专利名称：：蛋白质纯化的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用包括两个离子交换步骤并且不使用过程中(in-process)切向流过滤步骤的两步非亲和方法的蛋白质纯化，以获得高水平的纯度，该纯度的蛋白质可以配制用于人类治疗。特别地，本发明涉及一种从包含多肽和一种或多种污染物的组合物中纯化多肽(例如重组蛋白、抗体、抗体片l殳、Fab和Fv相关产物、单《连抗体、双抗体(cliabodies)、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体(包括来自抗体片段的多特异性抗体)、与Fc样区的融合蛋白、抗体样分子，如免疫粘附素或肽体(peptibodies))的方法。
背景技术：
：大规模、经济的蛋白质纯化是生物医药产业上日益重要的问题。治疗性蛋白质一般利用原核或真核细胞系产生，该细胞系被工程化为由含编码目的蛋白质的基因的重组质粒表达目的蛋白质。由于几个原因，从提供给细胞的成分和细胞副产物的混合物中分离出所需蛋白质以达到足够的纯度，如足以用作人类治疗剂的纯度，对于生物制品的制造者来说是一个巨大的挑战。基于蛋白质的药物产品的生产者必需遵守严格的规章标准，包括极其严格的纯度要求。为确保安全性，管理机构，例如食品和药品管理局(FDA)，要求基于蛋白质的药物产品基本上不含杂质，包括与产品有关的污染物如重组蛋白的聚集体、片段和变体，以及与操作相关的污染物如宿主细胞蛋白质、培养基成分、病毒、DNA和内毒素。尽管有多种蛋白质纯化方案可以应用并被广泛用于生物制药产业，但是这些方案通常包括亲和纯化步骤，例如在抗体的例子中的蛋白A纯化，以达到药学上可接受的纯度。尽管出现了先进的层析和过滤方法，但是为获得治疗级别的纯度，亲和层析仍然经常用作捕获步骤来满足生物医药抗体纯化在纯度、产率、生产能力方面的要求。尽管蛋白A层析对于抗体具有高结合亲和性(对于人IgG来说，大约为M),以及具有除去多达99.5%的杂质的能力，但是对于在商业规模上应用于纯化治疗性蛋白质而言，亲和层析是一种昂贵的纯化步骤。蛋白A不仅比非亲和介质明显更贵，还存在其他问题，例如树脂的不稳定性、清洗的困难、配体的渗漏、污染纯化产品的蛋白A或蛋白A相关化合物的潜在免疫原性。然而，亲和介质的高成本和不稳定性提高了基于蛋白质的治疗剂的最终成本，特别是那些需要高剂量和/或长期给药的治疗剂。仅层析就可占下游加工成本的三分之二，对于单克隆抗体来说，亲和捕获柱的树脂的成本可超过原材料的成本(见Rathore等人，CostingIssuesintheProductionofBiopharmaceuticals,BioPharmInternational,Feb1,2004)。即使使用蛋白A亲和层析，也经常不能获得足够的纯度，除非结合几种纯化步骤，由此进一步增加了成本并降低了产品的产率。由于抗体占市场上和开发中的用于治疗癌症、自身免疫病、感染性疾病、心血管疾病和移植排斥的治疗性生物制剂的比例日益增大，因此需要一种可以利用较少的步骤来纯化蛋白质的方法，由此实现较低的成本。美国专利公开No.2003/0229212(其全文在此引入作为参考)描述了一种利用非亲和层析纯化步骤紧接着利用高效切向流过滤(HPTFF)步骤从包含宿主细胞蛋白质的混合物中纯化抗体的方法。通过CHOPs(中国仓鼠卵巢细胞蛋白)的减少确定，该纯化方法使污染物水平在阳离子交换纯化之后为大约144,780ppmCHOPs，在阴离子交换纯化之后为大约410ppmCHOPs，在HPTFF纯化(最后的步骤)之后大约为17-21ppmCHOPs,因而提供了一种三步非亲和方法。HPTFF的纯化步骤对于获得最终纯度是关键性的，其使用带电膜来分离杂质(相对大小不限)，例如蛋白质、DNA和内毒素，并从包含抗体的混合物中清除蛋白质寡聚体和降解产物。而且，HPTFF和其它传统TFF步骤存在缺点，即(1)它是蛋白质治疗剂的开发、优化和放大中的一个额外步骤，需要膜清洗、确认、商业上可以获得的大规模GMP套件(对于HPTFF而言这仍然是无法获得的)、以及额外的緩沖液、装置和更多的处理时间，和(2)它增加了成本，同时由于损害抗体完整性(通过降解或聚集或其他影响分子活性的分子变化)而具有潜在产物损失的危险。因此，希望可通过一种两步非亲和方法获得高纯度的蛋白质治疗剂，该方法不使用过程中TFF步骤，与基于亲和力的纯化方法和其他多步骤纯化方法相比成本降低。如果该非亲和纯化方法可以去除宿主细胞蛋白质、核酸、内毒素、与产物相关的污染物如蛋白质的聚集、氧化、脱酰胺化或降解形式、和培养基添加剂如脂质、维生素、胰岛素、氨曱喋呤、氨基酸、碳源例如葡萄糖等，它将是有益的。开发可应用于多种蛋白质类型的、可规模化、可控制、并且利用更便宜、可重复使用的树脂的纯化方案，将允许其整合进整个药物开发的非常早期的产品开发中。这种纯化方案的设计方法可使生产方法的耗资性改变减为最小，否则，该生产方法的改变在药物开发的后期是必需的，或更糟糕的是，在批准之后是必需的。当该方法放大并接近GMP生产条件时，会出现另外的内在复杂性，包括与树脂包装和緩冲液制备相关的问题。该生产方法和其能力可通过简化纯化方案来改善，这种简化是通过取消处理步骤并使生产量和生产率最大化，同时保持被纯化分子的完整性和纯度。因此，开发一种与常规纯化方法相比以低成本生产高质量、高安全性的药物物质的简单且有效的方法是所期望的并且是有益的。
发明内容本发明基于以下的意外发现多肽和蛋白质，特别是重组蛋白例如单克隆抗体，可通过利用不包括亲和层析步骤或过程中緩沖液交换步骤(如TFF或HPTFF)的两步纯化法，乂人包含污染物例如宿主细胞蛋白质和培养基成分的被污染混合物中纯化。而且，从第一步骤到第二步骤仅仅需要调节pH和/或稀释。因而，本发明的两步法大大降低了通常依赖亲和层析或多步方法来获得类似高水平蛋白质纯度的纯化蛋白质的成本。在本发明中，利用阳离子交换层析(CEC)和阴离子交换层析(AEC)将蛋白质高度纯化至治疗等级，而不使用亲和层析或过程中TFF步骤，以产生杂质(例如，含量低于百万分之100(ppm)的宿主细胞蛋白质，如CHOP,和10pg/ml或更少的核酸)含量可忽略的多于95%单体的高纯度蛋白质。本发明的纯化方法也清除内毒素、与产物相关的污染物，如蛋白质的聚集、氧化、脱酰胺化或降解形式，和培养基添加物，如脂质、维生素、胰岛素、氨曱喋呤、氨基酸、碳源如葡萄糖，等等。在使用CEC然后使用AEC的本发明纯化方法的具体实施方式中，不使用过程中TFF步骤是有利的，这导致更大的大规模纯化能力，结合更多污染物的能力以及操作时间明显缩短。本发明提供了纯化重组蛋白的方法，所述重组蛋白包括但不限于抗体、具有Fc样区的融合蛋白、抗体样分子，如免疫粘附素，用以获得适于应用于制备治疗等级组合物的高纯度蛋白质。因此，本发明的方法的一个优点是所述高纯度蛋白质适用于制备治疗等级的药物。因此，在一个方面，本发明提供一种纯化含有目标蛋白质和一种或多种污染物的混合物的方法，包括(a)将该混合物进行ECE纯化步骤，然后进行AEC纯化步骤，其中没有过程中TFF步骤，和(b)分离目标蛋白质。在一个特定实施方式中，AEC步骤使用阴离子交换膜。图1显示了如实施例1中进行的本发明的两步纯化方法的流程图。在该具体实施方案中，纯化方法包括CEC步骤以及随后的病毒灭活步骤和AEC步骤。在CEC和AEC步骤之间为稀释步骤，以降低CEC洗脱物(elutionbulk)的电导率，并在AEC步骤中获得所需的病毒和污染物清除。具体实施方式定义如此处所用的"蛋白质，，通常指具有至少5个或更多个通过肽键连接在一起的氨基酸的肽和蛋白质。蛋白质一般是复杂的多肽，可以是抗体、受体、配体融合蛋白(包括两个或多个在其自然状态下不融合的多肽的至少一部分)，其片段和变体，等等，如，见US2003022921和US20030166869，它们全部在此引入作为参考，其中列出了多种可用本发明的方法进行纯化的蛋白质。按照本发明的方法纯化的蛋白质可以来自任何生物(原核的或真核的)，特别是哺乳动物。术语"抗体"最广义地使用，包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)、免疫粘附素以及抗体片段。抗体或片段可以被修饰，例如脱岩藻糖基化的抗体。抗体可针对目的"抗原"，如多肽，该抗原可以是生物学相关的治疗靶标，或非多肽抗原(如，胂瘤相关糖脂抗原，见美国专利No.5,091,178)。优选地，抗原是生物学上重要的多肽，并且将该抗体施用于患有疾病或失调的哺乳动物可以导致对该哺乳动物的治疗益处。多肽抗原包括跨膜分子(如受体)和配体如生长因子。示例性的抗原包括上面讨论的多肽。用于于跨膜分子，例如受体，其片段(如受体的胞外域)可用作免疫原。可选择地，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。这样的细胞可获自天然来源(如癌细胞系)或可以是通过重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。"