用于开发变性疾病新药的治疗性靶分子的制作方法

专利名称：用于开发变性疾病新药的治疗性靶分子的制作方法
用于开发变性疾病新药的治疗性乾分子
本发明整体上涉及治疗、预防和诊断变性疾病(degenerative disease ) (尤其是神经变性疾病)的领域。具体而言，本发明涉及基因和蛋白质， 其在细胞中伴随长期氧化应激而受调控并用于治疗、预防、和诊断变性疾 病，尤其是神经变性疾病。另外，本发明涉及在细胞中伴随长期氧化应激 而受调控的基因和蛋白质的用途，用于筛选候选物质以鉴定预防和/或治疗 剂，所述试剂调节基因和/或蛋白质的生物活性，所述基因和/或蛋白质在细 胞中伴随长期氧化应激而受到活化。另外，本发明涉及诊断变性疾病(尤 其是神经变性疾病)的方法、和鉴定预防和/或治疗剂的方法，所述试剂调 节基因和/或蛋白质的生物活性，所述基因和/或蛋白质在细胞中伴随长期氧 化应激而受到活化。另外，本发明涉及进行诊断方法的试剂盒。
需氧生物体以及其它生物体，使用氧化反应来从食物中获取能量并提 供代谢物，以维持整个分解和代谢。因此，在细胞中不断形成活性氧类别 (reactive oxygen species, ROS)和活性氮中间体(reactive nitrogen species, RNS)，诸如超氧化物阴离子、羟基自由基、过氧化氢、过氧亚硝酸盐和氧 化氮。这些反应性分子的产生或(更确切地是)形成必须被精确调节，以 防止细胞中的生物分子，如蛋白质、DNA、和脂类不受控制的氧化和硝化。 在对ROS和/或RNS出现不平衡时，细胞则受到氧化应激，其可导致以不 受控的和不需要的方式来修饰生物分子，由此导致细胞死亡(变性)。神经 元是特别易受氧化应激的，这是由于它们的高能量消耗和高代谢活性造成 的。
神经元的死亡对于受影响的人来说是有灾难性和不可恢复的影响的。 例如，神经元的死亡可例如是中风、心月几梗塞、创伤性脑和脊髓损伤、感 染、炎症反应、兴奋性神经毒性、缺血、低氧、或其他脑和脊髓供给受限 的结果。而且，神经元的死亡出现于神经变性疾病，诸如阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease )、 卢Y尹体病(Lewy body diseases)诸如帕金森病 (Parkinson's disease )、弥漫性卢4尹体病(diffuse Lewy body disease )、亨廷 顿病(Huntington's disease )、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、朊病毒病(prion diseases, PrD)、克雅病(Creutzfeldt-Jakob disease )、 唐氏综合症(Down syndrome )、额颞叶痴呆(frontotemporal dementia, FTD)、 皮质基底变性(corticobasal degenerations )、多发性才更塞性痴呆(multi-infarct dementias )、进4亍性核上麻痹(progressive supranuclear palsy )、 多系统萎缩 (multiple system atrophy )和科尔萨科夫氏综合症(Korsakoff's syndrome )。 神经元的死亡也可是药物影响的结果。相应地，较长期施用神经抑制药物 治疗患者精神病状况，可导致慢性延迟性运动障碍，其是由受影响的神经 元中自由基浓度增加并接着发生神经元变性而造成的。
神经变性疾病中神经元选择性和进行性死亡的原因还未被揭示。这些 疾病的每一种中最多有10%呈常染色体遗传性形式，然后在其65岁前就影 响患者("早发")。阿尔茨海默病的特征在于细胞内神经原纤维缠结 (neurofibrillar tangle, NFT)(其主要由过磷酸化的tau蛋白质组成)和老年 斑(senile plaque， SP )中细胞外淀粉样蛋白(3 (amyloid |3， A卩)40-42沉积。 结果是胆碱能神经元的选择性丧失。可是，也存在无斑形式的阿尔茨海默 病。遗传形式主要由基因突变造成的，所述基因编码AP前体蛋白质(A(3 precursor protein, APP)和早老蛋白(分别为PS1和PS2)。以该结果为基础的 淀粉样蛋白假说考虑到了 A(3稳态改变，其造成了渐进性Ap沉积和Ap聚 集，这造成胆;威能神经元的死亡。
帕金森病候是由脑黑质神经元死亡导致的多巴胺不足所造成的。在细 胞水平上，可观察到产生卢伊体，其主要由聚集的a-突触核蛋白组成，还 包含其他蛋白质，诸如泛素C-末端水解酶。家族性累积的帕金森病迄今与 超过10个染色体区域相关，其中编码a-突触核蛋白(PARKl)、 Parkin (PARK2)、和DJ-1 (PARK7)的基因中的突变清楚地是疾病成因。
ALS是由运动神经元的累进性丧失造成的。该病家族形式中20%与 Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)中超过90个突变相关。
亨廷顿病是由编码亨廷顿蛋白的基因中的CAG三核苷酸重复序列的 致命延伸而造成的。该延伸导致积聚在细胞内的富含谷氨酰胺的异常亨廷 顿蛋白形成，并在紋状体神经元中形成凝聚体及其它物质。
可是，对于大多数神经变性疾病，其以65岁后零星形式("迟发")发生， 不涉及已知的各个突变。它们是由环境影响和内源因素的多因子协同造成 的。年龄被认为是主要风险因素。近几年中，ROS和RNS造成的细胞损伤性氧化应激正日益被视为引发 或促进疾病的因素。相应地，蛋白质硝化、蛋白质羰基化、糖氧化、和脂 过氧化物在阿耳茨海默病和帕金森病的脑样品中被频繁地4企测到。其他证 据分别是抗氧化酶的补偿性上调和增强RNA和DNA的氧化、以及修复这 类损伤能力的降低。另外，在帕金森病中，能发现线粒体电子传递链复合 物I和细胞内硫醇的水平降低以及铁增加。动物模型支持了帕金森病发生的 氧化应激假说。相应地，给药6-OH-多巴胺或1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(MPTP)能诱导多巴胺能神经元的变性，长期暴露于杀虫剂也一 样。PARK7-区编码的DJ-1蛋白在细胞中能起抗氧化功能。也已知，a-突触 核蛋白的积聚由氧化应激造成。在ALS中，硝基酪氨酸常常在脊髓中被观 察到。在亨廷顿病中，8-羟基脱氧鸟香和硝基酪氨酸常常在紋状体中被作为 氧化应激标志而观察到。
所以在神经变性疾病发病机理中，氧化应激是外部因素(如环境毒性 化合物)和内部因素(如遗传诱因)之间的关键连结。另外已知，自由基 解毒系统(如谷胱甘肽(GSH)系统)的功效在年老时下降。需要直接干扰 该细胞针对应激的保护机制并由此产生神经保护作用的疗法，其预计能阻 止疾病进程。
当前没有有效的药物针对神经变性疾病。使用的试剂仅针对症状。可 是，它们不能终止疾病进程。在某种程度上，产生了相当大的副作用，如 运动障碍、精神错乱状态等。药物治疗目标分别在于代替缺少的神经递质 并使幸存神经元功能最大化，神经元数量在症状开始时就急剧下降，如阿 尔茨海默病中下降超过50 %。
