专利名称：用于鉴定新的味觉细胞基因和咸味受体靶标的原理、方法和测定以及使用这些鉴定基因 ...的制作方法
技术领域：
本发明在其宽的实施方案中鉴定一组新的基因，其在化学感觉或 更多特异的味觉细胞，例如小鼠轮廓(circumvallate)味觉细胞，以 及可能来源于其它哺乳动物如人类和非人类灵长类动物的味觉(例如 轮廓的)细胞中特异表达。因为这些基因在味觉细胞中的特异表达， 所以它们在此相当于"味道-特异的"基因。然而，这些味道-特异基 因包括直接或间接地涉及味道检测和调节如有咸味、鲜味、甜味、酸 味、油脂味、金属味或苦味传感的基因以及包括涉及生物学功能而不 直接与味道检测如消化的调节、味觉细胞更新、免疫系统特别是口腔 调节、以及如碳水化合物代谢、糖尿病、肥胖病、恶病质、消化期间 食物检测等的新陈代谢调节相关的基因。
与上述相关的本发明提供了一组新的基因，其在小鼠化学感觉(例 如小鼠轮廓味觉细胞)中特异表达，在舌细胞中不表达或显著地低表 达，所述基因用于筛选检测法，优选高流通量筛选检测法以鉴定直接 或间接调节不同味道形式如咸味、鲜味、甜味、酸味、油脂味或金属 味的化合物。
进一步地，与上述相关的本发明提供了一组新的基因和相应基因 产物或表达改基因的细胞，其用于筛选检测法，优选高流通量篩选检测法以鉴定化合物，所述化合物例如用作消化系统病症如癌症和自身 免疫病症的治疗中的治疗剂，用于调节味觉细胞凋亡或味觉细胞更新， 用于诱导味觉细胞再生，用于影响口腔中免疫的调节和例如治疗糖尿 病、肥胖病、进食障碍和其它代谢失调中的新陈代谢调节。 此外，与上述相关的本发明提供了一组新的基因，其用 于鉴定和/或分离和/或富集味觉或化学感觉细胞的特异类型或谱系， 例如涉及特异味觉形态、口腔中免疫系统调节、味觉细胞凋亡或味觉 细胞更新、味觉细胞再生、消化系统调节和新陈代谢调节的味觉或化 学感觉细胞，这些细胞有助于食物检测、涉及饥饿感和消化的激素或 酶的分泌等。 进一步地，本发明涉及这些分离的化学感觉或味觉细胞 在筛选检测法中用于鉴定调节味觉的化合物以及在鉴定调节免疫系统 的治疗剂中的用途，特别是口腔免疫内环境平衡的调节、味觉细胞凋 亡的调节、更新或味觉细胞再生和增殖、涉及消化的激素或酶及其它 味觉细胞功能的调节、消化系统病症如口腔或消化系统癌症、自身免 疫或炎性消化障碍的治疗、糖尿病、肥胖病、进食障碍或其它代谢失 调等的治疗。 更具体地说，本发明提供了分离、纯化和标记想得到的 味觉细胞类型和味觉包括如鲜味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、 金属味的细胞镨系以及包括分化成味蕾细胞、味觉细胞神经元、味觉
免疫细胞等细胞的味觉干细胞和其它味觉细胞谱系的方法，这些细胞 基于一种或多种在此提供的味觉特异基因的表达。这些分离和提纯法 包括阳性和阴性细胞分离法。例如通过阳性细胞选择方法分离，如通 过使用荧光激活细胞分选(FACS)，磁珠细胞选择如通过目视鉴定想 得到的细胞如通过使用电生理学抗体包被小球的个体转染细胞来分离 想得到的细胞i普系活类型。另外地，通过阴性细胞纯化和隔离法可以 回收或纯化想得到的味觉细胞谦系或类型，其中通过除去一个或多个 不想要的细胞镨系，从混合细胞群体中富集或纯化想得到的细胞类型， 例如通过接触包含想得到的味觉细胞和不想要的味觉细胞的混合细胞群体于对靼基因特异的细胞毒素的抗体接触，所述靶基因在将被除去 的不想要的味觉细胞类型上表达。
本发明还涉及标记物的用途，例如对一个或多个目标味
觉特异基因在舌和口腔映射区域特异性的抗体或低聚核苷酸，其涉及 特异性味觉和非特异性功能，胃肠道和表达特异性味觉特异基因的相 关器官特异性区域的映射，因此其涉及一个或多个在此公开的味觉细
胞特异性功能，和/或在味觉细胞分化研究中目标基因的用途，例如用 于鉴定诱导味觉干细胞和其它多能性或未成熟细胞类型分化为想得到 的味觉细胞语系和味觉细胞类型的化合物。 更具体地说，本发明涉及鉴定和表征新的味觉特异基因 (包括起咸味受体靶标作用的那些基因)的新的原理、方法和测定(包 括电生理学的测定)。本发明还涉及鉴定如咸味增强剂的调节剂和调 节人类咸味感觉的用途，以及用于治疗或预防与钠转运和吸收如高血 压、低血压、体液滞留、心脏病和中风有关的病症。
背景技术：
上皮钠通道(ENaC)是离子通道ENaC/退化蛋白家族的 成员，其包括哺乳动物中酸敏感离子通道(ASIC)、蜗杆中机械敏感 性退化蛋白通道和软体动物中FMRF-肽酰胺门控通道(Kellenger， S. and Schild， L. ( 2002 ) Physiol. Rev. 82: 735-767 ) 。 ENaC介导 氨氯吡嗪脒敏感性顶膜Na+通过许多组织包括肾、结肠和肺的高阻力上 皮转运。 已知ENaC是异源三聚体通道，其由oc 、 P和y亚基或△、 13和Y亚基组成。该异源三聚体通道已推定涉及人类咸味感知。通过 现在的受让人使用ENaC序列发展先前的测定法鉴定化合物，如果这些 化合物潜在地调节人类咸味感知，那么调节A P Y和oc p y人类 ENaC以检验。同时，这些化合物潜在地可能用来治疗包含异常ENaC 功能的人类病变。 不同于其它哺乳动物，已经报道氨氯吡溱脒仅仅轻微地 降低氯化钠味觉的强度，即当使用在浓度为约15-20%氯化钠特异性调
20节ENaC功負巨(Halpern， B. P. ( 1998 ) Neuroscience and Behavioral Reviews. 23: 5-47 )。通过发明人实施试验已显示了当高于cc P y ENaC水平300倍(对于氨氯吡溱脒)和3000倍(对于benzami 1 ) IC5Q 值时(相当于高于A P Y ENaC ICs。值10倍(对于氨氯吡溱脒)和 100倍(对于benzamil))，氨氯吡溱脒或更有效的氨氯吡溱脒衍生 物phenamil不会引起人类咸度察觉显著的影响。因此，其它非ENaC 基因可能涉及人类咸味。 此外，最近已有报道说味觉受体可以在非口腔组织如在 消化系统和潜在其它的器官如肾中表达。特别是巳有报道说甜味、苦 味和鲜味味觉受体在除了 口腔如胃肠细胞的细胞中表达(参见如 Sternini 等人，Amer J Physiol. Gastrointestinal and Liver Physiology, 292: G457-G461, 2007; Mace， 0. J. et al， J. Physiology. 10:1113〃. Physiol. 2007.130906. Publ ished onl ine May 10， 2007 )。此外，很可能咸味受体在泌尿道中表达。基于上述， 味觉受体推定涉及不直接与品尝功能如消化功能如口腔或消化道的胃 动力、吸收、食物检测、代谢功能和免疫调节相关的功能，并且同时 可能影响与钠吸收、排泄和转运如血压和体液滞留相关的功能。因此，
助于更好理解这些味觉受体的其它非味觉功能，以及也有利于这些基 因、基因产物和表达该基因的细胞在用于鉴定新的治疗剂如为了治疗 消化性疾病如自身免疫、炎症和癌症、代谢作用、糖尿病、进食障碍、 肥胖病、味觉细胞更新、高血压、体液滞留和消化系统的免疫调节测 定中的用途。 发明简述和目标 在一个实施方案中本发明涉及在化学感觉或味觉细胞特 别是小鼠轮廓细胞和可能在其它的哺乳动物如人类和非人类灵长类动 物味觉细胞中特异性表达的一组新基因的鉴定。这些基因包括直接或 间接地涉及特异性味觉范畴如咸味、甜味、苦味、鲜味、酸味、油脂
21味和金属味和/或在调节味觉强度和持续时间中的检测。 在另一个实施方案中，本发明涉及一组新的基因，其在 化学感觉或味觉细胞特别是小鼠轮廓细胞和可能在其它化学感觉活味 觉细胞中和来源于其它的哺乳动物如人类和非人类灵长类动物类似细 胞中特异性表达，其涉及其它的味觉细胞功能包括举例来说为味觉细 胞凋亡或味觉细胞更新、味觉细胞再生、消化、口腔中免疫系统的调 节、碳水化合物的调节或与消化、食物检测、味觉细胞运输等有关的 其它的代谢功能。 在另一个实施方案中，本发明进一步涉及在小鼠或其它 的哺乳动物味觉细胞特异表达的特异基因或基因产物的鉴定，其用作 鉴定、分离或富集特异性味觉细胞亚类或味觉细胞谱系的标记物，举 例来说包括甜味、鲜味、酸味、苦味、咸味、油脂味和金属味觉细胞， 以及用于分离涉及非味觉功能如免疫调节的味觉细胞，例如在口腔中 消化或代谢功能的调节、味觉细胞凋亡、更新或味觉细胞分化和增殖 的调节和钠排泄、转运和吸收的调节。 在另一个实施方案中，本发明进一步涉及这些味觉细胞 特异基因或基因产物或所述分离或富集的味觉细胞谱系或味觉细胞类 型在表达所述味觉细胞特异基因的用途，其用于筛选检测法中例如为 了鉴定引起调节甜味、酸味、鲜味、咸味、苦味、油脂味或金属味的 化合物，以及这些基因、基因产物或分离或富集味觉细胞的用途，其 用于鉴定如治疗不同的消化系统病症如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、 乳糜泻、消化不良、消化系统癌症的潜在治疗化合物、用于调节^^未觉 细胞更新或凋亡或为用于如在患有癌症或经历化疗或辐射的老年患者 或个体中调节味觉细胞分化和再生的化合物、用于调节或提高口腔免