抗体片段"至少包括全长抗体的一部分，典型地为其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；单链抗体分子；双抗体；线性抗体；以及由抗体片段形成的多特异性抗术语"单克隆抗体，，在通常意义上使用，是指从一群基本同源的抗体获得的抗体，以致组成该抗体群的各个抗体除了可能以很小的数量出现的天然突变以外均相同。单克隆抗体是高度特异性的，针对一个抗原位点。与通常包括抗不同抗原决定簇(表位)的各种抗体的多克隆抗体制剂相比，单克隆抗体只针对该抗原上的一个决定簇。在描述抗体时术语"单克隆"指抗体获自基本同源的一群抗体的特性，并且不应理解为需要通过任何特定方法来产生该抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可使用由Kohler等人，Nature256:495(1975)首先描述的常规杂交瘤技术生产，或者可使用重组DNA方法(见，如美国专利No.4，816，567)。单克隆抗体也可从噬菌体抗体文库中分离，如使用Clackson等人，Nature352:624-628(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);和美国专利Nos.5,223,409;5,403,484;5,571,698;5,427,908;5,580,717;5,969,108;6,172,197;5,885,793;6，521，404;6,544,731;6,555,313;6，582，915;和6,593,081描述的技术。此处描述的单克隆抗体包括"嵌合"抗体和"人源化"抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时链的其余部分与来自其他种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及所述抗体的片段，只要它们显示所需的生物学活性(美国专利No.4，816,567;和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984》。非人(例如鼠)抗体的"人源化，，形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体的大部分是人免疫球蛋白(接受抗体)，其中接受抗体的超变区残基被具有所需特异性、亲和性和能力的来自非10人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长动物的超变区残基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且，人源化抗体可以包括在接受抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰可进一步提升抗体的性能。通常，人源化抗体包括基本上全部的至少一个、一般两个可变域，其中全部或基本上全部的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体任选地还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地包括人免疫球蛋白的该部分。更多的细节可见Jones等人，Nature321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。嵌合或人源化抗体可基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列而制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可获自感兴趣的鼠杂交瘤，并利用标准分子生物学技术构建为含有非鼠(如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可利用本领域公知的方法(见例如，Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)将鼠可变区与人恒定区连接。为了产生人源化抗体，可利用本领域公知的方法(见例如，Winter的美国专利No.5,225,539以及Queen等人的美国专利Nos.5,530,101;5,585,089;5，693,762和6,180,370)将鼠CDR区插入人框架中。此处描述的单克隆抗体还包括"人"抗体，其可从多种来源分离获得，包括，例如，从病人的血液中分离或利用转基因动物重组制备。所述转基因动物的例子包4舌KM-Mouse(Medarex，Inc.,Princeton,NJ)，其具有人重链转基因和人轻链转染色体(见WO02/43478),Xenomouse(Abgenix,Inc.,FremontCA;描述于,例如，Kucherlapati等人的美国专利Nos.5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584和6，162,%3),和HuMAb-Mouse(Medarex，Inc.;描述于，例如，Taylor,L.等人(1992)AW"cJc油20:6287-6295;Chen,J.等人(1993)/"^7a".o冊//mm簡o/ogj5:647-656;Tuaillon等人(1993)A^/.Jcadt/5L490:3720-3724;Choi等人(1993)A^wreGe"e"cs4:117-123;Chen,J.等人(1993)^ETkffiO/.12:821-830;Tuaillon等人(1994)丄/m麵"o/.152:2912-2920;Taylor,L.等人(1994)她雇"画//画圃/。"6:579-591;和Fishwild,D.等人(1996)淑歸/i/otec/mo/og_y14:845-851,Korman等人的美国专利Nos.5,545,806;5,569，825;5,625，126;5，633，425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5，874,299;和5,770,429;5，545，807;和PCT公开Nos.WO92/03918，WO93/12227,WO94/25585,WO97/13852,WO98/24884和WO99/45962，WO01/14424)。本发明的人单克隆抗体还可以利用SCID小鼠制备，该SCID小鼠中已经重构了人免疫细胞，以致在免疫后可产生人抗体反应。所述小鼠描述于，例如，Wilson等人的美国专利Nos.5,476,996禾口5,698,767。术语"超变区"用于描述负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。超变区包括来自"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(即，轻链可变区中的残基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区中的残基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3),见Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.(1991))和/或来自"超变环"的残基(即，轻链可变区中的残基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区中的残基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)，Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987》。"框架"或"FR"残基是超变区残基之外的可变区残基。在此处应用的术语"免疫粘附素，，指抗体样分子，其将异源"粘附"蛋白(例如，受体、配体或酶)的"结合域"与免疫球蛋白恒定区的效应器功能组合。在结构上，免疫粘附素包括粘附素氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列的融合体，该粘附素氨基酸序列具有与抗体的抗原识別和结合位点(抗原结合位点)不同的预期结合特异性(也就是为"异源"的)。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定区序列优选地来源于Yl、或重链，因为包含这些区的免疫粘附素可通过蛋白A层析(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))而纯化。免疫粘附素可通过本发明的方法纯化。"肽体"(pepdibody)是指含有Fc域和至少一个肽的分子。肽体可以是多聚体或二聚体或其片段，并且它们可以衍生化。肽体在美国专利公开文本20040214190、WO00/24782和WO01/83525中详细描述，上述文献全文引入本文作为参考。