60-80%的阿耳茨海默病患者对乙酰胆碱酯酶抑制剂类没反应。唯一可 用的其他选择仅有NMDA受体拮抗剂金刚烷胺。处于临床开发中的有针对 烟碱乙酰胆碱受体和NMDA受体的选择性配体、分别针对(3-和，分泌酶以 及tau凝聚体的抑制剂、抗P-淀粉样蛋白的免疫接种、非类固醇类抗炎药物、 降胆固醇水平的药物(他汀(Statine))以及非特异性抗氧化剂(其中有自旋 4甫获剂(spin trapping agent))，及其它。
在帕金森病中，左旋多巴和脱羧酶抑制剂的组合仅在约5年的时间内 有效。另外，可给药多巴胺激动剂或单胺氧化酶或儿茶酚-O-曱基转移酶的 抑制剂。处于临床开发中的有神经原生长因子、神经亲免素(neuroimmunophilin )、非特异性抗氧化剂、激酶抑制齐寸(CEP 1347)以及 细胞替代疗法(其中有Spheramine⑧)等。
在ALS中，NMDA受体拮抗剂Riluzol用于对症治疗。这期间，观察 到存活期稍微延长2个月，其中该病在诊断后2-5年内导致死亡。
因此，对于对神经变性疾病有更高效果、特异性和接受性的新药物有 着巨大的需求。整体上存在大量治疗方法，其追求抗炎、抗凝集、抗兴奋、 抗凋亡、抗氧化、神经营养-再生以及转录/转译修饰的策略。尽可能在变性 级联的更多阶段使用的、具有广泛基础的治疗方法以病理生理过程的复杂 性来看似乎是当前最有希望的。
以前针对神经变性疾病的抗氧化治疗策略仅使用非特异性抗氧化剂 (诸如维生素E、艾地苯(idebenon))。可是，这些并不能改善疾病症状。 所有这些方法缺乏对细胞内源基因和蛋白质的靶向调节，这些基因和蛋白 质通过作为氧化应激的成因或结果而发挥关键功能并由此进行神经保护作 用。分别鉴定这些基因和蛋白质的最有希望的机会是在以下条件时，即细 胞正与氧化应激对抗，可是它们仍能存活，即它们暴露于长期的和特别是 暴露于亚致死量的氧化应激条件下。
从所描述的现有技术来看，本发明的问题是要分别提供基因和它们的 产物，其在细胞中伴随长期氧化应激而受到调控。另外，本发明的问题是 要分别通过这些基因和它们的产物鉴定用于治疗和/或预防变性(尤其是神 经变性)疾病的试剂。
该问题由专利权利要求书定义的主题所解决。 "氧化应激，，理解为活性氧类别和活性氮中间体在细il包或組织中的形 成。氧类别可以是过氧化物阴离子、羟基自由基和11202。活性氮中间体可 以是超氧亚硝基(peroxinitrite )和氧化氮。例如，这些类别例如在每个细 胞线粒体中的电子传递链反应中形成。如当在高代谢活性在脑中占上风时， 细胞损伤的风险增加。通常，氧类别被抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、过 氧化氢酶、或谷胱甘肽过氧化物酶)去除。如果不能完全实现这样的去除， 则形成羟基自由基、过氧化物阴离子和过氧化氢，其可造成严重的细胞损 伤和细胞死亡，并最终形成诸如神经变性疾病。
本文所用的术语"长期氧化应激(chronic oxidative stress )"或"长期亚 致死性氧化应激"，指相对于对照条件，细胞由一种或多种氧化应激剂作用而造成的至少一种活性氧或氮化合物的增加，其中该增加持续至少4小时
并多至35天或更长。
本文所用的术语"氧化应激剂"，指导致细胞氧化应激的分子。 本文所用的术语核酸的"衍生物"或"变体"指核酸序列，如本领域普通才支
术人员已知的，其相对于被比核酸，呈现出一个或多个缺失、取代、添力口、
插入、和/或倒位。
本文所用的术语蛋白质的"衍生物"或"变体"指氨基酸序列，如本领域 普通技术人员已知的，其相对于被比蛋白质，呈现出一个或多个缺失、取 代、添加、插入、和/或天然和非天然蛋白质修饰(如，糖基化或GPI锚定 分子)。
本文所用的术语"同源序列"或"同源物"指与被比序列或片段相比有显 著相似性的核酸或蛋白质序列，其中呈现这些同源序列的核酸和蛋白质与 被比序列相比展示出核酸和蛋白质活性的可相比较的活性或部分活性。核
紧或较严紧的条件，参见Sambrook等，Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6)下杂交，则其^皮认为是同 源序列。严紧杂交条件的例子是在4 x SSC中于65°C (可选的是在50%曱 酰胺和4xSSC中于42。C)杂交，然后在0.1xSSC中于65。C进行几个洗涤 步骤，总共一小时。较严紧的杂交条件是在4 x SSC中于37。C，杂交， 然后在lxSSC中于室温进行几个洗涤步骤。另夕卜，利用相似性算法BLAST (基本局部配对检索工具，Altschul等，Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990)，核酸或蛋白质序列或其片段呈现出与用作比较的序列的核 酸和氨基酸序列的显著相似性，应被认为是同源序列。如本文所用的，序 列被认为是显著相似的，则当与其相比较的序列或片段比较时，其例如利 用NCBI的Blast服务，展示出P<10-5的显著性水平(概率)。
本文所用的术语"调节剂，，指试剂，其具有改变(尤其能增加或减少) 基因的表达率和/或蛋白质的生物活性的能力。对此，表达率或生物活性的 改变可由本领域普通技术人员已知的方法在核酸水平(如产生的mRNA)和 蛋白质水平(如免疫印迹、2D凝胶电泳或FRET)上直4妄来确定。
本文所用的术语"神经变性疾病(neurodegenerative disease)"，指变 性和神经疾病，如中风和多发性硬化，以及特征在于神经元死亡的神经变性疾病，如痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、ALS或亨廷顿病。术语神经
变性疾病还涉及神经变性进程在其中起作用的那些疾病，如药物影响造成 的细胞变性(如延迟性运动障碍)、或精神病(如精神分裂症或抑郁症)。
本文所用的术语"治疗性靶分子"或"药靶，，指基因或蛋白质，其通过结合 分子或物质有目标地影响它们的表达率或生物活性而用于治疗、诊断、治
愈、延迟和/或预防疾病。
本发明分别涉及基因和蛋白质，其在长期亚致死氧化应激条件下受调 控并属于细胞保护性的细胞兵工厂。本发明的目的在于分别使用这些基因 和蛋白质、以及其衍生的衍生物、变体、同源物、和片段、以及靶向后者 的抗体，用于治疗、预防和诊断变性疾病(尤其是神经变性疾病)的方法 中，以及用于鉴定调节这些基因和/或蛋白质生物活性的预防剂和/或治疗剂 的方法中。另外，本发明提供了诊断试剂盒和基因和蛋白质，其在细胞中 伴随长期氧化应激而受调控。试剂盒、基因、和蛋白质被用于早期通过合 适的方法防止变性疾病(尤其是神经变性疾病)，治疗或it断这些疾病，并 通过这种诊断降低该疾病的风险。
在第一个方面，本发明提供了代表基因的核酸，其在真核细胞中伴随 长期氧化应激而受到调控。接着，本发明提供了这些基因编码的蛋白质。 另外，本发明还提供了这种蛋白质，其伴随长期氧化应激而受到调控，而 不在核酸水平上进行调控作用。尤其是，本发明涉及核酸的同源物、衍生 物、变体、和片段以及核酸编码的蛋白质。
在真核(优选人)细胞中伴随长期氧化应激而受到调控的基因优选编
