用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇...的制作方法

专利名称：用羟基类固醇脱氢酶通过还原氧代类固醇化合物或者氧化羟基类固醇化合物制备类固醇 ...的制作方法
用羟基类固醇脱氢酶通ffi原氧代类固醇化合物或者 氧化羟基类固醇化合物制备类固醇衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种对映体it择性酶促还原化合物的方法，所述化合物包括类 固醇结构(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子， 一个或多个双 键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3， 7， 11， 12或17位或者在类固醇 骨架任何碳基团的a位至少有一个桥氧基(=氧代类固醇化合物)，其中在存在 NADH或者NADPH作为辅因子的劍牛下，所述氧代类固醇化合物用羟基类固 醇脱氢酶还原。
本发明还涉及一种氧化化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构 (ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子， 一个或多个双键和/或一 个芳香环，并且在类固醇环系的3， 7， 11， 12或17位或者在类固醇骨架任何 碳基团的a位至少有一个羟基(=羟基类固醇化合物)，其中在存在NAD或者 NADP作为辅因子的条件下，所述羟基类固醇化合物用羟基类固醇脱氢酶氧化。
类固醇是有胆固醇的环结构，且随双键的数量、功能基团的种类、数量禾口 位置、甲基、烷基侧链的数量以及键之构型而不同的化合物。类固醇化合物存 在于动物以及真菌(Pilzmi)和植物中，并且有多种生物学作用，例如可作为雄 性和雌性、激素，肾上腺、激素、维生素、胆汁酸(Gallensaeuren)、类固醇皂苷元 (Steroidsapogenine)，作为心脏活性物质和作为蟾蜍毒素。
下面氧代类固醇化合物理解为前述定义的类固醇，也S是说，其中它们至 少有一个酮功能团，所述酮功能团可包含在环系上或者在类固醇框架的侧,5lh。
下面羟基类固醇化合物理解为前述定义的类固醇，也就是说，其中它们 至少有一个羟基功能团，所述羟基功能团可在环系上或者在类固醇框架的侧 链上。
由于类固醇的很多生理学作用，人们认为类固醇化合物及其更大量的衍生 物可用作医学中治疗有效的物质和药物。
例如发现世界上已广泛4顿孕激素和雌激素衍生物用于避孕；嫩敫素(睾 酮)例如在治疗前列腺癌时被用作促蛋白合成甾类和抗鄉敫素。糖皮质激素(可的松、氢化可的松、强的松龙和强的松)及其衍生物，由于其抗炎、抗过敏和 免疫抑制作用而被广泛用于皮肤病、风湿性疾病、过敏反映、肾病、胃肠疾病 以及许多其他疾病的治疗中。
生物活性类固醇化合物的市场很大。生物转4W于生产具有不同作用的不 同类固醇衍生物起很大的作用。特别是由羟化酶和脱氢酶催化的反应很重要。
在此起重要作用的是5-l-脱氢反应、llp-还原、20p-还原、17(3-还原，在3和7 位的立体选择性还原，另外，还有羟基，特别是3、 7、 12和17位羟基的氧化 作用。
迄今为止，只有用完整的细胞实现了对类固醇的工业生物还原，但物质浓 度远低于10g/1。产生这种情况的原因是，生物转化所需的酶迄今尚未被表征或 者表达出来，另外，没有令人满意的技术手段， 一方面，类固酉雜水介质中的 溶解度小，另一方面，需要再生足够量的辅因子NADH和NADPH。
迄今为止，类固醇的氧化是用工业化学方法完成的。
从1975-1988年，GCairea就实质上描述了用分离的酶进行对映体选择还原 类固醇的方法(Eur.丄Biochemistiy 44， 1974 p.401~405; Biotechnology and Bioengineering， Vol 17， 1975， p. 1101-1108; Enzyme Microb. Technol. Vol 6， My, 1984， p. 307-311; Biotechnology and Bioengineering, Vol 26， 1984， p. 560-563; J. Org. Chem. 51 ， 1986， p. 2902-2906; J. Org. Chem. 58， 1993， p.499-501; J. Org. Chem. 53， 1988， p.88-92; Enzyme Microb. Technol. ， Vol 10， June, p. 333-339; Archives ofBiochemistiy and Biophysics, 159， 1973， p,7-10)。
为此，需要4顿不同的羟基类固醇脱氢酶(HSHD)，其中，实质上通过乳 酸脱氢酶、甲酸脱氢酶或者来自酵母的醇脱氢酶连接可以实现辅因子NADH的 再生。用葡萄糖脱氢酶实现NADP的再生。用乙酸乙酯和乙酸丁酯作为有机相 的两相体系解决溶解度低的问题。在两相体系中的分离的酶会以远低于10 g/l 的浓度实施反应，其中所达到的"总转^i〔" (TTN=mol还原的氧代类固醇化 合物/mol所用的辅因子)同样远在1000以下，所述方法与全细胞方法相比，没
有实质上的经济it势。
