专利名称：新的协同药物组合物的制作方法
新的协同药物组合物 本发明涉及治疗结核病的方法及用于该方法的化合物和化合物組合。
结核病(Mtu)是世界上最严重的单一感染性疾病杀手，每年夺去约 两百万人的生命。世界上每秒钟都有人被结核病感染，每年近乎1%的
世界人口;f皮结核病感染。总共有三分之一的世界人口^皮结核病杆菌感
染并且5-10%被结核病感染的人群在他们一生的某些时间会患病或有 传染性。如今使用的药物是40多年前发现的，从那时起就没有对发现 和研发任何新的治疗剂付出过主要药学研究努力。现在迫切需要用可 快速有效对抗抗药型和敏感型结核病的药物治疗该疾病。
结核病的联合疗法包括四种药物，利福平、异烟肼、吡。秦酰胺和 乙胺丁醇，最短疗程为六个月。使用多种药物可帮助预防抗药突变型 的产生并且六个月的治疗可帮助预防复发。另一方面，多种药物疗法 和延长治疗时间是顺应性(compliance)的主要障碍。目的在于通过 DOTS (短程直接督导化疗法)实现"顺应性"的督导方案大大增加了 任何治疗的管理负担。目前，DOTS仅可用于25%的TB患者。在四种 抗TB药物中，利福平在缩短疗程至六个月中发挥了重要作用，在利福 平抗性结核病的情况下治疗会增加至18个月。例如见N.K. Jain、 K.K. Chopra和Govind Prasad,结核杆菌的固有和获得性异烟肼和利福平抗 性及其对治疗的意义(Initial and acquired isoniazid and rifampicin Resistance to M. tuberculosis and its Implications for treatment) Ind. L Tub., 1992, 39， 121 。也可见Iseman M D, MDR-TB和发展中国家一不可 再被忽视的问题WHO宣布'DOTS Plus'策略(the developing world—a problem no longer to be ignored: the WHO announces 'DOTS Plus' strategy ),结核病和月申病国际杂志(International Journal of Tuberculosis & Lung Disease ) , 1998, 2和TB药物研发的全球联盟(Global Alliance for TB drug development)。肺结核药物发展的科学蓝图(Scientific blueprint for tuberculosis drug development), 结核(Tuberculosis), 2001 81 (l):l-52。
很明显需要缩短疗程。本发明基于利福平可与结核病乙酰乳酸合成酶(ALS )抑制剂联合 用药并产生协同治疗作用这一发现。
因此在本发明的第 一方面我们提供杀死或控制细菌生长的方法， 该方法包括对该细菌或其环境使用协同有效量的(i) RNA聚合酶抑制 剂和(ii) ALS酶抑制剂，藉此将细菌杀死或控制其生长。
"协同有效量，，指根据确定的治疗方案应用于细菌或其生长环境 的(i)和(ii)的给药量可杀死或控制细菌的生长。
可使用任何适当的细菌，包括分枝杆菌，通常是结核分枝杆菌(M 励ercw/。57i )、鸟分枝杆菌(M謂'画)、胞内分枝杆菌(M z"加ce〃w/are ) 或麻风分枝杆菌(M/e/ rae),尤其是结核分枝杆菌及其抗药性菌抹， 例如多重抗药性结核分枝杆菌(Mtu),尤其是利福平抗性结核分枝杆菌 (Mtu)。
需要理解的是选择RNA聚合酶抑制剂和ALS酶抑制剂是由于其 作为特定(particular)细菌抑制剂的性质。
需要理解的是可同一时间给予(i)和(ii),或以任何适当的顺序 在不同时间(连续地)给予，前体是根据确定的治疗方案给药。
需要理解的是确定的治疗方案将取决于特定的分枝杆菌并且应被 设计为强调例如抗药性尤其是多重抗药性这样的因素。因此该方案可 包括使用 一种或多种附加治疗药剂。