码MAC30(与脑膜瘤相关的蛋白质)、BRI3(同义词13、 pRGR2)、 G1P3、 LOC222171、 1型含CUE结构域(CUE domain containing 1 ) (CUEDC1)、 Niemann-Pick病C2型(NPC2)、硬脂酰-CoA去饱和酶(SCD; A-9-去饱和酶) 和异戊歸基-二磷酸5异构酶1 (isopentenyl-diphosphate delta isomerase 1 ) 蛋白质(IDI1;=异戊烯基二磷酸二曱基烯丙基二磷酸异构酶1 (isopentenyl diphosphate dimethylallyl diphosphate isomerase 1 ))。另夕卜，本发明涉及相应 基因的转录变体。
MAC30的核酸序列优选涉及cDNA序歹'j , 其对应于NCBI Genbank/EMBL登录号NM—014573， BC045655, BC091504, CR613993, CR590967, CR612870, L19183, BC017362 (参见实施例1)。BRB的核酸序列优选涉及cDNA序列，其对应于NCBI Genbank/EMBL 登录号BC018737, BC071992, AF041430, AB055977 ， NM—015379， BC062370, AF106966(参见实施例2)。
G1P3的核酸序列优选涉及cDNA序列，其对应于NCBI Genbank/EMBL 登录号NM—022872， NM—022873， NM—002038， X02492, AK024814, BN000257, BC011601, BC015603和BT006850 (参见实施例3)。
LOC222171的核酸序列优选涉及cDNA序列，其对应于NCBI Genbank/EMBL登录号BC029131, NM—175887， CR619478, CR608739, CR610203, BC018144, CR604389 (参见实施例4)。
CUEDC1的核酸序列优选涉及cDNA序列，其对应于NCBI Genbank/EMBL登录号NM—017949, AK000746, BC056882, AK000977 (参 见实施例5)。
Niemann-Pick病C2型(NPC2)的核酸序列优选涉及cDNA序列，其对应 于NCBI Genbank/EMBL登录号NM—006432, BC002532, CR609490, CR608935, CR605546, CR622486, AK222474, CR624497， CR601885, X67698, CR595914(参见实施例6)。
硬脂酰-CoA去饱和酶(SCD; A-9-去饱和酶)的核酸序列优选涉及 cDNA序列，其对应于NCBI Genbank/EMBL登录号S70284, Y13647, NM—005063， BC005807, AK222862, AB208982, BC062303, AF097514, AB032261 (参见实施例7)。
IDI1 (异戊烯基二磷酸二曱基烯丙基二磷酸异构酶1)的核酸序列优选 涉及cDNA序列，其对应于NCBI Genbank/EMBL登录号NM—004508， BC057827, BC019227, BC022418, BC025375, BC006999, BC005247, AF271720 (参见实施例8)。
在真核(优选人)细胞中伴随长期氧化应激而受到调控的蛋白质涉及 前述基因和它们转录变体的表达产物。
蛋白质MAC30的氨基酸序列优选涉及登录号NP—055388, AAH91504, AAH45655, AAA16188。
蛋白质脑蛋白i3 (Brain protein i3 ) (BRB)的氨基酸序列优选涉及登录 号AAH18737, AAH71992, AAD05167, BAB32785, NP—056194, AAH62370, AAF18565, 095415。蛋白质脑蛋白i3不应与登录号Q9NQX7的蛋白质混淆，其具有相同的BRB命名而与本发明的蛋白质无任何相似性。
蛋白质干扰素诱导的6-16蛋白(Interferon induced 6-16 protein)的氨 基酸序列优选涉及登录号NP—075010， NP—075011， NP—002029， AAH15603, CAE12275, AAH11601, AAP35496, CAA26322。
蛋白质LOC222171的氨基酸序列优选涉及登录号AAH29131, NP一787083， EAL24204。
1型含CUE结构域蛋白的氨基酸序列优选涉及登录号NP-060419, BAA91357, AAH56882, BAA91452, Q9NWM3。
NPC2蛋白的氨基酸序列优选涉及登录号NP_006423, AAH02532, BAD96194, CAA47928, P61916。
人SCD蛋白质的氨基酸序列优选涉及登录号BAA93510, BAD92219, AAH62303, AAD29870, NP—005054， AAH05807, 000767, BAD96582, AAB30631, CAA73998。
人异戊烯基-二磷酸S异构酶1蛋白(IDI1;=异戊烯基二磷酸二曱基 烯丙基二磷酸异构酶l)的氨基酸序列优选涉及登录号Q13907, NP—004499， AAH19227, AAK49435, AAK49434, AAK29357, AAH06999。
本发明优选涉及呈现SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及呈现SEQ IDNO: 64至113序列的蛋白质、和它们的同源物、衍生物、变体和片段。 当涉及与本发明所述的核酸的同源物时，则同源物展示出与具有SEQ ID NO: l-63序列的核酸至少80%的同源性，优选约85%、 90%、 95%、或99% 的同源性。当涉及与本发明所述的蛋白质的同源物时，则同源物展示出与 具有SEQ ID NO: 64-113序列的蛋白质至少70%的同一性，至少75%、 85%、 90%、 95°/。或99%的同一性。接着，本发明所述的蛋白质可显示有修饰。示 例性的修饰是化学修饰的氨基酸，如不天然存在的(非天然)氨基酸，氨基 酸序列中的缺失、突变和添加，蛋白质与异源多肽的融合(融合蛋白)以及通 过天然存在的和不存在的结构(如糖基化、GPI锚定分子和/或脂化)进行 的氨基酸的化学和生物修饰。
本发明所述的核酸分子可以是天然或非天然存在的基因组DNA、 RNA、 cDNA、微小RNA、 siRNA、以及其同源物、衍生物、片段和变体(尤 其是可变剪切变体)、或修饰的(尤其是转录或化学修饰的)核酸或肽核酸 (PNA)等。在另一方面，本发明涉及寡核苷酸，其作为探针或引物选择性地与本 发明所述的核酸杂交，并可用于检测和/或扩增生物样品材料中的这些核酸
分子。寡核苷酸可以是DNA、 RNA、或PNA。对于DNA或RNA，寡核普 酸由以下核苷酸中连续的至少6、优选6-50、 10-45、 12-40、 15-35、 15-30、 20-45、 25-40个组成，或可显示出与本发明所述的核酸互补的反义核苷酸序 列。寡核苷酸可以是修饰的，如与酶偶联，与发色团、荧光、或发光底物 反应，或与以下分子连接染料、荧光、发光、或放射性分子、和/或质谱 活性化合物(同位素标记)。此外，寡核苷酸的修饰可以是单个核苷酸间的键 的一个或多个修饰，例如硫代磷酸酯或曱基膦酸。本发明所述的寡核香酸 可用于核酸生物芯片中，尤其是本发明所述的方法中的电子生物芯片中。