3ffilit—歩努力，fflil结^il化和还原反应，7a羟^^专化成7p羟基。这可 以M3！ 7aHSDH和7卩HSDH的结合来实现(Pedrim et al. ， Steroids 71 (2006) pl89-198)。但是，在该方法中，浓度也是远低于10g/1，且所达到的"总转变数"(TTN^mol还原的氧代类固醇化合物/mol所用的辅因子)同样在100以下，该 方法也是相对不经济的。
本发明的目的是为了克月gJ^缺陷和困难并以此为己任，发明了一种方法:
在较高浓度下，以较高的转变能力，和较高的辅因子TTN并因此以经济的方式 可以完成氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物的对映体选择还原或者氧化反应。
就开始提及类型的方法而言，所述任务是通过下述方法完成的
a) 氧代类固醇化合物在反应混合物中的浓fe50g/1，
b) 通过氧化通式为RxRyCHOH的二级醇，或者S51氧化C4-C6环烷醇持 续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NAD或者NADP，其中Rx， RY彼此^Ut是氢、支链或者无支链C广C8烷基，且C总^3，禾口
c) 另外的氧化还原,醇脱氢酶用于氧化通式为RxRyCHOH的二级醇或者 环烷醇。
就开始提及类型的方法而言，J^任务还可以ffl31另一种方法完成
a) 羟基类固醇化合物在反应混合物中的浓fe50g/1，
b) M31iS原通式为RxRyCO的酮化合物，或者通过还原C4-C6环烷酮， f煞卖性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NADH或者NADPH，其 中Rx， RY彼此3拉是氢、支链或者无支链C广Q烷基，且C总&3，禾口
c) 另外的氧化还原 郭兑氢酶用于还原通式为RxRyCO的酮或者环烷酮。 本发明描述了明显改进现有技术有关类固醇结构中对映体选择性酶i^原
和氧化反应的方法。本发明可以用大大高于现有技术所述浓度的自由酶，将氧
代类固醇化合物还原或^il化成相应的羟基-或^it代类固醇。
在本发明方法中使用了辅因子NADH或者NADPH。在所述概念中， "NADP"是烟酉划安腺嘌呤二核苷酸^^酸，"NADPH"是还原型烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸磷酸。"NAD"是烟酉划安腺嘌呤二核苷酸，"NADH"是还原型烟酉划安腺 嘌呤二核苷酸。
按照4，的实施方案，本发明方法的特征在于，使用下列通式I的氧代类 固醇化合物其中，
!^是氢、甲基、羟基或者桥氧基(Oxogruppe); R2是氢、甲基、羟基或者桥氧基； R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基； R4是氢或者羟基；
Rs是氢，-COR1Q，其中，R化是未取代的或者用羟基取代的C1-C4烷基， 或者取代的或者未取代的Cl-C4羧烷基； 或者&和R5 —起表示桥氧基； Re是氢、甲基、羟基或者桥氧基； R7是氢、甲基、羟基或者桥氧基； Rs是氢、甲基或者卤素；禾口 R9是氢、甲基、羟基或者桥氧基或者卣素；
其中R!、 R2、 R4+R5、 R6、 Rg或者R9至少之一是氧桥基，或者Rs是-CORk 且下列结构式
是苯环或者有0、 1或2个C-C双键的C6环。
按照本发明的优选技术方案，本发明发明特征在于，使用有下列通式I的
羟基类固醇化合物<formula>formula see original document page 12</formula>(I)
R9
其中
Rj是氢、甲基、羟基或者挢氧基； R2是氢、甲基、桥氧基或者羟基； R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基； R4是氢或者羟基；
Rs是氢，画CORk)，其中，RK)是未取代的或者用羟基取代的C1画C4烷基， 或者取4戈的或者未取代的Cl-C4 M^烷基； 或者&和R5 —起表示桥氧基； R6是氢、甲基、桥氧基或者羟基； R7是氢、甲基、桥氧基或者羟基； Rs是氢、甲基或者卤素；和 R9是氢、甲基、羟基、桥氧基或者卤素；
其中Ri、 R2、 R4、 R6、 R7、 Rs或者R9至少之一是羟基，且下列结构式 ^环或者有0、 1或2个C-C双键的C6环。
雌是用2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、4-甲基-2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、5-甲 基-2-己醇或者2-辛醇作为通式RxRyCHOH的二级醇，和用环己醇作为环烷醇。
雌是用2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、5-甲^~2-己酮 或者2-辛酮作为通式RxRyCO的酮，和用环己酮作为环烷酮。
下面，将通式为RxRyCO的酮或C4-C6环烷酮与通式为RxRyCHOH的二 级醇或C4-C6环烷酉鲱诚为总的术i吾共底物(Cosubstot)。
，本发明的方法在含水的有机两相体系中完成。这里合适地，用于辅酶再生的共底物不能与水混合，并因此形成含水的有机两相体系中的有机相。