该确定的治疗方案可适当包括一个或多个起始阶段及一个或多个 持续阶段。
对于结核病，各起始阶段可涉及但不限于四种药剂，例如利福平 (作为RNA聚合酶抑制剂)、异烟肼、吡嗪酰胺和ALS抑制剂。各 起始阶段可持续约8周并涉及每日给药(例如总共约56个剂量)或每 周给药5次(例如约40个剂量)。通常仅使用一个起始阶段。
各持续阶段可仅涉及两种药剂例如利福平和ALS抑制剂并且持续 约18-31周。剂量总数(每药剂)取决于所使用的药剂。通常仅使用一 个持续阶段。
我们在下文的参考实施例1中列出了用于由药物敏感性有机体引 起的培养阳性肺结核的用药方案。
可使用任何适当的RNA聚合酶抑制剂。这可为利福平或其衍生物 例如利福霉素及其书f生物如利福喷丁 、利福布汀和其它抑制剂。例如
5见WO-03/084965、 WO-04/005298和Lounis N & Roscigno G.利福霉 素衍生物对分枝杆菌感染的体外和体内活性("In vitro and In vivo activities of rifamycin derivatives against mycobacterial infections"), 当 今制药(Curr. Pharm. Design ) , 2004,(10) 3229-3238。
可使用任何适当的ALS抑制剂。这可选自^黄酰脲类、咪唑啉酮类、 三唑嘧啶类、嘧啶基-氧基-苯甲酸酯类、嘧啶基-硫代-苯类、4,6-二甲 氧基嘧啶类、吲哚酰基磺胺类、嘧啶基水杨酸类和磺酰甲酰胺类 (sulphonyl carboxamides)。夺'H口美国专利5998420 (Grandoni)或参考文 献"抑制支链氨基酸生物合成的除草剂(Herbicides inhibiting branched chain amino acid biosynthesis )"画Stetter, J. (ed) Springer-Verlag, Germany和其中的参考文献，及"农业化学品的合成和化学III (Synthesis and Chemistry of Agrochemicals III)" , 1992 - Don R. Baker、 Joseph G. Fenyes和James J. Steffens主编和其中的参考文献列出了适当 的ALS抑制剂。
磺酰脲化合物为用于本发明的特定化合物。
三唑嘧啶化合物为用于本发明的特定化合物。
需要理解的是本发明提供的协同组合可允许使用 一种或两种药剂
这比所使用组合中的一种或两种化合物的MIC少2-4倍。换而言之它 可能为实际MIC值的至多50%或至多25%的浓度。
因此在本发明的特定方面协同有效量的(i) RNA聚合酶抑制剂和 (ii) ALS酶抑制剂包含亚MIC浓度的(i)和(ii)之一或两者。
在本发明的另 一 方面我们提供施用于细菌或其环境的治疗药剂， 该药剂包含协同有效量的(i) RNA聚合酶抑制剂和(ii) ALS酶抑制 剂。
例如人或动物细菌感染的治疗药剂。
在本发明的另 一个方面我们提供了治疗人或动物细菌感染的方 法，其包括给予人或动物协同有效量的(i) RNA聚合酶抑制剂和(ii) ALS酶抑制剂。
本发明的 一 个独特优点为其可用于解决利福平抗性结核病的问 题。利福平最早在1972被作为抗结核药物使用并对结核分枝杆菌非常有效。由于其强效的杀细菌作用，利福平与异烟肼一起是短程化学疗 法的主要依靠。由于广泛使用，利福平抗性正不断增加并引起对短程
化学疗法中其它组分具有抗性的突变体的筛选从而导致MDR-TB。已 记录了在所有被调查的国家中对短程化学疗法中使用的所有药剂具有 单独药物抗性的菌株。据WHO报导，HIV和TB形成的致命组合导致 全世界13%的AIDS死亡。