疫系统化合物、用于消化和代谢功能调节的化合物如影响消化液、激 素或酶如唾液、胃和小肠液、GLP-1 (胰高血糖素样肽1) 、 GIP (葡 萄糖依赖性胰岛素释放多肽)、胰泌素、淀粉酶等产生的化合物、影 响消化动力的化合物、用于治疗糖尿病的化合物、用于调节食物检测 和用于治疗肥胖病或进食障碍、恶病质等化合物的鉴定。
本发明进一步提供分离、纯化和标记想得到的味觉细胞 类型和味觉细胞镨系如鲜味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、金 属味以及味觉千细胞和其它包含分化成味蕾细胞、味觉细胞神经元、 味觉免疫细胞等的细胞的不成熟和成熟的味觉细胞镨系，基于在此提 供的一种或多种味觉特异基因表达或未表达。这些分离和提纯法包括 两种阳性和阴性细胞分离方法。例如通过阳性细胞选择方法可以分离 想得到的味觉细胞谱系或类型，如通过利用焚光激活细胞分选(FACS ), 磁珠细胞选择如通过目视鉴定想得到的细胞如通过使用电生理学抗体 包被小球的个体转染细胞。另外地，通过阴性细胞纯化和隔离法可以 回收或纯化想得到的味觉细胞镨系或类型，其中通过除去一个或多个 不想要的细胞谱系，从混合细胞群体中富集或纯化想得到的细胞类型， 例如通过使包含想得到的味觉细胞和不想要的细胞的混合细胞悬浮夜 (例如，来自舌、口腔或肠胃道和相关器官)与对靶基因特异的细胞 毒素抗体接触，所述靶基因在将被除去的不想要的味觉细胞类型上表 达。 本发明还涉及标记物的用途，例如对一个或多个目标味 觉特异基因在舌和口腔映射区域特异性的抗体或低聚核苷酸，其涉及 特异性味觉和非特异性功能，胃肠道和表达特异性味觉特异基因的相 关器官(例如，肠上表皮细胞或尿道)特异性区域的映射，因此其涉 及一个或多个在此^S开的味觉细胞特异性功能，和/或在味觉细胞分化 研究中目标基因和对该基因特异性的标记物的用途，例如用于鉴定诱 导味觉细胞例如成熟和胚胎千细胞和其它多能性或未成熟细胞类型分 化为想得到的味觉细胞镨系和味觉细胞类型的化合物。 本发明在其更特异性实施方案中涉及新的原理和方法， 以及迄今为止使用这些原理和方法鉴定和表征基于不同参数构造盐受 体靶标的新味觉特异基因的结果。使用这些规程的靶标在高通量筛选 工作鉴定人类咸味增强子中是有用的靶标。使用两种不同的技术、基 因芯片和聚合酶链式反应(PCR)筛选鉴定这些乾标，以鉴定新的盐受 体靶基因。第一，包含大多数已知的小鼠基因的基因芯片微阵列技术
23用来测定通过激光捕获显微分离技术分离小鼠舌后和非舌上皮细胞的
轮廓乳头味觉细胞中哪些基因特异性表达。第二， PCR用来测定从我 们已经收录在人类/小鼠基因组中339通道的哪些离子通道在人类/小 鼠轮廓(CV)乳头味觉细胞而不是通过激光捕获显微分离技术分离的 舌上皮细胞中特异性表达。通过任一方法鉴定基因的味觉特异性表达， 由使用独立的组织学方法如原位杂交或免疫组织化学确定以测定哪些 基因在味觉细胞中表达。使用双标记组织学方法确定哪些新的味觉特 异基因在表达味觉特异性离子通道TRPM5的甜味、苦味和鲜味味觉细 胞、表达味觉特异性离子通道PKD2L1/PKD1L3的酸味味觉细胞或不表 达TRPM5或PKD2L1/PKD1L3的异常细胞类型中表达。味觉特异基因， 优选离子通道，即通过钠离子传导性或激活，并在TRPM5和 PKD2L1/PKD1L3阴性细胞群体中表达，为筛选工作以鉴定编码哺乳动 物咸味受体的基因的极有希望的待选物，以及特异性细胞类型其中这 些咸味受体基因如在口腔和泌尿道中表达，以及在设计为高通量测定 中鉴定人类咸度增强剂的使用。 虽然我们的工作已经集中于鉴定可能构造盐受体靶标的 新离子通道，我们认识到盐受体靶标可以包括另一个蛋白类型如转运 蛋白、G蛋白偶联受体(GPCR)或未知跨膜蛋白。因此，我们还包括 在我们分析法中具有超过一个跨膜结构域的膜蛋白。因为甜味、苦味、 鲜味和酸味受体是具有多重跨膜结构域的所有跨膜蛋白，我们据理说 明其它的味觉受体包括盐受体也将是具有多重跨膜结构域的蛋白。 同时，如上讨论推定它在我们研究期间是合理的，虽然 这些试验的焦点是鉴定新的盐受体靶标，但还鉴定了涉及其它味觉范 畴(例如酸味、涩味、质感、油脂味、金属味等)的其它味觉特异基 因。因此，通常在此鉴定的影响盐感觉的新味觉特异性基因(和可能 由此影响其它生物学的活性如钠吸收、转运和排泄及其影响如体液滞 留和血压调节)可以另外地影响其它的味觉范畴和滋味感觉。另外， 虽然这些试验的焦点在于鉴定新的盐受体靶标，很可能在我们研究期 间但还鉴定了其它^^未觉特异性基因。因此，在此鉴定的新味觉特异性基因能可用作味蕾或味觉受体细胞类型包括甜味、苦味、鲜味、酸味 以及咸味细胞的特异性标记物，并且鉴定的味觉特异性基因可以是用 于调节甜味、苦味、鲜味、酸味和咸味的乾标。另外，当设计目标测定法以鉴定可能的盐受体靶标时， 更有可能的是这些方法已经鉴定涉及上述讨论到的非味觉生物学功能 的味觉特异性基因。因此，这些新的味觉特异性基因和它们的相应基 因产物应当用于分离新的味觉细胞亚类或味觉细胞i瞽系。此外，这些 味觉特异性基因或相应基因产物或表达该基因的细胞(例如表达这些 味觉细胞特异性基因的分离或富集的内源性味觉或化学感觉细胞)， 可用于治疗剂筛选检测法中，如用于鉴定治疗消化系统病症如消化性 癌症、自身免疫和炎性消化障碍如渍疡性结肠炎、消化不良、克罗恩 氏病、乳糜泻、炎性肠综合症、憩室炎等中的治疗剂、用于调节味觉 细胞凋亡和味觉细胞更新、用于诱导味觉细胞再生如在老年病、遭受 化疗或辐射的癌症病人或个体、用于调节口腔的免疫系统、用于调节 消化粘液和流体、酶或激素如GLP-1 (胰高血糖素样肽1) 、 GIP (葡 萄糖依赖性胰岛素释放多肽)、淀粉酶、唾液、胃酸、小肠液、胃朊 酶、胰泌素等；用于治疗糖尿病、进食障碍、恶病质和其它包括这些 基因和/或分离或富集味觉细胞的代谢失调。 更特别地是本发明涉及味觉特异性基因的发现，其可能 在味觉细胞生长和凋亡、味觉细胞再生、调节味觉细胞受体表达的转 录因子的调节、调节往返于顶膜/味孔区域运输的味觉受体、调节味觉 细胞作用电位放电频率/膜电位以控制特异性味觉强度和/或调节特异 性味觉、神经递质释放至调节味觉强度或特异性味觉的传入神经，以 及传信号至神经纤维的味觉细胞等中起作用。
本发明还进一步涉及在味觉细胞(这些味觉细胞为如在 消化道和口腔、舌等中)，如胃肠细胞或口腔细胞中特异性表达的味 觉特异性基因的发现，以及这些基因、基因产物或表达该基因的细胞 用于鉴定特异性结合这些基因或调节这些基因活性的化合物的用途， 这些化合物可用来治疗或预防包括消化功能上的病理学症状。举例来
25200 说这些病症包括机能性消化不良(消化不良)和其它消化不良，其可 能或不可能是源于或与溃疡相关，可以包括消化道如上腹腔、中腹腔 或下腹腔的不同区域。 本发明进一步地提供在味觉细胞如咸味鲜味味觉细胞中 特异性表达的基因，这些基因、基因产物或表达该基因的细胞(例如 源于胃肠或口腔的味觉细胞)，可以用于筛选以鉴定可能用来治疗或 预防包括涉及消化或饥饿的胃肠液、粘液、酶或激素如促胃液素、胰 泌素、胃朊酶、缩胆嚢素、胰高血糖素样肽l (GLP-1)、淀粉酶、脑 肠肽、瘦素等的病理学症状的化合物。同时这些化合物可以提高唾液 或其它消化粘液分泌和流体的产生。这些化合物潜在地可用来抑制或 诱导饥饿感和/或调节所需要患者中的消化。 进一步地因为本发明鉴定在味觉细胞如咸p未、甜味、苦 味、酸味或鲜味味觉细胞中特异性表达的基因。本发明还涉及这些基 因、基因产物或表达该基因的细胞(例如但不限于味觉细胞，如源于 胃肠或口腔的细胞)，在筛选中鉴定结合这些基因或基因产物或调节 这些基因或基因产物活性或数量的化合物的用途，这些化合物潜在地 可用来治疗或预防病理性或慢性炎症或自身免疫胃肠症状如克罗恩氏 病、炎性肠综合症(IBD)、乳糜泻、溃疡性结肠炎、憩室炎、胃炎、 反流性食管炎等。这些化合物潜在地可用来治疗或预防影响消化系统 的自身免疫或炎性疾病。 同时，因为本发明提供在味觉细胞如鲜味、甜味、咸味、 苦味或酸味味觉细胞中特异性表达的基因，本发明进一步涉及这些基 因、基因产物或表达该基因的细胞(例如味觉细胞，如源于胃肠或口 腔的味觉细胞细胞)，在筛选中鉴定结合这些基因或基因产物或调节 这些基因或基因产物活性或数量的化合物的用途，这些化合物潜在地 可用来调节胃回流和相关的疾病或症状，如胃食管回流疾病、烧心、 Barrett氏食管和食管炎。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如咸味、甜味、苦味、 酸味或鲜味味觉细胞中特异性表达的基因。本发明进一步涉及这些基