进一步的实施方案是在本发明方法中还使用不参与辅因子再生的有机溶
齐!J，例如乙醚、叔-丁甲醚、二异丙醚、二丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、 己烷或者环己烷。
进一步{，本发明方法的TTN^103。
此外，优选地，在2-96小时内，至少50%所用的氧代类固醇化合物或者羟 基类固醇化合物，被还原成相应的羟基类固醇化合物或者被氧化成氧代类固醇 化合物。
本发明方法优选的实施方案的特征在于，用例如酮石胆酸 (Ketolithocholsaeure)(式n)、地塞米松(式m)、 4-雄甾烯-3,17-二酮(式IV)、 1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(式V)、雌酮(式VI)、孕烯醇酮(式VH)和可的松
(式vm)作为氧代类固醇化合物。
进一步说，本发明优选的实施方案的特征在于，用例如胆汁酸的不同衍生
物，如胆酸、鹅脱割旦酸、12-氧ftl旦酸、3-羟基-12-氧代胆酸、酮石胆酸、石胆 酸(l他ocholsaeure)或者氢化可的松作为羟基类固醇化合物。
所谓羟基类固醇脱氢酶，通常理解为这样一种酶，即该酶旨詢多催化类固醇 结构中酮基还原成羟基或者羟基氧化成相应酮基的反应。这里，所述氧化或 者还原反应可以在类固醇自身的环系统中(例如7-oc羟基类固S享-脱氢酶)或者 也可在类固醇基本结构的碳上(例如20-P羟基类固醇脱氢酶)发生。
用于氧代类固醇化合物还原反应的适宜的羟基类固醇脱氢酶是例如3-a羟 基类固醇脱氢酶(HSDH)、 3(3HSDH、 12aHSDH、 20(3HSDH、 7aHSDH、 7pHSDH、 17(3HSDH和11阳SDH。
一种适宜的3-a羟基类固醇脱氢酶例如得自睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni) (J.Biol.Chem. 276 (13)， 9961-9970 (2001))，并可以用于3-a-羟基 类固醇的氧化反应或者3-酮类固醇，象例如3-酮-胆汁酸、孕烯醇酮、4-雄甾烯 -3,17-二酮、5-a-雄甾烷-3,17-二酮等的还原反应。
具有3-P-羟基类固醇脱氢酶活性的适宜的酶可以例如得自无害梭菌 (Clostridium innocuum) (Applied and Environmental Microbiology, June 1989， p.1656-1659)或者得自睾丸酮假单胞菌，并可以用于3-(3-羟基类固醇的氧化反 应或者3-酮类固醇，象例如3-酮-胆汁酸、孕烯醇酮、4-雄烯-3,17-二酮、5-a-雄甾烷-3,17-二酮等的还原反应。
12oHSDH例如得自梭菌(Clostndien) (Eur.J.Biochem. 196 (1991 )439450)，
并可以用于12ot羟基类固醇(例如胆酸)的氧化反应，或者12-酮类固醇，例如 象12-酮胆汁酸(12-酮鹅脱氧胆酸、脱MI旦酸)的还原反应。同样具有l邻羟基 类固醇脱氢酶活性的酶也来自梭菌(Biochim.Biophys.Acta 1988 Octl4; 962 (3): 362-370)。
具有20-p羟基类固醇脱氢酶活性的酶例如得自链霉菌属的生物(The Journal of Biological Chemistry, 1977， Vol.252 Nol， JanlO， 205-211)，并可以用 于可的松和氢化可的松衍生物(可的松、氢化可的松、11-脱氧皮甾醇、黄体酮) 生成相应20-(3-羟基类固醇的还原反应(例如20-(3羟基黄体酮)。
具有20-oc-羟基类固醇脱氢酶活性的相应酶例如得自梭菌，特别是得自闪烁 梭菌(Clostridium scindens) (Journal of Bacteriology, June 1989， p.2925-2932)， 以及得自梨形四膜虫(Tetrahymena Pynfo醒s) (Biochem.J. (1994) 297， 195-200) 的相应酶。
特别地，适宜的7-oc羟基类固醇脱氢酶是来自肠内微生物区系的生物，例 如来自梭菌(不同梭菌、肠内微生物区系氏梭菌)(Journal of Bacteriology, Aug. 1994， p.4865-4874),来自大肠杆菌(Journal of Bacteriology, Apr.， 1991， p.2173-2179),来自脆弱拟杆菌(CurrentMicrobiology, Vol47 (2003) 475484)， 布鲁氏菌属、真杆菌属，并可以用于7-a-羟基类固醇(鹅石胆酸 (Chenolithochlosaeure))的氧化反应，或者7-酮类固醇，例如象7-酮-胆汁酸(酮 石胆酸)的还原反应。
具有7-p-羟基类固醇脱氢酶活性的相应酶同样得自梭菌，瘤胃球菌科的微 生物aBiochemistry102， 1987， p.613-619)，或者得自消化链球菌属(Biochimica and Biophysica Acta 1004， 1989， p.230-238)，得自产气真杆菌(Applied and Environmental Microbiology, May 1982, p. 1057-1063 )和嗜麦芽假单胞菌(Pednm etal.， Steroids71 (2006) p. 189-198)。通过7-pHSDH可以从酮石胆酸产生乌索