术语"配体结合域"指任何天然细胞表面受体或其任何至少保持相应天然受体与配体结合的性质的区域或其衍生物。在一个特定实施方式中，受体来自具有与免疫球蛋白超基因家族中的成员同源的胞外结构域的细胞表面多肽。不属于免疫球蛋白超基因家族的成员、但被该定义所覆盖的其他受体包括细胞因子受体，特别是具有酪氨酸激酶活性的受体(酪氨酸激酶受体)，促红细胞生成素和神经生长因子受体超家族的成员，和细胞粘附分子，如(E-、L-和P-)选择素。术语"受体结合区"用于指一种受体的任何天然配体(包括细胞粘附分子)或至少保持相应天然配体的受体结合能力的这些天然配体的任何区域或衍生物。该定义尤其包括来自上述受体的配体的结合序列。"抗体-免疫粘附素嵌合体"包括将一种抗体(如此处所定义的)的至少一个结合域与至少一个免疫粘附素(如本申请所定义的)组合而成的分子。示例性的抗体-免疫粘附素嵌合体是Berg等人，PNAS(USA)88:4723-4727(1991)和Chamow等人，丄Immunol.153:4268(1994)描述的双特异性CD4-IgG嵌合体。此处所用的"混合物"包含目的多肽(期望对其进行纯化)和一种或多种污染物，也就是杂质。混合物可直接获自产生该多肽的宿主细胞或生物体。作为非限定性的例子，可根据本发明的方法纯化的混合物包括收获的细胞培养液、细胞培养上清液和条件细胞培养上清液。已经"部分纯化"的混合物已经进行了层析步骤，例如，非亲和层析、亲和层析等等。"条件混合物"是为本发明方法中的层析步骤而制备的混合物，例如细胞培养上清液，所述制备包括将混合物进行緩冲液交换、稀释、加盐、pH滴定或过滤中的一个或多个，以设定pH和/或电导率范围和/或緩沖液基质，从而获得所需的层析性能。"条件混合物，，可用于将第一层析柱上的加样条件标准化。通常，混合物可通过多种本领域公知的分离方法获得，例如，通过利用过滤或离心将生物反应器反应结束后的肉汤中的死细胞和活细胞与其他成分物理分离，或通过将细胞培养上清液浓缩和/或渗滤为特定范围的pH、电导率和缓冲液种类浓度。术语"杂质，，和，，污染物"以及其语法上的变化可互换地用于表示除了期望从含有目的蛋白质的组合物中移出的该目的蛋白质之外的任何物质。污染物包括但不限于任何生物大分子例如宿主细胞蛋白质(如，CHOPs)、目的蛋白质之外的蛋白质、核酸(如，DNA和RNA)、脂质、糖类、内毒素、细菌或其他微生物例如酵母、培养基成分，和作为在层析中使用的吸附剂的部分并可能在层析过程中进入样品中的任何分子，等等。术语"目的蛋白质"和"目标蛋白质"可互换地用于指期望根据本发明的方法从混合物中纯化的上述蛋白质，例如，抗体。术语"宿主细胞蛋白质"或"HCP，，指表达目标蛋白质的宿主细胞的代谢(细胞内和细胞外)产生的任何蛋白质，包括任何从宿主细胞的基因组中表达的蛋白质或重组表达的蛋白质，不考虑目标蛋白质。宿主细胞可以是任何能够表达目标蛋白质的细胞，特别是哺乳动物(如，CHO和鼠骨髓瘤细胞系例如NS0)、昆虫、细菌、植物和酵母细胞系。在本发明的一个特定实施方式中，HCP是"中国仓鼠卵巢细胞蛋白质"，或"CHOP",其指任何来源于中国仓鼠卵巢("CHO")细胞培养物的宿主细胞蛋白质("HCP")。HCP通常作为包含目的蛋白质的细胞培养基或裂解液[例如，收获的细胞培养液("HCCF")]中的杂质存在。包含目的蛋白质的混合物中存在的HCP的量提供了一种对目的蛋白质纯度的量度。通常，蛋白质混合物中HCP的量以相对于该混合物中目的蛋白质含量的百万分比来表示。术语"百万分之"或"ppm"在此可互换地用于指通过本发明的方法纯化的目的蛋白质的纯度的量度。当蛋白质在溶液中时，单位ppm指相对于以亳克/毫升表示的目的蛋白质，以纳克/毫升表示的HCP的量(即，如下文实施例所述，HCPppm二(CHOPng/ml)/(目的蛋白质mg/ml))。当蛋白质被干燥，例如冻干时，ppm指(HCPng)/(目的蛋白质mg)。术语"纯化"及其语法上的变化用于表示完全或部分地去除包含蛋白质和一种或多种杂质的混合物中的至少一种杂质，从而提高组合物中蛋白质的纯度水平(也就是，通过降低该组合物中杂质的含量(ppm))。根据本发明，纯化用两个非亲和层析步骤进行，而没有过程中TFF步骤。本发明的一种方法可纯化目的蛋白质，以获得含有少于100ppm的HCP、优选少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、或少于20ppm的HCP的组合物，其通过ELISA测定。如此处所用的术语"分离"及其语法上的变化是指从其他物质中分离纯化的目的蛋白质，例如，从用于纯化目的蛋白质的柱或树脂中分离，以获得均质的组合物，其中包含基本没有污染物、杂质和其他物质的目的蛋白质。术语"层析，，是指通过在该方法的特定缓冲条件下使混合物流经吸附剂渗滤而将混合物中的目的溶质如目的蛋白质与混合物中的其他溶质分离的方法，由于溶质的性质例如pl、疏水性、大小和结构，该吸附剂或强或弱地吸附或保留溶质。术语"层析"的使用包括柱和膜的类型。"吸附剂，，是任何能够通过与目的分子直接相互作用或与附着到吸附剂上的化合物相互作用而将另一种物质吸附到其表面上的固定的固态物质。在各种类型的层析中有用的吸附剂在本领域是公知的并且通过商业途径可以容易地获得。术语"亲和层析"和"蛋白质亲和层析"可互换地用来指一种蛋白质合，通常作为空间互补性和结合位点处的一种或多种化学相互作用如15静电力、氢键、疏水力和/或范德华力的组合。这些相互作用不是归因于分子的通常性质，例如等电点、疏水性或大小，而是目的分子与配体的特异性相互作用的结果，所述配体例如是适于蛋白A和抗体相互作用的精确的疏水性蛋白质结构域。蛋白A是吸附剂的一个例子，其可被固定到固体支持物如琼脂糖上，用于结合含FC区的分子。见Ostrove(1990)，GuidetoProteinPurification,MethodsofEnzymology182:357-379,其全文在此引入作为参考。可使用任何配体纯化其相应的特异性结合蛋白质。优选地，生物特异性配体与层析固相物质共价结合，并且当溶液接触该层析固相物质时可与溶液中目的蛋白质(如，抗体、酶或受体蛋白质)接触。目的蛋白质在层析步骤中保持对于生物特异性配体(例如，抗原、底物、辅因子或激素)的特异性结合亲和性，同时混合物中的其他溶质和Z或蛋白质不与配体可检测地或特异性地结合。目的蛋白质与固定配体的结合允许污染蛋白质和其它杂质通过层析介质，同时目的蛋白质保持与固相物质上的固定配体特异性结合。然后利用低pH、高pH、低盐、高盐、竟争性配体等从固定配体上移除特异性结合的蛋白质，并与洗脱缓冲液一起通过层析柱。也可能存在相对于目的蛋白质具有较低相对浓度的污染蛋白质和其他类型的污染物例如核酸和内毒素，它们4交早地通过柱子。术语"特异性结合"和"结合特异性"及其语法上的变化描述目的蛋白质与配体之间的通常特异性且可逆的相互作用，其需要蛋白质和配体结构在结合位点处的空间互补性与结合位点处的一种或多种静电力、氢键、疏水力和/或范德华力的组合作用。配体应该具有允许其与基质附着而不破坏其结合活性的化学可修饰基团。配体与结合物质的理想的亲和力为在自由溶液中10-4到10—8M。空间互补性越大以及在结合位点处的其他力越强，蛋白质对其相应配体的结合特异性也越大。特异性结合的非限制性实例包括抗体-抗原结合、酶-底物结合、酶-辅因子结合、金属离子螯合、DNA结合蛋白-DNA结合、调节蛋白-蛋白质相互作用，等等。术语"非亲和层析"和"非亲和纯化"指不使用亲和层析而是需要溶质(如目的蛋白质)与吸附剂基质之间的非特异性结合相互作用的纯化步骤。此处使用的术语"非特异性结合"指目的蛋白质与结合在固相基质上的配体或其他化合物之间的相互作用，所述相互作用是通过在相互作用位点处的非特异性相互作用，例如通过静电力、氢键、疏水力和/或范德华力，但是缺乏增强非结构力例如亲和(特异性)结合的效果的结构互补性。依赖于非特异性结合而不是亲和性的层析方法的例子包括离子交换层析(例如，阴离子和阳离子交换)和疏水电荷诱导层术语"疏水电荷诱导层析"(或"HCIC")是一种混合模式的层析方法，其中混合物中的目的蛋白质在没有添加盐(例如，易溶盐)的情况下通过温和的疏水相互作用与双模式(即，一种模式用于结合，另一种模式用于洗脱)可离子化配体结合[见Boschetti等人，2000,GeneticEngineeringNews20(13)]。"疏水电荷诱导层析4对脂"是包含配体的固相，所述配体具有亲硫效应(即，利用亲硫层析的性质)、疏水性以及用于其分离能力的可离子化基团的组合性质。因此，一种在本发明的方法中使用的HCIC树脂包含在中性(生理学)或微酸性pH,例如大约pH5到10,优选大约pH6到9.5时可离子化并且适度疏水性的配体。在此pH范围里，配体大部分不带电荷，通过温和的非特异性疏水相互作用与目的蛋白质结合。当pH降低时，配体获得电荷，由pH转移引起的对溶质的静电荷排斥使疏水结合破坏。