由于ALS对于革兰氏阴性菌如鼻疽伯克氏菌(B.mallei)等是必需 的，本发明也可用于提供广谱活性。革兰氏阴性有机体的实例包括伯 克霍尔德氏菌属(Burkoldaria sp),例如鼻疽伯克氏菌；布鲁氏菌属 (Brucella sp),例如猪布鲁菌(B. suis );假单胞菌属(Pseudomonas sp ),例如铜绿々￡单月包菌(P.aeruginosa);奈瑟(氏)菌属(Neisseria sp ), 例^口、淋J求菌(N. gonorrhoeae )、月亩月莫炎奈瑟菌(N. meningitidis )等。
同时我们不希望被理论因素限制，我们认为所观察到的RNA聚合 酶和ALS抑制剂之间的协同作用具有潜在的生物学机制。这可能是由 于细胞代谢产物ppGpp的水平增加，该增加由ALS抑制和之后的氨基 酸耗竭引起的。据报导该细胞代谢产物ppGpp可调节RNA聚合酶的活 性。
基于上述内容我们设计了用于鉴定新的RNA聚合酶或ALS抑制 剂的方法。
因此在本发明的另一方面我们提供了鉴定ALS抑制剂的方法，该 方法包括将细菌与(i)浓度小于最低抑制浓度(MIC)的细菌RNA聚 合酶抑制剂和(ii)假定的ALS抑制剂接触，测定(i)和(ii)的联合抑制 活性并参考其对该细菌的任何抑制作用确立该待测化合物是否为抑制剂。
需要理解的是(i)和(ii)可同时或以任何顺序与细菌接触。通常将细 菌同时与(i)和(ii)接触。在上述方法中可使用任何适当的细菌，如上文
中提到的细菌。 一个用于该方法的特定菌林为结核分支杆菌H37Rv。 RNA聚合酶抑制剂的MIC可由可获得的数据或常规试验确立。 适当选择所使用的假定ALS抑制剂的浓度以得到其活性的有意指 示，例如与细菌RNA聚合酶抑制剂相比。所使用的适当浓度包括现今 在药物筛选方案中常规使用的浓度例如约lOpmol至100uM。 该鉴定方法可用于药学和农业化学领域。
7可使用任何小于MIC的适当浓度，前提是可将待测化合物的任何 协同作用与RNA聚合酶抑制剂的单独活性区分开来。实际使用的浓度 可能小于比如MIC的80%或75%,例如小于60%、 50%、 40%、 30% 或20%。特别的数值为小于50%或小于25%,例如小于25%。
需要理解的是任何抑制作用可能是由于ALS抑制之外的机制。需 进一步研究以确立实际的坤几制。这些研究可涉及作用才几制(MOA)或 酶抑制研究。
也需要理解的是任何抑制作用可能单独由假定的ALS抑制剂造 成。这可通过该鉴定方法的平行版本但是不含有RNA聚合酶抑制剂进 行监控。此外在不含假定ALS抑制剂的情况下进行该鉴定方法的平行 版本。这些平行方法作为对照。
可以以相似方式使用上述方法以鉴定新的RNA聚合酶抑制剂。 因此在本发明的另 一方面我们提供鉴定细菌RNA聚合酶抑制剂的 方法，该方法包括将细菌与(i)浓度小于最低抑制浓度(MIC)的ALS抑制 剂和(ii)假定的细菌RNA聚合酶抑制剂接触，测定(i)和(ii)的抑制活性 并参考其对细菌的任何抑制作用确定待测化合物是否为细菌RNA聚合 酶抑制剂。
上述有关鉴定ALS抑制剂方法的详细内容可类推于鉴定RNA聚 合酶的方法中。
现参考以下附图和实施例描述本发明，其中 实施例1
单独检测和与利福平联合检测磺酰脲ALS抑制剂和三唑嘧咬ALS 抑制剂。所使用的阳性对照为异烟肼和链霉素，二者被发现具有协同 作用。异烟肼(INH)和链霉素(Strep)的单独MIC分别为0.03和1.0吗/ ml。当联合使用时，这些数值分别降至0.0075和0.12i!g/ml(参考
图1 )。 这小了 4倍和8倍。
所使用的阴性对照为联合使用乙胺丁醇(Etham)和异烟肼(Inh), 二者无协同作用。当一起检测时其单独MIC 0.5和0.03不会显著降低 (图2),见Isenberg, Henry. D.编,临床微生物学操作手册(Clinical Microbiology Procedures Handbook ) , 1-2巻，Washington D.C; 美国 微生物学协会(American Society for Microbiology ) /1992; 5.18.1-5.18.28页。该结果显示出明显的协同作用；图3显示了具有ALS抑制活性的 利福平和磺酰脲化合物(SU)的单独MIC为0.03和0.25吗/ml。当联 合使用时，这些MIC分别降至0.0038和0.03ug/ml,对于两个药物而 言均小了 8倍。