26因、基因产物或表达该基因的细胞，在筛选中鉴定结合这些基因或基 因产物或调节这些基因或基因产物活性的化合物的用途，因此潜在地 可用来治疗或预防与消化系统相关的癌症或恶性胂瘤，举例来说如舌 癌和口腔癌如味蕾癌和唾液腺癌、胃、食管、小或大肠、肛门或直肠、 胰腺、胆嚢、肝、直肠或结肠癌。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如咸味、甜味、苦味、 酸味或鲜味味觉细胞中特异性表达的基因。本发明进一步涉及这些基 因、基因产物或表达该基因的细胞，在篩选中鉴定结合这些基因或基 因产物或调节这些基因或基因产物活性的化合物的用途，这些化合物 潜在地可用来治疗或预防与食欲功能相关的障碍和症状，如肥胖、食 欲不振、贪食症和与之相关的恶病质。 同时，本发明涉及在此鉴定基因的用途，所述基因在味 觉细胞中特异性表达，以分离或富集特异性味觉细胞镨系或亚型，特 别是源于如舌、口腔或胃肠系统的味觉细胞，其表达这些味觉细胞特 异性基因的一种或几种。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞(如鲜味、甜味、酸 味、苦味或其它的味觉细胞类型)味觉细胞中特异性表达的基因，并 且因为味觉细胞在消化道和口腔、舌中，本发明进一步涉及这些基因、 基因产物或表达该基因的细胞(例如但不限于味觉细胞，如胃肠或口 腔的细胞)，在鉴定结合这些基因或基因产物或调节这些基因或基因 产物活性的化合物的用途，其可用来治疗或预防包括消化功能的病理 学症状。举例来说这些病症包括机能性消化不良(消化不良)和其它 消化不良，其可能或不可能是源于或与溃疡相关，可以包括消化道如 上腹腔、中腹腔或下腹腔的不同区域。 进一步因为本发明鉴定在味觉细胞如鲜味、甜味、酸味、 苦味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，本发明进一步涉及这些 基因、基因产物或表达该基因的细胞(例如但不限于如胃肠或口腔的 味觉细胞)，可以用于筛选以鉴定可能用来治疗或预防包括涉及消化 或饥饿的胃肠液、酶或流体涉及如促胃液素、胰泌素、胃朊酶、缩胆嚢素、葡萄糖依赖性胰岛素释放多肽、胰高血糖素样肽l (GLP-1)、 淀粉酶、脑肠肽、瘦素(leptin)等的病理学症状的化合物。这些化 合物潜在地可能用来抑制或诱导饥饿感和/或调节所需要患者中的消 化。 进一步因为本发明提供在味觉细胞如鲜味、甜味、酸味、 苦味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，本发明还涉及这些基因、 基因产物或表达该基因的细胞(例如但不限于如源于胃肠或口腔细胞 的味觉细胞)，在篩选中鉴定结合这些基因或基因产物或调节这些基 因或基因产物活性或数量的化合物的用途，这些化合物潜在地可用来 治疗或预防病理性或慢性炎症或自身免疫胃肠症状如克罗恩氏病、炎 性肠综合症(IBD)、乳糜泻、溃疡性结肠炎、憩室炎、胃炎、反流性 食管炎等。这些化合物潜在地可用来治疗或预防影响消化系统的自身 免疫或炎性疾病。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如鲜味、甜味、酸味、 苦味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，本发明进一步涉及这些 基因、基因产物或表达该基因的细胞(例如味觉细胞，如源于胃肠或 口腔的味觉细胞细胞)，在筛选中鉴定结合这些基因或基因产物或调 节这些基因或基因产物活性或数量的化合物的用途，这些化合物潜在 地可用来调节胃回流和相关的疾病或症状，如胃食管回流疾病、烧心、 Barrett氏食管和食管炎。 同时，因为本发明提供在味觉细胞如鲜味、甜味、酸味、 苦味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，本发明进一步涉及这些 基因、基因产物或表达该基因的细胞，在篩选中鉴定结合这些基因或 基因产物或调节这些基因或基因产物活性的化合物的用途，因此这些 化合物潜在地可用来治疗或预防与消化系统相关的癌症或恶性肿瘤， 举例来说如唾液腺和味蕾、舌、口腔、胃、食管、小或大肠、肛门、 胰腺、胆嚢、肝、直肠或结肠癌。 同时，因为本发明鉴定在涉及钠转运的味觉细胞如甜味、 鲜味、苦味、酸味、咸味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，这
28些基因、基因产物和表达该基因的细胞在筛选中可用于鉴定调节离子 转运或离子流动，特别是为了鉴定治疗化合物的钠离子的化合物，例 如该治疗化合物可以用于调节血压和体液滞留以及涉及异常的钠吸 收、排泄和转运的症状和疾病。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如甜味、鲜味、苦味、 酸味、咸味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，这些基因、基因 产物或表达该基因的细胞在筛选中可被用于鉴定调节味觉细胞的选择 性凋亡、调节控制味觉受体表达转录因子、味觉细胞生长的自分泌/ 旁泌性调节、味蕾寿命的化合物，筛选使用导致超级味觉 (supertaster)表型的基因，激活味觉干细胞的化合物，影响如从顶 膜/味孔区域运输的味觉受体的化合物，经由电位放电频率/膜电位调 节味觉细胞作用的控制影响味觉强度的化合物，调节神经递质释放至 传入神经的化合物，所述传入神经控制一般和特异性味觉强度，以及
味觉受体功能的自分泌/旁泌性调节。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如甜味、鲜味、苦味、 酸味、咸味或其它的味觉细胞中特异性表达的基因，这些基因、基因 产物或表达该基因的细胞在筛选中可被用于鉴定影响如在病态或老年 个体或损伤或手术后，患者遭受化疗或损伤后味觉细胞或味蕾的再生 的化合物，用于调节药物诱导的味觉障碍、味觉缺失、味蕾损害、口 干燥或举例而言在Sjogren氏综合症中发现的口腔干燥的化合物，以 及用于维持口腔卫生、治疗或预防口臭、有害口腔微生物如病毒和细 菌等的化合物。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如鲜味、甜味、苦味、 咸味、酸味、油脂味金属味等和其它味觉细胞谱系如干细胞、味觉细 胞神经元、免疫细胞等中特异性表达的基因，本发明还提供分离、纯 化、富集和标记想得到的味觉细胞类型和味觉细胞谱系的方法，包括 如鲜味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、金属味以及味觉干细胞 和其它味觉细胞谱系，包括在基于在此提供的一种或多种味觉特异性 基因的表达，分化成味蕾细胞、味觉细胞神经元、味觉免疫细胞等的
29细胞。这些分离和提纯法包括两种阳性和阴性细胞分离方法。例如通 过阳性细胞选择方法可以分离想得到的味觉细胞镨系活类型，如通过
利用荧光激活细胞分选(FACS)，磁珠细胞选择如通过目视鉴定想得 到的细胞如通过使用电生理学抗体包被小球的个体转染细胞。另外地， 通过阴性细胞纯化和隔离法可以回收或纯化想得到的味觉细胞i普系或 类型，其中通过除去不想要的细胞谱系，从混合细胞群体中富集或纯 化想得到的细胞类型，例如通过使包含想得到的味觉细胞和不想要的 细胞的混合细胞群体与对靶基因特异的细胞毒素抗体接触，所述靶基 因在将被除去的不想要的味觉细胞类型上表达。 同时，因为本发明鉴定在味觉细胞如鲜味、甜味、苦味、 咸味、酸味、油脂味、金属味等和其它味觉细胞谱系或类型如干细胞、 味觉细胞神经元、免疫细胞等中特异性表达的基因，本发明进一步涉 及标记物的用途，例如对一个或多个目标味觉特异基因特异性的抗体 或低聚核苷酸，所述基因在涉及特异性味觉和非特异性功能的舌和口 腔映射区域中，映射胃肠道和表达特异性味觉特异基因的相关器官特 异性区域，因此其涉及一个或多个在此^^开的味觉细胞特异性功能， 和/或在味觉细胞分化研究中目标基因的用途，例如用于鉴定诱导味觉
和味觉细胞类型的化合物。 更具体地说，如下文详细的描述，本发明提供了用于候 选咸味基因的原理和标准，优选一种离子通道，其显示 a)在味觉细胞和非舌细胞中特异性表达，或在味觉细胞 中比舌细胞更高水平的表达 b)通过组织学方法在味觉细胞中表达。具体地说，在不 表达甜味、苦味和鲜味味觉细胞标记物TRPM5或酸味味觉细胞标记物 PKD2L1/PKD1L3的异常味觉细胞类型中表达。该异常的细胞类型可以