在另一方面，本发明分别涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的 核酸的用途、和这些核酸编码的蛋白质的用途，用于医学研究，例如研究 神经变性疾病。本发明尤其分别涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控 的核酸的用途、和这些核酸编码的蛋白质的用途，用作靶分子(药靶)来鉴 定调节基因和/或蛋白质生物活性的试剂，所述基因和/或蛋白质在细胞中伴 随长期氧化应激而受调控。因此，本发明尤其涉及呈现SEQ ID NO: l至 63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、变体、和片段、和呈现SEQIDNO: 64至113序列的蛋白质、以及其同源物、衍生物、变体、和片段的用途。 如本文定义的，所用的核酸和蛋白质也可显示有修饰。
本发明所述的用途能鉴定治疗剂和/或预防剂，其用来分别对抗与氧化 应激相关的疾病和/或(慢性)疾病有关的状况，尤其是癌症、心血管病、 动脉硬化症、糖尿病、免疫系统的炎症性疾病、类风湿性关节炎、炎性肠 病、早老性进程、变性和神经性疾病，如中风和多发性硬化以及特征在于 神经元死亡的神经变性疾病，如痴呆、阿尔茨海默病、帕金森病、ALS或 亨廷顿病，以及预防这些疾病和/或('f曼性)疾病相关状况。
在另一方面，本发明涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸 或蛋白质的用途，用于鉴定、监测、疾病分类(疾病阶段分类)、治疗、诊断、 和/或预后评估由细胞的氧化应激而造成的疾病或疾病相关状况。本发明尤 其涉及呈现SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、变 体、和片段的用途、以及呈现SEQIDNO: 64至113序列的蛋白质、以及 其同源物、衍生物、变体、和片段的用途。在一个具体实施方式
中，本发明涉及用于检测和/或分析在细胞中伴随 长期氧化应激而受调控的核酸的诊断方法。
因此，该方法包括以下步骤
a) 从样品中分离核酸，
b) 制备cDNA或任选之前合成cRNA用于线性扩增，
c) 加入靶向伴随长期氧化应激而受调控的基因的寡核苷酸，之后扩增 步骤b)的cDNA，
d) 分析步骤c)的扩增产物。
如果为了进行分析需要增强信号，则步骤c)的扩增产物可与化学修饰 的寡核苷酸或互补的核酸序列在生物芯片上杂交。
在另一具体实施方式
中，本发明涉及检测和/或分析核酸的诊断方法， 所述核酸在细胞中伴随长期氧化应激而受调控，该方法包括以下步骤
a) 从样品中分离核酸，其中RNA任选是直接^皮标记的，
b) 加入靶向基因的寡核苷酸，所述基因伴随长期氧化应激而受调控， 之后与步骤a)分离的核酸杂交，
c) 分析杂交信号。
分离的样品可以是生物样品，例如，组织才丰品，诸如脑组织样品、或 体液，如血液、唾液、血清、或脑脊液(CSF)。样品也可以是以前乂人生物材 料中得到的DNA或RNA。
要检测的核酸可以是在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的DNA或 RNA，其中优选DNA。因此，本文中特别优选的要检测的核酸可以是一个 或多个呈现SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、变 体、和片段。如果核酸是RNA，则在核酸扩增前进行RNA向cDNA的反 转录。如果核酸是RNA，则优选通过RT-PCR方式进行反转录和核酸扩增。
确定一个或多个在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达率 水平，优选通过本发明所述的方法来进行。另外，优选从样品中分离出总 RNA或mRNA,并将RNA反转录成cDNA。为了线性扩增，第一cDNA合 成后，用DNA依赖性RNA聚合酶进行体外转录，借助该聚合酶用相应的 cDNA继续进行cDNA合成。为了直接标记，例如，将碱性磷酸酶与RNA 偶联，之后检测酶活性。为该目的，优选用本发明所述的方法扩增cDNA, 其如现有技术所已知的，进行定量PCR。另外，在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达率可通过与其杂交的寡核苷酸来检测。因此，其
表达要被定量的核酸优选是一个或多个呈现SEQ ID NO: 1至63序列的核 酸、以及其同源物、衍生物、变体、和片段。
确定核酸的表达率例如能诊断氧化应激是否在细胞中发生(样品由所 述细胞中或用所述细胞获得)，从而对鉴定、监测、疾病分类、诊断和/或预 后评估疾病和疾病相关状况作出说明，所述疾病由细胞氧化应激造成。本 发明所述的方法能诊断与氧化应激相关的疾病和/或(慢性)疾病相关状况， 尤其是癌症、心血管病、动脉^更化症、糖尿病、免疫系统的炎症性疾病、 类风湿性关节炎、炎性肠病、早老性进程、变性和神经性疾病，如中风和
默病、帕金森病、ALS或亨廷顿病。接着通过本发明所述的方法，进行鉴 定、评估、和/或监测药物副作用，该副作用因相应药物造成的氧化应激而产生。
本发明的另一方面是用于进行本发明所述的分析和检测方法的试剂
对。因此，相应引物对的引物包括与细胞中长期氧化应激相关受调控的核 酸杂交的各个DNA序列。引物优选包括各个DNA序列，其与一个或多个 呈现SEQIDNO: l至63序列的核酸、以及其同源物、衍生物、变体、和 片段杂交。另外，与要进行的核酸扩增方法相对应的试剂盒可包括合适的 试剂，如緩沖剂、核苷酸、和酶(如DNA聚合酶)、以及至少一种合适的 参照核酸。
在另一方面，本发明涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白 质的用途，用于鉴定、监测、疾病分类、治疗、诊断、和/或预后评估由细 胞的氧化应激而造成的疾病或疾病相关。因此，本发明尤其涉及呈现SEQ ID NO: 64至113序列的蛋白质、以及其同源物、衍生物、变体、和片段的用途。
在一个具体实施方式
中，本发明涉及定量在细胞中伴随长期氧化应激 而受调控的蛋白质的分析和/或诊断方法。因此，该方法包括以下步骤
a) 在分离的样品(优选来自生物材料，如脑、CSF、血液、唾液)中定 量至少一种在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质。
b) 比较参照样品中至少一种在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质的确定量，其中参照样品源自未患变性疾病的受试者，
其中步骤a)中测试的样品中至少一种蛋白质的量相对于参照样品的 相应蛋白质的量的增加，表示患有变性疾病或有患变性疾病的风险。
优选进行至少一种蛋白质的定量，其选自呈现SEQ ID NO: 64至113 序列的蛋白质、以及其同源物、衍生物、变体、和片段的组。