脱w酸。
已矢卩17-(3羟基类固醇脱氢酶来自真菌，如Cylindrocarpon radicola (J.Biochemistry 103， 1988， 1039-1044 )和Cochliobolus lunatus (J. Steroid Biochem. Molec.Biol. Vol. 59， 1996，No.2，p.205-214)，来自链霉菌科的细菌(Hoppe-Seyler，sZ. Physiol. Chem.， Bd.356， 1975， 1843-1852)，假单胞菌(The Journal of Biological Chemistry, Vol. 252No.ll， June 10， 1977， p.3775陽3783)和产碱菌属(Alcaligenes) (The Journal of Biological Chemistry ， Vol. 260 ， No.25 ， Nov.5 , 1985 ， p.l3648陽13655)。
17-p羟基类固醇脱氢酶例如可用于17-(3羟基类固醇的氧化反应，或者17-酮类固醇，如4-雄甾烯-3,17-二酮、雄酮(Androsteron)、雌酮(Estron)的还原反应。
具有17a羟基类固醇脱氢酶活性的相应酶是来自真杆菌属(Journal of Lipid Research, Vol. 35， 1994， p.922-929)。
ll-p羟基类固醇脱氢酶己知来自高等哺乳动物，并能够例如用于将氢化可 的松氧化成可的松。
然而在催化类固醇结构的氧化或者还原反应中，还可以用任何其他氧化还 原謝乍为羟基类固醇脱氢酶。
用于NADH或者NAD再生的合适的二级S郭兑氢酶例如当使用来自睾丸酮 假单胞菌的17-p羟基类固醇脱氢酶、来自无害梭菌的3-p羟基类固醇脱氢酶或者 来卽危弱拟杆菌的7-oc羟基类固醇脱氢酶时是例如上面描述的那些，并且分离自 念珠菌属和Pichia的酵母中分离，如来自Candida parapsilosis的羰基还原酶 (CPCR) (US 5,523,223和US5,763,236; Enzyme Mcrob. Technol. 1993 Nov; 15 (11) :950-8)， Pichiacapsulata (DE 10327454.4)， Pichiafarinosa (A 1261/2005， K.C12N), Pichiafinlandica (EP1179595 Al)， Candida腿odendra (A 1261/2005， Kl. C12N)， Pichiatrehalophila (A 1261/2005， Kl. C12N)， Rhodotorula mucilaginosa (A 1261/2005， K1.C12N)， Lodderomyces elongisporus (A 1261/2005， K1.C12N) 和Pichia stipidis (A 1261/2005， K1.C12N)。
另外，所述二级醇S媳,氧化还原酶也可以完成NADH的再生，所述二 级醇脱氢酶/氧化还原酶如所述并且分离自放线菌科的细菌，例如红城红球菌 (US5523223X Norcardm fUsca (Biosci.Biotechnol.Biochem.， 63 (10) (1999)， p.1721-1729; Appl.Mcrobiol.Biotechnol.2003 Sep; 62 (4): 380-6， Epub 2003 Apr.26)、赤红球菌(J.Org.Chem.2003Jan24; 8 (2) :402-6)或者微杆菌属(A 1261/2005，幻.C12N)。
用于NADPH或者NADP再生的合适的二级醇脱氢藤氧化还原酶，例如在用来自累腐败梭菌的12-a羟基类固醇脱氢酶、来自真杆菌属的17-OC羟基类固醇 脱氢酶，或者来自索氏梭菌的7-ot羟基类固醇S腹酶时，是如所述并分离自下列 微生物的所述酶乳杆菌属(高加索酸奶乳杆菌US5200335)、短乳杆菌 (DE19610984A1; Acta Qystallogr.D.Biol. Qystallogr. 2000 Dec; 56 Pt 12:1696-8)、 稍小乳杆菌(DE 10119274)、肉色明串球菌(A 1261/2005，幻.C12N)，或者如 所述来自布氏热厌氧菌、Thermoanerobmmethanolicus或者拜氏梭菌的那些。
两种酶，羟基类固醇脱氢酶和氧化还原,郭兑氢,t^用于在大肠杆菌中 重组过表达。在本发明方法中，两种酶，羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢,氧4K 原酶可以以完全纯化地、部分纯化地，或者以含在细胞中的形式使用。所用的 细胞可以是天然的、有渗透性的或者溶解形式存在。
每公斤待转化的氧代类固醇化合物或者羟^类固醇化合物{吏用50 000至10 Mo U羟基类固醇脱氢酶，以及50 000至10 Mo U醇脱氢酶(如上所公开的)。
酶单位1U相当于，对于羟基类固醇脱氢酶来说，每么H中(min)转化1 !imol 氧代类固醇化合物所需的羟基类固醇脱氢酶酶量，或者每^H中(min)氧化1 fimol 2-醇所需的醇脱氢酶酶量。