适用于HCIC的配体的例子包括任何可离子化的芳香族或杂环结构和染料，包括其衍生物，见Burton和Harding,JournalofChromatographyA814:81-81(1998)和Boschetti,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods49:361-389(2001),这些物质在连接臂和/或配体结构上具有脂肪族链和至少一个硫原子。HCIC树脂的例子包括MEPHYPERCEL(PallCorporation;EastHills,NY).。术语"离子交换"和"离子交换层析"指一种层析方法，其中目的可离子化溶质(例如，混合物中的目的蛋白质)在适当的pH和电导率的条件下与连接(例如通过共价连接)于固相离子交换材料上的带有相反电荷的配体相互作用，以致目的溶质以强于或弱于混合物中溶质杂质或污染物的作用力与该带电荷化合物发生非特异性相互作用。混合物中的污染溶质可比目的溶质更快或更慢地从离子交换材料柱上洗去或者与树脂结合或从树脂上除去。"离子交换层析"具体包括阳离子交换、阴离子交换以及混合模式层析。短语"离子交换材料"指带负电荷的固相(即阳离子交换树脂)或带正电荷的固相(即阴离子交换树脂)。在一个实施方式中，可通过将一种或多种带电配体(或吸附剂)附着到固相上(例如通过共价连接)而提供电荷。可替代地，或者除此之外，电荷可以是固相固有的性质(例如，如在二氧化硅的例子中，其总体上带负电荷)。"阳离子交换树脂"指具有负电荷的固相，并且其具有可与通过或穿过该固相的水溶液中的阳离子交换的自由阳离子。可以使用任何附着于适于形成阳离子交换树脂的固相上的带负电配体，例如，羧酸盐、磺酸盐以及下述的其他物质。商业上可以获得的阳离子交换树脂包括，但不限于，例如，具有以下基团的阳离子交换树脂基于磺酸的基团(如，来自GEHealthcare的MonoS、MiniS、Source15S和30S、SPSepharoseFastFlowfM、SPSepharoseHighPerformance,来自Tosoh的ToyopearlSP-650S和SP-650M,来自BioRad的Macro-PrcpHighS，来自PallTechnologies的CeramicHyperDS、TrisacrylM和LSSP和SpherodexLSSP);基于磺乙基(sulfoethyl)的基团(^口，来自EMD的FractogelSE,来自AppliedBiosystems的PorosS-10和S-20);基于磺丙基的基团(如，来自Tosoh的TSKGelSP5PW和SP-5PW—HR，来自AppliedBiosystems的PorosHS—20和HS50);基于磺异丁基的基团(如，来自EMD的FractogelEMDSO,);基于次碌l酸乙基(sulfoxyethyl)的基团(如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-IonS);基于羧甲基的基团(如，来自GE■Healthcare的CMSepharoseFastFlow,来自BiochromLabsInc.的HydrocellCM,来自BioRad的Macro-PrepCM,来自PallTechnologies的CeramicHyperDCM、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM,来自Millipore的MatrexCellufineC500和C200,来自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express一IonC,来自Tosoh的ToyopearlCM-650S、CM-650M和CM-650C);基于石黄酸和羧酸的基团(如，来自J.T.Baker的BAKERBONDCarboxy-Sulfon);基于羧酸的基团(如,来自J.TBaker的WPCBX，来自DowLiquidSeparations的DOWEXMAC-3,来自Sigma-Aldrich的Amberlite弱阳离子交换剂、DOWEX弱阳离子交换剂和Diaion弱阳离子交换剂，以及来自EMD的FractogelEMDCOO-);基于石黄酸的基团(如，来自BiochromLabsInc.的HydrocellSP,来自DowLiquidSeparations的DOWEX细筛强酸阳离子树脂,来自J.T,Baker的UNOsphereS，WPSulfonic,来自Sartorius的SartobindS膜，来自Sigma-Aldrich的Amberlite强阳离子交换剂、DOWEX强阳离子交换剂和Diaion强阳离子交换剂);和基于正磷酸的基团(如，来自Whatman的Pll)。如果需要，可以使用阳离子交换膜代替阳离子交换树脂，例如SartobindS(Sartorius;Edgewood,NY)。"阴离子交换树脂，，指带有正电荷因而其上附着有一种或多种带正电的配体的固相。任何附着于适于形成阴离子交换树脂的固相上的带正电配体都可使用，例如季氨基。例如，AEC中使用的配体可以是季铵，如季烷基胺和季烷基烷醇胺，或胺、二乙胺、二乙基氨基丙基、氨基、三甲基铵乙基、三曱基节基铵、二甲基乙醇千基铵、多胺。此外，对于AEC，可以使用具有带正电配体(如上述配体)的膜代替阴离子交换树脂。商业上可以获得的阴离子交换树脂包括但不限于来自AppliedBiosystems的DEAE纤维素、PorosPI20、PI50、HQ10、HQ20、HQ50、D50，来自GEHealthcare的MonoQ、MiniQ、Source15Q和30Q、Q、DEAE和ANXSepharoseFastFlow、QSepharosehighPerformance,QAESEPHADEXTM和FASTQSEPHAROSE,来自J.T.Baker的WPPEI、WPDEAM、WPQUAT，来自BiochromLabInc.的HydrocellDEAE和HydrocellQA,来自Biorad的UNOsphereQ、Macro-PrepDEAE和Macro-PrepHighQ，来自PallTechnologies的CeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、QHyperZ、TrisacrylM和LSDEAE、SpherodexLSDEAE、QMASpherosilLS、QMASpherosilM，来自DowLiquidSeparations的DOWEX细筛强石咸I型和II型阴离子树脂和DOWEXMONOSPHERE77、弱碱阴离子，来自Millipore的MatrexCellufineA200、A500、Q500和Q800，来自EMD的FractogelEMDTMAE、FractogelEMDDEAE和FractogelEMDDMAE,来自Sigma-Aldrich的AmberliteI型和II型弱及强阴离子交换剂、DOWEXI型和II型弱及强阴离子交换剂、DiaionI型和II型弱及强阴离子交换剂、Duolite，来自Tosoh的TSKgelQ和DEAE5PW和5PW-HR、ToyopearlSuperQ-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C,来自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-IonD和Express-IonQ。如果需要，可以使用阴离子交换膜代替阴离子交换树脂。在商业上可以获得的阴离子交换膜包括但不限于来自Sartorius的SartobindQ、来自PallTechnologies的MustangQ和来自Millipore的InterceptQ膜。"混合模式离子交换树脂"指利用阳离子、阴离子和/或疏水部分进行共价修饰的固相。混合模式离子交换树脂的例子包括BAKERBONDABXTM(J.T.Baker;Phillipsburg，NJ)、陶瓷羟磷灰石I型和II型和氟化羟磷灰石(BioRad;Hercules,CA)、CaptoMMC(GEHealthcare;Waukesha,WI)矛口MEP和MBIHyperCel(PallCorporation;EastHills,NY)。术语"亲硫的"指蛋白质具有的对紧密靠近硫醚基团的砜基的选择性(Porath等人，1985)。"亲硫层析"也被称为"亲硫吸附层析"，是一类非亲和层析，其中含有亲硫区域和芳香族氨基残基的目的蛋白质与用于分离该蛋白质的含^L配体结合。亲^L凝胶可通过用p-巯基乙醇还原20二乙烯砜(与Sepharose4B偶联)而制备。亲硫吸附层析基于电子供体-受体性质并与基于疏水性的层析明显不同。不与亲硫吸附剂发生疏水性结合和离子相互作用，因为硫-乙基砜结构没有显著的疏水性或离子电荷。商业上可以获得的亲硫层析树脂的例子包括FractogelEMDTA(Merck;KGaA;Darmstadt,德国)、Uniflow和S叩erflow树脂(Clontech;MountainView,CA)和T-Gel(Pierce;Rockford，IL)。