优选通过免疫学方法进行定量，例如通过ELISA测试、免疫印迹、RIA、 免疫组化、或免疫细胞化学。本发明所述的蛋白质定量优选通过免疫学方 法利用单克隆或多克隆抗体或其它分子来进行，所述分子特异结合在细胞 中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质，并特异结合选自呈现SEQIDNO: 64至113序列的蛋白质、以及其同源物、衍生物、变体、和片段的组的蛋 白质。由此，分子可与下述治疗或预防结合物相同，并分别可以是生物分 子或化学制品，尤其是下述用作表达和生物活性调节剂的化学小分子。定 量也可优选通过非免疫学方法用NMR或PET 4罙针进行。同样优选通过质 谱法的定量。如本文所定义的，要确定的蛋白质可展示出修饰。
在一个优选的具体实施方式
中，样品与抗体或结合物接触，并且通过 上述方法分别确定抗体和蛋白质形成的复合物、和结合物和蛋白质形成的 复合物的量。抗体或结合物可以是化学修饰的。例如，抗体或结合物可以 与和(发色团)底物反应的酶偶联，其中所述反应、以及由所述反应所形 成的抗体和蛋白质复合物、和结合物和蛋白质复合物通过产生的荧光、发 光、或磷光而可视化，并可检测。此外，抗体或结合物可以分别直接连上 染料、荧光、发光、或放射性分子，并可以含有质谱活性同位素，从而可 直接可视化抗体和蛋白质形成的复合物、和蛋白质和结合物质形成的复合 物的检测，而不需要插入酶反应步骤。
在另一个优选的具体实施方式
中，蛋白质芯片用于在患者材料(如血 液、血清、CSF、脑、唾液)中^r测抗在细^^中伴随长期氧化应激而受调控 的蛋白质的抗体。
在另 一个优选的具体实施方式
中，蛋白质芯片分别含抗体或结合物， 用于在患者材料(如血液、血清、CSF、脑、唾液)中^f企测本发明所述的在 细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质。
定量在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质，能鉴定、监测、疾 病分类、-^断和/或预后评估由细胞氧化应激造成的疾病和/或疾病相关状况。本发明所述的方法能诊断与氧化应激相关的疾病和/或('f曼性)疾病相 关状况，尤其是癌症、心血管病、动脉石更化症、糖尿病、免疫系统的炎症 性疾病、类风湿性关节炎、炎性肠病、早老性进程、变性和神经性疾病， 如中风和多发性硬化以及特征在于神经元死亡的神经变性疾病，如痴呆、
阿尔茨海默病、帕金森病、ALS或亨廷顿病。此外通过本发明所述的方法 鉴定、评估、和/或监测药物副作用，该副作用因相应药物造成的氧化应激 而产生。
本发明的另一方面是进行本发明所述的方法的试剂盒，用于定量至少 一种在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质。因此，试剂盒包括至 少一种单克隆或多克隆抗体或其它结合物，所述结合物特异于在细胞中伴 随长期氧化应激而受调控的蛋白质，并优选特异于选自呈现SEQ ID NO: 64至113序列的蛋白质、以及其同源物、衍生物、变体、和片段的组的蛋 白质。另外，与要进行的蛋白质定量方法相对应的本发明所述的试剂盒可 包括合适的试剂(如緩沖剂)以及合适的参照蛋白质。本发明所述的试剂 盒可进一步包含NMR标签、PET探针、用于质i瞽的同位素标记和/或适体。
在另一方面，本发明涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸 的用途，用于分别鉴定调节在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的 表达、或调节这些核酸编码的蛋白质生物活性的治疗剂和/或预防剂。因此， 本发明尤其涉及呈现SEQ ID NO: 1至63序列的核酸和呈现SEQ ID NO: 64至113序列的蛋白质以及它们的同源物、衍生物、变体、和片段的用途。
在一个具体实施方式
中，本发明涉及鉴定调节在细胞中伴随长期氧化
应激而受调控的核酸的表达的治疗剂和/或预防剂的方法，其中该方法包括 以下步骤
a) 提供表达在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的细胞
b) 将所述细^^与候选物质"^妻触，并
c) 将在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达与未加入候选 物质时在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达相比较，
其中在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达改变，表示候
选物质是在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的调节剂。
在另一具体实施方式
中，本发明涉及鉴定调节在细胞中伴随长期氧化
应激而受调控的蛋白质的生物活性的治疗剂和/或预防剂的方法，其中该方法包括以下步骤
a) 分别提供细胞，其含有在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋
白质，并在载体材料上固定至少一种在细胞中伴随长期氧化应激而受调控 的蛋白质，
b) 将在载体材料上的细胞和蛋白质分别与候选物质接触，并
c) 通过生物物理方法，如等离子表面共振、FRET、定量HPLC、生物
测定、和质谱，检测与蛋白质结合的候选物质的量，所述蛋白质在细胞中 伴随长期氧化应激而受调控，
其中结合表示它是潜在的调节剂。
如本发明所述的，检测核酸表达和该核酸表达的蛋白质的量分别可通 过RNA分析(尤其是通过Northern印迹、带有可能的信号增强的 RNA/cDNA杂交或RT-PCR)、或通过蛋白质分析法(尤其是通过免疫印迹 分析或ELISA )来进行。
本发明所述的方法优选利用基因文库、表达文库、天然化合物文库、 化学小分子文库、重组的化学产生的前导结构等来鉴定治疗剂和/或预防剂。
本发明所用的所述候选物质可以是生物分子或化学制品，尤其是以下 定义的化学小分子。
分别用作表达和生物活性调节剂的生物分子的例子是核酸，如多核 苷酸和寡核苷酸、嘌呤、嘧啶、多肽、抗体、寡糖、多糖、脂、脂肪酸、 类固醇或其结构类似物、片段或衍生物、和/或其组合。
表达调节剂的例子是微小RNA、 siRNA或本领域普通技术人员已知 的其它RNA干扰(RNAi)分子；寡核苷酸、多核苷酸、反义核酸、PNA、 适体、或核酶，其分别作为转录活化剂或抑制剂、和转译活化剂或抑制剂 对诸如核酸转录和/或转译具有特异效应，所述核酸在细胞中伴随长期氧化 应激而受调控。表达调节剂可展现出修饰。
生物活性调节剂的例子是任意长度的多聚化形式的氨基酸(如多肽、 蛋白质)，其包括天然存在的和非天然氨基酸，并以单个氨基酸链或作为多 聚体分子存在；多肽包括氨基酸类似物、修饰或衍生化的氨基酸；带有环 或双环肽骨架的多肽；融合蛋白、酯肽、PNA、或肽模拟物。生物活性调 节剂可展现出修饰。
生物活性调节剂可额外对所述蛋白质的结合能力具有效应。优选的生物活性调节剂是抗体，例如多克隆或单克隆抗体，其激动性、 拮抗性、或中和性地对蛋白质生物活性起作用，所述蛋白质与细胞氧化应 激相关受调控并结合抗体。抗体优选是人源或人源化的。根据本发明抗体 优选用作调节剂的抗体包含以下结构域中的至少 一种免疫球蛋白的可变 区、免疫球蛋白的恒定区、免疫球蛋白的重链、免疫球蛋白的轻链和免疫 球蛋白的抗原结合区。