^似地，每公斤待转化的氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物f吏用约 10 g至500 g含羟基类固醇脱氢酶的大肠杆菌生物湿物质，和10 g至500 g含醇 脱氢,氧化还原酶的大肠杆菌生物湿物质(按上文所公开的)。
NAD (P) H的再生用所述的酶偶联方式完成。
在本发明方法中氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物的转化t^用两 相系统完成，所述两相系统含有用于辅因子再生的2-醇或者酮化合物、羟基类 固醇脱氢酶、醇脱氢酶、水、辅因子以及氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化 合物。此外，还含有另外的有机溶剂，所述溶剂不参与辅因子的再生，也就是 说，没有Mil所用的醇脱氢酶可氧化的羟基或者可还原的酮基而含有。
两相系统中与水不混合的有机组分的含量为占反应混合物总体积量的10% 至90%，优选20%至80%。水占反应混合物总体积量的90%至10%，优选80% 至20%。
可将pH值为5-10，雌6-9的缓冲液，例如磷酸妈-、Tns/HCl、甘氨酸-或者三乙翻安-缓冲液加至咏中。所述缓冲液还可含有用于稳定或者活化所述两 种酶的离子，例如f美离子或者锌离子。另外本发明方法中还可使用用于稳定羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢酶的附加
组分，例如甘油、山梨醇、1,4-DL-二硫苏糖醇(DTT)或者二甲基亚砜(DMSO)。
辅因子NAD (P) H的浓度，以7jC相为^5出计算，为0.001 mM-10 mM， 特别地0.01-1.0 mM。温度可取决于所用酶具体的特点，为1(TC-7(TC， 20°C-35°C。
本发明方法达到的TTN (总转变数^mo1还原的氧代类固醇化合物/mol所 用的辅因子)可以为102-105，通常TTN〉103。
待还原的氧代类固醇化合物或者羟基类固醇化合物通常难溶于水。在反应 过程中，所述底物可以完全或者不完全溶解。若所述底物在反应混合物中不完 全溶解，贝ij一部分底物以固体形式存在，因此，可以形成第三固相。在转化过 程中，反应混合物可以形成临时的乳液。
本发明方法中，待还原的氧代类固醇化合物或者待氧化的羟基类固醇化合 物的量为，以总反应混合物的体积计》50 g/1。,为50 g/1400 g/1氧代类固醇 化合物/羟基类固醇化合物，特别i^50^-200g/1。
优选的不参与辅因子再生的其他有机溶剂是，例如乙酸乙酯、乙酸丁酯、 叔丁基甲级醚、异丙基醚、庚烷、己烷、甲苯、二氯甲垸或者环己烷或者其不 同组成的混合物。
ilil氧化通式为RxRyCHOH的二级醇或者C4-C6环烷醇完成NAD (P) H的再生。形成通式为RxRyC二0的酮或者C4-C6环烷酮的反应产物。这里优 选二级醇是脂肪族2-醇，例如异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、2-辛 醇、4一甲基_2一戊醇、5-甲基-2-己醇，以及环二级醇，例如环己醇、环戊醇。原 则上，二醇化合物也是可行的，例如l,4-环己二醇。
M313S原通式为RxRyC二O的酮或者C4-C6环烷酮完成NAD(P)的再生。 形 式为RxRyCHOH的二级醇或者C4-C6环烷醇的反应产物。优选的酮化 合物是酮，例如丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、4-甲基-2-戊 嗣、5-甲基-2-己酮，以及环酮，例如环己酮、环戊酮。原则上，二酮化合物也 是可行的，例如l,4-环己二酮。
本发明方法例如在玻璃或者^属反应^^器中完成。这样组分在反应容器中 单独转化，同时在例如氮气或者空气下搅拌。根据所用的氧代类固醇化合物计 算反应时间，为1小时至96小时，特别是2小时48小时。在所述反应时间内，至少50%的氧代类固醇化合物被还原城相应的羟基类固醇或者将羟基类固醇氧 化城相应的氧代类固醇化合物。
下来实施例将用于进一步说明本发明。 实施例
1.将雄甾烯-3,17-二酮还原成17-P-羟基4-雄甾烯-3-酮(睾酮)
A) 用于辅酶再生的含4-甲基-2-戊醇的两相系统
为了合成17f3-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)，向含有0.1mgNAD， 30单位来 自睾丸酮假单胞菌的重组17-f3-羟基类固醇脱氢酶(J.Steroid B10chem.M0l.B10l. 44 (2)， 133-139 (1993)， PubmedP19871)和50单位来自Pichiacapsulata (DE画A 103 27 454)的重组醇脱氢酶的0.5ml缓冲液(lOOmM三乙醇胺，pH=7， 1 mM MgCl2， 10%甘油)中，加入100mg溶于0.4m14-甲基-2-戊醇中的雄甾烯-3,17-二酮。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。雄甾烯-3,17-二酮在总反应 体积中的浓度为大约100 ^1。
反应结束后，例如处理反应混合物，其中用有机^f(j提取反应混合物，然 后蒸馏除去所述有机溶剂。
