与分析物测定相关的方法、混合物、试剂盒和组合物的制作方法

专利名称：与分析物测定相关的方法、混合物、试剂盒和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与通过质谱法进行分析物测定相关的方法、混合物、试剂盒和组合物。
导言 本发明涉及通过质量分析测定分析物。分析物可以是感兴趣的任何分子。分析物的非限定性实例包括但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、类固醇和质量小于1500道尔顿的小分子。可利用独特的标记试剂对分析物进行测定，所述标记试剂使得可对复杂混合物中的分析物进行相对定量和/或绝对定量。可成组使用标记试剂用于分析复杂的样品混合物，其中标记试剂可以是同分异构的(isomeric)和/或同量异位的(isobaric)。
参照图1a，标记试剂包含报告物部分、平衡物(或连接物)部分和反应活性基团，其中所述反应活性基团被组合物中已反应分析物形式的分析物所取代。此通式的标记试剂和标记的分析物的实例已经公开于例如公开的共同未决和共有的美国专利申请US 2004-0219685 A1、US2005-0114042 A1、US 2005-0147982 A1、US 2005-0147985 A1、US2005-0147987 A1、US 2005-0148771 A1、US 2005-0148773 A1和US2005-0148774 A1中。如在所引用的公开的美国专利申请中所讨论的，同分异构和/或同量异位的标记试剂组可以用于标记例如两个或更多个不同样品的分析物，其中组中的不同标记试剂均具有相同的总质量，但每个报告物部分可被特别编码，使得该组的每个报告物部分都具有独特的质量。因为该组中的所有试剂都具有相同的总质量但可包含具有独特质量的报告物部分，所以平衡物(或连接物)部分通常也会(但并非必须)包含一种或多种重原子同位素，以此“平衡”每个独特报告物的质量，从而该组中每种标记试剂的报告物/连接物组合都具有相同的总质量。
在图1b中图示了新标记试剂(或标记的分析物)的实例(如本文中所详述的)。尽管是以未取代形式(除了R1和R2)进行阐述的，但应当理解所述标记试剂可以是取代的或未取代的。在图示中，某些键显示为断裂的，从而从标记试剂或标记的分析物上至少释放独特的报告物部分、以及通常但不必要的平衡物部分。对于标记的分析物而言，然后可将在质谱仪中观察到的每种特别的报告物离子(有时候称为信号离子(signature ion))用于定量样品和/或样品混合物中分析物的量。
图2a和2b图示了如图1b所示的基础结构的9种不同编码形式(例如R1和R2可彼此独立地为氢或甲基)，其可用于促进至少9重实验(9-plex experiment)，其中星号(＊)用于表明在适当时此处12C原子被13C原子替代，或者14N原子被15N原子替代。图2c中显示了不同报告物/信号离子的建议结构。然而，如果例如在报告物部分和/或平衡部分中，氘也用于替代一个或多个氢原子和/或用18O替代16O，则可预料有多于9种不同的化合物，从而可进行多于9重的实验。参照如下图6a和6b，对于此通式的标记试剂/标记的分析物的进一步替代的这种可能性进行了更详细的讨论。
与在图2a和2b中所示的那些相似的同量异位化合物的可替代组(其中R1和R2可用于形成6元环)图示于图3a和3b中。这些标记试剂可形成9种不同的报告物/信号离子的同样的组，其建议结构显示于图2c中。能够容易地制备具有分析物分析所需性质的替代结构表明本发明实施方式具有通用性。
通常，标记试剂、标记的分析物和所述标记试剂和/或标记的分析物的一些中间体可由式I化合物，包括其盐形式和/或其水合物形式所代表
其中Z可以是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、能与分析物的官能团反应而形成标记的分析物的反应活性基团、反应活性基团的离去基团，其中所述离去基团在所述标记试剂与分析物的亲核性官能团或与共价键合的分析物反应时离去，其中对原子或基团V+、X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面进行更详细地描述。
因此，在一些实施方案中，分析物可以通过所述分析物与式I’化合物(包括其盐形式和/或其水合物形式)所代表的标记试剂的反应而标记
其中Z’代表能与分析物的官能团反应而形成标记的分析物的反应活性基团或所述反应活性基团的离去基团，其中所述原子或基团X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L将在下面进行更详细地描述。所述标记试剂可以成组使用，其中所述组包含同分异构和/或同量异位的化合物，由此标记的分析物同样可以是同分异构和/或同量异位的。
此外，在一些实施方案中，如此标记的分析物可由式I”所代表，包括其盐形式和/或其水合物形式
其中，Z”代表与所述标记试剂共价键合(可能通过所述反应活性基团的其它原子或基团)的分析物，其中所述原子或基团X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面进行更详细地描述。
此外，在一些实施方案中，所述标记试剂的中间体可由式I”’所代表，包括其盐形式和/或其水合物形式
其中Z”’代表-OH、-SH、-O-V+或-S-V+，其中所述V+、X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面进行更详细地描述。所述中间体可用于例如产生本文中所公开的标记试剂，包括原位产生所述标记试剂，其中所述原位产生的标记试剂可用于标记分析物。
在图示的化合物中，基团Y-J-表示报告物部分。因此，可将同分异构和/或同量异位的标记试剂组进行编码，使得所述组的每种不同标记试剂具有相同的总质量但其中所述组的每种不同标记试剂的基团Y-J-被特别编码，例如通过利用一个或多个同位素富集部位进行，从而当基团Y-J-的基团J与所述标记的分析物(或其片段)的其余部分之间的键在质谱仪中断裂时，可形成具有独特质量的报告物离子(参见图1c)。与报告物部分(即信号离子或报告物离子)相关的离子的峰强度可与被分析样品中标记的分析物的量(常表示为浓度和/或量)相关联。因此，同分异构的和/或同量异位的标记试剂组可用于标记两种或更多种不同样品的分析物，其中所述标记试剂可因不同的样品而不同并且其中所述标记试剂可包含能与产生所述标记的分析物的样品关联的具有独特质量的报告物部分。因此，即使是通过对混合多种不同样品的标记产物而获得的标记的分析物的复杂混合物进行分析，也可将例如每个报告物部分的存在和/或量的信息与两种或更多种不同样品中的所述分析物相关联起来。
如本文中所述，可制备成组的九种或更多的同分异构和/或同量异位的标记试剂，从而允许9重(9-plex)或更多的实验(一种示例性分析的图示可见于图19a和19b中)。例如，有可能对各自进行不同标记后混合的9种(或更多种)不同样品中的分析物进行同时鉴定和/或定量。这样的分析可通过从9种不同样品(每种样品被图2a/2b或3a/3b所示组中的不同的标记试剂所标记)的混合物中确定独特的报告物离子(其可具有如图2c所示的结构)而实现。因此，本发明的实施方案特别适于复杂样品化合物的多重分析(multiplex)。例如，本发明的一些实施方案可用于蛋白质组分析和/或基因组分析，以及用于与基因组分析和蛋白质组分析有关的相关性研究。本发明的一些实施方案也可用于小分子分析，比如脂质、类固醇或氨基酸分析。可使用同分异构的和/或同量异位的试剂的实验性分析包括但不限于时间过程研究、生物标记物分析、多重蛋白质组分析、多维蛋白质鉴定技术实验(mudpit experiment)、亲和性Pull-down实验(affinity pull-down)、翻译后修饰(PTM)测定(参见例如公开的美国专利申请No.US 2005-0208550 A1)以及多重控制实验(multiple control experiments)。



本领域技术人员将理解以下所描述的附图仅用于举例说明的目的。所述附图并非意在以任何方式限制本发明教导的范围。
图1a是标记试剂或标记的分析物的组成部分及其断裂性质的举例说明。
图1b是示例性的基于N-甲基哌嗪的标记试剂或标记的分析物的一般组成部分及其断裂性质的举例说明。
图1c是被鉴定通式的标记的分析物的一般组成部分及其断裂性质的举例说明。
图1d是一些示例性的同量异位的标记试剂的通式的说明。
图2a是不同同量异位化合物的举例说明，其中所述化合物与图2b所示化合物一起能形成9-重组(a 9-plex set)。
图2b是不同同量异位化合物的举例说明，其中所述化合物与图2a所示化合物一起能形成9-重组。
图2c是用于报告物离子(即信号离子)的各种可能结构的举例说明，所述报告物离子可由图2a、2b、3a和3b中所示的同量异位化合物产生。
图3a是不同同量异位化合物的举例说明，其中所述化合物与图3b所示化合物一起能形成9-重组，其中所述平衡物包含环结构。
图3b是不同同量异位化合物的举例说明，其中所述化合物与图3a所示化合物一起能形成9-重组，其中平衡物包含环结构。
图4a是示例性的同量异位化合物的说明。
图4b是示例性的同分异构的同量异位化合物的说明。
图5是将示例性的载体结合的标记的分析物从载体上断开的过程的举例说明。
图6a是标记试剂或标记的分析物的举例说明，其中所述报告物包含多个同位素富集部位。
图6b是标记试剂或标记的分析物的举例说明，其中所述平衡物(连接物)包含多个同位素富集部位。
图7a是示例性标记试剂的示例性合成的步骤1-3的说明。
图7b是示例性标记试剂的示例性合成的步骤4-5的说明。
图7c是示例性标记试剂的示例性合成的步骤6-7的说明。
图8是合成多种活性酯的方案的举例说明。
图9a是举例说明同位素编码的原料的表，通过实践本文中所公开的本发明，所述原料能用于制备多种同量异位化合物。
图9b是举例说明同位素编码的原料的表，通过实践本文中所公开的本发明，所述原料能用于制备多种同量异位化合物。
图9c是举例说明同位素编码的原料的表，通过实践本文中所公开的本发明，所述原料能用于制备多种同量异位化合物。
图10a是举例说明同位素编码的原料的表，通过实践本文中所公开的本发明，所述原料能用于制备多种同量异位化合物。
图10b是举例说明同位素编码的原料的表，通过实践本文中所公开的本发明，所述原料能用于制备多种同量异位化合物。
图10c是举例说明同位素编码的原料的表，通过实践本文中所公开的本发明，所述原料能用于制备多种同量异位化合物。
图11a是对编码的肌氨酸衍生物的一种可能合成途径的举例说明，所述编码的肌氨酸衍生物可用于制备编码的N-甲基-哌嗪衍生物。
图11b是对编码的肌氨酸衍生物的一种可能合成途径的举例说明，所述编码的肌氨酸衍生物可用于制备编码的N-甲基-哌嗪衍生物。
图12a是对包含两个同位素编码部位的编码的N-甲基乙二胺的一种可能合成途径的举例说明。
图12b是对包含四个同位素编码部位的编码的N-甲基乙二胺的一种可能合成途径的举例说明。
图12c是对包含四个同位素编码部位的编码的N-甲基乙二胺的一种可能合成途径的举例说明。
图12d是对包含四个同位素编码部位的编码的哌嗪的一种可能合成途径的举例说明。
图12e是对包含两个同位素编码部位的编码的哌嗪的一种可能合成途径的举例说明。
图13是对使用同量异位的标记试剂组(即标记物1和标记物2)处理测试样品和对照样品的一种可能工作流程的举例说明。
图14a是对使用同量异位的标记试剂组(即标记物1和标记物2)处理测试样品和对照样品的一种可能工作流程的举例说明。
图14b是对捕获支持物的组成部分的举例说明。
图14c是对示例性的捕获支持物的举例说明。
图15是对使用同量异位的标记试剂组(即标记物1和标记物2)处理测试样品和对照样品的一种可能工作流程的举例说明。
图16是对使用同量异位的标记试剂组(即标记物1、标记物2、标记物3和标记物4)处理两种蛋白质样品的一种可能工作流程的举例说明。
图17是对使用同量异位的标记试剂组(即标记物1、标记物2、标记物3和标记物4)处理两种蛋白质样品的一种可能工作流程的举例说明。
图18是对使用同量异位的标记试剂组(即标记物1、标记物2、标记物3、标记物4、标记物5和标记物6)处理两种蛋白质样品的一种可能工作流程的举例说明。
图19a是对所选质量的肽的MS分析的标记物和产物(尤其是m/z)的举例说明，其中所述所选质量的肽源自采用同量异位的标记试剂组进行不同标记的9种不同样品。
图19b是对9种不同标记的肽(具有特定的m/z值)的MS/MS分析结果的举例说明，其中所述肽选自如图19a中所示的MS分析。
图20是对一些示例性标记试剂的可能途径的举例说明。
图21是对一些示例性标记试剂的可能途径的举例说明。
图22a是使用本文中所述的未编码形式的示例性标记试剂标记的肽([Glu1]-人血纤维蛋白肽B)的MS数据的谱图。
图22b是在图22a中所示的标记的肽的所选峰的MS/MS数据谱图，其中将所述肽进行CID断裂和片段的再分析。
图23a是使用本文中所述的未编码形式的示例性标记试剂标记的肽([Glu1]-人血纤维蛋白肽B)的MS数据谱图。
图23b是在图23a中所示的标记的肽的所选峰的MS/MS数据谱图，其中将所述肽进行CID断裂和片段的再分析。
图24a是使用本文中所述的未编码形式的示例性标记试剂标记的肽([Glu1]-人血纤维蛋白肽B)的MS数据谱图。
图24b是在图24a中所示的标记的肽的所选峰的MS/MS数据谱图，其中将所述肽进行CID断裂和片段的再分析。
图25a是对不同同量异位试剂的举例说明，其中所述试剂与图25b所示化合物一起能形成8-重组(8-plex set)。
图25b是对不同同量异位试剂的举例说明，其中所述试剂与图25a所示化合物一起能形成8-重组。
图26a是对不同同量异位试剂的举例说明，其中所述试剂与图26b所示化合物一起能形成8-重组。
图26b是对不同同量异位试剂的举例说明，其中所述试剂与图26a所示化合物一起能形成8-重组。
图27a是对示例性标记试剂的示例性合成的步骤1-3的说明。
图27b是对示例性标记试剂的示例性合成的步骤4-5的说明。
图27c是对示例性标记试剂的示例性合成的步骤6-7的说明。
图28a是对包含两个同位素编码部位的编码的N-甲基乙二胺的一种可能合成途径的举例说明。
图28b是对包含六个同位素编码部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成的举例说明。
图29a是对包含四个同位素编码部位的编码的N-甲基乙二胺的一种可能合成途径的举例说明。
图29b是对包含八个同位素编码部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成的举例说明。
在本申请中所引用的全部文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和互联网页，不论这些文献和类似材料的格式如何，为任何的和所有的目的，均明确地通过引用而整体并入本文中。
定义 出于解释本发明的目的，将使用以下定义，如果需要，任何时候以单数使用的术语也包括其复数形式，并且反之亦然。出于解释本说明书及其所附权利要求书的目的，当以下提出的任何定义与其它任何文件(包括通过引用并入本文中的任何文件)中的词语的用法相抵触时，将总是以下面提出的定义为准，除非清楚地表明了相反的意思(例如在术语最初使用的文件中)。除非另有说明或者“和/或”的使用明显不合适的情况下，本文中“或”的使用总是意指“和/或”。除非另有说明或者“一个或多个”的使用明显不合适的情况下，本文中“一个”的使用总是意指“一个或多个”。“包含”、“包括”、“含有”的使用可以互换，而且并非意在限制。另外，在对一个或多个实施方案的描述中使用了术语“包含”(“包括”)的情况下，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，所述一个或多个实施方案也可由短语“基本上由...组成”和/或“由...组成”进行描述。
a.)本文中使用的“分析物”意指可测定的感兴趣的分子。分析物的非限定性实例包括但不限于蛋白质、肽、核酸(DNA或RNA)、碳水化合物、脂质、类固醇和分子量小于1500道尔顿(Da)的其它小分子。分析物的来源、或包含所述分析物的样品并不限制其可来自任何来源。分析物可以是天然的或合成的。分析物或包含分析物的样品的来源的非限定性实例包括细胞或组织、或其培养物(或传代培养物)。分析物来源的其它非限定性实例包括但不限于粗的或加工的细胞溶解产物、体液、组织提取物、细胞提取物或来自分离过程(比如色谱分离、一维电泳分离、二维电泳分离或毛细管电泳分离)的级分(或部分)。体液包括但不限于血液、尿、粪便、脑液、羊水、淋巴液或腺体分泌的流体。处理的细胞溶解物意指除了溶解细胞所需要的处理以外，还处理所述细胞溶解物以进行对所收集材料的其它处理。例如，所述样品可以是包含一种或多种分析物的细胞溶解物，所述分析物是通过利用一种或多种蛋白水解酶处理细胞溶解物以消化前体肽和/或蛋白而形成的肽. b.)酯”意指酯和/或硫酯，除非其所使用的上下文中清楚地表明并非如此(例如当参考另外指出的具体结构时)。
c.)本文中所使用的“断裂”意指共价键的断裂。
d.)本文中所使用的“片段”/“断裂”(“fragment”)意指断裂的产物(名词)或引起断裂的操作(动词)。
e.)本文中所用的“水合物形式”意指化合物或混合物的任何水合状态或化合物的多于一种的水合状态。例如，本文中所述标记试剂可以是半水合物、一水合物、二水合物等。此外，本文中所述标记试剂的样品可同时包含一水合物、二水合物和半水合物的形式。
f.)本文中所用的卤素基团指-F、-Cl、-Br或-I。
g.)本文中对化合物所使用的“同位素富集的”意指已经富集了一种或多种重原子同位素(例如稳定的同位素，比如氘、13C、15N、18O、37Cl或81Br)的化合物(例如标记试剂)。在一些实施方案中，也可以使用不稳定的同位素(例如14C或3H)。“富集的”意指重原子同位素的量超过了天然同位素的丰度。在不同的实施方案中，同位素富集的化合物可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个同位素富集的部位。
因为同位素富集并不是100％的有效，所以在化合物的样品中可存在处于较少的富集状态且具有较低质量的杂质。同样，由于过于富集(例如不期望的富集)以及由于天然同位素的丰度，可在化合物的样品中存在较大质量的杂质。在一些实施方案中，所引入的每种重原子同位素可以至少80％的同位素纯度存在于同位素富集部位。在一些实施方案中，所引入的每种重原子同位素可以至少93％的同位素纯度存在于同位素富集部位。在一些实施方案中，所引入的每种重原子同位素可以至少96％的同位素纯度存在于同位素富集部位。在一些实施方案中，所引入的每种重原子同位素可以至少98％的同位素纯度存在于同位素富集部位。
h.)本文中所使用的“同位素富集部位”意指化合物中的部位，在所述部位用重的原子同位素替代该原子的轻的同位素(例如13C替代12C，18O替代16O，15N替代14N，或者氘替代氢)。
i.)本文中对于化合物所使用的“轻”意指未用重原子同位素进行富集的化合物。本文中对于原子所使用的“轻”意指所述原子最低质量的同位素。本文中对于化合物所使用的“重”意指用至少一种重原子进行同位素富集的化合物。本文中对于原子所使用的“重”意指所述原子的重质量同位素。
j.)本文中所使用的“标记试剂”意指适于标记用于测定的分析物的结构部分。术语标记物(“label”)与术语标签(“tag”)和标记(“mark”)以及其它等价的术语和短语是同义的。例如，标记的分析物(labeledanalyte)还可以称为标记的分析物(tagged analyte)或标记的分析物(marked analyte)。因此，术语“标记物”(“label”)、“标签”(“tag”)、质量标签(“mass tag”)、标记(“mark”)以及这些术语的派生词是等价的和可互换的，并且指适于标记或者已经标记用于测定的分析物的结构部分。有时候标记试剂可称为标签试剂(“tagging reagent”)或质量标签试剂(“mass-tagging reagent”)。
k.)本文中所使用的“天然同位素丰度”意指，基于自然界中天然占优势的一种或多种同位素，在化合物中发现的一种或多种重同位素的水平(或分布)。例如，得自活植物材料的天然化合物通常包含相对于12C的约1.08％的13C。
l.)本文中所使用的同量异位物(isobar)是具有相同的标称总质量的在结构上不能区分的化合物(除了重原子同位素的同位素含量和/或分布以外)。为免除疑惑，根据本文中的定义，图4a的化合物1-4是同量异位的。相比较而言，本文中所使用的异构体是具有相同的标称总质量的在结构上能区分的化合物。示例性的异构的同量异位物在图4b中说明。
m.)本文中所使用的“载体”、“固相载体”(“solid support”、“solidcarrier”)或树脂意指任何固相材料。固相载体包括术语比如“载体”(“support”)、“合成载体”、“固相”、“表面”、“膜”和/或“载体”(“support”)。固相载体可由有机聚合物组成，比如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺、以及其共聚物和接枝物。固相载体还可以是无机物，比如玻璃、二氧化硅、可控孔度玻璃(CPG)、或反相二氧化硅。固相载体的外形可以为珠、球、微粒、颗粒、凝胶、膜或表面的形式。表面可以是平面的、基本平面的、或非平面的。固相载体可以是多孔的或非多孔的，并且可具有膨胀或非膨胀的性质。固相载体可以设计成池、凹陷或其它容器、管、特征或位置的形式。多个固相载体可以设置为处于阵列的不同位置，对试剂的自动递送是可寻址的，或通过检测方法和/或设备寻址。
n.)本文中所使用的“样品或其部分”或“样品部分”可用于指样品的一部分。样品的部分可以通过简单取出样品的一部分而得到，或者其可通过进行使样品被分级为两个或多个部分的分离过程而得到。除非说明书的内容中另外指出，这些术语是等价的并可互换，意指样品产生的任何类型的部分。
o.)本文中所使用的“信号离子”和“报告物离子”是可以互换的，并且都是指通过使标记试剂或标记的分析物断裂而由报告物部分产生的具有独特质量的报告物离子。信号离子或报告物离子鉴定所述用于标记分析物的独特的标记试剂，其在MS/MS分析中的峰强度可与存在于分析样品中的标记的分析物的量相关。本文中所使用的信号离子或报告物离子有时候仅称为报告物。本文中所使用的报告物部分有时候也仅称为报告物。应当理解，报告物部分指与标记试剂、标记的分析物或其片段相结合的基团，报告物离子指通过断裂连接所述报告物部分和所述标记试剂、标记的分析物或其片段的键而形成的片段。因此，在本文中使用“报告物”时将表明其本义。还应当理解，短语“独特的报告物部分”与“具有独特质量的报告物部分”是等价的并可互换，“独特的报告物离子”与“具有独特质量的报告物离子”是等价的并可互换。
p.)本文中所使用的术语“盐形式”包括化合物的盐或化合物的盐混合物。此外，化合物的两性离子形式也包含在术语“盐形式”中。具有胺或其它碱性基团的化合物的盐例如可以通过使之与合适的有机酸或无机酸(比如盐酸、氢溴酸、乙酸、高氯酸等)反应而得到。具有季铵基团的化合物也可含有反离子比如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根离子、高氯酸根离子等。具有羧酸或其它酸性官能团的化合物的盐可通过使所述化合物与合适的碱(例如氢氧化物碱)反应而制得。因此，酸官能团的盐可具有反离子，比如钠离子、钾离子、镁离子、钙离子等。
q.)本文中所使用的“合成化合物”意指通过操纵过程包括操纵天然发生途径而产生的化合物。因此，可利用合成化学技术制备合成化合物。然而，本文中所使用的“合成化合物”还意指包括例如通过酶方法而产生的化合物，所述酶方法包括例如给有机体(比如细菌或酵母)提供同位素富集的化合物，所述有机体改变这些化合物从而产生本文中所述的同位素富集的标记试剂或所述标记试剂的中间体。
r.)本文中所使用的“合成富集的”指操纵合成或天然过程从而产生本文中所述的同位素富集的标记试剂、或所述标记制剂的中间体。
s.)已公认，原子或分子的质量可以是近似的，常常是最接近的整个原子质量单位或最接近的以十或以百计的原子质量单位。本文中所使用的“总质量”指在以下范围内的绝对质量和近似质量，所述范围中不同原子类型的同位素的使用在质量上如此接近以至于它们在平衡所述报告物和/或连接物部分的质量(从而所述报告物/连接物组合的总质量在同分异构和/或同量异位的标记试剂的组或试剂盒中相同)的目的上在功能上是等价的，而无论所使用的不同同位素类型在质量上非常小的差异能否检测得到。
