1的单克隆抗体的杂交瘤；通过小鼠腹水大量制备TK1的单克隆抗体。最后，将收集的小鼠腹水高速冷冻离心，其上清液用正辛酸一硫酸胺法分别进行提取，并用蛋白G柱亲和层析法纯化，即可得到可用于检测临床样品中TK1标志物的TK1单克隆抗体。
文档编号C12N15/54GK101186922SQ200710203299
公开日2008年5月28日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者宇 丁, 丁克祥, 刘卫国, 费定宇, 郑永晨 申请人:丁克祥