24小时后，约94%的所用雄甾烯-3,17-二酮转化成n-P-羟基-4-雄甾膝3-酮(睾酮)。
用气相色谱足跟宗雄甾烯-3，17-二酮向17-P-羟基-4-雄甾烯-3-酮(睾酮)的转 化。为此，用带有手性分离柱LipodexE， 12m (Macheiy-Nagel， Dueren，德国)， Flammen-Ionisations-Detektor和氦作为载气的Shimadzu的气相色谱GC-17A进 行检测。
B) 带有用于辅酶再生的乙酸丁酯和2-丙醇的两相系统
为了合成17-p-羟基4-雄甾烯-3-酮(睾酮)，向含有0.1mgNAD， 30单位 来自睾丸酮假单胞菌的重组17-(3-羟基类固醇脱氢酶(J.SteroidBiochem.Mol.Bi01. 44(2)， 133-139 (1993)， PubmedP19871)和50单位来自Pichiacapsulata (DE國A 103 27 454)的重组醇脱氢酶的0.5ml缓冲液(lOOmM三乙醇胺，pH=7， 1 mM MgCl2， 10%甘油)中，加入100 mg溶于0.3 ml乙酸丁酯和0.1 ml 2-丙醇中的 雄甾烯-3,17-二酮。将混合物在室温，恒定搅拌下i咅养24小时。雄甾烯-3，17-二 酮在总反应体积中的浓度为大约100 g/1。
反应结束后，例如处理反应混合物，其中用有机^^提取反应混合物，然后蒸馏除去所述有机溶剂。
24小时后，约90%-95%所用雄甾烯-3,17-二酮转化成17-(3-羟基4-雄甾烯-3-
酮(睾酮)。
2. 将酮石胆酸还原成鹅石胆酸
A) 用来自布氏热厌氧菌的ADH/两相系统完成辅酶再生
为了合成3a-7oc-二羟基-5-f3-胆酸(鹅石胆酸)，向含0.1mgNADP、 10单 位来自闪烁梭菌的重组7-a-羟基类固醇脱氢酶(PubmedAAB61151)和10单位 来自布氏热厌氧菌的重组醇脱氢酶的0.2 ml缓冲液(100 mM磷酸钙缓冲液， pH=8.5， lmMMgCl2， 10%甘油)中加入在0.5ml甲基戊醇中的100mg3a-羟 基-7-氧代-5-P-胆酸(酮石胆酸)。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。 酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100 g/L
24小时后，约90-98%的所用酮石，旦酸转化成鹅石胆酸。 用HPLC跟踪酮石胆酸向鹅石胆酸的转化。为此，用分离柱EC125/4 Nucleodur 100-5 C18ec (Machery-Nagd， Dueren，德国，)，MeOH/zK (80: 20) 混合物进行检测。
B) 用来自乳酸杆菌的ADH (DE 10119274) /两相系统完成辅酶再生
为了合成3a-7a-二羟基-5-p-胆酸(鹅石胆酸)，例如向含O.l mg NADP、 10单位来自闪烁梭菌的重组7-a-羟基类固醇脱氢酶(PubmedAAB61151)和10 单位来自乳酸杆菌的重组醇脱氢酶(DE 10119274)的0.3ml缓冲液(100 mM 三乙醇胺缓冲液，pH=7， lmMMgCl2， 10%甘油)中加入在0.5 ml辛醇中的100 mg 3a-羟基-7-氧代-5-p-胆酸(酮石胆酸)。将混合物在室温，恒定搅拌下培养 24小时。酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100 g/l。
24小时后，约70-80%的所用酮石胆酸转化成鹅石胆酸。
3. 将1，4-雄甾二烯-3,17-二酮还原成17-p-羟基-l,4-雄甾二烯-3-酮
为了合成17-P-羟基-l,4-雄甾二烯-3-酮，向含有0.1mgNAD， 30单位来自 睾丸酮假单胞菌的重组17-p-羟基类固醇脱氢酶asteroid Biochem.Mol.Biol. 44 (2)， 133-139 (1993), PubmedP19871)和5单位来自Pichiacapsulata (DE-A103 27 454)的重组醇脱氢酶的0.5 ml缓冲液GOO mM三乙醇胺，pH-7， 1 mMMgCl2， 10%甘油)中，加入100mg溶于0.4m14甲基-2-戊醇中的l,4-雄甾二烯-3,17-二 酮。将混合物在室温，恒定搅拌下培养24小时。1，4-雄甾二烯-3,17-二酮在总反应体积中的浓度为大约100 g/l。
反应结束后，例如反应混合物进行处理，其中有机相进行分离，然后蒸馏 除去所述有机溶剂。
24小时后，约90%-98%的所用雄甾烯-3,17-二酮转化成17-(3-羟基-1,4-雄甾 二烯-3-酮。
用气相色谱足殿宗1,4-雄甾二烯-3,17-二酮向17-P-羟基-l,4-雄甾二烯-3-酮的 转化。为此，用Perkin Elmer的气相色谱AutosystemXL，配有带FS-毛细管柱 Optima-5-MS (Machery-Nagel, Dueren，德国)的质谱仪，以氦作为载气，进行 检测。
4.鹅石胆酸氧化成酮石胆酸
A) 用来自布氏热厌氧菌的ADH/两相系统完成辅酶再生