例如，氧的常见同位素具有16.0(实际质量15.9949)和18.0(实际质量17.9992)的总质量，碳的常见同位素具有12.0(实际质量12.00000)和13.0(实际质量13.00336)的总质量，氮的常见同位素具有14.0(实际质量14.0031)和15.0(实际质量15.0001)的总质量。虽然这些值是估计的，但本领域技术人员将会理解，如果在组中的一个标记物内的同位素富集部位使用18O同位素，那么额外的2个质量单位(超出总质量16.0的氧同位素)可以例如通过引入其它的标记物而在所述包含16O组的不同标记物中补偿两个碳13C原子替代两个12C原子，两个15N原子替代14N，甚至一个13C原子和一个15N原子替代12C和14N以补偿给18O。通过此方法，所述组内的两个不同标记物可具有相同的总质量，因为在使用两个13C原子(替代两个12C原子)、两个15N原子(替代两个14N原子)、一个13C和一个15N(替代12C和14N)或一个18O原子(替代一个16O原子)从而使得所述组或试剂盒的所有标记物在质量上增加两个道尔顿时，它们之间的质量差别实际上非常小，不会实质上妨碍所述分析。
这一点可以参考图4a得到说明。在图4a中，化合物3(图4a；分子式C513CH1115N2O)的报告物/连接物组合具有两个15N原子和一个13C原子，总理论质量为130.085。相比而言，同量异位物1(图4a；分子式C513CH11N218O)具有一个18O原子和一个13C原子，总理论质量为130.095。尽管所述报告物/连接物部分存在微小的绝对质量差异(质量130.095与质量130.085)，化合物1和3可以是同量异位物，它们除了重原子同位素的含量以外，在结构上不可区分。然而，出于本发明的目的，化合物1和3的报告物/连接物部分的总质量都是130.1，因为无论质谱仪是否灵敏到足以测量同量异位物1和3所产生的报告物离子的绝对质量间的微小差异，都不会对分析造成妨碍。
同样，参考图4b，举例说明了两种同分异构的同量异位物，其中化合物5和6的报告物/连接物部分的质量分别是144.111和144.100。出于本发明的目的，这些化合物的报告物/连接物部分的总质量都是144.1，因为无论质谱仪是否灵敏到足以测量同量异位物5和6所产生的报告物离子的绝对质量间的小差异，都不会对分析造成妨碍。
从图4a和4b清楚可见，相同重原子同位素在结构内的分布对于产生同分异构和/或同量异位的标记试剂的组而言并不是唯一的考虑因素。可以将重原子同位素类型混合以实现所期望总质量的同分异构体和/或同量异位物。这样，重原子同位素的选择(组合)及其分布都是在制备可用于本发明实施方案的同分异构和/或同量异位的标记试剂时可以考虑的因素。
t.)本文中所使用的术语“烷基”指直链或支链的C2-C8烃或环状C3-C8烃(即环烷基，比如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环己基亚甲基)，其可以是完全饱和的。当在本文中使用时，术语“烷基”指可被取代或未取代的基团。术语“烷基”还意指其中烷基链上的一个或多个亚甲基可以被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些实施方案中，烷基可以是直链或支链的C2-C6烃或环状C3-C6烃，其可以是完全饱和的。
u.)本文中所使用的术语“亚烷基”指包含连接到至少两个结构部分的至少两个点的直链或支链的烷基链或环烷基基团(例如{CH2}-(亚甲基)、-{CH2CH2}-(亚乙基)、

等，其中括号{}表示连接的点)。当在本文中使用时，术语“亚烷基”指可被取代或未取代的基团。术语“亚烷基”还意指其中亚烷基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可以被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些实施方案中，亚烷基可以是C1-C10烃。在一些实施方案中，亚烷基可以是C2-C6烃。
v.)本文中所使用的术语“烯基”指包含一个或多个双键的直链或支链C2-C8烃或环状C3-C8烃。当在本文中使用时，术语“烯基”指可以被取代或未取代的基团。术语“烯基”还意指其中烯基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可以被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些实施方案中，烯基可以是具有一个或多个双键的直链或支链的C2-C6烃或环状的C3-C6烃。
w.)本文中所使用的术语“亚烯基”指包含连接到至少两个部分上的两个点的烯基。当在本文中使用时，术语“亚烯基”指可以被取代或未取代的基团。术语“亚烯基”还意指其中亚烯基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。
x.)本文中所使用的术语“炔基”指包含一个或多个叁键的直链或支链C2-C8烃或环状C3-C8烃。当在本文中使用时，术语“炔基”指可以被取代或未取代的的基团。术语“炔基”还意指其中炔基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。在一些实施方案中，炔基可以是具有一个或多个叁键的直链或支链的C2-C6烃或环状的C3-C6烃。
y.)本文中所使用的术语“亚炔基”指包含连接到至少两个部分上的两个点的炔基。当在本文中使用时，术语“亚炔基”指可以被取代或未取代的的基团。术语“亚炔基”还意指其中亚炔基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。
z.)本文中所使用的术语“脂肪族”指如上述定义的任何直链、支链或环状的烷基、烯基和炔基部分。当在本文中使用时，术语“脂肪族”指可被取代或未取代的基团。
aa.)本文中所使用的术语“芳基”(单独或作为另一结构(例如芳基烷基等)的一部分时)指碳环芳香性基团，比如苯基。芳基还包括稠合的多环芳香环系，其中碳环芳香环与其它碳环芳香环稠合(例如1-萘基、2-萘基、1-蒽基、2-蒽基等)，或者其中碳环芳香环与一个或多个碳环非芳香环稠合(例如四氢萘、茚满等)。本文中所使用的术语“芳基”指可被取代或未取代的基团。
ab.)本文中所使用的术语“杂芳基”指包含1、2、3或4个彼此独立地选自氮、硫和氧的杂原子的芳香杂环。本文中所使用的术语“杂芳基”指可被取代或未取代的基团。杂芳基可以与一个或两个环稠合，比如环烷基、芳基或杂芳环。杂芳基与分子的连接点可以是杂芳基、环烷基、杂环烷基或芳基环，并且所述杂芳基可以通过碳原子或杂原子连接。杂芳基的实例包括咪唑基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噁唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、吲唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、吲嗪基、咪唑并吡啶基、吡唑基、三唑基、噁唑基、四唑基、苯并咪唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噁二唑基、吲哚基、四氢吲哚基、氮杂吲哚基(azaindolyl)、咪唑并吡啶基、喹唑啉基、嘌呤基、吡咯并[2，3]嘧啶基、吡唑并[3，4]嘧啶基或苯并(b)噻吩基，其中每个基团都可任选地被取代。
ac.)本文中所使用的术语“亚芳基”指包含至少连接到两个结构部分上的至少两个点的芳基或杂芳基(例如亚苯基等)。亚芳基与碳环非芳香环稠合的连接点可以在芳香环、非芳香环中的任一个上。本文中所使用的术语“亚芳基”指可被取代或未取代的基团。
ad.)本文中所使用的术语“芳基烷基”指通过亚烷基连接物与其它结构部分连接的芳基或杂芳基。本文中所使用的术语“芳基烷基”指可被取代或未取代的基团。术语“芳基烷基”意指其中芳基烷基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。
ae.)本文中所使用的术语“亚芳基烷基”指具有与至少两个结构部分相连的至少两个点的芳基烷基。连接的第二点可以在芳环或亚烷基中的任一个上。本文中所使用的术语“亚芳基烷基”指可被取代或未取代的基团。术语“亚芳基烷基”还意指其中亚芳基烷基的烷基链上的一个或多个亚甲基(如果有的话)可被杂原子如-O-、-Si-或-S-取代的那些化合物。当亚芳基烷基被取代时，取代基可以在所述亚芳基烷基的芳香环或亚烷基部分中的任一个或两个上。
af.)本文中所使用的术语“任选取代的”和“取代或未取代的”是等价和可互换的。任何烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、芳基、芳基烷基、亚芳基、杂芳基或亚芳基烷基的合适取代基包括在本发明实施方案中所使用的反应条件下稳定的任何取代基。合适取代基的非限定性实例可包括烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环己基等)、卤代烷基(例如三氟甲基、2，2，2-三氟乙基等)、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、芳基(例如苯基)、芳基烷基(例如苄基)、硝基、氰基、季铵化的氮原子或卤素基团(例如氟、氯、溴和/或碘)。
此外，烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、芳基、芳基烷基、亚芳基、杂芳基或亚芳基烷基的任何部分也可以被＝O或＝S取代。
ah.)本文中所使用的术语“活性酯”指可在碱性条件下易于与胺、醇和某些硫醇反应而分别得到酰胺、酯和硫酯的化合物。另外请参考Leo A Paquette，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis.Vol.2，John Wiley and Sons，New York，1995，其作为证据表明活性酯是有机化学领域中沿用已久的术语。
ai.)本文中所使用的术语“杂环”指在所述一个或多个环中包含至少两种不同元素的原子的任何环状分子结构。另外请参考OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Oxford UniversityPress，Oxford，1997，其作为证据表明杂环是有机化学领域中沿用已久的术语。
aj.)本文中所使用的术语“离去基团”指在取代反应或置换反应中离去的任何带电荷或不带电荷的原子或基团，其被认为是反应基质的残余物或主要部分。另外请参考Oxford Dictionary of Biochemistry andMolecular Biology，Oxford University Press，Oxford，1997，其作为证据表明离去基团是有机化学领域中沿用已久的术语。
ak.)本文中所使用的术语“保护基团”指与分子中的官能团反应并与之结合以防止所述官能团受到该分子随后参与的反应的影响的化学基团，其随后可被脱除从而再生未保护的官能团。另外请参考OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Oxford UniversityPress，Oxford，1997，其作为证据表明保护基团是有机化学领域中沿用已久的术语。
具体实施方案 应当理解，在此“概要”部分中的以下讨论可涉及本发明的各种实施方案的一些或全部。
1.概要 标记试剂 如前所述，标记试剂通常包含报告物部分、平衡物部分(或连接物部分)和反应活性基团(图1a)。本文中公开的一些新型标记试剂可由通式I’所代表，包括其盐形式和/或其水合物形式
报告物 平衡物 其中Z’代表反应活性基团或所述反应活性基团的离去基团，其中所述原子或基团X1、X2、R1、R2、Y、J、K和L在下面进行更详细地描述。对于式I’所代表的化合物而言，标出了所述分子的报告物部分和平衡物部分。其它同量异位的标记试剂的式子可见于图1d中。
反应活性基团 在方法、混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案中使用的标记试剂的反应活性基团(有时用缩写“RG”表示)可以是亲电性的或亲核性的基团，其能与样品的一种或多种反应活性分析物的一种或多种官能团反应。应当理解，在一些情况下，可认为反应活性基团包含与连接物(平衡物)相结合的原子或基团。例如，如果反应活性基团是活性酯或酰基卤基团，那么出于平衡同分异构和/或同量异位的标记试剂组中的报告物部分的质量的目的，所述活性酯的羰基或酰基卤在一些情况下也可被认为是与连接物结合的，其中羰基碳存在于标记试剂和标记的分析物中。因此，在一些实施方案中，反应活性基团可理解为仅代表反应活性基团的离去基团。
还应当理解，当反应活性基团由下述一些具体结构部分代表时，分析物可通过一个或多个其它的原子或基团与连接物(平衡物)连接，所述其它的原子或基团可以被认为或不被认为是所述连接物(平衡物)的一部分。
反应活性基团可以预先存在或者其可在原位制备。反应活性基团的原位制备可以在缺乏反应活性分析物的情况下进行或者其可在存在反应活性分析物的情况下进行。例如，羧酸基团可以用水溶性的碳二亚胺(例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；EDC)进行原位修饰从而制得亲电性基团，所述亲电性基团能与分析物的亲核物比如烷基或芳基胺反应。在一些实施方案中，利用EDC对标记试剂的羧酸基团的活化可以在含胺(亲核物)分析物的存在下进行。在一些实施方案中，所述含胺(亲核物)分析物也可以在与EDC的初始反应进行之后加入。在另一些实施方案中，可通过原位除去保护基团而原位产生反应活性基团。因此，由本发明实施方案的方法、混合物、试剂盒和/或组合物可以预料到通过亲核物和/或亲电物的反应而影响分析物衍生化的任何存在的或新产生的试剂。
在标记试剂的反应活性基团是亲电物的情况下，所述亲电物能与一种或多种分析物的合适的亲核基团反应。在标记试剂的反应活性基团是亲核物的情况下，所述亲核物能与一种或多种分析物的合适的亲电基团反应。许多合适的亲核基团和亲电基团对是化学和生物化学领域中已知并常用的。包括可与分析物(例如蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、类固醇或质量小于1500道尔顿的其它小分子)结合的以实现其衍生化的合适的亲核或亲电基团的试剂的非限定性实例描述于PierceLife Science & Analytical Research Products Catalog & Handbook(aPerstorp Biotec Company)，Rockford，IL 61105，USA中。其它合适的试剂是本领域中众所周知的，并且它们可由多个其它供货商如Sigma-Aldrich处商购得到。
标记试剂的反应活性基团可以是胺反应活性基团。例如，胺反应活性基团可以是活性酯。活性酯在肽合成中是众所周知的，并且其指在通常用于肽合成的条件下可易于与氨基酸的N-α胺反应的某些酯(参见Leo A Paquette，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，Vol.2.John Wiley and Sons，New York，1995)。所述胺活性酯基团可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮酯(Dhbt)、羟基吡咯烷酮酯(NHP)、2，4-二卤代苯基酯(参见图8和以下标题“标记试剂制备方法的举例说明”下的内容)、2，2，2-三氟乙基酯或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯。例如，活性酯的离去基团(在本文的一些实施方案中通常称为Z’，比如在此情形下，变量RG仅与反应活性基团的离去基团部分是同义的)可以由以下各式所代表
其中X’是-O-或-S-，并且每个X”彼此独立地是-F、-Cl、-Br或-I(关于代表性化合物的活性酯的合成的更详细描述请参见美国公开专利申请No.US 2005-0148771 A1)。上述描述的都是活性酯的醇或硫醇离去基团，其中所述醇或硫醇离去基团可通过氨基酸的N-α-胺与所述活性酯基团的羰基碳反应而被置换。本领域普通技术人员应当清楚，可利用公知的方法及本文中的公开内容制备本文中所描述的任何合适的标记/标签试剂的活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺基酯)(另外请参照例如GregT.Hermanson(1996).＂The Chemistry of Reactive Groups＂in＂Bioconjugate Techniques＂Chapter 2 pages 137-165，Academic Press，(New York)；还请参照Innovation And Perspectives In Solid PhaseSynthesis，EditorRoger Epton，SPCC(UK)Ltd，Birmingham，1990)。
在一些实施方案中，标记试剂的反应活性基团可以是混合酸酐，因为已知混合酸酐与胺基团有效地反应从而产生酰胺键。混合酸酐是公知的并且可利用有机化学和/或肽化学领域内常用的方法进行制备。
在一些实施方案中，标记试剂的反应活性基团可以是酰卤基团，比如酰氟基团(参见Carpino等J.Am.Chem.Soc.，1129651(1990))或酰氯基团。
在一些实施方案中，标记试剂的反应活性基团可以是硫醇反应活性基团。例如，所述硫醇反应活性基团可以是马来酰亚胺、烷基卤化物、α-卤代酰基的芳基卤化物、α-卤代硫酮或α-卤代亚胺。卤化物或卤代意指氟、氯、溴或碘的原子。所述硫醇反应活性基团是众所周知的并可利用肽化学领域中常用的方法进行制备。
在一些实施方案中，标记试剂的反应活性基团可以是羟基反应活性基团。例如，所述羟基反应活性基团可以是三苯甲基卤化物或甲硅烷基卤化物活性部分。所述三苯甲基卤化物活性部分可以是取代的(例如X”’-甲氧基三苯甲基、X”’-二甲氧基三苯甲基、X”’-三甲氧基三苯甲基等)或未取代的，其中X是连接反应活性基团和连接物(即平衡物)的键。所述甲硅烷基活性部分可以是烷基取代的甲硅烷基卤化物，比如X”’-二甲基甲硅烷基、X”’-二三乙基甲硅烷基(X”’-ditriethylsilyl)、X”’-二丙基甲硅烷基、X”’-二异丙基甲硅烷基等)，其中X”’是连接反应活性基团和连接物(即平衡物)的键。所述反应活性基团是众所周知的并可利用核酸化学领域中常用的方法进行制备。
在一些实施方案中，标记试剂的反应活性基团可以是亲核物，比如氨基、羟基或硫醇基。在一些实施方案中，所述亲核反应活性基团可以是氨基烷基、羟基烷基或硫代烷基。所述反应活性基团是众所周知的并可利用有机化学领域中常用的方法进行制备。
报告物部分 本发明实施方案中使用的标记试剂的报告物部分(有时候使用缩写“RP”表示)可以是具有可测定的独特质量(或质荷比)的基团。因此，每组的报告物部分可具有独特的总质量。不同的报告物部分可包含一个或多个重原子同位素以达到其独特的总质量。例如，存在着碳(12C、13C和14C)、氮(14N和15N)、氧(16O和18O)或氢(氢、氘和氚)的同位素，并且可用于制备不同组的报告物部分。这些并非是限制性的，因为其它的轻原子和重原子同位素也可以用于报告物部分中。适于制备包含轻和重原子同位素的报告物部分的基础起始原料可从各商业来源购得，比如Cambridge Isotope Laboratories、Andover、MA(参见www.isotope.com的名单或“基础起始原料”)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支机构)。Cambridge Isotope Laboratories和Isotec也会按照客户合成协议制备所需要的化合物。同上。
报告物部分可包含固定的电荷或者能被离子化。因为报告物部分可包含固定的电荷或者能被离子化，所以标记试剂可能以盐(或盐的混合物)或两性离子的形式被分离或者用于标记反应活性分析物。报告物部分(或报告物离子)的离子化使其可在质谱仪中进行测定。因此，报告物部分在标记的分析物中的存在可作为片段离子(有时称为信号离子(或报告物离子))而测定。当离子化后，报告物离子可包含一个或多个净正电荷或净负电荷。因此，报告物离子可包含一个或多个酸性基团和/或碱性基团，因为这些基团可在质谱仪中容易地离子化。例如，报告物部分可包含一个或多个氮原子(正电荷)或一个或多个可离子化的酸性集团，比如羧酸基团、磺酸基团或磷酸基团(负电荷)。包含至少一种碱性氮的报告物部分的非限定性实例包括取代或未取代的含有吗啉、哌啶或哌嗪的化合物。
独特的报告物部分可与感兴趣的样品相结合，从而标记具有所述独特报告物部分的样品的一种或多种分析物。这样，有关独特报告物部分(通常作为报告物离子而被检测到)的信息可与有关样品的一种或全部分析物的信息相关联。然而，当测定报告物离子时，所述独特的报告物部分不必与分析物物理性连接，而是在标记的分析物的离子被断裂从而产生子片段离子(daughter fragment ion)和报告物离子后，报告物离子的独特的总质量例如可在串联的质量分析仪的第二次质量分析中进行测定。测定的报告物离子可用于鉴定测定的分析物所来源的样品。此外，所述独特的报告物离子相对于其它报告物离子或相对于与校正标准相关的报告物离子(例如用具体报告物标记的分析物)的量可用于测定样品中分析物的相对量和/或绝对量(常以浓度和/或量来表示)。因此，比如具体样品中的一种或多种分析物的量的信息可与用于标记每种具体样品的报告物部分相关联。在对一种或多种分析物的鉴定也被测定的情况下，所述信息可与涉及不同报告物离子的信息相关联，从而有利于对一个或多个样品中每种标记的分析物的鉴定和量的测定。
报告物部分可包含与取代或未取代的N-烷基化的乙酸部分的亚甲基碳共价键合的氮原子，其中所述取代或未取代的亚甲基基团而非羧酸基团是报告物的一部分。羧酸基团可用于将报告物与连接物连接起来。氮原子可被一个、两个或三个基团烷基化。例如，含有氮原子的部分可以是取代的仲胺，比如二甲胺、二乙胺或二丙胺。
报告物部分可以是包含环氮原子的5、6或7元杂环，所述环氮原子被取代或未取代的乙酸部分N-烷基化，分析物通过N-烷基乙酸部分的羰基碳连接到乙酸部分上，其中所述取代或未取代的亚甲基基团而非羧酸基团是报告物的一部分。杂环可以是芳香的或非芳香的。因此，报告物部分可以由式Y-J-表示，其中基团Y代表5、6或7元杂环，基团J代表乙酸部分的取代或未取代的亚甲基。杂环可以是取代的或未取代的。例如，杂环部分的取代基可包括烷基、烷氧基和/或芳基。取代基可包括保护或未保护的基团，比如适于将分析物连接到载体上的胺、羟基或硫醇基团。杂环可包含其它的杂原子比如一个或多个硅、氮、氧和/或硫原子。
可以选择报告物部分以便其在对分析物进行分析的通常条件下基本上不发生亚断裂(sub-fragment)。为清楚起见，这是个可选的而非必需的特征。可以选择报告物，使得在向质谱仪中标记的分析物施加离解能使其断裂的条件下报告物基本上不发生亚断裂。“基本上不发生亚断裂”意指在对感兴趣的分析物进行成功分析时，在上述背景噪音下难以或不可能检测到报告物的片段。
在一些实施方案中，可以有意进行选择，使报告物离子的总质量不同于寻求测定的分析物的质量或分析物的任何预计片段的质量。例如，在蛋白质或肽是分析物的情况下，可选择报告物离子的总质量，使之不同于任何天然存在的氨基酸或肽，或预计的其片段离子。这可有助于分析物的测定，因为基于分析物，具有同样一致质量的任何可能样品成分的缺乏可增加任何分析结果的可信度。肽的质量范围的实例可见于表1中，其中很少背景可预测到。
表1选择与肽分析相关的标记物片段离子m/z的可能的“安静区域” 报告物部分可以是非聚合的。可以选择报告物部分以产生m/z小于250原子质量单位(amu)的信号离子。可以选择报告物部分以产生m/z小于200amu的信号离子。可以选择报告物部分以产生m/z小于150amu的信号离子。这些小分子可容易地在第二级质谱分析中测定，其不含有其它的在一级质谱分析中具有同样一致质量的样品成分。在本文中，可对在一级质谱分析中测定的所选离子进行二级质谱分析，通常在串联质谱仪(或者，例如通过单级仪器中的源后衰变)中进行。因为具有特定质荷比的离子可特定地从一级质谱分析中选择出来用于可能的断裂和进一步的质量分析，所以来自一级质谱分析的未选择的离子不被带到二级质谱分析中并因此不会污染二级质谱分析的谱图。此外，质谱仪的灵敏度和检测器的线性(出于定量目的)在此低质量范围内可相当稳健。而且，现阶段的质谱仪技术可允许在此质量范围内小于1道尔顿的基线质量分辨率。