术语"固相"用于表示任何非水性基质，一种或多种配体可附着于其上，或者，在大小排斥层析中，其可指树脂的凝胶结构。固相可以是任何能够以这样方式附着配体的基质，例如，纯化柱、离散粒子的不连续相、膜、滤器、凝胶，等等。可用于形成固相的材料的例子包括多糖(例如琼脂糖和纤维素)和其他机械稳定的基质例如二氧化硅(如可控孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙晞酰胺、陶覺颗粒及其中任一种的衍生物。本发明不限于任何用于层析步骤中的特定固相材料，本领域普通技术人员可以选择适当的固相材料用于本发明。本文中用来指一种层析类型的"膜"通常是具有吸附性质的聚合微量滤膜，如乙酸纤维素和聚偏氟乙烯。在层析中使用膜代替树脂是有利的，因为不需要装填、合格化(qualifying)、验证或者进行清除和再循环研究。而且，膜提供了更高的清除能力值，例如比树脂对应物高200倍，以及高流速能力，使循环只有数分钟，这显著缩短了清除污染物所需的时间。膜可以在使用分步洗脱的快速层析中使用，或者作为可以处理极大体积的流通模式使用。结果，与树脂相比，可以使緩沖液利用减少最多达90%,从而明显节约成本。另外，膜层析技术允许以比传统层析方法快100倍的高流速大规模清除DNA，从而允许在每个生产转换中处理大体积。出于实施的目的，在必须用吸附剂避免气泡的同时，它们不能破坏膜的结构。考虑到这些过滤器的结构，它们的性能基本上不依赖于所附装置的类型，如泵的类型。它们不象传统层析柱那样受到扩散限制。由于膜的大孔结构，使用膜吸附剂比使用传统凝胶对极大生物分子和病毒的结合能力显然更高。术语"去污剂"指离子型、两性离子型和非离子型表面活性剂，其对于防止蛋白质的聚集以及防止污染物与目的蛋白质的非特异性相互作用或结合是有用的，并且可以在用于本发明的多种緩沖液中存在，所述緩冲液包括净化、平衡、上样、上样后清洗、洗脱或清除緩沖液。在具体的实施方式中，可将去污剂加到清洗緩沖液中。可用于本发明的去污剂的例子包括但不限于聚山梨醇酯(如，聚山梨醇酯20或80);泊洛沙姆(poloxamers)(例如泊洛沙姆188);Triton;十二烷基硫酸钠(SDS);月桂基硫酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂酰-磺基甜菜碱(sulfobetaine);月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、或硬脂酰-肌氨酸；亚油基-、肉豆蔻基-、或鯨蜡基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-、或异硬脂酰胺丙基—二曱胺；甲基椰油基牛磺酸钠或曱基油基牛磺酸二钠；M0NAQUATTM系歹寸(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N丄)；IgepalCA-630、Pluronic、Triton、BRIJ、AtlasG2127、Genapol、HECAMEG、LUBROLPX、MEGA、NP、THESIT、TOPPS、CHAPS、CHAPSO、DDMAU、EMPIGENBB、AWITTERGENT和C12E8。去污剂可添加到任何工作緩冲液中，还可包含在含有目的分子的料液中。去污剂的含量可以是任何适于蛋白质纯化方法的量，例如，从大约0.001%到大约20%,典型地从大约0.01%到大约1°/0。在一个具体的实施方式中，在用于CEC的清洗緩冲液中使用聚山梨醇酯80。本发明中使用的"緩冲液"是通过其酸-碱共轭成分的作用阻止由添加酸或碱引起pH变化的溶液。多种緩沖液可用于本发明的方法中，取决于緩沖液的所需pH和纯化方法的具体步骤[见Buffers.AGuideforthePreparationandUseofBuffersinBiologicalSystems,Gueffroy,D.,ed.CalbiochemCorporation(1975)]。可用于控制本发明方法所需pH范围的缓沖液成分的非限制性实例包括醋酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、铵緩沖液例如醋酸铵、琥珀酸盐、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、Tris等，以及下列物质的组合TRIS-苹果酸-NaOH、马来酸盐、氯代醋酸盐、曱酸盐、苯曱酸盐、丙酸盐、吡啶、哌。秦、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、三(幾曱基)甲基甘氨酸(tricine)、二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、TAPS、乙醇胺、CHES、CAPS、曱胺、哌啶、O-硼酸、碳酸、乳酸、丁二酸、二乙基丙二酸、双甘氨肽、HEPPS、HEPPSO、咪唑、笨酚、POPSO、琥珀酸盐、TAPS、基于胺的、节胺、三曱基或二曱基或乙基或苯基胺、乙二胺、或吗啉。需要时緩冲液中也可含有其他成分(添加剂)，例如，可用盐调节緩沖液的离子强度，例如，氯化钠、石克酸钠和氯化钾；以及其他添加剂，例如氨基酸(如甘氨酸和组氨酸)、离液剂(如尿素)、醇(如乙醇、甘露醇、甘油、苄醇)、去污剂(见上文)、以及糖(例如蔗糖、甘露醇、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖和果糖)。緩冲液成分和添加剂以及使用浓度可根据本发明使用的层析类型而改变。缓冲液的pH和电导率可根据纯化方法中哪一步骤使用緩冲液而改变。可以使用pH与所选配体和树脂/膜相容的任何合适的緩沖液纯化目的蛋白质，如上述緩冲液。在CEC中，根据纯化步骤和使用的緩冲液，緩冲液的pH可在3到IO之间，更优选大约pH4.0到9.0，电导率可为大约0.1到40mS/cm,更优选为大约0.5到15mS/cm。在AEC中，根据纯化步骤和使用的緩沖液为大约0.1到10.0mS/cm,更优选大约0.5到5mS/cm。在整个纯化方法中使用的緩冲液将在下文对每个层析步骤更详细地描述。"净化"溶液一般用于在纯化步骤之前通过除去任何结合的污染物例如生物来源的污染物而净化在柱层析中使用的树脂。只要与根据本发明的方法选择的特定柱和树脂相容，任何期望的緩冲液都可用于此目的。优选地，净化溶液的pH库交高，例如，为pH10或更高，更优选pHll或更高，更优选pH12或更高；或者，净化溶液的pH可以较低，例如为pH4或更低，更优选pH3或更低。在一个具体实施方式中，本发明的方法中使用的树脂用包含1NNaOH、pH^12的净化溶液来净化。"平衡緩冲液，，用于在向树脂中装载含有待纯化的目的蛋白质的混合物之前调节在CEC或AEC中使用的层析介质例如树脂或膜的pH和电导率。可用于此目的的适合的緩沖液在本领域是熟知的，例如，上述緩沖液，并包括其pH值与用于纯化目的蛋白质的层析步骤中选择使用的树脂相容的任何緩沖液。在具体实施方式中，用于CEC和AEC的平衡緩沖液种类是基于磷酸盐或TRIS的緩沖液。平衡緩冲液的电导率和/或pH使得目的多肽与树脂结合或目的蛋白质流经柱子而一种或多种杂质与柱子结合，这取决于是使用CEC还是使用AEC。在一个具体实施方式中，在层析介质的pH和电导率分别在平衡缓冲液的土0.2和±0.4mS/cm以内时，更优选分别在平衡緩冲液的士O.l和±0.2mS/cm以内时，完成平衡。在CEC中，平衡緩冲液的pH为大约3到大约9，更优选为大约4.0到大约8.0,电导率为大约0.1到大约40mS/cm，更优选为大约0.5到大约10.0mS/cm。在AEC中，平衡緩冲液的pH为大约4到大约10，更优选pH为大约6到9,电导率为大约0.1(WFI)到大约10mS/cm，更优选电导率为大约0.5到大约5mS/cm。"上样缓冲液"用于将含目的蛋白质的混合物上样到柱子上。应当理解，如果使用膜作为层析介质，则按照本领域使用的常规方法，上样緩沖液只与膜接触。任何适当的緩冲溶液都可用作上样緩冲液。在一个具体实施方式中，上样緩冲液为磷酸盐或TRIS緩冲液。对于CEC，选择上样缓冲液的电导率和pH使得目的蛋白质与层析介质结合而污染物可以流过。对于AEC,选4奪上样缓冲液的电导率和pH4吏得目的蛋白质可以流过而污染物被层析介质保留。适合用作上样緩冲液的緩冲液在本领域是公知的，例如，上述的那些缓冲液。本领域普通技术人员应该认识到，用于CEC和AEC的上样緩沖液所使用的pH和电导率可以与上述用于CEC和AEC的平衡緩冲液相当(如果不相同的话)。在此使用的术语"清洗緩冲液"或"上样后清洗液"是指用于在洗脱目的蛋白质前从层析树脂(例如当使用柱时)中除去杂质的緩沖液。术语"清洗"及其语法上的变化用于描述适当的清洗緩沖液通过或流经层析树脂。在本发明中，清洗緩冲液在CEC中使用，并且可以在AEC中用来将产物"推出"柱子，但它不是必需的。在膜AEC中清洗緩沖液是不必要的，因为目的蛋白质不被AEC膜介质保留。需要时，清洗、平衡和上样緩冲液可以是相同的。