为了合成3a-羟基-7-氧代-5-P-胆酸(酮石胆酸)，向0.4 ml缓冲液(100 mM 磷歡tf丐缓冲液，pH=8.5， lmMMgCl2， 10%甘油)中，加入在0.5ml甲基异丁 酮中的100mg3a-7a-二羟基-5-p-胆酸(鹅石胆酸)，所述缓冲液含O.l mgNADP、 10 mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自闪烁梭菌的过表达的7-a-羟基类固醇 脱氢酶(PubmedAAB61151))和5 mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自布 氏热厌氧菌的过表达的醇脱氢酶)。将混合物在室温，恒定搅拌下i咅养24小时。 酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100 g/1。
24小时后，80。/。以上的所用鹅石胆酸转化成酮石胆酸。
用薄层色谱足跟宗鹅石胆酸向酮石胆酸的转化
B) 用来自孚L酸杆菌的ADH (DE 10119274) /两相系统完成辅酶再生
为了合成3a-羟基-7-氧代-5-(3-胆酸(酮石胆酸)，向0.15 ml缓冲液(IOO mM 磷Mf丐缓冲液，pH=7.5， lmMMgCl2， 10%甘油)中，加入在0.7ml甲基异丁 酮中的100mg3a-7a-二羟基-5-p-胆酸(鹅石胆酸)，所述缓冲液含0.1 mgNADP、 10 mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自闪烁梭菌的过表达的7-a-羟基类固醇 脱氢酶(PubmedAAB61151))和5 mg大肠杆菌生物湿物质(其中含有来自乳 酸杆菌的过表达的醇脱氢酶(DE10119274))。将混合物在室温，恒定搅拌下培 养24小时。酮石胆酸在总反应体积中的浓度为大约100 g/l。
24小时后，90%以上的所用鹅石胆酸转化成酮石胆酸。
权利要求
1、一种对映体选择性酶还原化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个桥氧基(＝氧代类固醇化合物)，其中在辅因子NADH或者NADPH存在的条件下，用羟基类固醇脱氢酶还原所述氧代类固醇化合物，其特征在于a)氧代类固醇化合物在反应混合物中的浓度≥50g/l，b)通过氧化通式为RXRYCHOH的二级醇，或者通过氧化C4-C6环烷醇持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NAD或者NADP，其中RX，RY彼此独立是氢、支链或者无支链C1-C8烷基，且C总数≥3，和c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于氧化通式为RXRYCHOH的二级醇或者环烷醇。
2、根据权利要求l的方法，其特征在于，是具有下列通式I的化合物用作 氧代类固醇化合物 <formula>formula see original document page 2</formula>(I)其中R!是氢、甲基、羟基或者桥氧基； R2是氢、甲基、羟基或者桥氧基； R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基；R4是氢或者羟基；Rs是氢，-COR10，其中，R化是未取代的或者用羟基取代的C1-C4烷基，或者取代的或者未取代的Cl-C4鄉基； 或者R4和R5—起表示桥氧基； R6是氢、甲基、羟基或者桥氧基； R7是氢、甲基、羟基或者桥氧基； Rs是氢、甲基或者卤素；禾口 R9是氢、甲基羟基、桥氧基或者卣素；其中R!、 R2、 R4+R5、 R6、 Rg或者R9至少之一是氧桥基，或者Rs是-C01^且下列结构式;^环或者有0、 1或2个C-C双键的C6环。
3、 根据权利要求1或者2的方法，其特征在于2-丙醇、2-丁醇、2-戊醇、 4-甲基-2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、5-甲基-2-己醇或者2-辛醇用作通式为RxRyCHOH 的二级醇以及环己醇作为环烷醇。
4、 根据丰又利要求1-3任一项的方法，其特征在于J^述方法在含7jC的有丰几两 相系统中完成。
5、 根据权利要求4的方法，其特征在于另外地4柳有机溶齐,如乙醚、叔 丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或者 环己烷。
6、 根据权利要求1-5的任一项的方法，其特征在于TTN (总转变数mol 还原的氧代类固醇化合物/mol所用的辅因子)
7、 根据禾又利要求1-6的任一项的方法，其特征在于在2-96小时内，至少 50%的所用氧代类固醇化合物被还原成羟基类固醇化合物。
8、 根据禾又利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用酮石胆酸(式n)作 为氧代类固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
9、根据权利要求l-7的任一项的方法，其特征在于用土也塞米松(式m)作为氧代类固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
10、根据权禾腰求1-7的任一项的方法，其特征在于用1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(式IV)作为氧代类固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>