平衡物(或连接物)部分 可用于本发明实施方案的标记试剂的平衡物(或连接物)部分(有时使用缩写“LK”表示)将报告物部分与分析物或报告物部分与反应活性基团连接起来，取决于与分析物的反应是否已发生。可选择连接物以产生中性物(即在质谱仪中经历中性丢失)，其中连接连接物和报告物部分的键(RL键)以及连接连接物与分析物的键(LA键)在质谱仪中断裂。可将连接物设计成当施加解离能级(包括亚断裂)时发生亚断裂，从而仅产生连接物的中性片段。可设计连接物以产生一种或多种可检测的片段。
连接物部分可包含一种或多种重原子同位素，从而其质量补偿给(用于混合物的每种标记的分析物的或用于标记试剂组和/或试剂盒的标记试剂的)报告物部分间的总质量差异。而且，报告物/连接物组合(即报告物/连接物部分)的集合总质量(即作为一个整体的总质量)对于混合物中每种标记的分析物而言或对于标记试剂组和/或试剂盒的标记试剂而言可以是相同的。更具体地，连接物部分可补偿不同样品中标记的分析物的报告物部分间的总质量差异，其中报告物部分的独特的总质量与标记的分析物所来源的样品相关联，并且报告物/连接物组合的集合总质量对于样品混合物中的每种标记的分析物而言都是相同的，而不管分析物所来源的样品如何。这样，当进行标记然后混合以产生样品混合物时，在两个或更多个不同样品中的相同分析物的总质量可具有同样的总质量。
例如，标记的分析物或用于标记分析物的标记试剂组和/或试剂盒的标记试剂可以是同分异构的和/或同量异位的。因此，如果在质谱仪中从样品混合物的初始质量分析中选择具有特定质荷比的离子(取自样品混合物)(即选择的离子)，则来自构成样品混合物的不同样品的同样分析物可代表与其在样品混合物中的各自浓度和/或量成比例的所选择的离子。因此，连接物不仅连接报告物和分析物，它还能用于补偿独特报告物部分的差异质量从而调和不同样品中标记的分析物的报告物/连接物部分的总质量(参照图2a/2b和3a/3b)。
因为连接物可用作报告物部分的质量平衡物，所以连接物中原子的数目越大，则标记试剂组和/或试剂盒的不同同分异构的/同量异位的标记试剂的可能数目也越大。换言之，通常连接物包含的原子数目越大，则存在的可能的报告物/连接物组合就越多，因为同位素可在连接物的大多数位置取代从而产生连接物部分的异构体和/或同量异位物，其中所述连接物部分用于补偿报告物部分的差异质量并因此产生独特的同分异构和/或同量异位的标记试剂组。这些不同的标记试剂组尤其适合同一和/或不同样品中分析物的多重分析。
在标记试剂组和/或试剂盒中的标记试剂的总数目可以是两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多。在组和/或试剂盒中的标记试剂的多样性仅受到报告物和连接物部分的原子数目、取代轻原子同位素的可用的重原子同位素以及不同合成构型(其中同位素可通过合成而置入)的限制。然而，如前文所表明，多种同位素富集的基础起始原料可容易地从制造商如CambridgeIsotope Laboratories和Isotec处得到。这些同位素富集的基础起始原料可在制备同分异构和同量异位的标记试剂组的合成过程中使用，或者用于生产在制备同分异构的和同量异位的标记试剂组的合成过程中使用的同位素富集的基础起始原料。此方面在以下标题“标记试剂制备方法的举例说明”下进行了更详细的论述。
制备适用于标记试剂组的同量异位标记试剂的一些实施例在下面进行更详细地论述。例如，连接物部分可由式1#代表
其中由X1、X2、K、L、R1和R2所代表的原子或基团在以下进行了更详细的描述。
报告物/连接物组合(即报告物/连接物部分) 标记试剂可包含彼此直接连接的报告物部分和连接物部分。如上所述，报告物/连接物部分对于标记试剂组和/或试剂盒中的每个成员而言在总质量上可以是相同的。此外，连接报告物部分和连接物部分的键经设计以便当施加解离能级时断裂所选离子的至少一部分，从而从连接物部分和/或连接物/分析物部分释放报告物离子。因此，可在MS/MS分析中直接检测报告物离子的总质量(在质谱仪中作为质比(即m/z)而被检测到)及其强度。
报告物/连接物部分可包含在标记试剂组或试剂盒中的各种标记试剂的相同或不同重原子同位素的各种组合。在科学文献中，这有时被称为“编码”(“coding”)、“同位素编码”(“isotope coding”)或简称为“编码”(“encoding”)。例如，Abersold等已公开了同位素编码的亲和力标签(ICAT；参见WO00/11208)。在一方面，Abersold等的试剂与本发明的标记试剂的不同之处在于Abersold没有教导两种或更多种相同质量的标记试剂，比如同分异构和/或同量异位的标记试剂。相反，Abersold等教导了其标记试剂的“轻”和“重”的形式。
在一些实施方案中，报告物和/或连接物部分可包含可用于将标记试剂或标记的分析物固定到载体上的原子或基团。固定可以是直接或间接的。例如，在一些实施方案中，如果与报告物和/或连接物结合的原子或基团(例如报告物和/或连接物的烷基胺取代基)与载体的反应活性基团(例如可断开的连接物)直接相互作用以实现固定，则可发生直接固定。相比而言，如果例如将报告物和/或连接物的取代基(例如报告物和/或连接物的烷基胺取代基)修饰(例如被生物素化)并且修饰基团与载体(例如抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素)的反应活性基团相互作用以实现固定，则发生间接固定。因此，本发明涉及其中分析物可与载体结合的标记试剂反应的实施方案，其中每种载体包含独特的标记试剂，从而不同的样品与不同的载体反应，并且本发明涉及其中每种不同的样品与不同的标记试剂反应并且反应产物此后被固定到相同或不同的载体上的实施方案。在每一种情况下，样品混合物通常都通过利用质谱仪将标记的分析物从用于分析的载体上断开而得到(参见图5)。
质谱仪/质谱法(MS) 可使用具有选择并断裂分子离子的能力的串联质谱仪和其它质谱仪实践本发明的方法。串联质谱仪(以及在较次要地位上的单级质谱仪)具有根据分子离子的质荷比(m/z)选择并断裂分子离子以及然后记录所得到的片段(子片段)离子谱的能力。更具体地，通过对所选离子施加解离能级(即碰撞诱导解离(CID))可产生子片段离子谱。例如，可从一级质谱分析中选择对应于具有特定m/z比的标记的肽，在二级质谱分析中对其进行断裂和再分析。能够进行这样的串联质量分析的代表性仪器包括但不限于磁性四区(magnetic four-sector)质谱仪、串联飞行时间质谱仪、三重四极杆质谱仪、离子阱质谱仪和混合四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪。
这些类型的质谱仪可与各种类型的电离源组合，所述电离源包括但不限于电喷雾离子化(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)。电离源可用于产生第一级质谱分析的带电物种，其中分析物不具有固定的电荷。其它的质谱法仪器和断裂方法包括MALDI-MS仪器中的源后衰变和使用MALDI-TOF(飞行时间)-TOF MS的高能量CID。关于串联质谱仪的新近综述请参见R.Aebersold和D.Goodlett，MassSpectrometry in Proteomics.Chem.Rev.101269-295(2001)。
通过解离能级(Dissociative Energy Level)的断裂 众所周知，键的断裂可作为发生在质谱仪中的过程的结果。而且，可通过给离子施加解离能级而在质谱仪中引起键断裂。例如，解离能级可在质谱仪中通过碰撞诱导解离(CID，有时也称为碰撞活化的解离或CAD)而产生。质谱领域内的普通技术人员将会理解，用于施加引起断裂的解离能级的其它示例性技术包括但不限于光解离、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD，参见美国公开专利申请No.2005-199804A1和Syka等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA.，101(26)9528-9533(2004))、以及表面诱导解离(SID)。出于解释本说明书的目的，解离能级还可认为包括任何类型的导致在质谱仪中断裂的气相化学反应。
通过碰撞诱导解离的断裂过程包括通过与惰性气体碰撞而使所选离子的动能状态增加到键断裂发生的点。例如，动能可通过与惰性气体(比如氮气、氦气或氩气)的碰撞而转移到碰撞池内。可转移给离子的动能的量与允许进入碰撞池的气体分子的数目成比例。当存在更多的气体分子时，更大量的动能可转移给所选的离子，当存在较少气体分子时，可转移较少的动能。
因此，很清楚质谱仪中的解离能级是可以控制的。还公认某些键较其它键更不稳定。分析物或报告物/连接物部分中的键的不稳定性取决于分析物或报告物/连接物部分的性质。因此，可调节解离能级以便分析物和/或标记物(例如报告物/连接物组合)以可测定的方式断裂。本领域技术人员会理解如何对质谱仪的部件进行这样的常规调节而实现合适的解离能级，从而将至少一部分的标记的分析物的离子断裂成离子化的报告物部分和子片段离子。
例如，可将解离能施加给从一级质谱分析中选择/分离的离子。在串联质谱仪中，可将解离能级施加给提取的离子，然后将其转移至二级质谱分析仪。选择的离子可具有所选的质荷比。质荷比可在由质谱仪的性质所决定的质荷比的范围内。当使用碰撞诱导解离时，通过使离子通过碰撞池，可将离子从一级质谱分析仪转移至二级质谱分析仪，在所述碰撞池内可施加解离能级从而产生片段离子。例如，被送至二级质谱分析仪用于分析的离子的实例包括残留的(未断裂的)所选离子的一些或一部分、以及报告物离子(信号离子)和标记的分析物的子片段离子。
通过计算机辅助数据库分析的分析物测定 在一些实施方案中，可基于子离子(daughter-ion)断裂模式测定分析物，所述子离子断裂模式通过计算机辅助的与已知或“理论的”分析物光谱的比较而分析。例如，在低能量CID下断裂的肽离子的子片段离子谱可以认为是许多离散的断裂事件的总和。共同的命名区分了子片段离子，根据断裂的酰胺键和在键断裂后仍带电荷的肽片段(Reopstorff等，Biomed.Mass Spectrom.，11601(1988))。在易断裂的酰胺键的N末端一侧保留的电荷导致形成b型离子。如果断裂的酰胺键的C末端一侧保留电荷，则片段离子称为y型离子。除了b型和y型离子以外，CID质谱可包含其它的诊断片段离子(子片段离子)。这些包括通过从谷氨酸、赖氨酸和精氨酸中性丢失氨(-17amu)或者从含有羟基的氨基酸(如丝氨酸和苏氨酸)丢失水(-18amu)而产生的离子。已经观察到在低能量CID条件下某些氨基酸较其它氨基酸更容易断裂。对于含有脯氨酸或天冬氨酸残基的肽而言，这尤其显而易见，对于天冬氨酰基-脯氨酸键来说甚至更是如此(Mak，M.等，Rapid Commun.MassSpectrom.，12837-842(1998))。因此，相比于所有其它氨基酸二聚体组合间的肽键，Z”’-pro二聚体或Z”’-asp二聚体的肽键(其中Z”’是任意中性氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸)倾向于更不稳定。
因此，对于肽和蛋白质样品来说，低能量CID谱包含交叠b系列和y系列离子、来自同一肽的内部片段离子、以及亚铵离子(immonium)和其它中性丢失离子的冗余的序列特异性信息。尽管对这样的CID谱进行解析以从头组装母体肽的氨基酸序列是具有挑战性并耗费时间的，但仍可进行。关于计算机辅助的从头测序方法的新近进展描述于Huang，Y.，Ross，P，Smirnov，I，Martin，S.和Pappin，D.2003，Proceedings of6th International Symposium on MS in Health and Life Sciences，Aug24-28，2003，San Francisco CA中。在鉴定肽序列方面的最有意义的进展是计算机算法的进展，所述算法使肽CID谱与已存在于蛋白质和DNA序列数据库中的肽序列相关联。这些方法通过程序如SEQUEST(Eng，J.等J.Am.Soc.Mass Spectrom.，5976-989(1994))和MASCOT(Perkins，D.等Electrophoresis，203551-3567(1999))而举例说明。
简而言之，实验的肽CID谱(MS/MS谱)与由计算机从得自蛋白质或基因组序列数据库的肽序列产生的“理论性”子片段离子谱相匹配或相关。此匹配或关联性基于在MS/MS模式中子片段离子的预测质量与所检测到的质量之间的相似性。根据此实验性与“理论性”断裂模式相符合的程度给可能的匹配性或相关性评分。对于给定的肽氨基酸序列的数据库检索的约束条件是如此有鉴别力，以至于单个的肽CID谱即可足以鉴定整个基因组或表达序列标签(EST)的数据库中的任何给定蛋白质。其它综述请参见Yates，J.R.Trends，Genetics，165-8(2000)和Yates，J.R.，Electrophoresis 19893-900(1998)。
因此，对MS/MS谱的子片段离子分析不仅可用于测定标记分析物的分析物，还可用于测定所述被测定的分析物所来源的分析物。例如，在MS/MS分析中肽的鉴定可用于测定蛋白质，所述肽作为酶消化的蛋白质产物从所述蛋白质断裂而来。可以预见，此分析可用于其它的分析物，比如核酸、脂质和/或类固醇。
RL键和LA键 报告物部分的原子与连接物部分的原子之间的键是RL键。连接物部分的原子与分析物的原子之间的键是LA键。在一些实施方案中，当被施加解离能级时，在至少一部分所选离子中的RL键和LA键均可断裂。因此，在一些实施方案中，可在质谱仪中调节解离能级，以便在标记分析物的至少一部分所选离子中的RL键和LA键均断裂。
RL键的断裂从分析物释放出报告物部分，以便可独立于分析物测定报告物离子。LA键的断裂从分析物释放出报告物/连接物部分，或者从分析物释放出连接物，这取决于是否RL键已经断裂。在一些实施方式中，RL键可比LA键更不稳定。在一些实施方案中，LA键可比RL键更不稳定。在一些实施方案中，RL键和LA键可具有同样的相对不稳定性。简而言之，在本发明的各种实施方案中，设计使RL键断裂，从而释放报告物离子，但LA键可能断裂或不断裂。
在一些实施方案中，当感兴趣的分析物是蛋白质或肽时，可调节RL键和LA键的酰胺(肽)键的相对不稳定性。相比于典型的酰胺(肽)键，RL键、LA键或RL键和LA键均可以更不稳定、同样稳定或较稳定。例如，在解离能的条件下，与Z”’-pro二聚体或Z”’-asp二聚体相比，RL键和/或LA键可以较不易于断裂，其中Z”’是任意天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在一些实施方案中，RL键和LA键可在典型酰胺键的大约相同的解离能级下断裂。在一些实施方案中，与典型的酰胺键相比，RL键和LA键可在更高解离能级下断裂。
在一些实施方案中，可存在RL键和LA键，以便RL键的断裂导致LA键的断裂，并且反之亦然。在此方法中，RL键和LA键基本上同时断裂，以便没有重要量的分析物或其子片段离子包含部分标记物。“重要量的分析物”意指少于25％、优选少于10％的部分标记的分析物可在质谱仪中(例如在MS/MS分析中)测定到。
在一些实施方案中，因为在质谱仪中(例如在MS/MS分析中)分析物的标记片段和未标记片段之间可存在清楚的界限，所以此特征可简化来自子片段离子谱的计算机辅助分析的分析物的鉴定，因为不需将标记物残留物的补偿施加给用于分析物的子片段离子的分析的质量计算。此外，因为分析物的片段离子在某些实施方案中是全标记或未标记的(但不是部分标记的)，所以很少存在或不存在由跨越断裂键的同位素分布所引起的质量分散，从而会存在这样的情况由于应用解离能级而引起标记的分析物的断裂，导致同位素存在于部分标记的分析物的单个易断键的每一侧。
分析物的标记 如前所述，可以通过使分析物的官能团与标记试剂的反应活性基团反应而标记分析物。分析物的官能团可以是亲电基团或亲核基团中的一种，标记试剂的官能团可以是亲电基团或亲核基团中的另一种。亲电物和亲核物可以反应以形成分析物与标记试剂间的共价连接。
标记反应可在溶液中发生。在一些实施方案中，分析物或标记试剂中的一种可以是载体结合的。标记反应有时可以在含水条件下进行。可以为标记生物分子(如蛋白质、肽和/或核酸)而选择含水条件。标记反应有时可在有机溶剂或有机溶剂的混合物中进行。可以选择小分子的分析物的有机溶剂。可在广泛范围内使用水和一种或多种有机溶剂的混合物。例如，可制备并使用水和约5％到与约95％的一种或多种有机溶剂(v/v)的溶液以标记分析物。在一些实施方案中，可制备并使用水和约50％到与约95％的一种或多种有机溶剂(v/v)的溶液以标记分析物。在一些实施方案中，可制备并使用水和约65％到与约80％的一种或多种有机溶剂(v/v)的溶液以标记分析物。有机溶剂的非限定性的实例包括N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、N-甲基吡咯烷(NMP)和醇类比如甲醇、乙醇、丙醇和/或丁醇。本领域技术人员根据标记试剂的性质和分析物的性质，利用不超过本领域可获知的知识和本文中公开的内容以及常规的实验，将能够确定促进分析物标记的合适的溶剂条件。
当进行标记反应时，可调节pH。pH可在4-10的范围内。pH也可在此范围以外。通常，可通过加入非亲核性有机碱而调节非水反应的碱性。合适的碱的非限定性实例包括N-甲基吗啉、三乙胺和N，N-二异丙基乙胺。或者，可利用生物缓冲剂(比如N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙磺酸](HEPES)或4-吗啉乙磺酸(MES))或无机缓冲剂(比如碳酸钠和/或碳酸氢钠)调节含水溶剂的pH。因为至少反应基团之一可以是亲电性的，所以选择不含任何亲核性基团的缓冲剂可能是理想的。在应用常规实验的条件下，本领域技术人员能够确定用于调节标记反应的pH的其它缓冲剂，从而促进使用标记试剂对分析物的标记。因此，本领域技术人员将能够根据标记试剂的性质和分析物的性质，利用不超过本文中公开的内容以及常规的实验来确定合适的溶剂和pH条件，从而促进分析物标记。
样品处理 在本发明的某些实施方案中，可在标记一种或多种分析物之前和之后处理样品。处理可促进对所述一种或多种分析物的标记。所述处理可促进对样品组分的分析。处理可简化对样品的操作。处理可促进前述的两项或更多项。
例如，可用酶或化学物处理样品。酶可以是蛋白酶(以降解蛋白质和肽)、核酸酶(以降解核酸)或一些其它的酶。可选择酶以具有恰好可预料的降解方式。还可以将两种或更多种蛋白酶和/或两种或更多种核酸酶一起使用，或与其它的酶使用，从而降解样品组分。
例如，蛋白水解酶胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，其断裂丝氨酸或精氨酸与非特定氨基酸之间的肽键从而产生包含胺末端(N末端)和丝氨酸或精氨酸羰基末端氨基酸(C末端)的肽。在此方法中，来自蛋白质断裂的肽是可预测的，其在来自胰蛋白酶消化物的样品中的存在和/或量可以成为其所来源的蛋白质的存在和/或量的指示。此外，肽的游离胺末端可以是促进肽的标记的良好亲核物。其它示例性的蛋白水解酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶(例如羧肽酶A、B、C等)。
例如，当用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化时，蛋白质(例如蛋白g)可能产生三种肽(例如肽B、C和D)。因此，已经用蛋白水解酶(比如胰蛋白酶)水解过并且当分析时确认含有肽B、C和D的样品可被认为最初包含蛋白g。肽B、C和D的量也将与消化的样品中蛋白g的量相关联。在此方法中，关于样品(或其部分)中肽B、C和D中的一种或多种的鉴定和/或定量的任何测定都可用来鉴定和/或定量最初样品(或其部分)中的蛋白质。
因为某些酶的活性是可预测的，所以由已知序列的蛋白质降解而产生的肽的序列也是可预测的。根据此信息，可产生“理论上的”肽信息。因此，在来自实际样品的质谱分析的子片段离子(如上所述)的计算机辅助分析中，对“理论上的”肽片段的测定可用于测定一种或多种未知样品中的一种或多种肽或蛋白质(例如参见以上标题为“通过计算机辅助数据库分析的分析物测定”的部分)。
在一些实施方案中，样品处理可包括对待标记的一种或多种分析物的前体的处理。例如，如果待标记的一种或多种分析物是源于消化的蛋白质的肽，并且对此实例来说选择标记试剂以使其与肽或肽分析物的胺基团(例如赖氨酸的N-α-胺基团和N-ε-胺基团)反应，可以促进标记反应的方式处理样品的蛋白质(分析物前体分子)。在此实例中，可用还原剂(例如三[2-羧乙基]膦(TCEP))将蛋白质还原，然后通过与封闭剂(例如甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS))的反应进行封闭。在此方法中，蛋白质的硫醇基团被封闭并因此不干扰分析物的胺与标记试剂之间的标记反应。
本领域技术人员将会理解，利用易得的试剂和借助常规实验可调整的方案，可进行对某些其它前体分子的处理。可根据待标记分析物和标记试剂的性质对试剂和条件进行精确选择。
在一些实施方案中，样品处理可包括将分析物或分析物前体固定到固体载体上，而不论是否用标记试剂标记。固定可包括共价固定和吸附以及其它的非共价固定方法(例如静电固定)。在一些实施方案中，固定可有助于降低产品的复杂性。在一些实施方案中，固定可有助于分析物标记。在一些实施方案中，固定可有助于分析物前体标记。在一些实施方案中，固定可有助于对具有某些性质(例如，它们具有或缺乏半胱氨酸部分)的样品组分的一部分进行选择性标记。在一些实施方案中，固定可有助于纯化。固定可有助于前述各项中的两项或多项。
包括分离样品混合物的分离 在一些实施方案中，对标记分析物的样品或样品混合物的处理可能涉及分离。可对标记或未标记的分析物、标记或未标记的分析物前体、或其部分进行一种或多种分离。可对得自固相捕获物或分离过程的其它产品的一种或多种部分进行一种或多种分离。可对前述各项中的两项或多项进行分离。
例如，可制备来自不同样品的包含不同标记分析物的样品混合物。“不同标记”意为彼此区别的每个标记物包含可鉴别的独特性质(例如每个标记物包含独特的报告物部分，所述独特的报告物部分在MS/MS分析中产生独特的“信号离子”)。为分析样品混合物，可分离所述样品混合物的组分并对所述样品混合物的仅一部分进行质量分析。在此方法中，分析物的复杂性可被充分降低，因为可对分离的分析物单独进行质量分析，因而增加了分析方法的灵敏度。当然可对样品混合物的一个或多个其它的部分进行重复分析一次或多次，从而可对所述样品混合物的所有部分进行分析。
分离条件(在所述条件下不同标记的相同分析物在与其在样品混合物中的丰度成比例的浓度或量下共洗脱)可用来测定每种样品(所述样品包括样品混合物)中的每种标记分析物的量，前提是每种样品被加到所述样品混合物中的量是已知的。因此，在一些实施方案中，样品混合物的分离可简化分析，并同时保持质量分析(例如MS/MS分析)中测定的信号与样品混合物中不同标记的分析物的量之间的相关性。
可通过色谱法进行分离。例如，可使用液相色谱/质谱(LC/MS)实现样品分离和质量分析。而且，可使用任何合适的色谱分离方法分离感兴趣的分析物。例如，色谱分离可以是正相色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法(即阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法)、体积排阻色谱法或亲和色谱法。
分离可以在电泳下进行。可使用的电泳分离技术的非限定性实例包括但不限于一维电泳分离、二维电泳分离和/或毛细管电泳分离。
可使用同量异位的标记试剂或试剂组来标记样品的分析物。当进行分离步骤时，同量异位的标记试剂尤其有用，因为标记试剂组的同量异位标记物在结构上不能区分(并且在分析物断裂除去报告物之前不可通过总质量进行区分)。因此，以不同的同量异位的标记物标记的相同组成的所有分析物都能以严格相同的方式进行色谱分离(即共洗脱)。因为它们在结构上不可区分，分离过程的洗脱物可包含一定量的同量异位的标记分析物，所述标记分析物与样品混合物中的标记分析物的量成比例。而且，根据制备样品混合物的知识(为制备样品混合物而加入的样品和其它可选成分(例如校正标准物)的份数)，可能使样品混合物中标记分析物的量与标记分析物所来源的样品中的标记分析物的量相关。
标记试剂也可以是同分异构的。尽管异构体有时可通过色谱分离，但存在条件依赖的情形，其中可进行分离过程以共洗脱所有被不同标记的同样分析物，其中存在于洗脱物中的全部标记分析物的量与其在样品混合物中的浓度和/或量成比例。