CEC中使用的清洗緩沖液的pH和电导率为，使得一种或多种杂质从树脂上洗脱下来而树脂保留目的多肽。需要时，清洗緩沖液可以含有如上所述的去污剂，例如聚山梨醇酯。清洗緩冲液的pH和电导率的选择对于在不显著洗脱目的蛋白质的情况下除去HCPs和其他污染物是重要的。以上对于平衡和上样緩沖液所述的pH和电导率条件足以实现该目的。为了在洗脱步骤之前除去比目的蛋白质亲水性更强和酸性或碱性更强的污染物并降低系统的电导率，在混合物上样后，在用于CEC的后续清洗步骤中使用的清洗緩沖液的电导率和pH可以降低或保持或升高。选择清洗緩沖液的pH和电导率，使得目的蛋白质保留在该方法使用的CEC树脂中。适合用作清洗緩沖液的緩冲液的实例如上所述。在一个具体实施方式中，清洗緩沖液是基于磷酸盐或TRIS的緩沖液。CEC中使用的清洗緩冲液的pH可为大约3到大约10,更优选的pH是大约4到大约9，电导率为大约0.1到大约40mS/cm，更优选的电导率为大约0.5到大约5mS/cm。如此处所用的术语"洗脱緩冲液"是指用于从CEC树脂中洗脱目的蛋白质的緩冲液。术语"洗脱"及其语法上的变化是指通过利用适当的条件从层析材料中移出一种分子，例如目的多肽，所述适当的条件例如是，通过改变围绕层析材料的緩冲液的离子强度或pH,通过添加配体的竟争性分子，通过改变分子的疏水性，或通过改变配体的化学性质(如，电荷)，使得目的蛋白质不能与树脂结合因而从层析柱上洗脱下来。术语"洗出液"是指当对柱子进行洗脱时从柱子上洗下的含有目的多肽的流出液。在洗脱目的多肽后，柱子可根据需要进行再生、净化和储存。选择洗脱緩冲液的pH和电导率，以使目的蛋白从本方法使用的CEC树脂上洗脱下来。适于用作洗脱緩沖液的緩冲液的实例如上所述。在一个具体实施方式中，洗脱緩沖液是基于磷酸盐或TRIS的緩冲液。用于CEC的洗脱緩沖液的pH可为大约3到大约10,更优选的pH为大约4到大约9,电导率为大约0.1到大约40mS/cm,更优选的电导率为大约5到大约15mS/cm。需要时，可以使用另外的溶液处理柱子以重新使用。例如，可以使用"再生溶液"从纯化方法使用的柱子上"清除"或除去紧密结合的污染物。典型地，再生溶液具有足以从树脂上基本上去除任何残存的杂质和目的蛋白质的电导率和pH。AEC膜不结合目的蛋白质并且不重复使用。因此，使用膜AEC可能是有利的，因为它在使用前只需要用平衡緩沖液平衡。膜AEC中使用的平ff緩沖液的pH可以是大约4到大约10，更优选的pH为大约6到大约9,电导率为大约0.1到大约10mS/cm,更优选的电导率为大约0.5到大约5mSZcm。此处使用的术语"电导率"指水溶液在特定温度下在两个电极之间传导电流的能力。电流通过离子转运在溶液中流动。因此，随着水溶液中存在的离子量的增加，溶液将具有更高的电导率。在本发明的一种方法中，在特定pH范围内，纯化一般可以在大约4到大约37°C、更优选大约15到大约25。C的温度下进行。电导率的测量单位是毫西门子每厘米(mS/cm),可利用标准电导仪进行测量。溶液的电导率可通过改变其中离子的浓度而改变。例如，为了获得期望的电导率，可以改变溶液中的緩冲剂的浓度和/或盐(例如，NaCl或KC1)的浓度。优选地，如下面实施例所述改变盐浓26度以获得期望的电导率。多肽的"pl"或"等电点"是指多肽的正电荷与负电荷平衡时的pH。可根据多种常规方法计算pl，例如，根据多肽上氨基酸和/或唾液酸残基的净电荷或通过利用等电聚焦来计算。如此处所用的"低pH保持"(lowpHhold)是指含目的蛋白质的洗出液的pH的降低，其中pH降低至低于大约pH5，优选低于大约pH4，更优选低于大约pH3.7，最优选大约pH3.4到大约3.6，以实现病毒灭活(即，病毒滴度至少降低2log，更优选降低3log以上)，随后升高pH,以制备用于第二层析步骤的洗出液或将产物带至为目的产品的分子完整性提供稳定性的基质中。任何适当的酸可应用于含目的蛋白质的洗出液中，以降低pH进行低pH保持，例如，基于1NHC1或冰醋酸的溶液。4壬何适当的石威可应用于洗出液中，以将其pH还原至更中性的范围，如，1NNaOH或lNTris。"切向流过滤"或"TFF"或"横向流过滤"是指一种过滤方法，其中样品混合物沿膜的顶面循环，同时施加的压力使某些溶质和小分子穿过该膜。在TFF中，溶液一般与滤膜平行地流动。膜两边的压力差导致液体和可滤过溶质(其分子量小于膜或有类似的性质，如球蛋白)穿过滤器。这可作为连续流方法进行，因为溶液反复地在膜上流过，而穿过滤膜的液体被连续地抽入独立的循环中。在HPTFF(高效切向流过滤)中，膜带有电荷，因此利用分子的大小和电荷来分离污染物(见美国专利公开No.2003/0229212)。如果需要，TFF可用于交换緩冲液，其中目的蛋白质在本发明方法开始之前溶于另一种更适于结合到层析树脂上的緩冲液中。然而，在本发明的方法中，过程中TFF步骤(即，在两个层析步骤之间发生的TFF)是不必要的，因为在层析过程中使用的緩沖液和配体的性质允许直接从一个纯化步骤转移到下一个纯化步骤。如此处所用的"过程中"是指在开始使用CEC的捕获步骤之后及在AEC过程中完成收集目的蛋白质之前进行的任何方法、步骤、操作等等。过程中方法可直接导致纯度的变化(如过程中TFF)，但不是导致纯度变化所需的(例如pH和/或电导率调节)。可期望利用本发明的方法获得治疗级的蛋白质纯度，在这种情况中任选地可以使用本领域公知的附加步骤。例如，为了获得既清除外来病毒又清除内源病毒的病毒清除能力，可以使用低pH灭活和病毒过滤方法，包括带电膜过滤(例如，来自CUNO的VRCUNO、来自PallTechnologies的DV20、来自Asahi的Planova过滤器)。如此处所用的"深度过滤"是一种使用深度滤器的过滤方法，其典型的特征是其设计为将颗粒保留在过滤基质内。深度滤器的能力一般用深度来定义(如，10英寸或20英寸的基质)、因而用保持固体的能力来定义。在本发明的一种方法中，深度滤器可用于提高纯化方案的病毒清除能力，然而这是任选的步骤，不是获得本发明方法的纯度水平所必需的。用于去除病毒的深度滤器可在纯化方案中的任何时间点上使用，但出于滤器成本的考虑优选地在第一层析步骤之后使用，此时处理体积4交<氐。方法的描述在本发明的方法中，利用CEC然后利用AEC纯化目的蛋白质，达到少至大约100ppm或更少的HCP、10pg/mg或更少的DNA以及高达99%或更高的单体纯度的纯度。不需要TFF也不需要另外的层析步骤即可获得这样高水平的纯度。目的蛋白质可由已被基因工程化以产生该蛋白质的活宿主细胞产生或表达。将细胞基因工程化以产生蛋白质的方法在本领域是公知的。见例^口，Ausabel等人，eds.(1990),CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley，NewYork)和美国专利Nos.5，534，615和4,816,567，每篇都特别在此引入作为参考。所述的方法包括将编码蛋白质并允许该蛋白质表达的核酸导入到活的宿主细胞中。这些宿主细胞可以是在培养中生长的细菌细胞、真菌细胞、或优选动物细胞。细菌宿主细胞包括但不限于大肠杆菌细胞。合适的大肠杆菌菌抹的例子包括HBIOI、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM538、NM539,以及任何不能切割外源DNA的大肠杆菌菌抹。可利用的真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和曲霉细胞。可利用的动物细胞系的几个例子是CHO、VERO、DXBll、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、NS0和WI138。新的动物细月包系可利用本领域4支术人员熟知的方法(如，通过转化、病毒感染和/或筛选)建立。在具体实施方式中，目的蛋白质在CHO细胞中产生(见，例如WO94/11026)。CHO细胞的各种类型在本领域是已知的，例如，CHO-Kl、CHO-DG44、CHO-DXBll、CHO/dhfr—和CHO-S。用编码目的蛋白质的核酸工程化的宿主细胞可以在本领域公知的允许蛋白质表达的条件下培养。从细胞碎片制备用于纯化蛋白质的混合物首先依赖于蛋白质的表达方法。一些蛋白质直接从细胞分泌到周围的生长培养基中，而另外一些蛋白质保留在细胞内。对于细胞内产生的蛋白质，可利用任何方法，例如机械剪切、渗透休克以及酶处理法使细胞裂解。裂解使细胞的全部内容物释放到匀浆中，另外产生可通过离心或过滤除去的亚细胞片段。在蛋白质生产过程中，由于细胞的自然死亡和宿主细胞细胞内蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质会产生类似的问题，尽管程度较小。当使用重组技术时，目的蛋白质可在细胞内、在周质间隙中产生，或直接分泌到培养基中。本发明的方法不依靠任何特定的方法来清除细胞碎片。熟练技术人员可利用任何方法实现这一目标。如果蛋白质在细胞内产生，作为第一步骤，可(例如)通过离心或过滤步骤除去微粒碎片、宿主细胞或裂解片段，以制备用于纯化的混合物。