是对咸味有贡献的敏感细胞。c)作为具有基本的、结构的功能的钠通道或钠激活受体 (即通道群体的一部分是开放的和在休息时通过钠离子)在异源的表达系统(如非洲爪蟾属卵细胞和哺乳动物细胞)或主要的神经元(如 脊神经后根神经节神经元)中功能性表达。 达到这些标准的基因将被提出进入高通量筛选工作以鉴 定增加人盐感觉的化合物。此外在此(例如，在上表1、 2和3中)报
道的味觉特异性基因，将在如前述治疗筛选中有用。 因此在本专利申请中，通常我们描述筛选检测法以鉴定 基因，其通常推定涉及咸味感觉以及味觉和其它味觉细胞介导的活性。 本发明的一个具体目标是鉴定味觉特异性基因，其编码 在味觉细胞和非舌细胞中特异性表达，或在味觉细胞中比舌上皮细胞 更高水平的表达的膜蛋白，在测试中使用基因芯片和/或PCR方法以及 使用同样的作为盐受体靶标来鉴定咸味调节剂，以及通常影响其它味 觉范畴和味觉感觉和味觉细胞相关生物学和细胞功能和味觉细胞相关 表型的化合物。 本发明的更具体目标是测定在味觉细胞中表达味觉特异 性基因，特别是甜味、苦味、和/或鲜味味觉细胞(TRPM5阳性)、酸 味味觉细胞(PKD2L1/PKD1L3阳性)或异常的细胞类型(TRPM5阴性) 中表达。这些异常的细胞类型可能包括对咸味感觉有贡献的细胞。本发明的另 一个目标是在特异性测试中使用这些基因鉴
定味觉特异性离子通道或味觉特异性基因的调节剂(增强剂)，因为 这些化合物可以调节人的咸味感觉。 本发明的特定目标是在此存在和没有推定的增强剂下， 提供测定在此鉴定的推定味觉离子通道的导电性电生理学测定。 本发明的另一个具体目标是在卵细胞表达系统中鉴定患 者推定咸味相关的离子通道和其它味觉影响基因的增强剂。 本发明的更具体目标是使用卵细胞提供膜片钳或二电极 电压钳测定，所述卵细胞表达了用于鉴定化合物的推定咸味受体离子 通道，所述化合物调节该通道的活性并因此调节了咸味。如下所述一 个或多个实施方案符合本发明的这些目标和其它目标。
31
发明简述 发明在其宽的实施方案中鉴定一组新的基因，其在化学 感觉，例如小鼠轮廓味觉细胞，以及可能来源于其它哺乳动物如人类 和非人类灵长类动的味觉(例如轮廓的)细胞中特异表达。这些基因 包括直接或间接地涉及味道检测和味道调节(如有咸味、鲜味、甜味、 酸味、油脂味、金属味或苦味传感)以及不直接与味道检测和味道调 节相关的功能的基因，如涉及调节消化和产生和消化液、粘液、酶和 激素如唾液、胃和小肠液、GLP-1 (胰高血糖素样肽1) 、 GIP (葡萄 糖依赖性胰岛素释放多肽)、胰泌素、胃朊酶等组分的基因；涉及血 压和体液滞留控制的基因，涉及味觉受体运输、味觉细胞更新和味觉 细胞再生的基因，涉及口腔和胃肠系统的免疫系统控制的基因，涉及 胃肠相关疾病如癌症、影响口腔和消化系统的炎性和自身免疫疾病的 预防和发作的基因，涉及调节新陈代谢如碳水化合物代谢、肥胖、进 食障碍的基因，涉及消化期间检测食物的基因等。与前述有关的本发明提供了一组新的基因，其在化学感 觉，例如小鼠轮廓味觉细胞中特异表达，在舌细胞中不表达或显著低 水平的表达，其用于筛选检测法，优选高流通量筛选检测法，用于鉴 定直接或间接地调节不同味觉形式如咸味、甜味、鲜味、苦味、酸味、 油脂味或金属味的化合物。 与前述有关的本发明提供了一组新的基因，其用于筛选 检测法，优选高流通量筛选检测法以鉴定化合物，所述化合物用作在 消化系统病症治疗中的治疗剂，用于调节味觉细胞凋亡或味觉细胞更 新，用于诱导味觉细胞再生，用于影响口腔或消化系统中免疫的调节， 在治疗糖尿病、肥胖病、进食障碍和其它代谢失调中的治疗剂。与前述有关的本发明提供了一组新的基因，其用于鉴定 和/或分离和/或富集味觉或化学感觉细胞的特异类型或谱系，例如涉 及特异味觉形态、口腔中免疫系统调节、味觉细胞凋亡或味觉细胞更 新、味觉细胞再生、消化系统调节和新陈代谢调节(例如通过在食物 检测、涉及饥饿感和消化的激素或酶的分泌等中有帮助)的味觉或化
32学感觉细胞。 进一步地，本发明涉及这些分离的化学感觉或味觉细胞 在篩选检测法中鉴定调节味觉的化合物的用途，以及在鉴定治疗剂的 用途，所述治疗剂用于调节口腔免疫系统调节、味觉细胞凋亡的更新、 味觉细胞再生、涉及消化的激素或酶或流体和粘液及其它味觉细胞功 能的调节，用于治疗消化系统病症，用于治疗糖尿病、肥胖病、进食 障碍或其它代谢失调等。 进一步地，本发明涉及分离、纯化和标记想得到的味觉 细胞类型和味觉细胞镨系的方法，所述味觉细胞类型和味觉细胞谱系 包括如鲜味、甜味、咸味、苦味、油脂味、酸味、金属味以及味觉千 细胞和其它味觉细胞谱系，包括分化为味蕾细胞、味觉细胞神经元、 味觉免疫细胞等细胞，基于一种或多种在此提供的味觉特异基因的表 达。这些分离和提纯法包括阳性和阴性细胞分离法。例如通过阳性细 胞选择方法分离想要的味觉细胞谱系或类型，如通过使用荧光激活细 胞分选(FACS)，磁珠细胞选择如通过目视鉴定想得到的细胞如通过 使用电生理学抗体包被小球的个体转染细胞。另外地，通过阴性细胞 纯化和分离法可以回收或纯化想得到的味觉细胞谱系或类型，其中通 过除去不想要的细胞谱系，从混合细胞群体中富集或纯化想得到的细 胞类型，例如通过使包含想得到的味觉细胞和不想要的细胞的混合细 胞群体与对耙基因特异的细胞毒素抗体接触，所述靶基因在将被除去
的不想要的味觉细胞类型上表达。 同时，本发明涉及标记物或探针如抗体或低聚核苷酸的 用途，其可以用可检测的标记物如放射性核素、荧光团、酶等标记， 这些标记物和探针对一个或多个患者味觉特异性基因是特异性的，如 在舌和口腔映射区域，包含涉及特异性味觉范畴如鲜味、甜味、苦味、 咸味、酸味、油脂味、金属味等的细胞，以及涉及非味觉特异性功能 如在此鉴定的细胞，胃肠道和包含表达特异性味觉特异基因的细胞的 相关器官的特异性区域的映射，因此其涉及一个或多个在此公开的味 觉细胞特异性功能，和/或在味觉细胞分化研究中目标基因的用途，例如用于鉴定诱导味觉细胞(例如成人或胚胎干细胞)和其它多能性或
物o 更具体地说，本发明涉及新的原理、方法和测定，其包 括鉴定和表征包括那些起咸味受体作用的新味觉特异性基因的电生理 学测定。 人们普遍相信，通过钠或其它的离子通道以及转运蛋白 和GPCR在味觉细胞中特异性表达可以部分地介导人咸味觉。因此，本 发明提供用于鉴定味觉特异性基因的方法，其包括使用基因芯片和 PCR方法的可调节咸味以及其它的味觉范畴和味觉细胞介导功能和表 型的基因。调节这些靶基因的鉴定化合物和它们的衍生物作为人消费 的食物、饮料和药物中人咸味觉的调节剂能潜在地被使用。同时，这 些化合物和它们的衍生物可潜在地用来治疗包括异常离子通道功能的 疾病。进一步，在此论述使用鉴定的基因和表达该基因的细胞鉴定化 合物在治疗剂篩选测定中是有用的，用于鉴定调节其它的味觉细胞相 关功能和显型的潜在治疗剂。 在一个方式中，本发明提供了在哺乳动物味觉细胞中用 于鉴定编码多肽基因的方法。该方法的一个实施方案包含步骤(i )鉴 定一组基因，其包括在味觉细胞但不在舌细胞中表达的基因，和/或在 味觉细胞中比在舌细胞中以更高水平表达的基因；(ii)鉴定在(i) 中鉴定的该组基因内的基因亚型，其不在表达鲜味、甜味或苦味受体 (T1R或T2R )或酸味受体PKD2L1/PKD1L3 )味觉细胞中表达；和("i ) 功能性表达根据(ii)鉴定亚型中的一个或多个基因并测定这些基因 的哪些作为钠响应度离子通道或钠响应度受体或转运蛋白的功能，由 此鉴定这个基因或这些基因作为调节咸味的推定基因。 一般地，用于 该方法的味觉组织源于人或鼠类。在该方法的一个优选的实施方案中， 在步骤(iii )功能中基因作为钠响应度离子通道等，优选当表达基因 时，通道群体的一部分在休息时开放和通过钠离子。在一个优选的实施方案中，步骤(i)包含激光捕获显微
34分离技术(LCM)从非味觉组织解剖和纯化味觉组织的用途。在该实施 方案的一个方式中，步骤(i)包含从味觉细胞和舌细胞基因的RNA 扩增，针对包含对从特定哺乳动物得到的味觉和舌组织特异性基因样 品的基因芯片筛选扩增的基因，并且优选包含有注解的(annotated)
哺乳动物基因组的基因芯片。在选择性的优选实施方案中，步骤U) 包含在哺乳动物基因组中各个离子通道使用引物的高流通量PCR。 在另一个优选的实施方案中，步骤(ii)通过原位杂交 进行，其使用对在步骤(i)鉴定的基因组(set of gene)特异性的 反义RNA探针，用以测定在味觉对比舌细胞中的表达水平。在一个可 选的优选实施方案中，步骤(ii )通过免疫化学检测应用来进行，该 检测使用对通过步骤(i)中鉴定的基因编码蛋白特异性标记抗体。 在用于鉴定涉及哺乳动物中咸味感觉多肽编码基因的方
法的另一个实施方案中，本发明的方法包含步骤(i )鉴定包括在味觉
细胞中表达基因的基因组，但没有在舌细胞和/或基因中表达，其在味
觉细胞中比在舌细胞中具有更高水平；(H)鉴定在(i)基因组鉴定
内的基因亚型，其没有在表达鲜味、甜味或苦味受体(T1R或T7R)或
酸味受体PKD2L1/PKD1L3)味觉细胞中表达；和(iii)根据(ii)鉴 定亚型中一个或多个基因功能性表达和测定这些基因的哪些作为钠响