分析物的相对定量和绝对定量 在一些实施方案中，对样品混合物中不同标记的相同分析物进行相对定量是可能的。例如，通过与质量分析(例如在对一级质谱分析中所检测到的标记分析物进行选择并用于二级质谱分析)中测定的报告物离子(即信号离子)的相对量(例如报告的峰的面积和/或高度)进行比较，对不同标记的相同分析物进行相对定量是可能的。换言之，在每种报告物离子可与所用的特定样品的信息相关联以产生样品混合物的情况下，在质谱分析中报告物离子相对于所检测到的其它报告物离子的相对量，即是样品混合物中分析物的相对量。在形成样品混合物的组成成分已知的情况下，可基于所检测到的用于具有选定的质荷比的标记分析物的报告物离子的相对量，将用于制备样品混合物的每种样品中的分析物的相对量反算出来。对于在一级质谱分析中所检测到的所有不同标记分析物来说均可重复此过程。在此方法中，可测定用于制备样品混合物的每种不同样品中的每种反应活性分析物的相对量(常以浓度和/或量表示)。
在另一些实施方案中，可确定分析物的绝对定量。对于这些实施方案而言，可向样品混合物中加入已知量的一种或多种不同标记的分析物(一种或多种校正标准物)。校正标准物可以是用同分异构和/或同量异位的标记物或标记物组(用于标记样品混合物的分析物)标记的预期分析物，前提条件是所述校正标准物的报告物部分与用于形成样品混合物的任何样品相比是独特的。利用与样品混合物中不同标记的分析物的一种或多种报告物离子的相对量的相关性，一旦确定报告物离子相对所述一种或多种校正标准物的相对量，则可参考加入到样品混合物中的校正标准物的量而计算样品混合物中所有不同标记的分析物的绝对量(常以浓度和/或量表示)。在此方法中，还可基于制备样品混合物的方法的知识而确定每种不同标记的分析物(对其而言，在其来源的样品中存在校正标准物)的绝对量。
尽管有前述内容，但在需要时，还可针对报告物部分中任何天然或人工产生的同位素丰度做出报告物离子(信号离子)强度的修正。有多种方法修正报告物部分信号离子中杂质的同位素丰度。这样的修正方法的实例可见于公开的共同未决和共有的名称为“Method andApparatus For De-Convoluting A Convoluted Spectrum”的美国专利No.7,105,806。基本上，可利用数学公式和计算，通过对标记试剂的交叠同位素簇的褶合谱的退卷积计算而确定与单个标记试剂的同位素簇相关的加质量峰(up-mass peak)和减质量峰(down mass peak)。不管值是如何确定的，在准确定量每种报告物离子(即信号离子)的强度方面越谨慎，来源样品中分析物的相对定量和绝对定量就越准确。
蛋白质组分析 本发明的实施方案可用于复杂分析，因为可利用质量分析技术，以快速和重复的方式将样品多重化(multiplexed)、分析和再分析。例如，可进行样品混合物分析，以确定一种或多种样品中的一种或多种分析物的量。可针对样品混合物所包含的样品测定一种或多种分析物的量(常以浓度和/或量表示)。因为可快速进行样品处理和质量分析，所以这些方法可重复多次，以便可以测定样品混合物的多种不同标记分析物在分析物来源样品中的相对量和/或绝对量。
可使用这样的快速多重分析(multiplex analysis)的一种应用是在蛋白质组分析领域。蛋白质组学可看作是在生物过程的结构、功能和调控方面描述基因组序列中编码信息的一种实验性方法。这可以通过对细胞或组织所表达的总蛋白质成分的系统性分析而实现。与本发明的方法、混合物、试剂盒和/或组合物的实施方案组合使用的质谱是用于此综合蛋白质分析的一种可能工具。
例如，利用9种同量异位标记试剂组，可获得实验中的9个时间点以测定例如基于生长细胞对特定刺激物的应答的蛋白质表达的上调或下调。还可进行较少的时间点但引入一种或多种对照物。还可使同样的多重实验加倍或成三倍进行。在所有情形下，都可在单个多重实验中测定任选地相对于一种或多种任选的对照物和/或样品重复的蛋白质表达的上调或下调。此外，因为样品混合物的处理是平行进行的，所以结果是直接可比的，从而不需在方案或实验条件方面做出对微小变化的补偿。因此，这些同量异位的标记试剂可用的实验分析包括但不限于时间过程的实验、生物标记物分析、多重蛋白质组分析、多维蛋白质鉴定技术实验(mudpit experiments)、亲和性pull-downs实验(affinitypull-downs)、翻译后修饰测定(PTM)和多重控制实验(multiple controlexperiment)。
II.组合物 在一些实施方案中，本发明涉及由式I代表的包括其盐形式和/或水合物形式的组合物
其中，基团Y-J可以是任何报告物基团。合适的报告物基团的性质已在本文中前面描述过。合适的报告物基团的性质还在美国公开专利申请No.US 2004-0219685-A1中，尤其是第41-47段中描述过。
例如，报告物可包含可被取代或未取代的5、6或7元杂环，所述杂环可任选地可断开地连接到载体上，其中所述杂环包含通过共价键连接到基团J上的至少一个环氮原子。基团J可以是由式-CJ’2-所代表的取代或未取代的亚甲基，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3。基团K可以是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4。基团L可以是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；关于基团R1和R2，要么(1)R1是氢、氘或者R6，R2是氢、氘或R7；要么(2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6。原子或基团X1可以是＝O、＝S、＝NH或＝NR7，每个X2可以彼此独立地是＝O或＝S，每个X3可以彼此独立地是-O-或-S-。基团Z可以是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；其中，V+是带正电荷的反离子。每个R3、R4、R5、R6和/或R7彼此独立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。例如每个R3、R4、R5、R6和/或R7彼此独立地可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。每个R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此独立地可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。例如，每个R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此独立地可以是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚环丙基、亚正丁基、亚环丁基、亚正戊基、亚环戊基、亚正己基或亚环己基。
所述组合物可以是同位素富集的(即编码的)。所述组合物可以是同位素富集的以包含一种或多种重原子同位素。所述组合物可以是同位素富集的以包含两种或更多种重原子同位素。所述组合物可以是同位素富集的以包含三种或更多种重原子同位素。所述组合物可以是同位素富集的以包含四种或更多种重原子同位素。
所述5、6或7元杂环可以是包含至少一个氮原子的任何5、6或7元杂环，所述基团J可与所述氮原子共价连接。例如，所述杂环可以是取代或未取代的吗啉、哌啶或哌嗪。可能的取代基已在前面“定义”部分描述过，其中所述杂环可包括一种或多种所述取代基。例如，取代基可以是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或其它烷基。所述取代基可与所述环的杂原子相键合。例如，所述杂环可以是N-甲基哌嗪。所述杂环可以是芳香性或非芳香性的。
在一些实施方案中，报告物部分可以可断开地连接到载体上。各种载体是本领域中众所周知的。例如，各种包含三苯甲基部分的载体是商业出售的或者可制得的(例如三苯甲基氯载体(三苯甲基-Cl)或2-氯三苯甲基氯载体)。参照图5，举例说明了载体结合的标记试剂的一个实施方案。参照图5，可用分析物处理载体从而制得标记的分析物。如举例说明的，然后可用酸处理载体以释放出标记的分析物用于分析。
因此，在一些实施方案中，所述5、6或7元杂环可包含促进所述杂环与合适的载体的可断开结合的原子或基团。例如，所述基团可以是含有氨基、羟基或硫醇基的亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基基团。所述原子可以是哌嗪环上的仲氮。关于示例性哌嗪化合物及其制备方法的讨论可见于公开的美国专利申请US 2004-0219685 A1中。例如，可使所述载体结合的N-烷基哌嗪乙酸化合物与二胺反应，然后通过与二酸反应从而形成可用作标记试剂的载体结合的化合物，其中基于反应物的性质，同量异位编码是可能的。
再参照式I，基团Y-J-(不论其是否可断开地与载体连接)可形成报告物部分。所述报告物部分可包含至少一个同量异位富集部位。所述报告物部分可包含至少两个同量异位富集部位。所述报告物部分可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或更多个同量异位富集部位。例如，图6a举例说明了包含21个同量异位富集部位的N-甲基哌嗪报告物。
所述报告物部分可包含固定电荷或者在质谱仪中是可电离的。例如，含有碱性基团(例如胺基团)的化合物易于质子化以引入电荷，而含有酸性基团的化合物(例如羧酸基团)则易于脱质子而引入电荷(参见Roth，Kenneth等“Charge Derivatization of Peptides for Analysis byMass Spectrometry”，Mass Spectrometry Reviews，17255-274(1998))。
平衡物(连接物)部分可通过由式I#所代表的基团而形成
其中R1、R2、X1、X2、K和L如上定义。所述平衡物部分可包含至少一个同量异位富集部位。所述平衡物部分可包含至少两个同量异位富集部位。所述平衡物部分可包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17或更多个同量异位富集部位。例如，图6b举例说明了包含28个同量异位富集部位的平衡物部分，其中质量总增量可多达31道尔顿。
在一些实施方案中，所述组合物可由式II所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中W是取代六元杂环的至少一个M基团的原子或基团并且位于所述六元环的氮的邻位、间位或对位。基团W可以是-N(H)-、-N(R”)-、-N(R”’)-、-P(R”)-、-P(R”’)-、-O-或-S-。如果选为-N(R”’)-或-P(R”’)-，则该基团可用于将所述组合物与载体可断开地连接。每个余下的基团M可以彼此独立地是-CM’2-，其中每个M’可以彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R8、-OR8、-SR8、-R8’OR8或-R8’SR8。基团J、K、L、X1、X2、R1、R2和Z如前面所定义。每个R”彼此独立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基，每个R”’可以是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或将所述化合物可断开地与载体连接起来的可断开连接物。每个R8和/或R10可以彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基，R9’可以彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
在一些实施方案中，所述组合物可由式III所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中s可以是1～5的整数，t可以是1～10的整数。基团R1、R2和Z如前面所定义。原子和基团R11可以是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’，其中R”’如前面所定义。例如，可从如图2a和2b中所示的化合物V-XIII中之一选择所述组合物。
在一些实施方案中，所述组合物可由式IV所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，t、R11和Z如前面所定义。例如，可从如图3a和3b中所示的化合物XV-XXIII中之一选择所述组合物。
如所述，所述组合物可以其盐形式和/或水合物形式而存在。所述组合物是否作为盐形式存在通常取决于取代基的性质和数目以及组合物所存在和/或分离的条件。众所周知，通过用酸处理可以使碱性基团(比如胺)质子化，从而形成胺的盐。例如，含有哌嗪的标记试剂可作为单TFA盐、单HCl盐、二TFA盐或二HCl盐而得到(参见例如美国专利申请公开No.US 2005-0148771 A1)。还众所周知，通过用碱处理可以使酸性基团(比如羧酸)脱质子而形成羧酸盐。同上，例如，可以使羧酸的-OH或硫代羧酸的-SH脱质子而分别形成-O-V+和-S-V+，其中V+是碱性反离子(例如Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+或NH4+)。还众所周知，包含碱性基团(比如胺)和酸性基团(比如羧酸)的化合物可以两性离子形式存在。所有这些均被视为盐形式，组合物的这些官能团的离子化状态将取决于其所存在的任何溶液的pH，或者如果分离时，则取决于所分离的任何溶液的pH。本领域普通技术人员一定会理解，如何仅利用常规实验方法和本文中所公开的内容控制本文中所公开组合物的任何反离子盐形式的电荷状态和性质。
是否组合物作为水合物存在也将取决于其存在或分离的条件。水合物仅包含一个或多个络合的水分子。本发明涉及任何可能的水合物形式。
如上所述，基团Z可以与分析物共价键合。所述分析物可以通过使分析物与标记试剂反应而制得。所述分析物可以是任何分析物。例如，基团Z是肽或蛋白质。
基团Z可以是如前所述的反应活性基团。因此，在一些实施方案中，所述化合物可以是选自如下所述的化合物I’-XIII’或XV’-XXIII’中的任何的标记试剂。在一些实施方案中，所述组合物可以是标记试剂，比如如图25a和25b中化合物80’-87’所示的那些。
基团Z还可以是-OH、-SH、-O-V+或-S-V+。可将所述基团活化，从而产生反应活性基团的离去基团。所述活化的基团通常指活化的羧酸基团。例如，可使用如前所述的水溶性碳二亚胺EDC将羧酸基团(COOH)的-OH基原位活化。
基团Z还可以是反应活性基团(比如活化的羧酸基团或硫代羧酸基团(例如活性酯))的离去基团。例如，所述反应活性基团的离去基团可以是如前所述的式7-19的醇或硫醇离去基团。所述活性酯可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯(即在所述离去基团是化合物7且X’是-O-的情况下)。如前所述，可以使活性酯与分析物的亲核基团(比如氨基基团)反应，从而形成标记的分析物。因此，这样的化合物是标记试剂。
所述标记试剂可以是同分异构的和/或同量异位的。已经公开了所述标记试剂的其它性质。例如，所述标记试剂可用于同一样品或两种或更多种不同样品中的一种或多种分析物的多重分析。
所述标记试剂可以是同位素富集的(即编码的)。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含一种或多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含两种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含三种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含四种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含五种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含六种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含七种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含八种或更多种重原子同位素。所述标记试剂可以是同位素富集的以包含九种或更多种重原子同位素。
在一些实施方案中，组合物可以是标记的校正标准物。如本文中所述，可以将已知量的校正标准物加入到混合物中以促进感兴趣的分析物的绝对定量分析。因此，在一些实施方案中，本发明还涉及已用同分异构和/或同量异位的标记试剂标记的分析物，比如感兴趣的肽。因此，所述标记的校正标准物可以是用如本文中所述的标记试剂标记的任何分析物。通常，所述标记试剂可选自同分异构和/或同量异位的标记试剂组，以便其包含相比于用于标记一种或多种感兴趣样品的标记试剂的独特的报告物。
在一些实施方案中，标记分析物组合物可选自以下描述的化合物I”-XIII”或XV”-XXIII”中的任何一个。在一些实施方案中，组合物可以是标记的分析物，比如如图26a-26b中80”-87”所示的那些。
在一些实施方案中，所述组合物可以是片段离子。例如在一些实施方案中，所述组合物可以是在标记的分析物分子断裂后存在于质谱仪中的片段离子。例如，所述产生片段离子的标记的分析物分子可选自如图26a-26b所示的化合物80”-87”。因此，所述片段离子可具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。在一些实施方案中，所述分子式选自13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+和13C3C3H1315N2+。
所述片段离子可通过以下方式产生在质谱仪中使包含至少两种不同标记的分析物分子的样品混合物的一部分离子化，并以选定的断裂m/z值选择至少两种不同标记的分析物分子。然后可通过施加解离能级而断裂所选的不同标记的分析物分子，其中至少一种所述不同标记的分析物分子是选自以下式的化合物80”、81”、82”、83”、84”、85”、86”和87”。
III.标记和分析的方法 根据本发明的一些实施方案，可将分析物标记并然后测定。可通过质量分析测定标记的分析物、分析物自身、分析物的一种或多种片段和/或标记物的片段。在一些实施方案中，本发明的方法可用于同一样品中不同分析物的分析以及两个或多个不同样品中的同样和/或不同分析物的多重分析。可将所述两个或多个不同样品混合以形成样品混合物。在多重分析中，可用标记试剂测定分析物所来源的样品混合物。可测定形成样品混合物所组合的两个或多个样品中每一个之中的分析物的绝对和/或相对(相对于不同样品中的同样分析物)量(常以浓度或量表示)此外，可使用分析物片段(即子片段离子)的质量分析来鉴定分析物和/或分析物前体，比如所述降解成所述分析物的前体分子。
分析中使用的样品可以是包含可用标记试剂标记的分析物的任何样品。例如，样品可以是粗的或处理的细胞溶解物、体液、组织提取物或细胞提取物。样品可以是来自分离过程的一部分。其它可能的样品类型已在本文中描述过。
样品中的分析物可以是可用标记试剂标记的任何分析物。例如，所述分析物可以是肽和/或蛋白质。其它可能的分析物类型已在本文中描述过。
所述方法的一个区别在于来自不同样品的分析物可以用独特的标记物(其为同分异构和/或同量异位的(具有相同的总质量)并且鉴别所述分析物所来源的样品)进行不同标记(即编码)的事实。所述不同标记的分析物在质谱仪的MS模式下是不被区分的，因为它们具有相同的(总)质荷比。通常选择标记试剂组以便标记的分析物也不能通过分离技术(比如色谱法或电泳法)(其可在一级质谱分析之前应用于混合物)进行区分。然而，当施加解离能级(比如通过碰撞诱发解离(CID))时，则所述标记物可被断裂而形成可通过质谱仪中的质量(质荷比)分辨出的独特的报告物离子。可通过蕴含式(implication)使在MS/MS质谱中检测到的每种独特的报告物离子的相对量与样品混合物中标记分析物的相对量以及所述分析物来源样品中的分析物的相对量相关联。因此，报告离子(即信号离子)的相对强度可用于测定组合形成样品混合物的两个或多个不同样品中的一种或多种分析物的相对量。如果将绝对定量所需的每种分析物的校正标准物都以已知量引入样品混合物中，则可由报告物离子的信息推导出两个或多个样品中的一种或多种分析物的绝对量(常以浓度或量表示)。
例如，所述分析物可能是利用处理样品的酶消化反应由蛋白质降解而形成的肽。蛋白质降解可通过利用一种或多种蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、糜蛋白酶或羧肽酶)处理样品而实现。通过测定样品混合物中肽的鉴定和量以及鉴定其所来源的样品，并任选测定该样品的其它肽，可鉴定和/或并相对于其所来源的样品而定量所降解肽的前体蛋白。因为此方法允许进行蛋白质的多重测定，所以在多于一个样品(即来自样品混合物)的情况下，它是一种多重方法。
因此，在一些实施方案中，本发明涉及包括使两个或多个样品(每个样品包含一种或多种反应活性分析物)与标记试剂组中的不同标记试剂反应而产生两种或多种不同标记的样品(每种包含一种或多种标记分析物)的方法。所述标记试剂可选自同分异构和/或同量异位的标记试剂，其中所述不同的标记试剂各自包含独特质量的报告物部分。所述报告物部分可以是任何报告物部分。例如，所述报告物部分可包含取代或未取代的哌啶、哌嗪或吗啉基团。
例如，所述组中的不同标记试剂可由式I’所代表，包括其盐形式或水合物形式
其中原子或基团Y、J、K、L、R1、R2、X1和X2如前面所定义并且其中所述组中的不同标记试剂具有相同的总质量，但其中形成每个不同标记试剂的报告物部分的基团Y-J在一个或多个同位素富集部位被独特编码，从而当基团Y-J的基团J与所述标记试剂片段的其余部分之间的键在质谱仪中断裂时，产生具有独特质量的报告物部分。原子或基团Z’可以是反应活性基团或反应活性基团的离去基团。
例如，所述反应活性基团可以是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮酯(Dhbt)、羟基吡咯烷酮酯(NHP)、2，4-二卤代苯基酯(参见图8及标题“制备标记试剂的示例性方法”下的论述)、2，2，2-三氟乙基酯或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯(即反应活性基团的离去基团可以是化合物7-19中的一个)。
因此，样品混合物的标记的分析物可由式I”所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中原子或基团Y、J、K、L、R1、R2、X1和X2如前面所定义。例如，变量Y可以是取代或未取代的吗啉、哌啶或哌嗪基团。基团Z”可以是共价连接的分析物。
所述标记方法可产生两种或多种不同标记的样品，每种样品包含一种或多种标记的分析物。一旦利用对样品而言独特的标记试剂对每种样品的分析物进行标记，则可将两种或多种不同标记的样品或其部分混合以产生样品混合物。所述样品混合物可任选地包含一种或多种校正标准物。
可记录经组合而产生样品混合物的每种样品的体积和/或量。每种样品相对于样品混合物的总样品体积和/或量的体积和/或量可用来在样品混合物分析中测定每种样品中的被鉴定的分析物的量(常以浓度或量表示)。因此，样品混合物可包含复杂混合物，其中可通过对两种或多种样品的每一种中分析物的量的相对定量，或者通过其中向样品混合物中加入校正标准物的绝对定量而鉴定和/或定量相同和/或不同分析物的相对量。
例如，可将混合物应用于光谱技术，其中可利用一级质谱分析仪对所述样品混合物或其部分进行一级质谱分析。然后可选择来自所述一级质谱分析的特定质荷比的离子。可对所选的离子施加解离能级(即碰撞诱导解离(CID))而引起所选离子的断裂。通过对标记分析物的所选离子施加解离能级，所选离子至少一部分中的键RL和LA(参见标题“RL键和LA键”下的论述)可以断裂。键RL和LA的断裂可引起报告物/连接物部分的断裂并导致离子化的报告物部分(即报告物部分或信号离子)从所述分析物释放出来。通过解离能对所选离子的断裂还可产生分析物的子片段离子。然后可将所述离子(余下的所选离子、子片段离子和离子化的报告物部分)导向二级质谱分析仪。
在所述二级质谱分析仪中，可对所选的离子及其片段进行二级质谱分析。所述二级质谱分析可测定以所选质荷比存在的每种独特报告物离子的总质量(或m/z)和相对量以及样品混合物中至少一种标记分析物的子片段离子的一些或全部的质量(总质量和/或绝对质量)。对于以所选质荷比存在的每种分析物而言，可利用所述子片段离子鉴定以所选质荷比存在的一种和/或多种分析物。例如，可按照前面标题为“通过计算机辅助数据库分析的分析物测定”的部分中所述进行此分析。