此外，生物活性调节剂还包括抗体生物活性片段，其与抗原或蛋白质 表位特异结合，所述蛋白质与细胞氧化应激相关受调控。活性片段可以是
Fab片段、Fc片段、重链或轻链的可变区片段。
此外，生物活性调节剂也包括抗体或其活性片段，所述片段特异结合 蛋白质配体，所述蛋白质与细胞氧化应激相关受调控，由此调节配体活性。
细胞氧化应激相关受调控。该结合可以是共价的。合适的试剂如放射性 同位素、非特异性抗氧化剂、神经元生长因子以及凝集抑制剂。
分别作为核酸表达调节剂(所述核酸在细胞中与氧化应激相关受调控) 和作为这些核酸编码的蛋白质的生物活性调节剂的化学制品的例子是任 何化学种类的化学制品，合成、半合成或天然存在的、无机或有机分子， 小分子或大分子复合物或金属元素(如锂)，或气体。上述化学小分子的例 子是分子量至少约30道尔顿并小于约5000道尔顿的小有机化合物。
用作核酸或蛋白质相互作用(尤其通过氢键)调节剂的化学制品和小 分子可显示有以下功能团的至少一种羟基、氨基、亚氨基、羧基、或羰 基。另外，用作调节剂的化学制品和小分子可以是或展示为单环或多环碳 结构或杂环结构、和/或芳香或多聚芳香结构，其用上述功能团的至少一种 取代。
在优选的具体实施方式
中，调节在细胞中伴随长期氧化应激而受调控 的蛋白质的生物活性的试剂是结合在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的 蛋白质的试剂(所谓"结合物")。为了鉴定这些结合物，优选使用包括在细 胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质(尤其是包括如SEQ ID NO: 64 至113序列的蛋白质以及其衍生物、变体、同源物、和片段)的蛋白质芯 片。
本发明的另 一 方面是进行本发明所述的方法的试剂盒，用于分别鉴定治疗剂和/或预防剂，所述治疗剂和/或预防剂调节在细胞中伴随长期氧化应 激而受调控的核酸的表达或这些核酸编码的蛋白质的生物活性，其中试剂 盒包括至少一种细胞，所述细胞表达在细胞中伴随长期氧化应激而受调控
的核酸。细胞优选包括一种或多种呈现SEQ ID NO: 1至63序列的核酸、 以及其同源物、衍生物、变体、和片段。
本发明所述的方法所用的在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸 和编码与氧化应激相关受调控的蛋白质并优选呈现SEQ ID NO: 1至63序
列的核酸、以及其同源物、衍生物、变体、和片段，可与允许有效表达(即 宿主细胞和/或宿主生物体中转录和/或转译)的调控元件功能性地相连。例 如，调控元件是本领域普通技术人员已知的组成型的、诱导型的、细胞或 组织特异性启动子。其它的调控元件是终止子序列和多聚腺苷酸化信号序 歹ll。功能性地与调控元件相连的核酸出现在载体中，例如在质粒、粘粒、 噬菌粒、类病毒、病毒中，优选是腺病毒和杆状病毒。此外，功能性地与 调控元件相连的核酸可与标记基因一起出现在宿主细胞和/或宿主生物体 中，其中标记基因可与功能性地与调控元件相连的核酸一起出现在载体或 与这一载体不同的第二载体中。在第二种情况下，含标记基因的载体与含
与调节元件功能性相连的核酸的载体可一起被导入宿主细胞或宿主生物体 中。
此外，本发明分别涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸和 编码与氧化应激相关受调控的蛋白质、优选呈现SEQ ID NO: 1至63的序 列的核酸、以及其同源物、衍生物、变体和片段的用途，用于产生转基因 细胞和非人生物体，优选是转基因非人哺乳动物。
本发明的另 一方面是细胞，其分别包含至少一种在细胞中伴随长期氧 化应激而受调控的重组核酸和至少一种编码与氧化应激相关受调控的蛋白 质和优选呈现SEQIDNO: l至63序列、其同源物、衍生物、变体和片,殳 的重组核酸，其中重组核酸功能性地与调控元件相连。
本发明的另一方面是非人生物体，优选是哺乳动物，其分别包含至少 一种在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的重组核酸和至少一种编码与氧 化应激相关受调控的蛋白质和优选呈现SEQIDNO: l至63序列、其同源 '物、衍生物、变体和片段的重组核酸，其中重组核酸功能性地与调控元件 相连。另一方面是在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸和蛋白质在医
学科学中的治疗用途。因此，优选使用呈现SEQ ID NO: 1至113序列的核 酸和蛋白质、以及它们的同源物、衍生物、变体、和片段。
实施例
实施例1:
在无血清条件下以长期亚致死浓度的氧化应激剂氟哌丁笨 (haloperidol )(Sigma;目录号H-1512)处理细胞之后，利用焚光标记的cDNA 在微阵列分析中检测MAC30-mRNA在NT2-N神经元细胞(Andrews P. W., Dev. Biol.， 103, pp 285 — 293， 1984; Pleasure S丄 Page C.， Lee V.M,Y.， J. Neurosci., 12, pp 1802 - 1815， 1992)中的增加。才艮据厂商 说明，通过活/死-存活/细胞毒性测试(Molecular Probes)获得针对细胞最佳存 活率的合适条件。分别通过二维凝胶电泳和DNA微阵列进行表达语试验， 取样时间点超过3天后，超过75%的神经元在氧化应激剂浓度介于1， 0 - 25 jiM的情况下存活。获取ROS和RNS的浓度以及细胞的氧化还原状态以进 一步表征对细胞的效应。用2', 7'-二氯二氢荧光素-二乙酸盐(Sigma，目录 号D6883)确定细胞中ROS总量。10 cm板中的细胞刮入PBS中，等分试样 中加入5 juMDCFDA,于37。C孵育1 h。之后，超声匀浆细胞，离心(20分 钟，4。C, 20.000xg)，并测量上清液的荧光。标准品是DCF。所有数据用蛋 白质浓度来标准化。ROS的相对增加相对于对照来计算。另外，通过二氢 乙啡啶(DHE; Sigma目录号D7008)来确定ROS。将5 iuMDHE加入到等 分的洗下的细胞中，于37。C孵育1小时，过程类似于DCFDA的过程，并 确定上清液的荧光。用蛋白质调整的线粒体ROS变化相对于未处理的对照 加以计算。
各种试验中所用的氟哌丁苯浓度介于1, 0-25pM。可是，应激物的浓 度也可更高或低于所述的范围。