应度离子通道或钠响应度受体或转运蛋白的功能，由此作为调节咸味 的推定基因鉴定这个基因或这些基因。在该实施方案的一个方式中， 步骤(iii )包含接触具有特异性结合基因和抑制其功能抗体的神经元。 根据如上所述任何一种方法的鉴定的基因不表达TRPM5 和PKD2L1/PKD1L3。在另一个方式中，通过才艮据上述方法测定一个细 胞是否表达一个鉴定基因，本发明提供了在选择的细胞中不表达 TRPM5和PKD2L1/PKD1L3的辅助方法。优选在该段落方法中使用的基 因是列于表1-3中的基因之一，其列出了在味觉细胞中味觉特异性基 因编码跨膜蛋白。因为所有已知的味觉受体基因用于甜味、苦味、鲜 味和酸味编码跨膜蛋白，所以工作集中于跨膜基因。在另一个方式中，本发明提供了用于鉴定具有调节人咸味体内潜在应用的一种测定法。该方法包含步骤(i)接触表达基因编 码离子通道、受体或转运蛋白的细胞，其被鉴定为根据上述一种方法 的推定咸味影响基因，或者是编码具有与由此使用至少一种推定的增 强剂化合物编码多肽相比至少90%序列同一性的多肽；(ii)在存在 和没有所述推定的增强剂下测定钠离子电导率、受体活性或钠离子转 运；和(iii)鉴定作为基于提高钠离子电导率、所述受体或钠离子转 运活性是否促进潜在咸味增强剂的化合物。在不同的实施方案中，基 因编码离子通道或基因编码GPCR。优选，该基因是人基因。更优选该 方法进一步地包括在人味觉试验中检测化合物或其衍生物的效果。优 选选择的化合物促进钠离子转运至味蕾细胞。推定的咸味影响基因可 以在两栖类卵母细胞或哺乳动物细胞，优选非洲爪蟾属卵细胞或选自 ■293、 HEK293T、 Swiss3T3、 CH0、 BHK、 NIH3T3猴子L细胞、非洲 绿猴子肾细胞、Ltk-细胞和COS细胞中表达。优选推定的咸味影响基 因在可调节启动子的控制下表达。可以稳定或短暂表达推定的咸味影 响基因。在一个优选的方式中，选自推定咸味影响基因的基因包含于 表1-3和它们的直向同源和变异体。 在一个优选的方式中，步骤(ii)的测定法是一种电生 理学测定法，其使用钠离子敏感染料，优选的染料包括膜电位染料， 选自分子装置膜电位试剂盒(Cat#-R8034 ) 、 二-4-ANEPPS (吡啶盐，4-(2- ( 6- ( 二丁基氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1- ( 3-磺丙基))氢氧 化物、内盐、DiSBACC4 ( 2)(双-(1， 2-二巴比妥酸)-三乙炔氧烯洛 尔(oxanol ) ) 、 Cc-2-證E (太平洋蓝1， 2-十四酰(dietradeca呵l ) -sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐)和SBFI-AM ( 1， 3-苯二羧 酸，4， 4-[1， 4/10-三氧杂-7， 13-噢唑十五烷(diazacylopentadecane ) -7， 13-二基双(5-甲氧基-6， 1，2-苯并呋喃二基)]双-四{(乙酰氧 基)曱基}酯(分子探针)，更优选钠离子敏感染料是四乙酸绿钠(分 子探针)或钠-敏感染料试剂盒(分子装置)。在另一个优选的方式 中，步骤(ii)的测定是在非洲爪蟾属卵细胞中的二电极电压钳测定， 或在哺乳动物细胞中膜片钳测定。优选该测定法通过离子流动测定法
36测定活性，包括使用原子吸收光谱分析检测离子流动。 另外地，该测定可以使用焚光板阅读器(FLIPR)或电压 成像板阅读器(VIPR),其用于增加离子通道依赖性钠离子或流体吸 收。在该方法优选的实施方案中，通过膜片钳或二电极电压钳在蛙卵 细胞电生理标测测定推定咸味影响基因的活性，优选使用荧光板阅读 器(FLIPR)或电压成像板阅读器(VIPR)的自动成像仪。 在又一个方式中，本发明提供了用于鉴定具有调节人甜 味、苦味、鲜味或酸味体内潜在应用的一种测定法。该方法包含步骤 U)用至少一个推定增强剂或阻断剂化合物接触表l-3中的基因或直
向同源基因或变异体表达的细胞；(ii)在存在和没有所述推定的增 强剂下测定钠离子电导率、受体活性或味觉基因产物功能；和(Ui) 鉴定作为甜味、苦味或鲜味味觉潜在增强剂或阻断剂的化合物，其基 于是否调节钠离子电导率、所述受体或味觉基因产物功能。 在又一个方式中，本发明提供了用于鉴定具有体内潜在 治疗应用化合物的一种测定法。该方法包含步骤(i)用至少一个推定 增强剂或阻断剂化合物接触表1-3中的基因或直向同源基因或变异体 表达的细胞；(U)在存在和没有所述推定的增强剂下测定钠离子电 导率、受体活性或味觉基因产物功能；和(iU)鉴定作为可能用来调 节味觉细胞相关功能或表型(不直接包括味觉)的潜在治疗法的化合 物，消化病症或疾病、味觉细胞或味蕾更新或再生、口腔或消化系统 的免疫调节或代谢紊乱如糖尿病、肥胖、进食障碍等的治疗基于它是 否调节钠离子电导率、受体活性或味觉基因产物功能。 附图简述
图1包含^f吏用人p木觉组织LCM的一个实施例。
图2包含人味觉和舌细胞的PCR质量控制的一个实施例。
图3包含高通量PCR筛选鉴定新的味觉特异性离子通道 的一个实施例。图4包含原位杂交和免疫化学組织学方法观察已知味觉基因味导素在小鼠或人味觉组织部分表达的一个实施例。 图5包含原位杂交和免疫化学组织学方法观察在小鼠或 人味觉组织部分TRPM5味觉基因表达的一个实施例。 图6:免疫组织化学法观察在小鼠味觉组织TRPM5味觉 基因表达的实施例。 图7:免疫组织化学組织学法观察在小鼠味觉组织 SCN3A/Nav1. 3钠通道基因表达的实施例。 图8:双标记免疫组织化学法阐明SCN3A和TRPM5在相 同味觉细胞中共表达的实施例。 图9:免疫组织化学法观察在小鼠味觉组织中PKD2L1味 觉基因表达的实施例。 图10:双标记免疫组织化学法阐明PKD2L1和TRPM5在 不同味觉细胞中共表达的实施例。图11包含双标记试验观察HCN4和TRPM5在分离小鼠CV
细胞中表达的实施例。图12包含双标记试验观察HCN4和PKD2L1在分离小鼠
CV ^^未觉细胞中表达的实施例。 图13包含双标记试验表明从小鼠CV味觉细胞味孔中排 除HCN4的实施例。 发明详述本发明涉及在味觉組织中特异性表达基因的鉴定，其通 常涉及推定为的涉及咸味或其它味觉范畴；或涉及味觉细胞相关功能 和表型，其不直接包括味觉如味觉细胞或味蕾再生和更新、口腔或消 化系统的免疫调节、消化或代谢功能的调节、消化系统病症如癌症、 自身免疫疾病和炎性症状如IBD、溃疡性结肠炎、Sjogren's综合症、
乳糜泻克罗恩氏病等的发病或防止和其通常在筛选鉴定调节咸味感觉 其它味觉范畴或味觉的用途，或用于鉴定在人类使用的潜在疗法。特 别地，本发明包括使用以下方法鉴定新的味觉特异性基因
381) 激光捕获显微分离(LCM)和RNA扩增法。在激光捕获显微分 离法中，使用精密的激光束从组织部分切开和纯化味觉细胞。该方法 分离味觉细胞，缺少转染舌上皮细胞和结締组织，并允许在高浓缩味 觉细胞群体上进行分子生物学试验。通过LCM分离相平行的舌上皮细 胞，并用作缺少味觉细胞的阴性对照。因为这些原始的技术产生味觉 和舌细胞非均匀混合物，其中味觉细胞包括1-20%收集的原料，所以 LCM便于手工操作或味觉乳头的酶切开。在非偏离模式中，RNA扩增法 通过LCM将分离的味觉细胞和舌细胞的总RNA扩增至1百万倍，以产 生足够的遗传物质进行分子生物学研究(基因芯片或PCR)。我们已 发现1300-2000个味觉细胞足以满足小鼠味觉組织的基因芯片试验， 5， 000个味觉细胞足以满足人味觉组织的PCR试验。
2) 基因芯片-基因芯片在微小的芯片上包含几乎所有标记的基 因。从味觉和舌细胞分离和扩增杂交的RNA至基因芯片上，可用于测
与舌细胞相比的味觉细胞中表达水平更高。
3 ) PCR-通过LCM从人/小鼠味觉和舌细胞分离的人/小鼠基因组 和扩增RNA，使用对各自离子通道有特异性的引物在96孔板中进行高 通量PCR。检测味觉细胞而不是舌细胞合适大小的产物，对该产物进 行DNA测序确定基因同一性以表明所关心的离子通道是味觉特异性 基因。
4 )原位杂交-对于个体基因(基因芯片或PCR鉴定)特异性的反 义RNA探针杂交至包含味觉细胞的组织切片上，以测定所关心基因的 mRNA转录物是否在味觉细胞、酸味、甜味、苦味和/或鲜味味觉细胞 或包含在咸味检测中异常细胞类型中表达。
5 )免疫组织化学-对于个体蛋白(通过基因芯片或PCR鉴定其基 因)特异性的抗体被用于包舍味觉细胞的组织切片上，以测定所关心
蛋白是否在味觉细胞、酸味、甜味、苦味和/或鲜味味觉细胞或包含在 咸味检测中异常细胞类型中表达。
39