在一些实施方案中，所述方法的某些步骤可重复一次或多次。例如，在一些实施方案中，如前所述，可对来自一级质谱分析的所选质荷比(与任何先前的所选质荷比不同)的离子施加解离能级，从而产生离子化的报告物部分(即报告物离子)和至少一些所选离子的子片段离子。可对所选离子、报告物离子和子片段离子或其一部分进行二级质谱分析。还可测定所述二级质谱分析中每种独特的报告物离子的总质量和相对量以及所述子片段离子的质量(总质量和/或绝对质量)。在此方法中，可得到可用于来自所述一级质谱分析的一种或多种其它分析物的鉴定和/或定量的信息。
在一些实施方案中，在样品混合物已被分级(例如通过色谱法或电泳法分离)的情况下，可重复所述方法一次或多次。例如，通过对样品的一种或多种其它部分重复所述方法，可分析全部样品混合物。可以预计，在一些实施方案中，可重复整个过程一次或多次，并且如上所述，在这些重复中的每一次中，某些步骤都可重复一次或多次。在此方法中，可最大程度地探寻并测定样品混合物的含量。还可对两种或多种样品的新组重复所述整个过程。
质谱领域的普通技术人员将会明了，可在串联质谱仪中进行一级和二级质谱分析。适于进行串联质量分析的仪器已在本文中前面描述过。虽然优选串联质谱仪，但也可使用单级质谱仪。例如，可通过锥孔电压断裂法导致分析物断裂，然后使用单级的四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪对所得片段进行分析。在其它实例中，可利用激光源对分析物施加解离能，并在源后衰变之后在飞行时间或串联飞行时间质谱仪(TOF-TOF)中记录所得的片段。
在一些实施方案中，本发明方法还可包括在进行样品分析物的标记之前，利用至少一种酶消化每一种样品以部分或全部地降解样品组分(另外参见标题为“样品处理”的上述部分)。例如，所述酶可以是蛋白酶(以降解蛋白质和/或肽)或核酸酶(以降解核酸)。可一起使用两种或多种酶以进一步降解样品组分。例如，所述酶可以是蛋白水解酶，比如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、ArgC、LysC、V8蛋白酶、AspN、链霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶(例如羧肽酶A、B、C等)。
在一些实施方案中，方法还可包括在进行一级质谱分析之前分离样品混合物(另外参见标题为“包括分离样品混合物的分离”的上述部分)。按这种方式，可仅对样品混合物的一部分进行一级质谱分析。可通过任何分离方法，包括通过色谱法和/或电泳法进行分离。例如，可在质量分析之前使用色谱/质谱法(LC/MS)实现这样的样品分离。此外，还可使用适于分离感兴趣的分析物的任何色谱分离方法。本文中已经描述了合适的色谱和电泳分离方法的非限定性实例。
在一些实施方案中，可利用消化和分离步骤实践所述方法。尽管这些步骤是任选的，但它们常常一起进行，例如，当进行蛋白质组分析以测定细胞内蛋白质的上调和下调时。在一些实施方案中，可重复所述方法的步骤(具有或不具有消化和/或分离步骤)一次或多次以鉴定和/或定量样品中的分析物或两种或更多种样品(包括用载体结合的标记试剂标记的样品)中的每种样品的一种或多种分析物。取决于在样品混合物中是否存在校正标准，具体样品的定量可以相对于其它标记的分析物，或者它可以是绝对的。
如前所述，通过对子片段离子的质量(总质量或绝对质量)的分析，可测定与所选离子相关的分析物。一种这样的测定方法在标题为“通过计算机辅助数据库分析的分析物测定”的部分中作了描述。一旦已测定分析物，则关于二级质谱分析中每一种独特的报告物离子的总质量和相对量以及子片段离子的质量的信息提供了确定有关样品化合物其它信息的基础。
可通过质谱图中的峰强度确定报告物离子的相对量。在一些实施方案中，可利用质谱仪通过对所获得的报告物离子(信号离子)的峰高或峰宽(或峰面积)的分析而确定每种独特的报告物离子的量。因为可用不同的标记试剂标记每种样品，并且每种标记试剂可包含产生独特的报告物离子的独特报告物部分，所述报告物离子可与用于配制样品混合物的特定的不同标记的样品相关联，对二级质谱分析中不同报告物离子的测定可用于鉴定所选分析物的报告物离子所来源的不同标记的样品。在发现多个报告物离子的情况下(即根据本发明的多重方法)，可相对于其它报告物离子确定每种独特报告物离子的相对量。因为在二级质谱分析中测定的每种独特报告物离子的相对量可与样品混合物中分析物的相对量相关联，所以可测定每种不同标记的形成样品混合物的样品中的分析物的相对量(常表示为浓度和/或量)。此外，可使分析物的定量信息与最初不同标记样品中的组分相关联，其中测定的分析物是感兴趣的另一种化合物的副产物(即分析物是降解产物，比如在分析物是通过蛋白质的消化而形成的肽的情况下)。
如上所述，可针对不同质荷比的所选离子重复此分析一次或多次，从而获得组合形成样品混合物的每种样品中一种或多种其它分析物的相对量。另外，如在前述标题为“分析物的相对定量和绝对定量”的部分中所述的，在适当的情况下，可针对与每种独特报告物离子相关的峰强度而校正天然或人工产生的同位素丰度。
在一些实施方案中，所述分析物可以是样品或样品混合物中的肽。对样品或样品混合物中的肽的分析可用于确定样品或样品混合物中可鉴定蛋白质的量(常表示为浓度和/或量)，其中在一种或多种样品中的蛋白质可在一级质谱分析之前降解。而且，可将来自不同样品的信息进行比较以做出测定，比如用于比较对细胞中蛋白质的量的作用，所述细胞与不同浓度的影响细胞生长、发育、分化和/或死亡的物质一起孵育。另外，非限定性的实例可包括对患病或健康的组织或细胞培养物的表达的蛋白质组分的比较。这可包括在利用感染剂(如细菌或病毒)感染或其它疾病状态(如癌症)后比较细胞中表达的蛋白质水平。在其它实例中，可进行蛋白质浓度随时间(时间-进程)变化的研究，以检验药物治疗对细胞或组织的表达的蛋白质组分的作用。在另一些实例中，可利用所取来自不同样品的信息以检测并监测作为疾病(例如癌症)或感染结果的组织、器官或生物流体中具体蛋白质的浓度。这些实验可包含一种或多种对照样品。在一些实施方案中，本实验可用于测定感兴趣的上述两个或多个性质。
在一些实施方案中，所述分析物可以是样品或样品混合物中的核酸片段。有关核酸片段的信息可用来确定样品或样品混合物中可鉴定核酸分子的量(常表示为浓度和/或量)，其中所述样品在一级质谱分析之前被降解。此外，可比较来自不同样品的信息以做出科学上感兴趣的测定。
在包含独特报告物部分的校正标准物与已经以已知量(常表示为浓度和/或量)加入到样品混合物中具有所选质荷比的分析物相连接的情况下，可利用所述与校正标准物相关的独特报告物的量测定组合形成样品混合物的每种样品中分析物的绝对量(常表示为浓度和/或量)。这是可能的，因为与样品混合物中校正标准物的独特报告物离子相关联的分析物的量是已知的，所以可测定与所选离子相关联的标记分析物的所有独特报告物离子的相对量。既然每种所述独特报告物部分(包括校正标准物的报告物部分)的所测的每种独特报告物离子的相对量与和组合形成样品混合物的每种不同标记的样品相关联的分析物的量成比例，则可基于相对于用于制备样品混合物的制剂的计算比率而测定每种样品中分析物的绝对量(常表示为浓度和/或量)。需要时，可针对与独特报告物离子相关联的峰强度进行天然或人工产生的同位素丰度的校正。这样的分析方法尤其可用于具有复杂性质的多样品的蛋白质组分析中，特别时在进行一级质谱分析之前进行标记分析物的预分离(例如液相色谱或电泳分离)的情况下。
例如，如果样品混合物包含100fmol/mL的校正标准物，并且与所述校正标准物相关联的独特报告物离子的相对强度是1，而与第一样品相关联的第一其它独特报告物离子的相对强度是二分之一(1/2或0.5)，与第二样品相关联的第二其它独特报告物离子的相对强度是2，则在所述第一不同标记样品(混合而形成样品混合物)中分析物的量(假定等量的样品1和样品2混合以形成样品混合物)是50fmol/mL(0.5 x 100fmol/mL)，而在所述第二不同标记样品(混合而形成样品混合物)中分析物的量是200fmol/mL(2 x 100fmol/mL)。而且，例如如果所述分析物是与特定蛋白质相关联的肽，则可推断样品1中蛋白质的量是50fmol/mL，而样品2中蛋白质的量是200fmol/mL。因此，校正标准物的存在使得可进行混合而形成样品混合物的每种不同标记样品中标记分析物(以及在某些情形下其前体)的绝对定量。
如前所述，此分析可针对具有不同质荷比的所选离子而重复一次或多次，从而获得组合以形成样品混合物的每种样品中一种或多种其它分析物的绝对量。此外，如前所述，在需要时，可针对与独特报告物离子相关联的峰强度进行天然或人工产生的同位素丰度的校正。
在一些实施方案中，可用载体结合的标记试剂实践本文中所述的方法，其中组中每种不同的标记试剂是载体结合的并通过可断开连接物连接到所述载体上，从而使每种不同的样品与所述组中带有不同标记试剂的载体相连接。示例性的载体已在前面标题为“组合物”的部分中讨论过(另参见图5和下面的实施例部分)。根据所述方法，可任选地在已使分析物与载体结合的标记试剂反应之后但在混合样品之前洗涤载体以除去不与标记试剂的反应活性基团反应的样品组分。一旦已使所述分析物与标记试剂反应而形成标记的分析物并任选地进行了洗涤步骤，则可通过在断开可断开的连接物的条件下处理载体而从载体释放出标记的分析物。一旦断开，则可任选地采集两种或更多种不同标记样品中的每一种，每种样品包含一种或多种标记的分析物，其中与特定样品相关联的标记的分析物通过连接到其上的独特报告物部分是可鉴定的和/或可定量的。不论是否单独采集断开产品，都可将它们混合以形成样品混合物。
在一些实施方案中，可利用由式II’所代表的标记试剂，包括其盐形式和/或水合物，实践本文中所述的方法
其中W、M、J、K、L、R1、R2、X1、X2和Z’如前所定义。
在一些实施方案中，可利用由式III’所代表的标记试剂，包括其盐形式和/或水合物，实践本文中所述的方法
其中s、t、R1、R2、R11和Z’如前所定义。
在一些实施方案中，可利用至少一种由以下各式所代表的标记试剂，包括其盐形式和/或水合物，实践本文中所述的方法

或
其中R1、R2和Z’如前所定义。符号＊表示在适当时13C替代12C的情形或者15N替代14N的情形。
在一些实施方案中，可利用由式IV’所代表的标记试剂，包括其盐形式和/或水合物，实践本文中所述的方法
其中t、R11和Z’如前所定义。
在一些实施方案中，可利用至少一种由以下各式所代表的标记试剂，包括其盐形式和/或水合物，实践本文中所述的方法
或
其中＊和Z’如前所述。
IV.蛋白质组学工作流程 在一些实施方案中，可在进行样品处理步骤之前进行样品分析物的标记。在一些实施方案中，可在进行样品处理步骤之后进行样品分析物的标记。在一些实施方案中，可在其它的样品处理步骤之间进行样品分析物的标记。在一些实施方案中，分析物的标记是样品处理的最后步骤和/或恰在制备样品混合物之前。
用蛋白质组学分析作为非限定性的实例，存在可能使用的至少几种可能的流程。为帮助理解以下论述，有时在前体蛋白和分析物肽之间做出区分。然而，应当理解，在不同的实施方案中，蛋白质和/或肽中的任一种或两种均可被看作本文中所述的分析物。
在一种流程中，所述前体蛋白可被消化成随后可被标记的肽分析物。在另一种流程中，可用标记试剂将所述前体蛋白标记，然后被消化成标记的肽分析物。在又一种流程中，所述前体蛋白可被捕获到固体载体上、消化、然后可将所述载体结合的肽标记。任选地，所述通过肽的流程也可被标记。在另一种流程中，所述前体蛋白可被捕获到固体载体上、标记、然后可将所述载体结合的蛋白消化以产生标记的肽。任选地，所述通过肽的流程也可被分析。不管流程如何，可在MS和MS/MS分析之前按照需要对标记的肽进行其它样品处理(例如分离步骤)。
A)涉及消化并随后标记的示例性流程 参考图13，例如可能存在待分析的“对照”样品和“测试”样品。如果对于图13中所示的实例而言，目的是分析“对照”和“测试”样品蛋白的肽(作为分析物)，在一些实施方案中，样品的蛋白质可任选地被还原、任选地将半胱氨酸封闭和被酶消化，从而产生可被标记用于序列分析的分析物肽。在一些实施方案中，分析物肽不经进一步的样品处理而被标记(加标签)。不管如何标记，都可用各自包含独特质量报告物部分的不同标记试剂(例如同分异构和/或同量异位的标记物的标记试剂组)将每种不同样品的分析物标记。
在一些实施方案中，可能需要在标记之前和/或标记之后进行进一步的样品处理。例如，可进行分离步骤以除去不感兴趣的某些种类的肽，从而减少样品的复杂性。可将标记的样品混合以获得样品混合物。在一些实施方案中，可在质谱分析之前将标记的分析物肽进行分离(例如高效液相色谱法(HPLC))或其它分级过程。
另一种示例性流程示于图14a和图15中。图15与图14a主要的不同在于图15举例说明了可能涉及到肽捕获的半胱氨酸硫醇基的封闭和再生的任选步骤。为清楚起见，虽然在图13、14a、15和16-18中的描述都表明了针对两种样品的流程的应用，但不言自明，只要可获得其它的不同标记物以编码每种不同的样品或样品级分，也可处理其它的样品。
图14a阐明了在一些实施方案中可如何将“对照”样品和“测试”样品用酶消化然后将样品组分通过可断开的连接物捕获到固相上。例如，载体可包含可断开的连接物和与肽的结构部分反应的反应活性基团(参见图14b对这样载体的基本成分的举例说明)。在图14c中举例说明了适于捕捉包含半胱氨酸的肽的载体的具体实例。包含半胱氨酸的硫醇基的肽可与所举例说明的载体的碘乙酸基团反应。因为并非所有的肽都预计含有半胱氨酸，所以这是用于降低待分析样品复杂性的方法，因为不含半胱氨酸部分的那些肽将流过载体且不被捕获。一旦被固定，根据如图14a中所示的处理方法，可用标记试剂将所述肽的胺基团标记(参见图14a)。例如，每种“对照”样品和“测试”样品都可用同分异构和/或同量异位的标记试剂组中的不同标记物进行标记。然后可将标记的肽分析物从载体上断开和/或进一步处理(包括形成混合物)和/或分析(图14a)。
在一些实施方案中，可将流过载体的肽(因为它们不与所述载体的官能团反应)收集(而不是弃掉)、用同分异构和/或同量异位的标记试剂组中的标记试剂标记以及单独或与从所述载体上收集到的标记的肽一起分析。这种流程示于图16和17中。如图16和17中所示，可用相同或不同的同分异构和/或同量异位的标记试剂组中的标记试剂标记流过固体载体的肽。不管标记试剂如何，都可将其任选地与通过MS/MS分析进行分析的样品混合物混合。还可独立地对其进行分析。图16和17的不同之处在于当肽仍在载体上时(图16)或在已将肽从所述载体上断开之后(图17)可标记保留在载体上的肽。
参考图18，可使用固体载体捕获前体蛋白。如所举例说明的，可存在平行处理的两个样品。一种用于捕获蛋白质的半胱氨酸部分的合适载体示于图14c中。可利用洗涤将不含半胱氨酸部分的蛋白质从载体上除去并任选地收集(例如流过)。还可任选地将它们消化、标记和/或与样品混合物一起分析或单独分析。
根据图18，可将载体结合的蛋白质消化。然后可利用标记试剂将所述载体结合的包含半胱氨酸的肽标记并从载体上断开(此选择已示于图18中)。或者首先可将所述载体结合的包含半胱氨酸的肽从载体上断开，然后用标记试剂标记(此选择未示于图18中)。可将来自不同样品的标记肽(任选地包含不含半胱氨酸部分的标记肽)混合、处理和/或与样品混合物一起分析或单独分析。
根据图18，作为进行消化的结果，可收集从载体释放的任何肽。通常这些是不包含硫醇基的肽。可任选地将这些肽用标记试剂标记并任选地混合、处理和/或与样品混合物一起分析或单独分析。
B)涉及标记并随后消化的示例性流程 不论是否使用载体捕获用于分析的分析物，都可在消化或其它化学处理之前或之后进行利用标记试剂标记分析物的步骤，只要所述处理不改变所述标记物。对于蛋白质样品，还可将样品蛋白质还原和半胱氨酸封闭、用标记试剂标记样品蛋白N-ε-赖氨酸的侧链胺基，然后将蛋白质消化成标记的肽。
不管来源如何，可将标记的分析物分析或者进一步处理(包括制备样品混合物)，例如，通过分离和/或通过固定到载体上。例如，可通过使标记试剂与样品蛋白N-ε-赖氨酸的侧链胺基反应而标记前体蛋白，然后任选地将所述标记的前体蛋白固定到载体上。可将标记的蛋白从所述载体上断开然后消化，或者可在所述标记的蛋白仍与载体结合期间将其消化。在后一种情形下，载体结合的消化将从载体上释放不含半胱氨酸部分的肽。可将其收集并任选地单独分析或作为包含后者释放的含有半胱氨酸部分的标记肽的样品混合物的一部分而分析。
当在将前体蛋白消化成肽之前标记前体蛋白时，可对消化方式做出改变。例如，利用胰蛋白酶的消化可预期产生占优势的C-末端精氨酸肽，因为N-ε-赖氨酸侧链胺基被标记物修饰了。因此，胰蛋白酶的活性很象Arg-C。因为仅仅是还含有精氨酸侧链的C-末端精氨酸肽可被标记并因此在质谱仪中可检测到，所以这提供了一种进一步减少样品复杂性以进一步处理和/或分析的方法。
在一些实施方案中，可将蛋白质还原并用标记试剂(即硫醇特异性的标记试剂)将半胱氨酸基标记，然后将蛋白质消化成用于分析的标记的肽。可将所述标记的肽分析物分析或进一步处理，例如通过分离和/或固定到载体上。例如，可通过赖氨酸侧链上的N-α-胺基和/或N-ε-胺基与载体官能团间的反应而将标记的肽固定到载体上。用于固定包含胺基官能团的化合物的具有可断开连接物的载体包括含有三苯甲基连接物的载体(参见可购自Novabiochem(San Diego，CA)的三苯甲基氯载体(Trityl-Cl)或2-氯三苯甲基氯载体)。此流程与前述那些截然不同。可将标记的分析物从载体上断开，进一步处理和/或分析。此方法可能不能实质上减少复杂性，因为所有消化的肽都预计包含至少一个N-α-胺基。
上述实施例并非意在排除多种可能的流程。它们仅是示例性的。关于在消化之前标记的实施方案，还可在进行消化之前实施进一步的样品处理。
c)总结 尽管前面通过具体实例的方式对蛋白质组学分析和作为分析物的蛋白质和/或肽的测定进行了详细论述，但所述概念旨在包括可应用前述流程而不需进行过多实验的多种分析物。因此，本发明公开内容的范围不意在限于任何这些所述具体实例中。
IV.混合物 在一些实施方案中，本发明涉及混合物(即样品混合物)。例如，所述混合物可包含同量异位和/或同分异构的标记分析物。标记分析物的示例性混合物及其制备和/或分析方法已在前述标题为“标记和分析的方法”的部分中描述过。
可通过将两个或多个标记反应的全部或部分产物混合而形成混合物，其中将每种样品用标记试剂组的不同标记试剂标记，其中每种标记试剂包含独特(总)质量的报告物部分。可由两个或更多标记的分析物中的每一种被得到(即来源)的标记反应而鉴定每种不同标记试剂的独特报告物部分。所述标记试剂可以是同位素编码的同分异构和/或同量异位的标记试剂。因此，混合物的两种或更多种标记的分析物可以使同分异构的和/或同量异位的。标记试剂的性质和与那些方法相关的标记的分析物已在前面论述过。
混合物的分析物可以是肽。混合物的分析物可以是蛋白质。混合物的分析物可以是肽和蛋白质。混合物的分析物可以是核酸分子。混合物的分析物可以是碳水化合物。混合物的分析物可以是脂质。混合物的分析物可以是类固醇。混合物的分析物可以是质量小于1500道尔顿的小分子。混合物的分析物包含两种或更多种不同类型(即(1)脂质和类固醇；或(2)肽、脂质、类固醇和碳水化合物)。
混合物可包含任何类型的不同标记的分析物，所述分析物包含本文中所公开的新的报告物/连接物部分。例如，所述混合物可包含至少两种不同标记的可由式I”代表的分析物，包括其盐形式和/或水合物形式
其中原子或基团Y、J、K、L、R1、R2、X1和X2在前面已定义过，其性质已公开过。在一些实施方案中，两种标记的分析物中的每种都可源自不同的样品。根据式I”，基团Y-J(形成不同标记的分析物的报告物部分)可在一个或多个同位素富集部位被独特编码，从而当基团Y-J的基团J与所述标记的分析物的其余部分之间的键在质谱仪中断裂时，形成具有独特质量的报告物离子。基团Z”可以与分析物共价连接。对于每种不同的标记物而言，混合物中一些标记的分析物的可以相同，一些标记的分析物可以不同。
在一些实施方案中，混合物可包含至少两种不同标记的可由式II”所代表的分析物，包括其盐形式和/或其水合物形式
其中W、M、J、K、L、R1、R2、X1、X2和Z”如前所述。
在一些实施方案中，混合物可包含至少两种不同标记的可由式III”所代表的分析物，包括其盐形式和/或其水合物形式
其中s、t、R1、R2、R11和Z”如前所述。
在一些实施方案中，混合物可包含至少两种不同标记的可由下式所代表的分析物，包括其盐形式和/或其水合物形式
或
其中＊、R1、R2、和Z”如前所述。
在一些实施方案中，混合物可包含至少两种不同标记的可由式IV”所代表的分析物，包括其盐形式和/或其水合物形式
其中t、R11和Z”如前所述。
在一些实施方案中，混合物可包含至少两种不同标记的可由下式所代表的分析物，包括其盐形式和/或其水合物形式

或
其中，＊和Z”如前所述。
在一些实施方案中，本发明涉及片段离子的混合物。例如，可通过下列方式产生混合物的片段离子在质谱仪中使包含至少两种不同标记的分析物分子的样品混合物的一部分电离，并选择至少两种具有选定的m/z值的不同标记的分析物分子用于断裂。然后可通过施加解离能级而使所述选定的不同标记的分析物分子断裂。在一些实施方案中，至少一种不同标记的分析物分子是选自下式的化合物如图26a-26b中所示的80”、81”、82”、83”、84”、85”、86”和87”。因此，片段离子可具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。在一些实施方案中，所述分子式选自13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+和13C3C3H1315N2+。
V.试剂盒 在一些实施方案中，本发明涉及试剂盒。所述试剂盒可包含如本文中所述的标记试剂和一种或多种其它试剂、容器、酶、缓冲剂和/或使用说明。所述试剂盒可包含两种或更多种标记试剂的组和一种或多种其它的试剂、容器、酶、缓冲剂和/或使用说明。试剂盒中的两种或更多种标记试剂可以是同分异构的和/或同量异位的。例如，所述试剂盒中的一种或多种标记试剂可以是如本文中前面所公开的以下各式的化合物(包括化合物组)I’、II’、III’、IV’、V’、VI’、VII’、VIII’、IX’、X’、XI’、XII’、XIII’、XV’、XVI’、XVII’、XVIII’、XIX’、XX’、XXI’、XXII’和/或XXIII’。在一些实施方案中，所述试剂盒可包含如本文中前面所公开的以下各式的标记的分析物(例如作为校正标准物)I”、II”、III”、IV”、V”、VI”、VII”、VIII”、IX”、X”、XI”、XII”、XIII”、XV”、XVI”、XVII”、XVIII”、XIX”、XX”、XXI”、XXII”和/或XXIII”。试剂盒中标记试剂的其它性质已公开。所述试剂盒可以例如可用于同一样品中或两种或更多种不同样品中的一种或多种分析物的多重分析。
VI.制备标记试剂的示例性方法 参考图7a-7c、图27a-27c和20-21，可用于制备同量异位编码的标记试剂的一般合成策略将作为本发明的另一个实施方案而论述。应当理解，这些所示的方法各自代表了可用于制备同量异位编码的标记试剂的多种可能合成方法中的一种。还应当理解，本领域普通技术人员仅通过常规试验和本文中所公开的内容，即可容易地调整该方法用于制备具有类似化学结构的其它标记试剂。因此，本方法的公开内容旨在举例说明而并非是意在以任何方式的排除或限制。
尽管在图7a-7c、图27a-27c和20-21中所示的方法是针对未编码的化合物而给出的，但不言自明，同量异位编码的试剂可替代未编码的化合物，从而产生同量异位编码的产物，因为编码的物质与未编码的物质相比在反应活性上应该是基本上相同的。图7a-7c中给出的方法得到以下实施例1-9的支持。这些实施例也支持图20-21中所示的方法。可利用所示方法制备的示例性的同量异位编码的化合物描述于本说明书和附图(例如图9a-9c、10a-10c、12a-12e、28a-28b和29a-29b)以及权利要求书中。
参考图7a和27a步骤1以及图20-21，可使取代或未取代的二胺与取代或未取代的二羧酸或酸酐反应。反应产物是包含至少一个将所述二羧酸或酸酐与所述二胺连接起来的酰胺键(或硫代酰胺键)的氨基酸。例如，所述取代或未取代的二胺可具有如图20中化合物200所示的结构，所述取代或未取代的酸酐可具有如图20中化合物201所示的结构。所述反应的氨基酸产物可具有如图20中化合物202所示的结构。