图4显示了具有ALS抑制活性的利福平和三唑嘧啶化合物(TP)的 单独MIC分别为0.015和0.5ug/ml。当联合使用时，这些MIC降至0.0038 和0.03ug/ml，对于两种药物而言小了 4倍和8倍。
实施例2
筌定分枝杆菌RNA聚合酶或ALS抑制剂的方法。
在微量滴定板中进行细菌学筛选，每个板筛选20-25个化合物。使 用阿尔玛蓝测定法(Franzblau, S. G.等.1998. J. Clin. Microbiol. 36: 362-366 )进行筛选，其在7天后给予结果。
选择已知的ALS抑制剂并用于筛选假定的RNA聚合酶抑制剂。 可以0.5 &或0.25x MIC的固定浓度使用已知ALS抑制剂。在2个浓 度即10和100 uM筛选假定的RNA聚合酶抑制剂。进行三组试验
1 )单独与MIC和亚MIC浓度的ALS抑制剂，其也将作为阳性对照。
2)单独与10和lOOum的未知化合物以检测固有抑制活性，如果 存在的话。
3 ) 10和lOOum浓度的假定的RNA聚合酶抑制剂与0.5和0.25x MIC浓度的ALS抑制剂一起。筛选与亚MIC浓度的ALS抑制剂联合 使用显示出抑制作用或与ALS抑制剂联合使用增强抑制作用的化合物 用于进一步分析。
使用已知RNA聚合酶抑制剂例如利福平和假定的ALS抑制剂重 复该相同的方法。
参考实施例1:
用于由药物敏感有机体引起的培养阳性肺结核的药物方案 方案1 (起始阶段)
药物异烟肼(INH);利福平(RIF);吡嗪酰胺(PZA);乙胺丁醇 (EMB)
间隔和剂量(最短疗程)每周(wk)七日56个剂量(8 wk)或5曰/ 周(d/wk)40个剂量(8wk)方案la(持续阶段) 药物INH/RIF
间隔和剂量(最短疗程)每周七日126个剂量(18 wk)或5曰/周 90个剂量(18 wk)
总剂量范围(最短疗程)182-130 (26 wk) 评定(依据)HIV-: A (I); HIV+: A (II) 方案lb(持续阶段) 药物INH/RIF
间隔和剂量(最短疗程)每周两次36个剂量(18wk) 总剂量范围(最短疗程)92-76 (26 wk) 评定(依据)HIV國:A (I); HIV+: A (II) 方案lc(持续阶段) 药物INH/RPT
间隔和剂量(最短疗程):每周一次18个剂量(18wk) 总剂量范围(最短疗程)74-58 (26 wk) 评定(依据)HIV-: B (I); HIV+: E (I) 方案2(起始阶段) 药物INH、 RIF、 PZA、 EMB
间隔和剂量(最短疗程)每周七日14个剂量(2 wk),然后每周 两次12个剂量(6wk)或5日/周IO个剂量(2wk),然后每周两次12 个剂量(6wk)
方案2a(持续阶段)
药物INH/RIF
间隔和剂量(最短疗程))每周两次36个剂量(18wk) 总剂量范围(最短疗程)62-58 (26 wk) 评定(依据)HIV画:A (II); HIV+: B (II) 方案A(持续阶段) 药物INH/RPT
间隔和剂量(最短疗程)每周一次18个剂量(18wk) 总剂量范围(最短疗程)44-40 (26 wk) 评定(依据):HIV-: B (I); HIV+: E (I) 方案3(起始阶段)药物INH、 RIF、 PZA、 EMB
间隔和剂量(最短疗程)每周三次24个剂量(8wk) 方案3a(持续阶段) 药物INH/RIF