如果蛋白质分泌到培养基中，则可通过(例如)切向流过滤(TFF)或深度过滤从细胞培养基中分离重组宿主细胞，以制备用于纯化的混合物。根据本发明，一旦获得了含有目的蛋白质的混合物(即，在适当宿主细胞培养条件下表达后已经回收了蛋白质)，即可如上文所述，在适当条件下利用CEC和AEC的组合(见图l)进行目的蛋白质与混合物中污染物的分离。获得本发明方法可得到的纯度水平不需要其他过程中纯化步骤，如TFF或HPTFF。仅仅根据需要在两个层析步骤之间进行pH调节和/或稀释以制备用于在第二层析步骤中纯化的混合物。在一个具体实施方式中，AEC步骤使用的膜采用季铵离子配体，而CEC步骤使用与树脂连接的基于磺酸的配体。这些层析技术基于多种性质(如电荷)分离蛋白质混合物。本领域普通技术人员应当认识到，需要时可以将低pH保持引入本方法中作为过程中步骤。由于管理机构对治疗性蛋白质生产中病毒清除的要求，必须至少有两个单独的病毒灭活和清除的步骤，基于不同的化学作用模式，其典型地是低pH保持和病毒过滤步骤。本发明可以在任意点，在AEC步骤之前或之后，提供低pH保持。本领域普通技术人员应当认识到，在两个层析步骤之间的pH保持可利用任何本领域公知的方法实现，以达到一般通过低pH保持获得的病毒清除，只要包含目的蛋白质的混合物在应用于AEC步骤之前被适当地緩冲。低pH保持通常导致电导率提高至少0.5mS/cm。pH保持和中和后获得的pH可能在适当的pH范围内，大约4至大约10,优选大约6至大约9。本领域普通技术人员将会认识到，低pH保持步骤不是获得本发明方法可达到的纯度水平所必需的。例如，并非意在限制酸和碱试剂或pH值，低pH保持可以利用(例如)1NHC1、磷酸或冰醋酸进行，以降低CEC洗出液的pH到大约3.4至3.6的范围内，然后加入(例如)2MTrispH9.0,以提高洗出液的pH到大约7.0。本领域普通技术人员将会认识到可以使用各种酸和碱。本领域普通技术人员将认识到在本发明方法中使用的低pH保持步骤的时间条件。典型地，低pH保持进行至少大约15分钟，优选大约30分钟，更优选大约45分钟，更优选可达大约60分钟，最优选可达大约90分钟。在特定纯化方案中，根据被纯化的蛋白质不同，可期望进行低pH保持长达5小时。或者，可以按照常规方法添加去污剂并在溶液中4妄触一定时间来灭活病毒。如果希望获得治疗级蛋白质制剂，可采用第二病毒清除步骤，例如病毒过滤步骤，然而，达到本发明方法可获得的纯度水平不需要该步骤。可在病毒清除中使用的过滤装置是本领域公知的(如，UltiporVFGradeDV20或DV50和FiltronTFF(PallCorporation,EastHills,NY);Vi扁lve(Millipore，Billerica，MA);VRCUNO(CUNO;Meriden,CT);和Planova(AsahiKaseiPharma,PlanovaDivision,BuffaloGrove,IL)。为了除去病毒和其他生物物质，一般使用小于20nm的孔径，这样可除去脊髓灰质炎病毒。可以在该过程中最小化后进行。本发明的层析步骤可通过任何机械方法进行。层析可在柱上进行。柱子可使用或不用压力并从顶部到底部或从底部到顶部运行。需要时，根据本领域公知的常规方法，柱子中的液体流的方向在层析过程中可转换。层析也可利用批处理进行，其中通过任何适当的方法，包括重力、离心或过滤，将固体支持物与用来上样、清洗和洗脱样品的液体分离。层析还可以如下进行利用与对于层析树脂所描述的同样的化学原理，使样品接触比其他滤器更强地吸附或保留样品中的一些分子的带电荷滤器。尽管用于本发明的柱子的准备步骤可被修改以适应操作者的个人需求，但是提供下述描述作为指导，而且本领域普通技术人员将会理解在不偏离本发明精神的前提下可以进行改变。柱子和膜按照制造商的说明进行准备。在纯化之前，柱子一般利用净化溶液进行净化，然后利用易溶盐例如lMNaCl使其带电荷，并利用平衡緩沖液进行平衡。在净化步骤中，一般在净化溶液加到柱子上后停留例如大约15-30分钟，优选大约1小时，以清洁具有任何结合的污染物(包括生物来源的污染物)的树脂。电荷化(charge)步骤通过置换净化溶液而中和^f脂，例如，在CEC中，可利用NaCl从柱子中置换NaOH并保持树脂配体与正电离子接触。在柱子电荷化后，用平衡緩冲液平衡柱子，以准备树脂结合目的蛋白质的pH和电导率。例如，当其pH和电导率分别在平衡緩冲液的pH和电导率土O.l和±0.2mS/cm以内时，柱子可以认为是平衡的。制备上样混合物，其典型地是在适当的緩冲盐(即上样緩沖液)中浓缩和进行了緩冲液交换的细胞培养上清液。利用任选地可与平銜-緩冲液相同的上样緩沖液，将获自重组宿主细胞的上样混合物(即，含有希望纯化的目的蛋白质)上样到被平衡的柱(CEC)上。当混合物流过柱子的固相时，目的蛋白质和其他杂质(例如，如果蛋白质在CHO细胞中产生，则为HCPs)差异性地与固相结合，由此使蛋白质和污染物在通过层析柱时分离。一旦混合物被上样到柱子上并且目的蛋白质与树脂结合，就利用所述的清洗缓沖液进行清洗步骤以从柱子中清除污染物。任选地，清洗步骤的进行可以采用比其他清洗和洗脱步骤更慢的流速(但不是必需的)，例如，采用相当于几分钟(例如，2-30分钟)停留时间的流速。流速将在下文更详细地讨论。为了最大化地清除HCPs，清洗緩冲液的pH和电导率是重要的。在本方法中，CEC中的清洗步骤清除了核酸和剩余的HCPs同时保留了目的蛋白质。为从柱子上洗脱目的蛋白质，利用如上所述的适当的洗脱緩冲液，以使目的蛋白质与柱子脱离结合。緩沖液组合物中的緩冲液、盐和/或其他化合物的类型和浓度使得目的蛋白质相对于杂质差别洗脱。本领域普通技术人员利用此处提供的实施例作为指导，可容易地确定用于上样、清洗和洗脱緩沖液的适当的pH和电导率范围，从而在洗脱过程中回收目的蛋白质。为了使含目的蛋白质的洗出液中的HCPs减至最少，可利用下文描述的降低的流速。当从柱子上洗脱目的蛋白质时，根据从上升A，到下降A，的峰的形成收集目的蛋白质。本领域普通技术人员可在平衡緩冲液通过柱子时通过测量平衡緩沖液在250-280nm处的吸光度而容易地确定基线。为了减少HCPs的集合以制备含目的蛋白质的纯化组合物，优选在最大峰高度的25%之前收集含目的蛋白质的洗出液。32基本上，本发明采用的分离方法使污染物以不同速率沿着长柱子向下移动，获得随着它们进一步沿柱子向下流动而增强的物理分离，同时目的蛋白质附着于层析介质上，然后根据緩沖液进行差别洗脱。在本发明的纯化方法中，混合物沿柱子向下移动的降低的流速为大约2-10分钟停留时间，优选不超过30分钟停留时间。在一个本发明的具体实施方式中，层析步骤中的流速相当于不超过大约6分钟的停留时间。尽管流速对于获得本发明方法可获得的纯度水平不是关键因素，仍然提供了流速作为指导。本领域普通技术人员可根据需要改变流速。通过本发明方法测量蛋白质纯化效率的优选方法是测量宿主细胞蛋白质的去除。纯化的蛋白质优选是如上文定义的均质组合物。样品在任何纯化阶段的蛋白质浓度可通过任何适当的方法测定。这些方法在本领域是公知的，包括1)比色法，例如Lowry测定、Bradford测定、Smith测定、胶体金测定；2)利用蛋白质的UV吸收性质的方法；和3)基于凝胶上染色蛋白条带与相同凝胶上已知量的蛋白质标准作比较而进^亍的一见觉估测。见例如，Stoschek(1990),QuantitationofProtein,inGuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymol.182:50-68。含目的蛋白质的均质组合物的蛋白质污染物可通过本领域已知的多种方法测定，例如，通过酶联免疫测定(ELISA;见例如，Reen(1994),Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA),于BasicProteinandPeptideProtocols,MethodsMol.Biol.32:461-466，其全文在此引入作为参考)。含目的蛋白质的均质组合物中可能存在的核酸的含量可通过任何适当方法确定。例如，可使用一种利用聚合酶链式反应的检测。核酸可降至低于10pg/mg的水平。如此回收的蛋白质可以按照本领域公知的常规配制方法配制在生物医药可接受的组合物中，用于各种需要高度纯化的蛋白质组合物的诊断、治疗和其他用途。在收集含目的蛋白质的洗出液之后，可通过利用具有较高摩尔浓度和/或改变的pH的溶液清洗层析介质，释放任何可能保持与柱子结合的蛋白质。然后可以用一种溶液(例如，再生溶液)使柱子再生，该溶液具有从层析介质中释放大多数或全部蛋白质并减少或消除任何可能存在于层析介质中的微生物污染物的效果。随后，柱子可被沖洗并保存在防止微生物生长的溶液中。所述溶液可包含氢氧化钠，但也可使用其他试剂，例如乙醇、叠氮钠、苯曱醇或高浓度的易溶盐。下述实施例用于说明本发明，而非意在限制。实施例本实施例描述了利用本发明的纯化方法进行抗体纯化(见图1)。制备了抗肿瘤抗原(TA)的完全人类抗体。利用CHODG44细胞制备了转染瘤。在中性pH(7到8)和电导率为10到20mS/cm的合成的、无血清的、成分确定的培养基中进行细胞培养。