所述取代或未取代的二胺的一个或两个胺基都可包含N-烷基化的基团，在各图中以R1和/或R2表示(参见例如图27a)。所述二胺可被胺基保护基团如叔丁氧基羰基(t-boc)或9-芴基羰基(Fmoc)部分保护。其它合适的胺基保护基团及其使用方法可见于Green等ProtectiveGroups In Organic Synthesis，Third Edition，John Wiley & Sons，Inc.New York，1999。本领域普通技术人员仅利用常规实验和本文中所公开的内容，即能够选择和使用其它合适的保护基团。
如果选择二羧酸作为起始原料，则可通过保护(比如通过形成大体积的酯(例如叔丁酯))将羧酸基之一保护起来。应当理解，当在本文中使用时，所述羧酸或酸酐可包含取代所述两个羧酸基或酸酐基的氧原子的硫原子。
在一些实施方案中，二羧酸和二胺都未被保护。通常，保护针对反应使用以便避免形成杂质。然而，如果试剂反应形成所期望的化合物和/或纯化容易实现，则保护并不是必须的。例如，如果起始原料是对称的，则常可免去保护。
还应当理解，在某些实施方案中，并非所有公开的步骤都需要进行。如实施例中所述，选择Fmoc保护的二胺时可免去所示方法的步骤2(图7a-7c和图27a-27c)。
参考图20，所述取代或未取代的二胺可包含由K所代表的烷基(例如化合物200)，其中K可以是式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所示的桥接两个胺基的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4，其中R4是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。所述取代或未取代的二胺还可包含环状环比如哌嗪，其中所述二胺的两个胺基中的一个或两个是环氮原子(例如化合物205，图21)。在一些实施方案中，所述取代或未取代的二胺的一个或多个原子可以被重原子同位素取代。参考图20和21，通过取代或未取代的二胺与酸酐的反应而形成的氨基酸化合物分别由202和206所代表。
所述取代或未取代的二羧酸或酸酐可包含基团L(例如化合物201，图20)，其中L由桥接两个羧酸基或酸酐的两个羰基的式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5，其中R5是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。所述取代或未取代的二羧酸或酸酐可包含环状环如环己烷或环戊烷环，其中所述羧酸部分中的一个或两个(或通过两个羧酸基形成的酸酐的羰基)是所述环状环的取代基。在一些实施方案中，所述取代或未取代的二羧酸或酸酐中的一个或多个原子可以被重原子同位素取代。
如图7a步骤1中所示，N-(t-boc)-N-甲基-乙二胺101可与琥珀酸酐102反应。该反应形成产物N-甲基乙二胺-N’-琥珀酸(N-methylethylenediamine-N’-succinate)103。对于那些由式I’-XIII’和VI’-XXIII’所示的化合物而言，该反应可代表一种用于连接物部分的同位素编码的方法。可利用所述公开方法(除步骤2以外)制备式I’-XIII’和VI’-XXIII’的化合物的可能的二胺和酸酐的起始原料在图9a-9c和10a-10c中举例说明。
参考图7a和7b以及图27a和27b的步骤2-4，出于制备载体结合部分(包含报告物部分的化合物可最终与其连接)的目的，可控制步骤1的氨基酸产物的胺和酸官能团。如图7a步骤2中所示，t-boc胺保护基被置换为Fmoc胺保护基，从而产生Fmoc保护的化合物104。在步骤3(图7a)中，化合物通过其羧酸官能团经由可断开连接物被固定到载体上，从而形成了载体结合的化合物105。所述载体(所述连接物部分固定到其上)可包含空间阻碍的可断开连接物。多种包含可断开连接物的载体对本领域普通技术人员来说是众所周知的。空间阻碍的固体载体的非限定性实例包括三苯甲基氯载体(trityl-Cl，Novabiochem，P/N01-64-0074)、2-氯三苯甲基氯载体(Novabiochem，P/N 01-64-0021)、DHPP(Bachem，P/N Q-1755)、MBHA(Applied Biosystems P/N400377)、4-甲基三苯甲基氯载体(Novabiochem，P/N 01-64-0075)、4-甲氧基三苯甲基氯载体(Novabiochem，P/N 01-64-0076)、羟基-(2-氯苯基)甲基-PS(Novabiochem，P/N 01-64-0345)、Rink酸载体(NovabiochemP/Ns 01-64-0380，01-64-0202)和NovaSyn TGT醇载体(Novabiochem，P/N 01-64-0074)。如图中所示，可使用三苯甲基氯载体(参见实施例3)。
如图7b步骤4中所示，可除去载体结合的化合物105的末端胺的保护基团，从而促进所述载体结合的产物化合物106的所述胺与包含报告物部分的化合物进行反应。
因此，通常可使氨基酸产物的胺基与包含报告物部分的化合物反应以形成报告物/连接物组合。如图7a-7c和27a-27c中所示，在一些实施方案中，可通过将所述连接物部分固定到固体载体上而促进该反应。然而，应当理解，虽然可用在一些实施方案中，但连接物部分的固定并非必须的。
包含报告物部分的化合物通常具有两个特征。一个特征可以是取代或未取代的N-烷基化的乙酸部分，其中所述乙酸部分的羧酸(或硫代羧酸)基可与氨基酸产物的胺基反应而形成酰胺键(或硫代酰胺键)。第二个特征可以是与所述乙酸部分的亚甲基碳共价键合的氮原子。包含氮原子的部分可以是取代的仲胺，如二甲胺、二乙胺或丙胺。包含氮原子的部分可以是环状化合物，如取代或未取代的哌啶、哌嗪或吗啉。如图7b所示，所述含氮原子部分是N-甲基-哌嗪。
参考图20和21，可使所述氨基酸产物(分别为202和206)与包含报告物的化合物(即化合物203)反应。此反应的产物可形成报告物/连接物部分(即分别为化合物204和207)。
参考图7b步骤5，可使化合物106的末端胺与取代或未取代的N-烷基哌嗪乙酸部分(107)反应，从而形成载体结合的报告物/连接物组合物108。
当然包含报告物部分的化合物可包含一个或多个同量异位富集部位。例如，取代或未取代的图7c的N-烷基化的乙酸部分或N-烷基哌嗪可包含一个或多个同量异位富集部位(另外参见图9a-9c和10a-10c)。因此，可根据二胺、二酸(或酸酐)和包含报告物部分的化合物(例如取代或未取代的N-烷基哌嗪乙酸)的编码而控制报告物和连接物的编码。
在一些实施方案中，代表报告物/连接物的分子的羧酸基或硫代羧酸基可以被原位活化，从而促进分析物的标记。因此，在一些实施方案中，不需要额外的反应。
在一些实施方案中，代表报告物/连接物组合的分子的酸基或硫代酸基可被修饰以形成能与分析物的官能团反应的反应活性基团。在一些实施方案中，这可能涉及到与一种或多种产生所期望的反应活性基团的试剂的反应，所述反应活性基团能与分析物的官能团反应。在一些实施方案中，这可能涉及到酸基团或硫代酸基团向活化的化合物的转化。例如，可以将所述报告物/连接物组合的羧酸基或硫代羧酸基活化，从而制备包含醇或硫醇离去基团的活性酯，其中所述活性酯可与分析物的官能团反应而形成标记的分析物。
参考图20和21，可将代表报告物/连接物化合物的化合物(分别为化合物204和207)修饰，从而分别产生由I’或I”所代表的化合物。例如，可将羧酸基或硫代羧酸基转化为活性酯，比如N-羟基琥珀酰亚胺酯。
参考图7c步骤6，可将所述报告物/连接物化合物从载体上断开，从而产生中间体109。如所示地，所述中间体包含羧酸基，所述羧酸基可被活化用于与亲核物(比如蛋白质或肽的胺基)的反应。尽管在一些实施方案中，所述羧酸可如前所述被原位活化，参考图7c步骤7，举例说明了通过与三氟乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(110)的反应而形成N-羟基琥珀酰亚胺酯111。适于形成报告物/连接物化合物的活性酯的其它方法可见于共同未决和共有的美国公开专利申请No.US 2005-0148771A1中。示例性的合成示于图8。一些示例性活性酯的离去基团作为7-19而描述。
图9a-c举例说明了可能来源的同量异位编码的起始原料，所述起始原料可与所示方法一起用于制备化合物V’-XIII’。图10a-c，其中编码的哌嗪可被图7a-7c中的N-甲基乙二胺衍生物取代，举例说明了可能来源的同量异位编码的起始原料，所述起始原料可用于制备化合物XV’-XXIII’。用于从简单、易得的起始原料(比如编码的氨基乙酸和氨基乙酸的衍生物(例如肌氨酸)制备编码的哌嗪的方法是本领域中已知的。例如，用于制备所有不同类型(flavor)的编码的哌嗪和N-烷基哌嗪化合物的方法可见于共同未决和共有的美国公开专利申请No.US2004-0219685 A1、US 2005-0147982、US 2005-0147985和2005-1048774A1中。图12d和12e也举例说明了示于图10c中的编码的哌嗪化合物的合成路线的实例。示于图12d和12e中的合成路线基于如公开的专利申请中所述的制备编码的哌嗪化合物的方法。
如前所述，编码的起始原料(比如编码的氨基乙酸、肌氨酸和琥珀酸酐)可得自不同的商业来源，比如Cambridge Isotope Laboratories、Andover、MA(参见www.isotope.com上的列表或“基本起始原料”)和Isotec(Sigma-Aldrich的分支机构)。Cambridge Isotope Laboratories和Isotec还根据客户合成协议制备所需要的化合物。同上，各种同量异位编码的起始原料的来源和部分编号的参考文献可见于本发明公开内容各处，包括实施例和附图中。然而，这些参考文献仅为提供信息的目的，并非旨在是对所要求保护的本发明的限制或穷尽所有可能的商业来源。
参考图11a、11b和实施例8～9，通过适用已知的合成反应，举例说明并描述了用于制备各种编码的N-甲基-氨基乙酸(即肌氨酸)的方法。例如，这些编码的原料可用于制备编码的N-甲基哌嗪乙酸部分，所述N-甲基哌嗪乙酸部分用于如在图9a-c和10a-c中所引用的多个美国公开专利申请中所述的报告物中。因此，显然这些举例说明和实施例可用于从可商购的简单的编码的原料制备本文中所述的各种编码的标记试剂。
参考图12a、12b、12c、28a和29a，通过适用已知的合成反应，举例说明了用于制备各种编码的N-甲基-乙二胺的方法。因此，显然这些举例说明可用于从可商购的简单的编码的原料制备本文中所述的各种编码的标记试剂。例如，参考图12c，可以预计，在Michel等Structuralstudy of bonding in thioamides.Synthesis and conformation ofthioalanines and thioglvcines.Canadian Journal of Chemistry，67(8)1312-1318(1989)中所描述的方法可用作进行所示反应的步骤1的一般指导原则。此外，可以预计，由Gallery Chemical(a BASF Company，Florham Park，New Jersey，USA)提供的关于硼烷-四氢呋喃络合物的产品文献(及其中所公开的参考文献，如Amedia等，Syn.Comm.292377(1999))可用作进行所示反应的步骤2的一般指导原则。
实施例 可根据以下实施例，进一步理解本发明所教导的各方面，所述实施例不应解释为以任何方式限制本教导的范围。
实施例1N-[2-(叔丁氧基羰基-甲基-氨基)-乙基]-琥珀酸(103)的合成(步骤1-图7a) 向充分搅拌的N-(叔丁氧基羰基)-N-甲基-乙二胺101(5.5g，0.032mol)溶于二氯甲烷(CH2Cl2，30mL)的溶液中一次性加入琥珀酸酐102(3.2g，0.032mol)。在室温下将反应混合物搅拌1小时后，得到淤浆。将此淤浆不经进一步处理而用于步骤2。
注如果可能，使用N-(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-N-甲基-乙二胺将不必进行步骤2。为此原因，图9a-c显示了Fmoc保护的N-甲基乙二胺的使用。
实施例2N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸(104)的合成(步骤2-图7a) 向由步骤1产生的化合物103的淤浆中加入20mL 80％的溶于CH2Cl2中的三氟乙酸(TFA)。然后将反应混合物在室温下搅拌，并通过薄层色谱法(TLC)监测。2小时后，混合物的TLC表明起始原料完全消失，并形成了极性产物。然后在旋转蒸发仪中除去过量的溶剂和TFA并将残留物与四氢呋喃(THF，30ml x 3)共蒸发。然后将余下的油状残留物溶于丙酮(50ml)中，并通过小心加入NaHCO3(水)溶液而将pH调至碱性。然后一次性加入N-(9-芴基甲氧基羰基-氧基)琥珀酰亚胺(Fmoc-Osu，13.5g，0.0399mol)溶于丙酮(70mL)中的溶液。然后将反应混合物在室温下搅拌过夜。此时进行的TLC证实了起始原料已耗尽。然后在旋转蒸发仪中除去丙酮/水，以水(50mL)稀释残留物，并用乙醚洗涤(Et2O，30mL x 3)以除去非极性的杂质。然后用2NHCl将水层酸化至pH～2并以乙酸乙酯萃取(EtOAc，100mL x 3)。然后用水(30mL x 4)、盐水(1 x 30mL)洗涤合并的有机部分，并以硫酸钠(Na2SO4)干燥。然后在旋转蒸发仪中除去EtOAc，并将残留物保持在高真空下过夜而得到吸湿性白色固体N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸104(10.5g，82％)。MS397.2(MH+) 实施例3载体接合的N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸(105)的合成(步骤3-图7a) 向N-{2-[(9H-芴-9-基甲氧基羰基)-甲基-氨基]-乙基}-琥珀酸(104)(595mg，1.5mmol)溶于CH2Cl2(10mL)的溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，776mg，6mmol)，然后加入三苯甲基氯载体(1g，1mmol，P/N SC5028，Advanced Chemtech)。然后在室温下将淤浆搅拌1小时，然后用CH2Cl2/MeOH/DIPEA(17:2:1，3 x 10mL)的溶液、CH2Cl2(3 x 10mL)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，2 x 10mL)洗涤，最后再用CH2Cl2(2 x 10mL)洗涤。在真空下干燥负载的载体(105)并分析样品的Fmoc负荷。平均负荷为0.5mmol/g。将此载体不经进一步处理而用于步骤4。
实施例4载体接合的N-(2-甲基氨基-乙基)-琥珀酸(106)的合成(步骤4-图7b) 用20％的哌啶/DMF(使用10mL，然后允许排出)处理载体接合的琥珀酸N-(Fmoc)-N-甲基乙二胺(105)。然后再加入20％的哌啶/DMF(10mL)并搅拌淤浆10分钟。然后用DMF(10mL x 2)、CH2Cl2(10mL x 2)洗涤载体，最后用DMF(10mL x 2)洗涤。然后将脱保护的载体(106)迅速用于步骤5。
实施例5载体接合的N-(2-{甲基-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基]-氨基}-乙基)-琥珀酸(108)的合成(步骤5-图7b) 将(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酸二(三氟乙酸)盐107(965mg，2.5mmol)溶于无水DMF(8mL)和DIPEA(646mg，5mmol)中。向此溶液中加入O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，950mg，2.5mmol)。将混合物涡旋1分钟并向其中加入载体(106)。将淤浆搅拌25分钟，过滤，以DMF(10mL x　3)、CH2Cl2(10mL x 2)和DMF(10mL x 2)洗涤。然后使用等量的试剂将载体进行二次偶联(second round of coupling)(即双偶联(double coupling))，然后用DMF(10mL x 3)和CH2Cl2(10mL x 3)洗涤。然后在真空下将载体(108)干燥并不经进一步处理用于步骤6。
实施例6N-(2-{甲基-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基]-氨基}-乙基)-琥珀酸(109)的合成(步骤6-图7c) 将载体(108)用TFA/CH2Cl2(10mL)处理并放置5分钟。然后使溶剂从载体排出，再次用TFA/CH2Cl2(15mL)处理载体并收集溶剂。将TFA/CH2Cl2的两部分混合，然后在旋转蒸发仪中浓缩。将残留物与THF(20mL x 3)一起共蒸发。在高真空下除去痕量的TFA。然后用无水乙醚研磨残留物。得到胶粘团块。利用搅拌棒将此产物置于强烈搅拌下过夜。通过离心分离所得的白色固体，以乙醚洗涤(5mL x 3)，在高真空下干燥而得到白色吸湿性固体109(320mg，总产率59％)。MS315(MH+) 实施例7N-(2-{甲基-[2-(4-甲基-哌嗪-1-基)-乙酰基]-氨基}-乙基)-琥珀酸的NHS酯(111)的合成(步骤7-图7c) 向109(100mg，0.18mmol)溶于无水THF(2mL)的溶液中加入三氟乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯110(48mg，0.22mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。在旋转蒸发仪下除去THF，通过与额外的THF(2mL x 2)共蒸发而除去痕量的TFA。然后在冰箱中将胶状残留物静置于无水乙醚中过夜。倾析出乙醚并将残留物保持在高真空下而得到泡沫状的111(110mg，93％)。MS412(MH+) 实施例8编码的N-(t-boc)-肌氨酸(21)的合成(参见图11a) 将无水THF(100ml)通过套管转移至氮气吹洗的容纳有BOC-15NH-13CH2-13COOH(7g，39.29mmol，1当量，Cambridge IsotopeLab，P/NCNLM-2412-0)和磁力搅拌棒的500mL圆底烧瓶中。将混合物在室温下搅拌直到得到澄清的溶液。然后利用冰浴将溶液冷却至0℃。用氮气吹洗配有隔片的量筒并向其中转移叔丁醇钾(t-BuOK，157mL，1M，在THF中，4当量)溶液。然后将所述t-BuOK溶液加入到反应混合物中同时利用套管和压力差在0℃下搅拌。起初形成了凝胶，所述凝胶在约一分钟内溶解。使反应在0℃下再搅拌10分钟。
将数安瓿的13CH3I(2 x 10g，140mmol，3.56当量，CambridgeIsotope Lab，P/NCLM-287-10)在冰箱中冷却(3CH3I是高度挥发性的，应仅在冷冻下打开)并在氮气覆盖下打开。将内容物通过套管迅速转移到反应混合物中。然后在0℃下强烈搅拌反应混合物1小时。将反应的小的等分试样(100μL)用水(1mL)处理、通过加入1M HCl而酸化至pH1并用EtOAc(2mL)萃取。EtOAc层的TLC分析表明反应完成(Rf 20＝0.51，Rf 21＝0.70；1:4 MeOH-CH2Cl2-AcOH(10μl/10mL)；通过用3％(w/v)的茚三酮在乙醇(EtOH)中的溶液加热而使TLC显色。
然后在减压下除去THF溶剂，将固体溶于100mL水中，然后以1M HCl酸化至pH＝1。用EtOAc(300mL x 2)萃取水介质。将合并的EtOAc层用2％(w/v)NaHSO3(50mL)+盐水(50mL)溶液处理并强烈混合以除去在处理过程中形成的I2。将EtOAc层用盐水(50mL)进一步洗涤并用Na2SO4干燥。然后在减压下除去EtOAc和任何叔丁醇(t-BuOH)而得到稠厚无色油或低熔点固体的化合物21(7.42g，产率97％)。ES-MS(直接加入甲醇(MeOH)中)计算的MNa+(C513C3H1515NO4Na)＝216.10，实测的MNa+＝216.10。
实施例9编码的肌氨酸甲酯(23)的合成(参见图11b) 将BOC-15N13CH3-13CH2-13COOH(21，7.42g，38.41mmol)、二甲基氨基吡啶(DMAP，470mg，3.41mmol)和MeOH(7.8mL，5 x 38.41mmol)溶于EtOAc(200mL)中并冷却至0℃。然后向反应混合物中加入溶解在EtOAc(30mL)中的二环己基碳二亚胺(DCC，8.32g，1.05x 38.41mmol)。然后将反应混合物搅拌过夜，同时逐渐温热至室温。TLC分析表明反应已完成(Rf 21＝0.00，Rf 22＝0.50；7:3 己烷-EtOAc；通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。通过过滤(Whatman #2滤纸)除去二环己基脲(DCU)沉淀并将滤液浓缩至50mL。将浓缩溶液吸收进硅胶中并通过快速色谱纯化(进行两次；120g SiO2，柱Isco.；85mL/min，0～5分钟溶于己烷的10％ EtOAc，5～20分钟溶于己烷的25％ EtOAc)。
合并含有纯产物22的级分并使用旋转蒸发仪在室温下浓缩至50mL(化合物22的沸点低，不应施加高真空)。向浓缩溶液中加入HCl(60mL，4M HCl在二氧六环中)并搅拌。观察到强烈产生气泡。在30分钟后，TLC分析表明已完全脱去t-Boc的保护(Rf 23＝0.00，Rf 22＝0.50；7:3 己烷-EtOAc；通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。在减压下除去挥发物而得到白色吸湿性固体化合物23(5.2g，两步总产率94％)。ES-MS(直接加入甲醇(MeOH)中)计算的4MH+(C13C3H1015NO2)＝108.09，实测的MH+＝108.08，计算的M2H+＝215.18，实测的M2H+＝215.17。
实施例10载体接合的[Glu1]-人血纤维蛋白肽B的合成 [Glu1]-人血纤维蛋白肽B[Glu-Fib，CAS#103213-49-6]利用标准的Fmoc-肽合成方案(Novabiochem catalog，2004-2005)和以下的氨基酸衍生物在三苯甲基氯树脂(P/NNovabiochem，01-64-0074)上人工装配所述肽Fmoc-Arg(Pbf)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1145)、Fmoc-GIu(OtBu)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1020)、Fmoc-Gly-OH(P/NNovabiochem，04-12-1001)、Fmoc-Val-OH(P/NNovabiochem，04-12-1039)、Fmoc-Asn(Trt)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1089)、Fmoc-Asp(Mpe)-OH(P/NBachem，B-3560)、Fmoc-Phe-OH(P/NNovabiochem，04-12-1030)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(P/NNovabiochem，04-12-1033)、Fmoc-Ala-OH(P/NNovabiochem，04-12-1006)。[Glu1]-人血纤维蛋白肽B的氨基酸序列Seq ID.No.1Glu-Gly-Val-Asn-Asp-Asn-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg。
实施例11Fmoc-N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成 将NH(Me)-CH2CH2-NH(Me)(1.6mL，15mmol，P/NAlfa-Aesar，USLF006653，)溶于THF(15mL)的溶液加入到三苯甲基氯树脂(P/NNovabiochem，01-64-0074，1g，1.5mmol)中并在环境温度下搅拌混悬液1小时。然后将树脂过滤并以N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，15mL x 3)洗涤，以MeOH-DMF-二异丙基乙胺(DIPEA，15mL，4:7:2 v/v，P/NAldrich，387649)处理15分钟。最后将树脂过滤并以NMP(15mL x 3)洗涤。