通过实时RT-PCR分析(qRTRTPCR)，用SYBR-Green 1焚光标记可定 量MAC30-mRNA的增加。在处理细胞8天后，增加50%或更多，而且用 更长期的处理可获得多至200 %或更多的增加量。为了通过qRTRTPCR分 析MAC30 mRNA，使用PCR引物对MAC30-Forl (5'-AAGCCATCTTCCTTAGCCTCCCAAGTA-3') (SEQ ID NO: 114)和NO: 115)。用该引物对扩增cDNA片段，所述片段呈现长度为69个氨基 酸的多肽的编码序列(登录号NP_055388和AAH45655)。同样，用该引物 对扩增cDNA片段，所述片段呈现长度为176个氨基酸的多肽的编码序列 (登录号AAH91504)。此外，通过该引物对扩增cDNA片段，所述片段呈 现长度为189个氨基酸的多肽的编码序列(登录号AAA16188)。这些片段是 同一蛋白质长度不同的部分，该蛋白质除了一个氨基酸替换之外是相同的。 不同长度源于第 一个ATG起始密码子的不同位置，该起始密码子在 NP一055388和AAH45655中由于序列变化而处在下游。对于AAA16188， 开放阅读框(ORF)始于序列中的第一个密码子，其不是ATG。相反， AAH91504使用该序列的第一个ATG。此外，用该引物对可检测其它的 mRNA,其编码不同长度的其它MAC30蛋白质，并显示有至少50 °/。相似 性。
实施例2:
用氟哌丁苯处理后，利用荧光标记的cDNA在微阵列分析中检测 NT2-N神经元细胞中BRB-mRNA的增加(如实施例1所述)。通过实时 RT-PCR分析(qRTRTPCR)，用SYBR Green 1荧光标记可定量该增加。处 理3天后已经检测到增加量。在处理细胞8天后，已经增加40 °/。或更多， 而且用更长期的处理可获得多至200 %或更多的增加量。PCR引物对 BRB-Forl (5'-CTTTGGGTTCATTTGCTGTTTTG-3') (SEQ ID NO: 116)和 BRB-Rev2 (5'-CATTAGAAAAAGAGAGCTGGGTGTA國3') (SEQ ID NO: 117) 适于通过qRTRTPCR分析BRD mRNA。用该引物对扩增cDNA-BRI3片段， 其呈现长度为125个氨基酸的多肽的编码区。
实施例3:
用氟哌丁苯处理后，利用荧光标记的cDNA在微阵列分析中检测 NT2-N神经元细胞中GlP3-mRNA的增加(如实施例1所述)。通过实时 RT-PCR分析(qRTRTPCR)，用SYBR GREEN 1荧光标记可定量该增加。3 天后，已可^r测到明显的增加量，该增加量在8天处理后为50%或更多， 而且用更长期的处理可获得多至400 %或更多的增加量。PCR引物对GlP3-For 1 (5'画GCTATTCACAGATGCGAACATAGTA-3') (SEQ ID NO: 118) 和GlP3-Rev2 (5'-GGAGAGTGATAGACAAAGTTCTGGA-3') (SEQ ID NO: H9)适于通过qRTRTPCR分析GlP3mRNA。用该引物对扩增cDNA片段， 其呈现长度为134个氨基酸的多肽的编码区。同样，用该引物对扩增cDNA 片段，其呈现出长度为138个氨基酸的多肽的编码区。此外，还用该引物 对扩增cDNA片段，其呈现出长度为130个氨基酸的多肽的编码区。差异 可由编码区中转录物长度的微小差异来解释。
实施例4:
用氟哌丁苯处理后，利用荧光标记的cDNA在微阵列分析中检测 NT1N神经元细胞中LOC2Bni-mRNA的增加(如实施例1所述)。通过 SYBR Green 1用荧光标记进行实时RT-PCR (qRTRTPCR)分析，定量该增加。 氟哌丁苯处理15天后，可4企测到明显的增加量，其为50%或更多，而且用 更长期的处理可进一步增加。PCR引物对LOC222171-Forl (5'-TGGCTGTTATTTAGGACTCTGTGGAAA-3') (SEQ ID NO: 120)和 LOC222171-Rev2 (5'-TCCCCCACTCCTTCACTTAAGGTATAA-3') (SEQ ID NO: 121)适于通过qRTRTPCR分析LOC222171 mRNA。用该引物对扩增 cDNA片段，其呈现长度为129个氨基酸的多肽的编码区。
实施例5:
用氟哌丁苯处理细胞后，利用焚光标记的cDNA在微阵列分析中检测 NT2-N神经元细胞中CUEDCl-mRNA的增加(如实施例1所述)。通过 SYBR GREEN 1用焚光标记进行实时RT-PCR分析(qRTRTPCR)，可进一 步定量该增加。长期氧化应激15天后，检测到增加量超过30%,该量用更 长期的处理可进 一 步增加。PCR 引物对 CUEDCl-Forl (5'-CTTATTCAGGGACAAGCTGAAACACAT-3') (SEQ ID NO: 122)和 CUEDC1-Rev2 (5'-AGTGTTTCCTCTTTGACTTCCTCATTTT-3') (SEQ ID NO: 123)适于通过qRTRTPCR分析CUEDC1 mRNA。用该引物对扩增 cDNA片段，其呈现长度为386个氨基酸的多肽的编码区。同样，用该引 物对扩增cDNA片段，呈现长度为358个氨基酸的多肽的编码区。检测到 2个多肽的可能性是源于AK000977在编码区中出现缺失，由此形成短了约28个氨基酸的多肽，除此之外，该多肽与其他的一级结构的区别仅在于在
成熟蛋白质的氨基酸47位上有一个保守氨基酸替换。 实施例6:
氟哌丁苯处理后，用荧光标记的cDNA在微阵列分析中检测NT2-N神 经元细胞中NPC2-mRNA的增加(如实施例1所述)。用SYBRGREEN 1通 过荧光标记进行实时RT-PCR分析(qRTRTPCR),可进一步定量该增加。 处理3天后，与未处理的神经元细胞相比，已经4企测到NPC2-mRNA显著 增加了。长期亚致死氧化应激15天后，增加50%或更多，而且用更长的处 理可进一步增加。PCR引物对NPC2-Forl
(5'-AATTAACTGCCCTATCCAAAAAGAC-3') (SEQ ID NO: 124)和 NPC2-Rev2 (5'-CAGAAGAGACTTTGGTTTTTGTCAT-3') (SEQ ID NO: 125) 适于通过qRTRTPCR分析NPC2-mRNA。用该引物对扩增cDNA片段，其 呈现长度为151个氨基酸的多肽的编码区。同样，用该引物对扩增cDNA片 段，其呈现出长度为151个氨基酸的多肽的编码区，其与前一多肽的区别 在于2个保守氨基酸替换。
实施例7:
用氟艰丁苯处理NT2-N神经元细胞后，利用荧光标记的cDNA在微阵 列分析中检测SCD-mRNA的增加(如实施例1所述)。用SYBR GREEN 1 通过荧光标记进行实时RT-PCR分析(qRTRTPCR),定量该增加。15天处 理后，相对于未处理的神经元细胞，检测到约50%或更多的SCD-mRNA的 增加。PCR引物对SCD画Forl (5'-AAAGATGATATATATGACCCCACCT-3') (SEQ ID NO: 126)和SCD画Rev2 (5'-CCAAGTGTAGCAGAGACATAAGGAT-3') (SEQ ID NO: 127)适于通过qRTRTPCR分析SCD-mRNA。用该引物对扩增 cDNA片段，其呈现长度为359个氨基酸的多肽的编码区。同样，用该引 物对扩增cDNA片段，其呈现长度为366个氨基酸的多肽的编码区。此外， 用该引物对扩增cDNA片段，其呈现长度为355个氨基酸的多肽的编码区。 另外，用该引物对扩增cDNA片段，其呈现长度为237个氨基酸的多肽的 编码区。实施例8:
用氟哌丁苯处理NT2-N神经元细胞后，用二维聚丙烯酰胺凝月交电泳、 以及之后用质谱鉴定蛋白质点，来^^测IDI1蛋白质(IDI1 -异戊烯基-二磷 酸5异构酶l;=异戊烯基二磷酸二曱基烯丙基二磷酸异构酶1)的增加(如 实施例1所述)。用氟哌丁苯处理15天内，IDIl-蛋白增加约30 %或更多。