间隔和剂量(最短疗程)每周三次54个剂量(18wk) 总剂量范围(最短疗程)78 (26 wk) 评定(依据)HIV-: B (I); HIV+: B (II) 方案4(起始阶段) 药物INH、 RIF、 EMB
间隔和剂量(最短疗程)每周七日56个剂量(8 wk)或5日/周40 个剂量C8wk)
方案4a(持续阶段) 药物INH/RIF
间隔和剂量(最短疗程)每周七日217个剂量(31 wk)或5日/周 155个剂量(31 wk)
总剂量范围(最短疗程)273-195 (39 wk) 评定(依据)HIV-: C (I); HIV+: C (II) 方案4b(持续阶段) 药物INH/RIF
间隔和剂量(最短疗程):每周两次62个剂量(31wk) 总剂量范围(最短疗程)118-102 (39 wk) 评定(依据)HIV-: C (I); HIV+: C (II)
权利要求
1. 一种杀死细菌或控制细菌生长的方法，该方法包括向细菌或其环境应用协同有效量的(i)RNA聚合酶抑制剂和(ii)ALS酶抑制剂，藉此杀死细菌或控制细菌的生长。
2. 权利要求1的方法，其中所述RNA聚合酶抑制剂为利福平或 其衍生物。
3. 权利要求l的方法，其中所述ALS酶抑制剂为磺酰脲化合物。
4. 权利要求1的方法，其中所述ALS酶抑制剂为三唑嘧啶化合物。
5. 上述权利要求中任一项的方法，其中以特定药剂的亚MIC浓 度应用(i)和(ii)之一或两者。
6. 权利要求5的方法，其中以不多于特定药剂50%的亚MIC浓 度应用(i)和(ii)之一或两者。
7. 上述权利要求中任一项的方法，其中所述细菌为分枝杆菌。
8. 权利要求7的方法，其中所述分枝杆菌选自结核分枝杆菌、鸟 分枝杆菌、胞内分枝杆菌或麻风分枝杆菌。
9. 权利要求7的方法，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌或其抗 药菌抹。
10. 权利要求7的方法，其中所述分枝杆菌为多重抗药性结核分 枝杆菌。
11. 权利要求7的方法，其中所述分枝杆菌为利福平抗性结核分 枝杆菌。
12. 用于给予细菌或其环境的治疗药剂，该药剂包含协同有效量 的(i)RNA聚合酶抑制剂和(ii)ALS酶抑制剂。
13. 权利要求12的治疗药剂，其中所述RNA聚合酶抑制剂为利 福平或其衍生物。
14. 权利要求12的治疗药剂，其中细菌ALS酶抑制剂为磺酰脲 化合物。
15. 权利要求12的治疗药剂，其中细菌ALS酶抑制剂为三唑嘧 咬化合物。
16. ^l利要求12-15 4壬一项的治疗药剂，其中以特定药剂的亚MIC浓度提供(i)和(ii)之一或两者。
17. 权利要求16的治疗药剂，其中以不多于特定药剂50%的亚 MIC浓度提供(i)和(ii)之一或两者。
18. 权利要求12-17中任一项的治疗药剂，用于治疗人或动物细菌感染。
19. 治疗人或动物细菌感染的方法，其包括给予人或动物协同有 效量的(i)RNA聚合酶抑制剂和(ii)ALS酶抑制剂。
20. 鉴定ALS抑制剂的方法，该方法包括将细菌与(i)浓度小于最 低抑制浓度(MIC)的细菌RNA聚合酶抑制剂和(ii)假定的ALS抑制剂 接触，测定(i)和(ii)的联合抑制活性并参考对细菌的任何抑制作用确 定待测化合物是否为抑制剂。
21. 鉴定细菌RNA聚合酶抑制剂的方法，该方法包括将细菌与(i) 浓度小于最低抑制浓度(MIC)的ALS抑制剂和(ii)假定的细菌RNA聚 合酶抑制剂接触，测定(i)和(ii)的抑制活性并参考对细菌的任何抑制作 用确定待测化合物是否为细菌RNA聚合酶抑制剂。
全文摘要
用于给予细菌或其环境的治疗药剂，其包含协同有效量的(i)RNA聚合酶抑制剂和(ii)ALS酶抑制剂。
文档编号C12N1/00GK101443443SQ200780017084
公开日2009年5月27日 申请日期2007年5月9日 优先权日2006年5月11日
发明者M·巴尔加尼什, S·南丹 申请人:阿斯利康(瑞典)有限公司