然后向树脂中加入溶解在DMF(10mL)中的琥珀酸酐(P/NAldrich，2399690，1.5g，15mmol)，随后加入DIPEA(2.61mL，15mmol)。然后在环境温度下搅拌树脂20分钟。然后将树脂过滤并以NMP(15mL x 3)洗涤，然后以乙腈(CH3CN，15 x 3mL)洗涤。
将树脂以TFA-DCM(20％ v/v，40mL)处理、过滤并再次用TFA-DCM(20％ v/v，10mL x 5)洗涤。在减压下将滤液浓缩成油状残留物(TFA，N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH，1.07g)，将所述残留物溶解在饱和NaHCO3(pH 8-9)中。然后向所述水溶液中加入Fmoc-OSu的溶液(P/NAdvance ChemTech RC8015，1.43g，4.24mmol，溶于丙酮(20mL)中)并在环境温度下搅拌2小时。TLC分析表明形成了产物(Rf＝0.50；9:1:0.01 DCM-MeOH-AcOH，UV 254nm，通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。然后浓缩反应混合物以除去丙酮，然后以水(150mL)稀释残留物。通过利用Et2O(100mL x 2)萃取除去非极性杂质。将水层酸化(pH～1，HCl，1M)并用EtOAc(100mL x 2)萃取。将合并的EtOAc层通过Na2SO4干燥并浓缩而得到0.95g无色粘稠油Fmoc-N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH。ES-MS(直接加入MeOH中)计算的MH+(C22H24N2O5H+)＝397.17，实测的MH+ 397.16。
实施例12Fmoc-NH-CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-COOH·DIPEA的合成 使Fmoc-NH-CH2CH2-NH2·HCl(P/NNovabiochem，01-63-0064，1当量(eqv.))在DIPEA(1eqv.)存在下与琥珀酸酐(1eqv.)在DCM中反应而得到所述标题化合物。
实施例13Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成 向充分搅拌的Boc-NMe-CH2CH2-NH2(265mg，1.52mmol)溶于丙酮(15mL)的溶液中加入Fmoc-OSu(564mg，1.67mmol，溶于15mL丙酮中)的溶液。然后在环境温度下搅拌混合物2小时。在此阶段对反应混合物的TLC分析表明形成了Boc-NMe-CH2CH2-NH-Fmoc(Rf＝0.35；3:7 EtOAc:己烷，UV 254nm，通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。
蒸发丙酮后将产物通过快速色谱(40g Isco-二氧化硅柱，40mL/min，254nm，3:7 EtOAc:己烷，收集18mL级分，级分15-24含有纯的产物)纯化，得到泡沫状的Boc-NMe-CH2CH2-NH-Fmoc(520mg，产率＝86％)。
在环境温度下用TFA-水(15ml，95:5，v/v)处理Boc-NMe-CH2CH2-NH-Fmoc(520mg，1.31mmol)1小时，此时TLC分析表明已完全脱除了Boc的保护。在减压下除去TFA-水并将所得的油溶解在DCM(30mL)中。向此溶液中加入琥珀酸酐(131mg，1.31mmol)，然后加入DIPEA(至pH～10(通过湿的pH试纸))。然后搅拌混合物30分钟。然后将反应混合物HCl(1M)酸化(pH＝1)并以EtOAc(100mL x 3)萃取。用盐水(100mL x 2)洗涤合并的EtOAc层并通过Na2SO4干燥。在减压下除去EtOAc而得到无色油状的标题化合物。ES-MS(直接加入MeOH中)计算的MH+(C23H26N2O5H+)＝411.10，实测的MH+ 411.09。
实施例14N-(Fmoc)-N’-琥珀酰基-哌嗪的合成(图20) 向Boc-哌嗪(P/NLancaster L13363，500mg，2.68mmol)溶于DCM(30ml)的溶液中加入琥珀酸酐(269mg，2.68mmol)。在环境温度下搅拌反应2小时。TLC分析表明形成了琥珀酰化的Boc-哌嗪(Rf＝0.50；9:1:0.01 DCM-MeOH-AcOH，通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。向此溶液中加入TFA(30mL)，然后在环境温度下搅拌混合物1小时。在减压下除去混合物中的挥发性成分并将所得的油溶于含有最少量水的THF(30mL)中，通过加入DIPEA将pH调节到9。加入Fmoc-OSu(907mg，2.69mmol)溶于THF(10mL)中的溶液并在环境温度下搅拌1小时。TLC分析表明形成了产物(Rf＝0.55；9:1:0.01 DCM-MeOH-AcOH，UV 254nm，通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。然后在减压下除去混合物中的挥发性成分并将所得的油溶于最小体积的饱和NaHCO3中。然后用Et2O(100mL x 2)萃取水溶液，用HCl(1M)酸化(pH～1)并用EtOAc(150mL x 2)再萃取。将合并的EtOAc层通过Na2SO4干燥并浓缩而得到无色油状产物。
实施例15琥珀酰化的Fmoc-二胺和哌嗪乙酸与Glu-Fib肽的偶联 将约10mg的载体接合的[Glu1]-人血纤维蛋白肽B树脂(参见实施例10)用20％(v/v)溶于DMF中的哌啶处理(2mL x 1分钟，过滤，然后2mL x 5分钟)，过滤并洗涤(NMP)。将琥珀酰化的Fmoc-二胺(或其DIPEA盐，如在实施例11-14中所示[除了用于制备化合物125的、从无关原料自制的、但可利用本文中所公开的方法制得的Fmoc-NH-CH2CH2CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-COOH以外]，相对于树脂上Glu-Fib量的10eqv)用HATU(P/NApplied Biosystems 4317033，9.5eqv)和DIPEA(30eqv)在NMP(～1mL)中活化。将所述活化的化合物加入到树脂中并混合30分钟。然后将树脂过滤，用NMP洗涤，并通过如上所述的用20％(v/v)溶于DMF中的哌啶处理而除去Fmoc基团。然后利用HATU(9.5eqv)和DIPEA(60eqv)在NMP(～1.5mL)中活化哌嗪乙酸-TFA盐(10eqv)。然后将此活化的化合物的溶液加入到树脂中。30分钟以后将树脂用NMP洗涤，然后用CH3CN洗涤。然后使用95:5 TFA-水(200μL，2小时)将标记的肽从树脂上断开(和脱保护)并用乙醚(Et2O)沉淀。
各种标记肽的质谱分析数据(ES-MS，在水中直接输入) 化合物120(N-甲基-哌嗪)乙酰基-N(Me)-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib计算的MH+＝1880.9，实测的MH+＝1880.3 化合物121(N-甲基-哌嗪)乙酰基-NH-CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib计算的MH+＝1853.8，实测的MH+＝1853.8 化合物122(N-甲基-哌嗪)乙酰基-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib计算的MH+＝1867.9，实测的MH+＝1867.9 化合物123(N-甲基-哌嗪)乙酰基-N(Me)-CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib计算的MH+＝1867.9，实测的MH+＝1867.9 化合物124(N-甲基-哌嗪)乙酰基-哌嗪-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib计算的MH+＝1879.9，实测的MH+＝1879.0 化合物125(N-甲基-哌嗪)乙酰基-NH-CH2CH2CH2CH2-NH-CO-CH2CH2-CO-Glu-Fib计算的MH+＝1880.90，实测的MH+＝1880.94。
实施例16关于图22a、22b、23a、23b、24a和24b的讨论 图22a是化合物122的MS分析图。观察到标记肽具有+2和+3电荷的离子的强峰。图22b是对所选的在图22a中观察到的+2峰和其片段的MS/MS分析图。除了肽的子片段离子以外，还观察到在m/z 113.10处的未编码的报告物离子的强信号。此数据表明同样总体结构的编码的标记试剂将断裂而产生具有独特质量的报告物离子，所述报告物离子可用于分析物的多重分析。
图23a是化合物124的MS分析图。观察到标记的肽具有+2和+3电荷的离子的强峰。图23b是对所选的在图23a中观察到的+2峰和其片段的MS/MS分析图。除了肽的子片段离子以外，还观察到在m/z113.10处的未编码的报告物离子的强信号。此数据表明同样总体结构的编码的标记试剂将断裂而产生具有独特质量的报告物离子，所述报告物离子可用于分析物的多重分析。
图24a是化合物125的MS分析图。观察到标记的肽具有+2和+3电荷的离子的峰。图24b是对所选的在图24a中观察到的+2峰和其片段的MS/MS分析图。除了肽的子片段离子以外，还观察到在m/z 113.10处的未编码的报告物离子的强信号。此数据表明同样总体结构的编码的标记试剂将断裂而产生具有独特质量的报告物离子，所述报告物离子可用于分析物的多重分析。
在MS和MS/MS分析下，化合物120、121和123也表现出与化合物122、124和125所观察到的相似性质。在所有情形下，都观察到了报告物离子和子片段离子。因此，此数据表明同样总体结构的编码的标记试剂将断裂而产生具有独特质量的报告物离子，所述报告物离子可用于分析物的多重分析。
实施例17编码的N-(t-boc)-氨基乙醇的合成(图28a) 步骤1(图28a) 利用套管在氩气压下向N-Boc-肌氨酸(C3，15N)140(10g，51.7mmol)溶于无水THF(200ml)的冰冷溶液中滴加1M的BH3·THF溶于THF中的溶液(15.56g，181ml，181mmol)。起初控制加入速率保持适度的泡腾。一旦泡腾结束，就增加加入速率。加入后，在0℃搅拌混合物约1.5小时。通过TLC分析确认反应完成。然后通过小心加入0℃的甲醇而将反应猝灭。在旋转蒸发仪中浓缩反应混合物。然后将油状残留物与另外加入的甲醇(500mL)共蒸发。利用Combi-flash仪器，将所得的油状残留物通过快速色谱纯化而得到8g(90％)无色油状的N-Boc-N-Me-氨基乙醇(13C，15N)141。MS(178，M+H) 步骤2，(图28a) 在超过4分钟的时间下向141(7.8g，48mmol)、Et3N(16.7mL，120mmol)溶于DCM(700mL)的冰冷溶液中加入MsCl(P/NFluka 64260，4.5mL，57.6mmol)并同时搅拌。在0℃下又过15分钟后，通过TLC分析反应混合物，表明形成了新的产物(Rf 2＝0.20，Rf 3＝0.42；1:1 己烷-EtOAc，通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使TLC显色)。
蒸发DCM并将黄色固体溶于EtOAc(1.5L)中。将EtOAc层用HCl(1M，800mL)洗涤，然后用盐水(400mL x 2)洗涤，通过Na2SO4干燥并浓缩而得到黄色油。将所述油通过柱色谱(120g SiO2柱Isco(X2)；40mL/分钟，0～5分钟溶于己烷的35％EtOAc，5～15分钟溶于己烷的40％EtOAc。收集多个18mL-级分；级分9-24含有纯的化合物)纯化而得到无色油状的Boc＊NH＊CH2CH2OMs 142(～11.5g)，其直接用于下一步。
步骤3；图28a 用最小量的THF(～60ml)将化合物142(48mmol，假定前面反应的产率为100％)转移到化学玻璃压力容器中，并向其中加入500mL2M的甲胺溶液(P/NAldrich 395056，31g，1000mmol)，封口并在40～45℃下加热(同时搅拌)过夜(使用安全罩)。TLC分析(1:1 EtOAc-己烷)表明142已完全耗尽并生成了新产物(Rf 4＝0.52；1:1DCM-MeOH+1％(v/v)Et3N；先将TLC板加热5分钟以除去Et3N，然后通过用3％(w/v)的茚三酮在EtOH中的溶液加热而使其显色)。然后将反应混合物在旋转蒸发仪中浓缩，将残留物溶于二氯甲烷(1.5L)中并转移到分液漏斗中。加入1N NaOH(200mL)和盐水(200mL)并萃取。进一步用1N NaOH(200mL)和盐水(200mL)洗涤有机层。通过Na2SO4干燥。将残留物通过Combi Flash纯化而得到无色油的143(6.45g，76％)。MS(177M+H)。
实施例18包含6个同位素编码部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成(图28b) 向搅拌的143(6.4g，36.5mmol)溶于丙酮(200mL)的溶液中一次性加入琥珀酸酐-13C4(3.8g.36.5mmol)。然后滴加三乙胺(5mL，36.5mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30分钟。在此时TLC确认起始原料已完全消失。在旋转蒸发仪中浓缩反应混合物并将残留物溶于二氯甲烷(100mL)中。然后加入140mL 4M的HCl溶于二氧六环中的溶液。在5分钟内形成白色沉淀。通过TLC分析上清液以确认起始原料的完全消失。在旋转蒸发仪中浓缩反应混合物并将白色固体残留物溶于饱和NaHCO3溶液(pH 8-9)中。然后向上述溶液中加入Fmoc-Osu(14.5g，43mmol)溶于丙酮(400mL)中的溶液并在室温下搅拌3小时。在此时TLC表明反应完成。然后在旋转蒸发仪中浓缩反应混合物，并使用乙醚(200mL)和水(200mL)将固体残留物转移到分液漏斗中。分出乙醚层，并用乙醚(200mL X 3)萃取水层。然后用6M HCl将乙醚溶液酸化至pH 2并用EtOAc(4 X 200mL)萃取。将合并的EtOAc萃取物用盐水(50mL X 3)洗涤并通过Na2SO4干燥。在旋转蒸发仪上蒸发EtOAc，得到泡沫，将此泡沫保持在高真空下得到白色固体144，产率95％。MS(403，M＝H) 实施例19编码的N-(Fmoc)-N’-(甲基)-乙二胺·HCl的合成(图29a) 步骤1(图29a) 利用套管在氩气压下向N-Boc-肌氨酸(13C3，15N)150(10g，51.7mmol)溶于无水THF(200ml)的冰冷溶液中滴加1M的BH3·THF溶于THF中的溶液(15.56g，181ml，181mmol)。起初控制加入速率保持适度的泡腾。一旦泡腾结束，就增加加入速率。加入后，在0℃搅拌混合物约1.5小时。通过TLC分析确认反应完成。然后通过小心加入0℃的甲醇而将反应猝灭。在旋转蒸发仪中浓缩反应混合物。然后将油状残留物与另外加入的甲醇(500mL)共蒸发。利用Combi-flash仪器，将所得的油状残留物通过快速色谱纯化而得到8g(90％)无色油状的N-Boc-N-Me-氨基乙醇(13C3，15N)151。MS(180，M+H) 步骤2(图29a) 利用套管在氩气压下向N-Boc-N-Me-氨基乙醇(13C3，15N)151(8g，44.6mmol)、四溴化碳(17.8g，53.5mmol)和叠氮化钠(8.7g，133.8mmol)的混合物中加入无水DMF(240ml)，并搅拌所得的淤浆5分钟。在单独的烧瓶中制备三苯基膦(14g，53.5mmol)溶于无水二甲基甲酰胺(45ml)中的溶液并在氩气下保存。利用套管在氩气压下向上述淤浆中滴加所述三苯基膦溶液。再用DMF(5ml)冲洗烧瓶以确保定量转移。温热反应混合物，显现出亮黄色。然后在室温下搅拌混合物30分钟。取出等分试样并加入几滴乙醚。沉淀出白色固体，通过TLC分析上清液。通过起始醇(Rf0.24)的消失和较小极性产物(Rf0.65)的形成表明了反应的完成。向反应混合物中加入乙醚(1.5L)以沉淀三苯基鏻氧化物。然后通过有硅藻土层的烧结漏斗过滤所得的淤浆。再次用乙醚(500ml)充分洗涤白色固体。然后用盐水(300ml X 4)洗涤合并的滤液并通过Na2SO4干燥，过滤并在低于25℃的温度下于适度的真空度下在旋转蒸发仪上蒸发。然后使用Combi-Fash仪器将残留物通过快速色谱纯化而得到无色油的叠氮化物152，将其不经任何分析迅速用于下一步。
步骤3(图29a) 将从上述步骤得到的叠氮化物152溶于甲醇(900ml)中。然后加入饱和氯化铵溶液(180ml)并将反应混合物在室温下搅拌5分钟。然后向反应混合物中小批量地加入锌粉(8.7g，133.8mmol)。观察到有氮气放出。然后在室温下搅拌反应混合物10分钟。通过TLC分析等分试样，通过起始原料(Rf0.65)的消失确认反应的完成。滤出固体(未反应的锌和氢氧化锌)并用甲醇(200ml)洗涤。在旋转蒸发仪中浓缩合并的滤液。将残留物溶于二氯甲烷中并用6N NaOH溶液(800mL)萃取。用二氯甲烷(800ml)反萃水层。将合并的二氯甲烷萃取物通过Na2SO4干燥并在旋转蒸发仪中蒸发而得到浅黄色稠厚油的Boc-胺153。步骤2和3的总产率为80％。MS(179，M+H) 步骤4(图29a) 向N-Me-Boc-胺153(5.62g，31.5mmol)的丙酮(200ml)溶液中加入Fmoc-Osu(10.64g，31.5mmol)的丙酮(200ml)溶液。在室温下搅拌反应混合物5分钟后，加入80mL饱和NaHCO3溶液。继续搅拌反应混合物2小时。在此时TLC表明起始原料完全消失且形成了较小极性的产物。在旋转蒸发仪中蒸发丙酮。将半固体残留物在EtOAc(2L)、1M HCl(125ml)、盐水(125mL)和水(250mL)中分配。将EtOAc层进一步用1M HCl(100mL)、盐水+水(150mL+250mL)和盐水(250ml X 2)洗涤。通过Na2SO4干燥并在旋转蒸发仪中蒸发而得到灰白色的固体产物(12.6g)，将其溶于二氯甲烷(200mL)中并以4N HCl(188mL)处理30分钟而得到白色固体的Fmoc胺盐酸盐154(10.4g)。MS(301，M+H) 实施例20包含8个同位素编码部位的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH的合成(图29b) 向Fmoc-胺盐酸盐154(7.25g，21.5mmol)的二氯甲烷(600mL)混悬液中一次性加入琥珀酸酐(13C4)。然后滴加Et3N(4.5ml，32.3mmol)。在室温下搅拌反应混合物30分钟后，TLC分析表明起始原料已完全消失。在旋转蒸发仪中蒸发二氯甲烷。将所得的残留物在EtOAc(2L)和1M HCl(350mL)中分配。将有机层进一步用1M HCl(200mL)和盐水(200mL X 4)洗涤，通过Na2SO4干燥并蒸发而得到白色泡沫，将所述白色泡沫保持在高真空下48小时，得到白色固体的编码的Fmoc-NH-CH2CH2-N(Me)-CO-CH2CH2-COOH 155(7.5g，86％)。MS(405，M+1) 利用基本上如上述实施例1-7中所述的合成方案(另外参见图7a-7c)，可将根据实施例19和20制备的组合物用于根据图27a-27c的编码的标记试剂的合成。图25a-25b举例说明了可利用本发明中公开的一般方法制备的一些标记试剂。另外，图26a-26b举例说明了可利用图25a-25c中公开的标记试剂制备的一些标记的分析物。根据在质谱仪中的断裂，所述标记的分析物将产生可用于定量上述各种样品中的分析物的片段离子和片段离子的混合物。
还应当理解，通过选择合适的编码的起始原料，上述方法与常规实验方法相结合可用于制备各种其它的编码的组合物，所述组合物可用作根据在此公开的一种或多种发明的标记试剂。因此，上述实施例在任何方式下都不是限制性的。
尽管已描述了本发明的教导连同多种实施方案，但并非旨在将本发明的教导限制在这些实施方案中。相反，本领域技术人员将会理解，本发明的教导包括各种替代、修改和等同物。
权利要求
1.式I所代表的化合物，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
Y是可被取代或未取代的并可任选地可断开地连接到载体上的5、6或7元杂环，其中所述杂环包含通过共价键连接到基团J上的至少一个环氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基团，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；
每个X3彼此独立地是-O-或-S-；和
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；
其中，
V+是带正电荷的反离子；
每个R3、R4、R5、R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；和
每个R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此独立地可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
2.权利要求1的化合物，其中形成报告物部分的基团Y-J包含至少一个同位素富集部位。
3.权利要求1的化合物，其中形成平衡物部分的由式I#所代表的基团包含至少一个同位素富集部位
其中，
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；和
每个X3彼此独立地是-O-或-S-。
4.权利要求1的化合物，其中形成报告物部分的由式Y-J所代表的基团包含至少一个同位素富集部位，并且形成平衡物部分的由式I#所代表的基团包含至少一个同位素富集部位
其中，
Y是可被取代或未取代的并可任选地可断开地连接到载体上的5、6或7元杂环，其中所述杂环包含通过共价键连接到基团J上的至少一个环氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基团，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；和
每个X3彼此独立地是-O-或-S-。
5.权利要求1的化合物，由式II所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
W是取代六元杂环的至少一个M基团的原子或基团，并且位于所述六元环的氮的邻位、间位或对位，并且是-N(H)-、-N(R”)-、-N(R”’)-、-P(R”)-、-P(R”’)-、-O-或-S-；
每个余下的基团M彼此独立地是-CM’2-，其中每个M’可以彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R8、-OR8、-SR8、-R8’OR8或-R8’SR8；
J是由式-CJ’2-所代表的基团，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；
每个X3彼此独立地是-O-或-S-；
每个R”彼此独立地可以是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；
每个R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或将所述化合物可断开地与载体连接起来的可断开连接物；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；
其中，
V+是带正电荷的反离子；
每个R3、R4、R5、R6、R7、R8和/或R10彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；和
每个R3’、R4’、R5’、R6’、R8’和/或R9’彼此独立地可以是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
6.权利要求5的化合物，由式III所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
s是1～5的整数，t是1～10的整数；
R1是氢、氘或R6；
R2是氢、氘或R7；
R11是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；