RNA质量控制 使用两种方法测量RNA完整性。使用载有Series II RNA 6000 Pico Assay ( Cat#_5067-1514 )的Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies )确定RNA质量。在充足的28S核糖体RNA (rRNA)和18S rRNA镨带之间的比值合格。比值为2表明是高质量 RNA且没有降解。比值为-l表明部分RNA降解。当在室温下样品染色 和进行LCM，由于出现部分RNA降解，所以对于LCM样品比值在0. 5-1. 0 之间是普通的。此外确定RNA的完整数(RIN) 。 RIN值为IO表明是 高质量RNA且没有降解，RIN值为5表明部分RNA降解和RIN值为1 表明大量的RNA降解。RIN值〉5适用于基因芯片分析，对于LCM样品 是普通的。一般地，对于小鼠味觉组织样品来说28S/18S rRNA比值为~ l.O和RIN值为7-8，但对于人味觉组织样品来说28S/18S rRNA比值 为0. 5-1. 0和RIN值为5-6。 第二，用Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒(分子 探针，CatLR11490 )确定RNA数量。与染料结合的荧光RNA具有下至 lpg/ul的敏感度，用于测定在味觉和舌细胞样品中RNA的总数。对于 将味觉和舌RNA等量加入基因芯片和PCR试验来说RNA的精确定量是
重要的。2)基因芯片: 在5对小鼠CV味觉和舌样品使用Affymetrix 4302. 0 阵列实施基因芯片试验，并用GeneSpring GX v7. 3软件(Agilent Technologies)分析。通过LCM和各自样品纯化的总RNA单独分离在 1300-2000之间CV味觉和舌细胞。然后扩增和杂交RNA至基因芯片。 使用两种分离算法进行数据分析Affymetrix Microarray Suite 5 (MAS5)，其考虑了在基因芯片上理想的匹配和不匹配探针，和robust multi-chip algorithm ( RMA )，其仅仅考虑了在基因芯片上理想的 匹配和不匹配探针。在该分析中鉴定了味觉特异性基因编码跨膜蛋白。 3)^:在使用针对在人/小鼠基因组鉴定的所有3" 离子通道的引物进行高通量PCR之前，首先在多至4种已知的味觉特异性基因和2种看家基因上进行质量控制PCR反应以保证味觉和舌 RNA具有高质量。检验的4种已知的味觉特异性基因是G a蛋白味导 素、甜味受体组分T1R2、离子通道TRPM5和酶磷脂酶C同工型P 2; 检验的2种看家基因是P肌动蛋白和GAPDH。通过味觉细胞而不是舌 细胞的味觉基因特异性表达加上通过味觉和舌细胞普遍存在的看家基 因的表达表示为高质量的RNA原料。 如果合适大小的镨带出现于味觉细胞而不是舌细胞，那 么在琼脂糖凝胶上分析PCR产物。具有这种表达图案的基因推定为味
觉特异性基因。克隆和测序所有的味觉特异性基因以确定基因同一性。
4)原位杂交 在双标记原位杂交中，产生的两种不同的RNA探针标记 两种不同的基因，具体地通过基因芯片和/或PCR法鉴定两种不同味觉 特异性基因。另外地，如果基因在味觉细胞中表达，可以产生一个探 针来标记单个基因用于测定。对于双标记研究，用FITC探针标记的第 一基因在荧光显微镜中产生单色，然而用地高辛(DIG)探针第二基因 在荧光显微镜中产生不同的颜色。如果基因在相同或不同的细胞类型 中表达，那么探针1和探针2显示为叠加。例如，如果通过基因芯片 或PCR法共定位至细胞表达TRPM5来鉴定异常的离子通道，那么异常 的离子通道在负责甜味、苦味、和/或鲜味味觉的细胞中表达。相反， 如果通过基因芯片或PCR法不共定位至细胞表达TRPM5来鉴定异常的 离子通道，那么异常的离子通道在负责咸味味觉(或另 一种味觉范畴) 的不同细胞类型中表达，并且异常的离子通道可以直接包含在钠离子 检测中。5)免疫组织化学 在双标记免疫組织化学中，两种不同的抗体探针用来标 记两种不同的蛋白，具体地通过基因芯片或PCR法鉴定两种不同味觉 特异性蛋白的基因。另外地，如果在味觉细胞中表达该蛋白，那么一 个抗体探针可用于标记用于测定的单个蛋白。对于双标记研究，在仅 仅能够使用根据酪胺酰胺信号放大(TSA)d敏感性检测方法检测d非常稀释的浓度下标记第 一蛋白。然后使用另 一种抗体标记第二蛋白并
使用非TSA法检测。通过标准的非TSA法不能检测第一抗体；因此， 从相同种类(例如家兔多克隆的抗体)得到的两种不同的抗体不会交 叉作用，并且因此可4皮用于双标记试验。如果蛋白在相同或不同的细 胞类型中表达，蛋白标记1和蛋白标记2的显示为叠加。例如，如果 如果通过基因芯片或PCR法共定位至细胞表达TRPM5来鉴定异常的离 子通道，那么异常的离子通道在负责甜味、苦味、和/或鲜味味觉的细 胞中表达。相反，如果通过基因芯片或PCR法不共定位至细胞表达 TRPM5来鉴定异常的离子通道，那么异常的离子通道在负责咸味味觉 (或另一种味觉范畴)的不同细胞类型中表达，并且异常的离子通道 可以直接包含在钠离子检测中。 使用以下鉴定的基因的这些原理、方法和规程包含在本 文的表中。这些表在下面作简单的描述。
il:小鼠味觉特异性基因编码从Affymetrix 4302. 0
微列阵/基因芯片得到的跨膜蛋白的总表。 从PCR筛选得到的人和小鼠味觉特异性离子通道
的总表。 ii:在TRPM5(甜味、苦味、鲜味)和PKD2L1/PKD1L3 (酸味)细胞中味觉特异性基因共定位的总表。 因此基于上述，本发明通常涉及用于鉴定包括涉及咸味 感觉的基因味觉基因的方法，以及在用于鉴定人咸味增强剂和其它味 觉调节化合物，用于鉴定调节其它的味觉细胞包括不直接与味觉传导 相关的疾病和症状相关功能和表型潜在疗法中筛选测定的用途。 本发明特别包括基于细胞测定用于鉴定咸味调节剂(增 强剂)的用途。这些化合物在调节人咸味感觉中具有应用前景。例如 在电生理学测定中鉴定的化合物和它们生物学上可接受的衍生物将在 使用志愿者进行人味觉试验检测中确定它们在人咸味感觉上的影响。 此外，鉴定作为潜在疗法的化合物将在取决于想要应用性质合适的体 外和体内模型中评估。例如，用于糖尿病潜在疗法的化合物可以在公
42知的糖尿病动物模型如NOD小鼠模型或BB大鼠模型中评估。类似地， 用于IBD或克罗恩氏病潜在疗法的化合物可以在IBD或克罗恩氏病鼠 类动物模型中评估。 如以下进一步地论述，用于鉴定味觉如咸味调节或治疗 化合物基于细胞的测定将优选包括高流通量筛选平台，使用表达本文 公开的基因或其组合的细胞来鉴定调节(增加)涉及咸味感觉基因的 活性。另外，可以引入具有官能影响如影响离子(钠)流入的限定突 变的同义突变或突变以修饰这些序列。如上所述，这些测定将优选包
根据本发明使用荧光离子敏感染料或膜电^染料如钠敏感^料表达离 子通道。优选，通过使用含在卵细胞中作用的电生理学测定表达在此 鉴定(例如膜片钳或二电极电压钳)的离子通道来筛选鉴定调节这些 离子通道的化合物。 仍有另外地，通过离子流动测定如放射性标记离子流动 测定或原子吸收光镨偶合离子流动测定可以检测调节推定包含咸味的 目标离子通道的化合物。如上面所公开，这些化合物在调节人咸味感 觉或用于调节包括异常或标准离子通道功能的其它生物进程中具有应 用前景。 基于目标细胞的测定使用在想得到细胞表达的突变体 核酸序列，优选卵细胞或人细胞如HEK-293细胞，或通常用于筛选鉴 定离子通道或GPCR调节化合物的其它人或哺乳动物细胞。这些细胞可 以进一步设计表达其它序列如其它味觉GPCR,即通过在本发明受让人 Senomyx其它专利申请中描述的T1R或T2R以及合适的G蛋白。卵细 胞系统是有利的，这是由于卵细胞系统允许直接注入多重mRNA种类用 于高蛋白表达和可以接受离子通道超量表达固有的有害作用。然而使 用两栖类卵母细胞进行电生理学筛选的缺点是不能接受大量化合物的 高流通量筛选和不是一种哺乳动物系统。作为注意的是，本发明包含 使用哺乳动物细胞的测定，优选高流通量测定。已知推定包含在咸味(ENaC )蛋白的一些离子通道是形成由三个亚基ct P和Y或A亚基组成的异侧通道。这些各自ENaC亚基 的序列在本发明受让人在美国系列号10/133, 573的较早专利申请中 公开，其全文在此引用作为参考。在合适的细胞中共表达产生具有阳 离子通道活性的异源三聚体；特别是它响应钠离子并将同样响应基于 细胞测定中的锂离子，如本文和在上述参考的Senomyx在先申请公开 的那些离子。 通过参考文献并入的Senomyx申请提供了使用哺乳动 物细胞转染或种入孔或培养平板中的高流通量筛选测定，其中在测试 化合物存在下允许进行官能表达和使用膜潜在荧光或离子(钠)荧光 染料检测活性。 如以上所讨论，本发明特别地提供筛选人咸味或其它味 觉范畴以及使用本文提供核酸和蛋白、序列靶向其它味觉细胞功能或 表型的调节剂如活化剂、抑制剂、激活剂、增强剂等的方法。这些调 节剂可以影响咸味或其它味觉范畴或味觉细胞相关功能和表型，如通 过调节转录、翻译、mRNA或蛋白稳定性、通过改变具有胞膜或其它分 子的离子通道的相互作用；或通过影响离子通道蛋白活性。例如使用 高流通量筛选(HTS)筛选化合物以鉴定可以结合和/或调节味觉受体