11、根据权禾腰求1-7的任一项的方法，其特征在于用1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(式V)作为氧代类固醇化合物<formula>formula see original document page 4</formula>(V)
12、根据权利要求1-7的任一项的方法，其特征在于用雌酮(式VI)作为 氧代类固醇化合物<formula>formula see original document page 0</formula>
13、根据权利要求l-7的任一项的方法，其特征在于用孕烯醇酮(式vn)<formula>formula see original document page 0</formula>
14.作为氧代类固醇化合物<formula>formula see original document page 0</formula>
15、 一种对映体选择性酶氧化化合物的方法，所述化合物包括类固醇结构<formula>formula see original document page 0</formula>(ABCD)，该结构在环结构中包含一个或多个杂原子， 一个或多个双键和/或一 个芳香环，并且在类固醇环的3， 7， 11， 12或17位或者在类固醇骨架任何碳 基团的a位至少有一个羟基(=羟基类固醇化合物)，<formula>formula see original document page 6</formula>(ABCD) 其中在辅因子NAD或者NADP存在的^f牛下，用羟基类固醇脱氢酶氧化 所述羟基类固醇化合物，其特征在于a) 羟基类固醇化合物在反应混合物中的浓fe50^1，b) Mil还原通式RxRYCO的酮化合物，或者ffiii^原C4-C6环烷酮，持 续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NADH或者NADPH，其中 Rx， Ry彼此独立是氢、支f连或者无支f连C广C8烷基，且C总&3，禾口c) 另外的氧化还原敏醇脱氢酶用于还原通式为RxRyCO的酮或者环烷酮。
16、根据权利要求15的方法，其特征在于，具有下列通式I的化合物用作羟基类固醇化合物<formula>formula see original document page 6</formula>其中Rj是氢、甲基羟基或者桥氧基； R2是氢、甲基、桥氧基或者羟基； R3是氢、羟基、桥氧基或者甲基； R4是氢或者羟基；Rs是氢，-COR10，其中，R化是未取代的或者用羟基取代的C1誦C4烷基， 或者取代的或者未取代的Cl-C4羧烷基； 或者&和R5 —起表示桥氧基； R6是氢、甲基、桥氧基或者羟基；R7是氢、甲基桥氧基或者羟基；Rs是氢、甲基或者卤素；和R9是氢、甲基羟基、桥氧基或者卤素；其中R" R2、 R4、 R6、 R7、 R8或者R9至少之一是羟基，且下列结构式:是,或者有0、 1或2个C-C双键的C6环。
17、 根据禾又利要求15或者16的方法，其f寺征在于为2-丁酮、2-戊酮、4-甲基-2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、5-甲基-2-己酮或者2-辛酮作为通式RxRYCO的酮，和用环己酮作为环烷酮。
18、 根据权利要求15-17任一项的方法，其特征在于所述方法在含水的有 机两相系统中完成。
19、 根据权利要求18的方法，其特征在于另外地j顿有机溶剂，例如乙醚、 叔丁基甲基醚、二异丙基醚、二丁基醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、庚烷、己烷或 者环己烷。
20、 根据权利要求15-19的任一项的方法，其特征在于TTN (总转变数= mol还原的羟基类固醇化合物/mol所用的辅因子)
21、 根据权利要求15-21的任一项的方法，其特征在于在2-96小时内，至 少50%的所用羟基类固醇化合物被氧化^^基类固醇化合物。
全文摘要
一种对映体选择性酶促还原类固醇结构之化合物(ABCD)的方法，所述类固醇结构之化合物在环结构中包含一个或多个杂原子，一个或多个双键和/或一个芳香环，并且在类固醇环系的3，7，11，12或17位或者在类固醇骨架任何碳基团的α位至少有一个桥氧基(＝氧代类固醇化合物/羟基类固醇化合物)，其中在存在NADH或者NADPH作为辅因子的条件下，所述氧代类固醇化合物用羟基类固醇脱氢酶还原，其特征在于a)氧代类固醇化合物在反应混合物中的浓度为＞50g/l，b)通过氧化通式为R_XR_YCHOH的二级醇，其中R_X，R_Y彼此独立是氢、支链或者无支链C₁-C₈烷基，且C_总数≥3，或者通过氧化C4-C6-环烷醇，持续性地再生由羟基类固醇脱氢酶形成的氧化辅因子NAD或者NADP，和c)另外的氧化还原酶/醇脱氢酶用于氧化通式为R_XR_YCHOH的二级醇或者环烷醇。
文档编号C12P33/16GK101421413SQ200780012874
公开日2009年4月29日 申请日期2007年4月11日 优先权日2006年4月11日
发明者A·古普塔, A·申特谢尔, M·博布科瓦 申请人:Iep有限责任公司