其中，
V+是带正电荷的反离子；
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或将所述化合物可断开地与载体连接起来的可断开连接物；和
其中，
每个R6、R7和/或R10彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；和
每个R9’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
7.权利要求6的化合物，其中所述化合物由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在适当时替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
R1是氢或R6；
R2是氢或R7；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；
其中，
V+是带正电荷的反离子；和
R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
8.权利要求6的化合物，其中所述化合物由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
9.权利要求5的化合物，由式IV所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
t是1～10的整数；
R11是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3或-R”’；
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；
其中，
V+是带正电荷的反离子；
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或将所述化合物可断开地与载体连接起来的可断开连接物；和
其中，
每个R9’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基；和
每个R10’彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
10.权利要求9的化合物，其中所述化合物由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在适当时替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；和
Z是-OH、-SH、-O-V+、-S-V+、反应活性基团、反应活性基团的离去基团或共价键合的分析物；
其中，V+是带正电荷的反离子。
11.权利要求1、5、6或9中任一项的化合物，其中所述化合物包含至少一个同位素富集部位。
12.权利要求1、5、6或9中任一项的化合物，其中所述化合物包含两个或更多个同位素富集部位。
13.权利要求1-12中任一项的化合物，其中Z是肽或蛋白质。
14.权利要求1-12中任一项的化合物，其中Z是-OH。
15.权利要求1-12中任一项的化合物，其中Z是活性酯的离去基团。
16.权利要求15的化合物，其中Z是N-羟基琥珀酰亚胺。
17.权利要求1-13中任一项的化合物，其中所述化合物是校正标准物。
18.一种方法，包括
a)使每种包含一种或多种反应活性分析物的两种或多种样品与标记试剂组中不同的标记试剂反应，从而形成两种或多种不同标记的样品，每种标记的样品包含一个或多个标记的分析物，其中所述组中的不同的标记试剂由式I’所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
Y是可被取代或未取代的并可任选地可断开地连接到载体上的5、6或7元杂环，其中所述杂环包含通过共价键连接到基团J上的至少一个环氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基团，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；
每个X3彼此独立地是-O-或-S-；
Z’是反应活性基团或反应活性基团的离去基团；
其中，
每个R3、R4、R5、R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；
每个R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基；和
其中，
所述组中每种不同的标记试剂具有相同的总质量，但其中每种不同的标记试剂的形成报告物部分的基团Y-J在一个或多个同位素富集部位被独特地编码，从而当基团Y-J的基团J与所述标记试剂的其余部分之间的键在质谱仪中断裂时，产生具有独特质量的报告物离子；和
b)混合两种或多种不同标记的样品或其一部分以及任选的一种或多种校正标准物，从而产生样品混合物。
19.权利要求18的方法，还包括
c)对样品混合物或其一部分进行一级质谱分析；
d)给来自所述一级质谱分析的具有选定质荷比的标记的分析物的离子施加解离能级，从而形成至少一些所选离子的报告物离子和子片段离子；以及
e)对所选离子、报告物离子和子片段离子或其一部分进行二级质谱分析。
20.权利要求19的方法，还包括
f)测定所述二级质谱分析中每种报告物离子的总质量和相对量以及一些或全部子片段离子的总质量和/或绝对质量。
21.权利要求19的方法，还包括
g)通过对子片段离子的分析，确定与所选的质荷比相关的标记的分析物。
22.权利要求21的方法，还包括在不同选定质荷比下对标记的分析物的所选离子重复步骤(d)到(g)一次或多次。
23.权利要求22的方法，还包括重复步骤(c)到(g)一次或多次，每次用样品混合物的不同部分。
24.权利要求18～23中任一项的方法，其中基团Y是取代或未取代的吗啉、哌啶或哌嗪部分。
25.权利要求18～24中任一项的方法，其中每种样品是粗的或处理过的细胞溶解物、体液、组织提取物或细胞提取物。
26.权利要求18～24中任一项的方法，其中每种样品是由分离过程得到的级分。
27.权利要求18～26中任一项的方法，其中一种或多种分析物是肽和/或蛋白质。
28.权利要求18～26中任一项的方法，其中所述由Z’代表的反应活性基团是活性酯的离去基团，所述活性酯是N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(NHSS)、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、3-硝基苯基酯(3-NP)、4-硝基苯基酯(4-NP)、2，4-二硝基苯基酯、五氟苯基酯(Pfp)、五氯苯基酯(Pcp)、3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮酯(Dhbt)、羟基吡咯烷酮酯(NHP)、2，4-二卤代苯基酯、2，2，2-三氟乙基酯或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙基酯。
29.权利要求19～27中任一项的方法，其中每种具有独特质量的报告物离子鉴定作为每种标记的分析物的来源的样品。
30.权利要求18～29中任一项的方法，其中所述组中每种不同的标记试剂是载体接合的并通过可断开连接物与载体相连接，从而使每种不同的样品与载有所述组中不同标记试剂的载体反应；其中所述方法在进行步骤(b)之前还包括下列步骤
i)任选地洗涤所述载体以除去不与标记试剂的反应活性基团反应的样品组分；
ii)使所述可断开连接物断开，从而释放供采集的两种或更多种不同标记的样品，每种样品包含一种或多种标记的分析物，其中与特定样品相关联的标记的分析物通过连接到其上的具有独特质量的报告物部分是可鉴定的和/或可定量的；和
iii)在混合样品之前，任选地采集标记的分析物的每种样品。
31.权利要求18的方法，还包括
c)用至少一种酶消化每种样品以部分或完全地降解所述样品或样品混合物的组分；或
d)分离所述样品混合物；或
e)上述c)和d)。
32.权利要求21的方法，其中测定在所述二级质谱分析中具有独特质量的每种报告物离子相对于其他报告物离子的相对量。
33.权利要求32的方法，其中将与被鉴定的分析物相关的每种具有独特质量的报告物离子的相对量与组合形成所述样品混合物的每种不同标记的样品的量相关联，从而确定在组合形成所述样品混合物的两种或多种不同标记的样品中的每种之中的分析物的量。
34.权利要求33的方法，其中
i)所述样品混合物包含已知量的用于所述被鉴定分析物的校正标准物，该校正标准物包含具有独特质量的报告物部分；并且参照与所述校正标准物相关的独特报告物离子的量来测定具有独特质量的每种报告物离子的绝对量；以及
ii)参照具有独特质量的每种不同报告物离子的相对量来测定所述样品混合物的每种不同样品中被鉴定分析物的绝对量。
35.权利要求33的方法，还包括在不同的选定质荷比处对标记的分析物的所选离子重复步骤(d)到(g)一次或多次，从而鉴定和/或测定在组合形成所述样品混合物的两种或多种不同标记的样品的每种之中的一种或多种其它分析物的相对量。
36.权利要求34的方法，还包括在不同的选定质荷比处对标记的分析物的所选离子重复步骤(d)到(g)一次或多次，从而鉴定和/或测定在组合形成所述样品混合物的两种或多种不同标记的样品的每种之中的一种或多种其它分析物的绝对量。
37.权利要求34的方法，其中所述分析物是肽，并且基于组合形成所述样品混合物的两种或多种不同标记的样品的每种之中的一种或多种肽的鉴定和相对量来确定组合形成所述样品混合物的两种或多种不同标记的样品的每种之中的一种或多种蛋白质的鉴定和相对量。
38.权利要求35的方法，其中所述分析物是肽，并且基于组合形成所述样品混合物的两种或多种不同标记的样品的每种之中的一种或多种肽的鉴定和绝对量来确定组合形成样品混合物的两种或多种不同标记的样品的每种之中的一种或多种蛋白质的鉴定和绝对量。
39.权利要求18的方法，其中所述标记试剂由式III’所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
s是1～5的整数，t是1～10的整数；
R1是氢、氘或R6；
R2是氢、氘或R7；
R11是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’；
Z’是反应活性基团或反应活性基团的离去基团；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或将所述化合物可断开地与载体连接起来的可断开连接物；和
其中，
每个R6、R7和/或R10彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；和
每个R9’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
40.权利要求39的方法，其中至少一种标记试剂由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在适当时替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
R1是氢或R6；
R2是氢或R7；
Z’是反应活性基团或反应活性基团的离去基团；
其中，
R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
41.权利要求39的方法，其中至少一种标记试剂由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
42.权利要求18的方法，其中所述标记试剂由式IV’所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
t是1～10的整数；
R11是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、或-R”’；
Z’是反应活性基团或反应活性基团的离去基团；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-、HS-R9’-或将所述化合物可断开地与载体连接起来的可断开连接物；和
其中，
每个R9’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基；和
每个R10彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
43.权利要求42的方法，其中至少一种标记试剂由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在适当时替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；和
Z’是反应活性基团或反应活性基团的离去基团。
44.包含至少两种标记的分析物的混合物，其中所述标记的分析物中的至少两种源自不同的样品，其中所述混合物的每种标记的分析物由式I”所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
Y是可被取代或未取代的5、6或7元杂环，其中所述杂环包含通过共价键连接到基团J上的至少一个环氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基团，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者
1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；
每个X3彼此独立地是-O-或-S-；
Z”是共价连接的分析物；
其中，
每个R3、R4、R5、R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；
每个R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基；和
其中，形成报告物部分的所述基团Y-J在一个或多个同位素富集部位被独特地编码，从而当所述基团Y-J的基团J与所述标记的分析物的其余部分之间的键在质谱仪中断裂时，产生具有独特质量的报告物离子，所述报告物离子鉴定作为所述两种或更多种标记的分析物中的每一种的标记反应来源的所述样品。
45.权利要求44的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是肽和/或蛋白质。
46.权利要求44的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是核酸。
47.权利要求44的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是脂质和/或类固醇。
48.权利要求44的混合物，其中所述分析物中的一种或多种是质量小于1500道尔顿的小分子。
49.权利要求44的混合物，其中所述分析物中的两种或更多种是不同的分析物类型。
50.权利要求44的混合物，其中至少一种标记的分析物由式III”所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
s是1～5的整数，t是1～10的整数；
R1是氢、氘或R6；
R2是氢、氘或R7；
R11是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、其它烷基或-R”’；
Z”是共价连接的分析物；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-或HS-R9’-；和
其中，
每个R6、R7和/或R10彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；和
每个R9’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
51.权利要求50的混合物，其中至少一种标记的分析物由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在适当时替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
R1是氢或R6；
R2是氢或R7；
Z”是共价连接的分析物；
其中，
R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
52.权利要求50的混合物，其中至少一种标记的分析物由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
53.权利要求44的混合物，其中至少一种标记的分析物由式IV”所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
t是1～10的整数；
R11是氢、氘、甲基、-C(H)2D、-C(H)D2、-CD3、或-R”’；
Z”是共价连接的分析物；
其中，
R”’是H2N-R9’-、H(R10)N-R9’-、(R10)2N-R9’-、HO-R9’-或HS-R9’-；和
其中，
每个R9’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基；和
每个R10彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基。
54.权利要求53的混合物，其中至少一种标记的分析物由以下各式所代表，包括其盐形式和/或水合物形式
或
其中，
＊表示包括在适当时替代12C的13C和替代14N的15N的同位素富集部位；
Z”是共价连接的分析物。
55.包含至少一种根据权利要求1～17中任一项的化合物的试剂盒。
56.权利要求55的试剂盒，还包含至少一种选择的其它试剂，以便通过对样品进行不同标记而进行用于定量两种或多种不同样品中的一种或多种分析物的测定。
57.权利要求55的试剂盒，其中所述化合物是包含具有独特质量的报告物部分的标记的校正标准物。
58.权利要求55的试剂盒，其中所述化合物是包含具有独特质量的报告物部分的标记试剂。
59.一种方法，包括
a)使取代或未取代的二胺与取代或未取代的二羧酸或酸酐反应，从而形成包含至少一个酰胺键或硫代酰胺键的氨基酸产物；
b)使所述氨基酸产物与包含报告物部分的化合物反应，其中所述包含报告物部分的化合物包含取代或未取代的N-烷基化的乙酸部分和与所述乙酸部分共价连接的氮原子；以及
c)修饰所述氨基酸产物的酸基团或硫代酸基团，从而形成能与分析物的官能团反应的反应活性基团，
其中在步骤(c)的产品中包含至少一个同位素富集部位。
60.权利要求59的方法，其中所述方法产生由式I’所代表的化合物，包括其盐形式和/或水合物形式
其中，
Y是5、6或7元杂环，其中所述杂环包含通过共价键连接到基团J上的至少一个环氮原子；
J是由式-CJ’2-所代表的基团，其中每个J’彼此独立地为氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R3、-OR3、-SR3、-R3’OR3或-R3’SR3；
K是由式-(CK’2)n-或-((CK’2)m-X3-(CK’2)m)p-所代表的基团，其中n是2～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个K’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R4、-OR4、-SR4、-R4’OR4或-R4’SR4；
L是由式-(CL’2)q-或-((CL’2)m-X3-(CL’2)m)p-所代表的基团，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个L’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R5、-OR5、-SR5、-R5’OR5或-R5’SR5；
或者1)R1是氢、氘或者R6，并且R2是氢、氘或R7；
或者
2)R1和R2一起为由式-(CR’2)q-或-((CR’2)m-X3-(CR’2)m)p-所代表的基团，所述基团形成了桥接两个氮原子的环，其中q是1～10的整数，每个m彼此独立地是1～5的整数，p是1～4的整数，每个R’彼此独立地是氢、氘、氟、氯、溴、碘、-R6、-OR6、-SR6、-R6’OR6或-R6’SR6；
X1是＝O、＝S、＝NH或＝NR7；
每个X2彼此独立地是＝O或＝S；
每个X3彼此独立地是-O-或-S-；
Z’是反应活性基团或反应活性基团的离去基团；
其中，
每个R3、R4、R5、R6和/或R7彼此独立地是烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基或芳基烷基；和
每个R3’、R4’、R5’和/或R6’彼此独立地是亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚芳基或亚烷基芳基。
61.一种片段离子组合物，所述片段离子组合物在至少两种不同标记的分析物分子断裂后存在于质谱仪中，其中所述标记的分析物分子中的至少一种是选自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段离子是带正电荷或带负电荷的。
62.权利要求61的片段离子组合物，所述片段离子组合物具有以下分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
63.权利要求61的片段离子组合物，所述片段离子组合物具有以下分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
64.一种混合物，所述混合物包含由分析物的不同标记的分子发生断裂而衍生的片段离子，其中所述不同标记的分析物分子的所述片段离子在质谱仪中产生，并且其中至少一种所述不同标记的分析物分子是选自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段离子是带正电荷或带负电荷的。
65.权利要求64的混合物，其中至少一种片段离子具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
66.权利要求64的混合物，其中至少一种片段离子具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
67.一种片段离子，所述片段离子是由包含同量异位标记的分析物分子的组合物在质谱仪中发生断裂而产生，其中所述同量异位标记的分析物分子中的至少一种是选自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段离子是带正电荷或带负电荷的。
68.权利要求67的片段离子的组合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
69.权利要求67的片段离子的组合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
70.一种通过以下方法产生的片段离子
在质谱仪中电离包含至少两种不同标记的分析物分子的样品混合物的一部分；
在选定的m/z值处选择至少两种所述不同标记的分析物分子以进行断裂；以及
通过施加解离能级使所选的分析物分子发生断裂；
其中至少一种所述不同标记的分析物分子是选自以下各式之一的化合物
和
其中所述片段离子是带正电荷或带负电荷的。
71.权利要求70的片段离子的组合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+、13C3C3H1315N2+、13C3C3H1315NN+、13C2C4H1315NN+、13CC5H1315NN+、13CC5H13N2+或C6H13N2+。
72.权利要求70的片段离子的组合物，其具有以下的分子式13C6H1315N2+、13C4C2H1315N2+或13C3C3H1315N2+。
全文摘要
本发明涉及与通过质谱法进行分析物测定相关的方法、混合物、试剂盒和组合物。
文档编号G01N24/00GK101421609SQ200780009989
公开日2009年4月29日 申请日期2007年1月23日 优先权日2006年1月24日
发明者萨西·K·皮拉伊, 苏巴卡尔·戴伊, 苏巴西什·普尔什亚斯塔, 达里尔·J·C·帕平 申请人:阿普里拉股份有限公司