或味觉离子通道多肽或转运蛋白或其片段的那些化合物。在本发明中， 在细胞如人细胞或蛙卵细胞中重组表达蛋白，通过使用离子通道、受 体或转运蛋白功能的任意测定，如膜电位的测定或胞内钠离子或锂离 子水平改变的测定。测定离子如阳离子、通道功能的方法，包括例如 膜片钳技术、二电极电压钳、全部细胞电流的测定和荧光图象技术， 其使用离子敏感荧光染料和离子流动测定，如放射性标记离子流动测 定或离子流动测定。 进一步地，如前面提及，本发明进一步提供了分离、纯 化和标记想得到的味觉细胞类型和味觉包括如鲜味、甜味、咸味、苦 味、油脂味、酸味、金属味以及味觉干细胞和其它味觉细胞谱系，包 括辨别进入味蕾细胞、味觉细胞神经元、味觉免疫细胞等细胞的方法， 这些细胞基于一种或多种在此提供的味觉特异基因。这些分离和提纯
44法包括阳性和阴性细胞分离法。例如通过阳性细胞选择方法分离，如
通过使用荧光激活细胞分选(FACS)，磁珠细胞选择如通过目视鉴定 想得到的细胞如通过使用电生理学抗体包被小球的个体转染细胞。另 外地，通过阴离子细胞纯化和隔离法可以回收或纯化想得到的味觉细 胞谱系或类型，其中通过除去一个或多个不想要的细胞谱系，从混合 细胞群体中富集或纯化想得到的细胞类型，例如通过使包含想得到的 味觉细胞和不想要的细胞的混合细胞群体与对靶基因特异的细胞毒素 抗体接触，所述靶基因在将被除去的不想要的味觉细胞类型上表达。 本文鉴定的味觉特异性基因报道在表l、 2和3中，其 可作为鉴定和/或纯化包括如甜味、鲜味、酸味、苦味、咸味、油脂味 和其它味觉细胞包括干细胞的特异性味觉细胞的标记物使用。在一个 实施方案中，针对至少一种由包含于表l、 2或3的基因或直向同源或 其变异体编码蛋白抗体，可用于标记包含于味觉细胞如味蕾细胞的混 悬液或源于胃肠道细胞包括味觉细胞如通过酶消化和组织解聚作用产 生的混悬液的细胞(参见如Herness M. A. ， Neuroscience Letters 106:60-64 ( 1989 )等，其教导用于分离哺乳动物味蕾的解离方法)。 同时，通过利用荧光细胞激活分离器(FACS)可实现想得到味觉细胞 谱系或亚型的分离(参见如 Beavis， AJ and Pennline KJ Biotechniques 21: 498-503 ( 1996 ))，或通过使用》兹珠细胞分离 技术(参见如Jurman等人，Biotechniques 17:887-881 ( 1994 )， 其参考文献报道了使用抗体包被小球转染细胞的目视鉴定)或通过使 用通常本领域已知的其它方法，用于分离、纯化、标记和/或富集包含
于基于一种或几种标记基因表达的混合细胞群体所想得到的细胞。同 时，属于大肺泡上皮细胞亚类的细胞可以通过阴性细胞选择法纯化或 富集，其消除了如表示非靶标味觉细胞亚类的非靶标细胞，通过使用 方法消除非靶标细胞，如通过对一种或几种非靶标味觉细胞亚类特异 性细胞毒素抗体与混合细胞群体接触。 同时，本发明提供了使用包含于表l、 2或3的目标味 觉特异性基因或直向同源或其变异体的方法和针对它们的特异性标记
45物或探针如抗体或低聚核苷酸的用途，其可以用可检测的标记如放射 性核素、荧光团、酶等标记，这些标记物和探针对一个或多个患者味 觉特异性基因是特异性的，如在包含细胞的舌和口腔映射区域，其涉 及特异性味觉范畴如鲜味、甜味、苦味、咸味、酸味、油脂味、金属
味等，以及涉及非味觉特异性功能如在此鉴定的细胞，胃肠道和表达 特异性味觉特异基因的相关器官特异性区域的映射，因此其涉及一个 或多个在此公开的味觉细胞特异性功能，和/或在味觉细胞分化研究中 目标基因的用途，例如用于鉴定诱导味觉干细胞和其它多能性或未成 更具体地说，本发明涉及新的原理、方法和测定，其包 括鉴定和说明包括那些起咸味受体作用的新味觉特异性基因的电生理 学测定。 人们普遍相信，通过钠或其它的离子通道以及转运蛋白 和GPCR在味觉细胞中特异性表达可以部分地介导人咸味觉。因此，本 发明提供用于鉴定味觉特异性基因的方法，其包括使用基因芯片和 PCR方法的可调节咸味的基因以及其它的味觉范畴和味觉细胞介导功 能和表型。本文鉴定的化合物和它们的衍生物结合和/或调节味觉特异 性基因，在此所提供的功能在作为味觉调节剂以及作为疗法如用于治 疗胃肠和代谢失调如糖尿病、肥胖、恶病质等上是有用的。
定义"推定的咸味受体或离子通道基因"指的是在味觉细胞
中特异性表达的基因，其在舌细胞中不表达或在舌细胞中基本上很少 表达，此外，优选在表达T1R、 T2R、 TRPM5或PKD2L1/PKD1L3基因的
味觉细胞中不表达。"味觉细胞"指的是一种细胞，当成熟表达至少一个受 体、转运蛋白或离子通道时，其直接或间接地控制或调节特异性味觉 范畴如甜味、酸味、鲜味、咸味、苦味、油脂味、金属味或其它味觉 感觉或整体味感感觉如味觉强度或味觉响应的持续时间。味觉细胞表达mRNA和/或基因C6orfl5 (染色体阅读框15)的蛋白-亦称为STG。 该基因已被(M. Neira等人，通过激光捕获显微分离发现对味蕾特异 性的新的基因(mSTG) Mammalian Genome 12: 60-66 ( 2001 ))描 述为味觉特异性基因，并且是本文报道小鼠味觉特异性基因之一。此 外，成熟的味觉受体细胞一般将表达cx ENaC的mRNA和/或蛋白。我 们有数据(没有在本文中显示)显示oc ENaC在至少甜味、苦味、鲜 味、酸味和最可能是咸味的味觉细胞中表达。进一步地，成熟的味觉 受体细胞一般将在细胞角蛋白19的mRNA和/或蛋白中表达。该蛋白 仅仅在成熟的味觉细胞而在基细胞或干细胞中没有发现表达。(L. Wong 等人， "Keratin-like immunoreactivity in receptor cells of 謹malian taste buds". Chemical Senses 19( 3 ): 251-264 ( 1994 ))。 此外，本领域技术人员基于它们的特有的形态可以鉴定味觉细胞。特 别地，成熟的味觉受体味觉细胞是长形和梭形的。同时，成熟的味觉 受体细胞的细胞(顶膜)的顶点深入味孔中，因此能够进入或暴露于 唾液。相反，不成熟的味觉细胞如基细胞或干细胞散落各处并且不能 进入或暴露于唾液。同时，不同于成熟的味觉细胞，基细胞或干细胞 倾向于定位在味蕾的底部。"化学感觉细胞"是涉及感受化学兴奋剂如味觉剌激物 和其它化学感觉刺激物如添味剂的细胞。当成熟表达一个或多个味觉 受体时，本文的化学感觉细胞特别包括特定味觉受体细胞和包含在消 化或泌尿道或其它器官的细胞。例如，已知胃肠化学感觉细胞表达TIR 或T2R，这些细胞可能涉及食物感受、代谢功能、消化、糖尿病、食 物吸收、胃动力等。此外，在泌尿道发现的细胞可能表达咸味受体， 并涉及钠转运、与排泄和功能相关的如血压和体液滞留。进一步地， 在消化系统表达味觉受体的化学感觉细胞可以同时表达泌颗粒标记物 的嗜铬粒蛋白 A。 ( C. Sternini， "Taste Receptors in the Gastrointestinal Tract. IV. Functional Implications of Bitter Taste Receptors in Gastrointestinal Chemosensing". American Journal of Physiology, Gastrointestinal and Liver Physiology. 11
47292:G457-G461， 2007 )。 本文的"味觉细胞特异性基因"指的是通过味觉细胞如 轮廓味觉细胞特异性表达的基因，其不能通过涉及味觉或非味觉相关 味觉细胞功能或表型的舌细胞来特异性表达。味觉细胞包括在口腔中 表达如舌和味觉细胞的味觉受体、在身体的其它区域如消化系统和泌 尿道表达味觉受体。这些基因包括列于表l、 2和3中登录号的那些基 因以及其直向同源、等位变异体、嵌合体、在严格杂交条件下杂交的 基因和/或编码具有至少80%、更优选至少90%并且甚至更优选至少95% 任意上述物质的蛋白的基因。 这些味觉细胞特异性基因包括涉及味觉和非味觉相关 功能如味觉细胞更新、影响消化系统或口腔的疾病、口腔和/或消化系 统的免疫调节、包括味觉细胞的消化和代谢功能如糖尿病、肥胖、血 压、体液滞留等。在此作为注意的这些基因，关于特定味觉鉴定的特 异性基因包括列于表l、 2和3中登录号的核酸序列以及其直向同源、 嵌合体和包括其等位变异的变异体。特别地，这些变异体包括编码多 肽序列为至少80%、更优选至少90%或95%相同于通过相当于叙述的登 录号基因编码的多肽，或相当于其直向同源特别是人和非人灵长类动 物直向同源的基因编码多肽。此外，该基因包括在严格杂交条件下与 相当于基因序列之一(相当于本文表中叙述的基因登录号)杂交的核 酸序列。"阳离子通道，，是控制阳离子通过细胞膜流动的不同蛋 白组。 一般地，特异阳离子通道转运特定阳离子的能力随阳离子的原 子价以及特定阳离子给定通道特异性而变化。 "同数通道(homomeric channel)"指的是由相同a 亚基组成的阳离子通道，然而"异数通道"指的是由两种或更多不同类 型a亚基组成的阳离子通道。同数和异数通道都可以包括辅助的P亚 基。 " P亚基"是由cx亚基组成阳离子通道的辅助亚基的多 肽单体；然而P亚基不能单独形成通道(例如参见美国专利号5, 776, 734 )。例如，已知P亚基通过帮助a亚基到达细胞表面而增加