权利要求
1. 核酸或由这些核酸所编码的蛋白质用于鉴定治疗剂和/或预防剂的用途，所述核酸和/或蛋白质在细胞中伴随长期氧化应激而受调控，所述治疗剂和/或预防剂是用于治疗和/或预防变性疾病、对变性疾病进行鉴定、监测、疾病分类、诊断、预后评估、或治疗的治疗剂和/或预防剂。
2. 根据权利要求l的用途，其中所述核酸呈现SEQIDNO: 1-63之一 的序列、所述蛋白质呈现SEQ ID NO: 64-113之一的序列，或呈现它们的 同源物、衍生物、变体、或片段。
3. 根据权利要求1或2之任一项的用途，其中所述变性疾病是神经变 性疾病。
4. 根据权利要求3的用途，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病， 卢伊体病诸如帕金森病，弥漫性卢伊体病，亨廷顿病，肌萎缩性侧索硬化 (ALS)，朊病毒病(PrD)，克雅病，唐氏综合症，额颞叶痴呆(FTD)，皮质基 底变性，多发性梗塞性痴呆，进行性核上麻痹，多系统萎缩，和科尔萨科 夫综合症。
5. 鉴定调节核酸和/或蛋白质表达的治疗剂和/或预防剂的方法，所述 核酸和/或蛋白质在细胞中伴随长期氧化应激而受调控，其中该方法包括以 下步骤a) 提供表达核酸的细胞，该核酸在细胞中伴随长期氧化应激而受调控，b) 使细胞与候选物质接触，并且c) 将在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达与未加入所述 候选物质时所述核酸的表达相比较，所述核酸是在细胞中伴随长期氧化应 激而受调控的，其中在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的核酸的表达改变，表示所 述候选物质是所述核酸的调节剂，所述核酸在细胞中伴随长期氧化应激而 受调控。
6. 鉴定调节蛋白质生物活性的治疗剂和/或预防剂的方法，所述蛋白质 在细胞中伴随长期氧化应激而受调控，其中该方法包括以下步骤a)提供含在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质的细胞，并分 别将至少一种在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质固定在载体材料上，b)分别将载体材料上的细胞和蛋白质与候选物质接触，并且 C)通过生物物理方法，检测与所述蛋白质结合的候选物质的量，所述 蛋白质在细胞中伴随长期氧化应激而受调控，所述生物物理方法例如等离子表面共振、FRET、定量HPLC、生物测定、和质谱， 其中结合表示所述候选物质是潜在的调节剂。
7. 进行权利要求5或6的方法来鉴定治疗剂和/或预防剂的试剂盒，该 治疗剂和/或预防剂调节核酸的表达或这些核酸编码的蛋白质的生物活性， 所述核酸是在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的，其中该试剂盒包括至 少一种表达核酸的细胞，所述核酸在细胞中伴随长期氧化应激而受调控。
8. 检测和/或分析核酸的方法，所述核酸在细胞中伴随长期氧化应激而 受调控，所述方法包括以下步骤a) 乂人样品中分离核酸，b) 制备cDNA或任选先前合成cRNA,用于线性扩增，c) 加入耙向在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的基因的寡核普酸， 并接着扩增步骤b)的cDNA，d) 分析步骤c)的扩增产物。
9. 根据权利要求8的方法，其中所述分析通过与生物芯片上化学修饰 的寡核香酸或互补核酸序列杂交而进行。
10. ^r测和/或分析核酸的方法，所述核酸在细胞中伴随长期氧化应激 而受调控，所述方法包括以下步骤a) 从样品中分离核酸，其中任选RNA是^1直接标记的，b) 加入耙向在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的基因的寡核苷酸， 并接着与步骤a)分离的核酸杂交，c) 分析杂交信号。
11. 用于定量蛋白质的分析和/或诊断方法，所述蛋白质在细胞中伴随 长期氧化应激而受调控，所述方法包括以下步骤a) 在分离的样品中定量至少一种蛋白质，所述蛋白质在细胞中伴随长 期氧化应激而受调控，b) 与参照样品中至少一种蛋白质所确定的量进行比较，该蛋白质在细 胞中伴随长期氧化应激而受调控，其中所述参照样品源自未患变性疾病的受试者，其中步骤a)所测试的样品中至少一种蛋白质的量与参照样品中相应蛋白质的量相比有所增加，表示患有变性疾病、或有罹患变性疾病的风险。
12. 根据前述权利要求之任一项的方法，其中所述样品是生物样品，如 组织样品或体液；其中所述组织样品诸如脑组织样品，所述体液例如血液、 唾液、血清、或脑脊液(CSF)。
13. 根据权利要求6和8至12之任一项的方法，其中所述核酸选自由 具有SEQIDNO: 1至63之一的序列的核酸、和它们的同源物、衍生物、 变体、和片段组成的组，和/或所述蛋白质选自由具有SEQIDNO: 64至113 之一的序列的蛋白质、和它们的同源物、衍生物、变体、和片段组成的組。
14. 进行权利要求8至10和13之任一项的方法的试剂盒，包括至少一 个引物对，所述至少一个引物对的引物与核酸杂交，所述核酸在细胞中伴 随长期氧化应激而受调控。
15. 进行权利要求11至13之任一项的方法的试剂盒，包括至少一种特 异于在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的蛋白质的单克隆或多克隆抗体 或其他结合物，并任选包括合适的参照蛋白质以及进一步包括NMR-标签、 PET-探针、用于质谘的同位素标签、和/或适体。
16. 细胞，包含至少一种呈现SEQ ID NO: 1至63之一或它们的同源 物、衍生物、变体、或片段的重组核酸，其中所述重组核酸与调控性控制 元件功能性相连。
17. 非人转基因生物体，包含至少一种呈现SEQ ID NO: 1至63之一 或它们的同源物、衍生物、变体、或片段的重组核酸，其中所述重组核酸 与调控性控制元件功能性相连。
全文摘要
本发明整体上涉及治疗、预防和诊断变性疾病(尤其是神经变性疾病)的领域。具体而言，本发明涉及基因和蛋白质，其在细胞中伴随长期氧化应激而受调控并用于治疗、预防、和诊断变性疾病，尤其是神经变性疾病。另外，本发明涉及在细胞中伴随长期氧化应激而受调控的基因和蛋白质的用途，用于筛选候选物质以鉴定预防和/或治疗剂，所述试剂调节基因和/或蛋白质的生物活性，所述基因和/或蛋白质在细胞中伴随长期氧化应激而受到活化。另外，本发明涉及诊断变性疾病(尤其是神经变性疾病)的方法、和鉴定预防剂和/或治疗剂的方法，所述试剂调节基因和/或蛋白质的生物活性，所述基因和/或蛋白质在细胞伴随长期氧化应激而受到活化。另外，本发明涉及进行所述诊断方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK101420971SQ200780013423
公开日2009年4月29日 申请日期2007年4月19日 优先权日2006年4月20日
发明者托马斯·罗尔迈耶, 罗斯玛丽·戴格 申请人:神经谱型有限责任公司