DG44CHO细胞生长到密度大约为2-10xl()S细胞/ml。通过利用60MO2CUNO滤器(Meriden，CT)过滤以使细胞培养物澄清。将得到的细胞培养上清液浓缩并在pH6.2的70mM磷酸钠中渗滤。表1和2显示了本发明的两步纯化方法用于生产治疗级蛋白质物质的操作细节的概况。第一非亲和层析步骤是利用FractogelEMDSEHiCap树脂进行捕获的阳离子交换层析，紧接着是利用INHC1或冰醋酸的低pH保持，以将洗出液的pH降低到3.4-3.6,使用2MTrispH9.0将级分的pH提高到7.0。该方法利用如表1中显示的用于各自树脂的平衡、上样、清洗和洗脱緩沖液在CEC步骤中进行。表1.用于抗体捕获的阳离子交换层析主要操作细节的概要。结合能力为40mg/ml树脂。流速用相应的停留时间来表示，以提供较宽的实验灵活性。工作温度在15-25。C之间。NaP:磷酸钠。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>表2.上样制剂用于抗体精制的阴离子交换层析膜主要操作细节的概述。结合能力为2100mg/ml膜。流速以相应的床体积来表示，以提供较宽的实验灵活性。工作温度在15-25。C之间。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>NaP:A粦酸钠。BV:系统的床体积。流速(mL/min)=[(线性流速(cm/hr)]/(60min/hr)]x[正面表面积(cm2)]纯化方法不使用过程中緩沖液交换步骤，即，样品从第一层析步骤到第二步骤只进行pH调节和稀释操作以进行任选的低pH保持。在该实施例中为了制备治疗级别的蛋白质组合物，使用了稀释、病毒灭活、病毒清除和配制步骤。本领域技术人员应当理解，这些步骤都不会影响蛋白质产物相对于其它有机化合物的纯度。利用标准ELISA检测来确定CHOP水平，利用PCR确定DNA水平，并且利用HPLC-SEC确定抗体单体的纯度，该实施例的纯化方法获得均质的组合物，其含有少于100卯m的宿主细胞蛋白质(见下面表3)、少于lOpgDNA/mg抗体以及大于99%的单体，这允许将纯化的物质进一步加工和配制为治疗级产品。第一步骤后的污染物浓度为200到1500ng/mg的CHOPs,以及95%到100%的单体。结果显示在表3中。表3.利用建议的纯化方案去除污染物的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>权利要求1.一种纯化包含目标蛋白质和一种或多种污染物的混合物的方法，包括(a)对该混合物进行阳离子交换层析步骤，然后进行阴离子交换层析步骤，和(b)分离目标蛋白质。2.—种纯化包含目标蛋白质和一种或多种污染物的混合物的方法，所述混合物已经利用阳离子交换层析进行了部分纯化，该方法包括(a)对该混合物进行阴离子交换层析步骤，和(b)分离目标蛋白质。3.—种纯化包含抗体和一种或多种污染物的混合物的方法，包括(a)对该混合物进行阳离子交换柱层析，然后进行阴离子交换层析，和(b)分离目标蛋白质。4.权利要求1-3的方法，其中所述污染物选自宿主细胞蛋白质、宿主细胞代谢物、宿主细胞组成蛋白质、核酸、内毒素、产物相关的污染物、脂质、培养基添加物和培养基衍生物。5.权利要求4的方法，其中所述目标蛋白质被纯化为大约百万分之100(ppm)或更少的宿主细胞蛋白质和大约10pg/mg或更少的核酸的纯度。6.权利要求1或3的方法，进一步包括一个或多个选自病毒灭活和病毒清除的额外步骤。7.权利要求l-3的方法，其中所述阴离子交换层析在pH为大约4到大约IO且电导率为大约0.1到大约10mS/cm的条件下进行。8.权利要求1-3的方法，其中所述阴离子交换层析在pH为大约6.0到大约9.0且电导率为大约0.5到大约5mS/cm的条件下进行。9.权利要求1-3的方法，其中所述阴离子交换层析使用膜。10.权利要求1或3的方法，其中所述阳离子交换层析在pH为大约3到大约IO且电导率为大约0.1到大约40mS/cm的条件下进行。11.权利要求1或3的方法，其中所述阳离子交换层析在pH为大约4.0到大约9.0且电导率为大约0.5到大约15mS/cm的条件下进行。12.权利要求1或3的方法，其中所述阳离子交换层析步骤使用选自磺酸、羧酸、羧甲基磺酸、磺基异丁基、磺基乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、次硫酸乙基和正磷酸的配体。13.权利要求1或3的方法，其中所述阳离子交换层析步骤在选自下组的树脂或膜上进行PorosHS、PorosS、羧曱基纤维素、SartobindS、BAKERBONDABXTM、固定于琼脂糖上的磺丙基和固定于琼脂糖上的石黄酰基，MonoS、MiniS、Source15S、30S、SPsepharose、CMSepharose、BAKERBONDCarboxy-Sulfon、WPCBX、WPSulfonic、HydrocellCM、HydrocelSP、UNOsphereS、Macro-PrepHighS、Macro-PrepCM、CeramicHyperDS、CeramicHyperDCM、CeramicHyperDZ、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM、TrisacrylMSP、TrisacrylLSSP、SpherodexLSSP、DOWEX细筛强酸阳离子树脂、DOWEXMAC-3、MatrexCellufineC500、MatrexCellufineC200、FractogelEMDS03-、FractogelEMDSE、FractogelEMDCOO-、Amberlite弱及强阳离子交换剂、Diaion弱及强阳离子交换剂、TSKGelSP-5PW-HR、TSKGelSP-5PW、ToyopearlCM(650S、650M、650C)、ToyopearlSP(650S、650M、650C)、CM(23、32、52)、SE(52,53)、Pll、Express-IonC和Express-IonS。14.权利要求1—3的方法，其中所述阴离子交换层析步骤使用选自季铵或胺、二乙胺、二乙氨基丙基、氨基、三甲基铵乙基、三曱基苄基铵、二甲基乙醇千基铵、多胺的配体。15.权利要求1-3的方法，其中所述阴离子交换层析步骤使用选自下组的树脂或膜进行DEAE纤维素、SartobindQ、MonoQ、MiniQ、Source15Q、Source30Q、ANXSepharoseFastFlow、QSepharosehighPerformance、CaptoQ、QAESEPHADEXTM、FASTQSEPHAROSE、WPPEI、WPDEAM、WPQUAT、HydrocellDEAE、HydrocellQA、UNOsphereQ、Macro-PrepDEAE、Macro-PrepHighQ、CeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、SpherodexLSDEAE、QMASpherosilLS、QMASpherosilM、MustangQ、DOWEX细筛强碱I型阴离子树脂、DOWEX细筛强碱II型阴离子树脂、DOWEXMONOSPHERE77、来自DowLiquidSeparations的弱石咸阴离子、InterceptQ膜、MatrexCellufineQ500、MatrexCellufineA500和MatrexCellufineQ800、FractogelEMDTMAE、FractogelEMDDEAE和FractogelEMDDMAE和Amberlite。16.权利要求1-3的方法，其中所述目标蛋白质是抗体或抗体片段。17.权利要求16的方法，其中所述抗体是一种单克隆抗体。18.权利要求16的方法，其中所述抗体是一种完全人类抗体。19.权利要求16的方法，其中所述抗体或其片段选自单链抗体、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、脱岩藻糖基化抗体、肽体、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。20.权利要求1-3的方法，其中所述目标蛋白质是一种免疫粘附21.—种制备目标蛋白质的方法，包括培养工程化表达目标蛋白质的宿主细胞，将目标蛋白质回收在混合物中，以及根据权利要求1-3任一项所述纯化该混合物。22.权利要求21的方法，其中所述目标蛋白质是抗体或抗体片段。23.权利要求21的方法，进一步包括将纯化的蛋白质配制成药物组合物的步骤。全文摘要本发明提供纯化蛋白质的方法。具体地，本方法利用一种两步非亲和离子交换层析方法，而不使用过程中切向流过滤步骤。文档编号C12N15/85GK101437839SQ200780016347公开日2009年5月20日申请日期2007年3月9日优先权日2006年3月20日发明者A·阿鲁纳库马里,G·M·M·费雷拉申请人:米德列斯公司