通道数目并改变天然配体结合通道的敏感度。P亚基可以在小孔区域 的外部并与包含小孔区域的oc亚基相联系。它们还可以促进小孔区域
外部成口 。 术语"可信的"或"野生型"或"天然的"核酸序列是指列 于本文表中野生型核酸序列以及拼接变异体和其它本领域通常所知道 的核酸序列。 术语"可信的"或"野生型"或"天然的"核酸序列是指通 过列于本文表基因和核酸序列编码的多肽。 术语"修饰增加受体核酸序列"或"最优化核酸序列"指 的是包含一个或突变的核酸序列，特别是在重组宿主细胞和最特别是 卵细胞或人细胞如HEK-293细胞中影响(抑制或增加)基因活性的那 些核酸序列。特别地，这些突变包括含有突变亚基序列合成的离子通 道影响开启的那些突变。在构成特定离子通道三个亚基的一个或几个 突变中，离子通道可包含该突变。例如，在影响(损害)开启功能或 缺乏外层表达的一个亚基中，修饰的核酸序列可包含取代突变。本发 明包含其它突变基因序列的用途，即拼接变异体、包含缺失或增加的 那些变异体和目标序列的嵌合体等。进一步地，本发明能使用可修饰 引入宿主细胞优选密码子、特别是两栖动物或人宿主细胞优选密码子 的序列。 术语受体或离子通道蛋白或转运蛋白或其片段，或根据 本发明编码特定味觉受体或离子通道或转运蛋白或其片段的核酸指的 是核酸和多肽多形变异体、等位基因、突变体和种间同源物(l)氨 基酸序列，其与味觉蛋白的野生型核酸或氨基酸序列编码，如由本文 列于表中基因核酸序列以及其片段编码的蛋白的氨基酸序列相比，具 有大于约60%氨基酸序列同一性、65%、 70%、 75°/。、 80%、 85%、 90%， 优选91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96°/。、 97%、 98%或99°/。或更大的氨基 酸序列同一性，优选大于至少约25、 50、 100、 200、 500、 IOOO或更 多氨基酸的区域，及其保守修饰的变异体；(3)由核酸序列编码的多
49肽，其在严格杂交条件下与相当于核酸序列编码通过所述基因之一的
编码基因特异性杂交，及其保守修饰的变异体；(4)核酸序列，其与
如本文公开的核酸具有大于约60%序列同一性、65%、 70%、 75%、 80%、85%、 90%，优选91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%或更大的氨基酸序列同一性，优选大于至少约25、 50、 100、 200、 500、1000或更多核苷酸的区域。 —般地，从哺乳动物包括但不限于灵长类动物，如人；鼠类，如大鼠、小鼠、仓鼠；奶牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物中得到推定咸味或其它味觉特异性基因或多核苷酸或多肽序列。本发明的核酸和蛋白包括天然存在或重组分子。 一般地，这些基因将编码具有离子通道即它们能渗透钠或锂离子的蛋白。 通过"测定功能影响"或"测定在细胞上的影响"意指测定化合物在味觉基因，优选在此鉴定的咸味基因影响下间接或直接增加或减少参数的影响，如功能、物理、表型和化学的影响。这些功能影响包括但不局限于离子流动、膜电位、电流振幅、和电压门控中的改变，以及其它的生物效应如任意标记基因等的基因表达中的改变。离子流动可以包括通过通道如钠或锂离子通道和其类似物如放射性同位元素的任意离子。这些功能影响可通过本领域技术人员公知的任意方法如膜片钳、使用压敏染料或通过测定参数如光谱特性(例如荧光、吸光度、折射指数)、水力的(例如成型)、色谱或溶解度性能来测定。 多核苷酸和多肽序列表达目标味觉细胞的"抑制剂，，、"活化剂，，和"调节剂，，用来指使用这些多核苷酸和多肽序列的体外和体内测定激活、抑制或调节鉴定的分子。抑制剂是化合物，如这些味觉特异性蛋白的结合、部分或完全阻断活性、降低、防止、延迟活化、灭活、脱敏或下调活性或表达，例如是拮抗剂。"活化剂"是增加、开启、激活、促进、增加活化、敏化、折磨或下调蛋白活性的化合物。抑制剂、活化剂或调节剂还包括目标味觉细胞特异性蛋白的遗传改良形式，例如改变活性的形式以及天然地存在和合成的配体、拮抗剂、激动剂、肽、环肽、核酸、抗体、反义分子、siRNA、核糖酶、小的有机分子等。用于抑制剂和活化剂的这些测定包括如体外、细胞、细胞提取物或细胞膜中表达目标味觉细胞特异蛋白、应用推定调节剂化合物，然后测定在如上所述活性上功能影响。 包含通过本文鉴定基因编码蛋白的样品或测定，即用潜在的活化剂、抑制剂或调节剂与之比较没有抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品处理，检验活化或色移调控的程度。对照样品(未经处理，具有抑制剂)被指定为相对蛋白活性值为100%。当活性值相对于对照物为约80%，优选50%，更优选25-0%时，达到离子通道的抑制。当活性值相对于对照物(未经处理，具有活化剂)为110%，更优选150%，更优选200-500% (即相对于对照物高2-5倍)、更优选1000-3000%或更高时，达到离子通道的活化。 本文使用的术语"检测化合物"或"药物候选物"或"调节剂，，或语法上的等同物描述了任意分子，或者天然存在或合成的化合物，优选小分子或蛋白、寡肽(例如，从约5至约25个氨基酸长度，优选从约10 20或12至18个氨基酸长度，优选12、 15或18个氨基酸长度)、小的有机分子、多醣、脂类、油脂酸、多核苷酸、siRNA、低聚核苷酸、核酶等，用于检测调节冷觉的能力。检测化合物可形成检测化合物库，如提供多样性足够范围的组合或随机库。检测化合物任选与融合伴侣相关，如靶向化合物、援救化合物、二聚化合物、稳定化合物、可寻址化合物和其它功能部分。通常，通过鉴定检测化合物(称为"先导化合物")产生具有有用性能的新化学实体，其具有某些合乎要求的性质或活性如抑制活性，创造先导化合物的变异体和评估那些变异化合物的性能和活性。进行这样的分析常常使用高流通量筛选(HTS)法。"小的有机分子"指的是一种天然地存在或合成的有机分子，其具有分子量超过约50道尔顿和小于约2500道尔顿，优选小于约2000道尔顿，优选在约100至约1000道尔顿之间，更优选在约200至约500道尔顿之间。
51
"生物样品"包括组织部分如活体解剖和尸体解剖样品，以及用作组织学目的的冷冻部分。这些样品包括血液、唾液、组织、培养细胞，例如原始培养、外植体和转化细胞、粪便、尿等。 一般地从真核生物体中获得生物样品，最优选哺乳动物如灵长类动物，例如黑猩猩或人；奶牛；狗；猫；鼠类如豚鼠、大鼠、小鼠；家兔；或鸟类；爬虫；或鱼类。 在两个或更多核酸或多肽序列的范围内，术语"相同的"或百分比"相同"指的是使用具有如下所述缺省参数的BLAST或BLAST2. 0序列比较算法测定两个或更多序列或子序列相同或氨基酸残基或核苷酸的规定百分比相同(即当在一个比较窗或指定区域上比较和调整最大一致性时，在规定区域内(例如列于本文表内的基因或序列)约60。/。相同，优选65%、 70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 91%、 92%、 93%、94%、 95°/。、 96%、 97%、 98%、 99°/。、或更高相同)，或者通过手工定位和目测(参见，如NCBI网址等)。然后这些序列称为"基本相同，，。该定义还引用或可以应用于检测序列的问候。该定义同时包括具有缺失和/或增加的序列，以及被置换的那些序列。如如下所述，优选的算法可以解释缺口染色体等。优选同一性存在于至少约25个氨基酸或核
苷酸长度的区域，或更优选50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域。为了序列对比，通常将一个序列作为参照序列，将实验序列与其对比。当使用序列对比算法时，将实验和参照序列输入计算机，指定子序列坐标，在必要时，指定序列算法程序参数。优选地，可以使用缺省程序参数，或者可以指定备选参数。序列对比算法然后基于程序参数，计算实验序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
〖00144]本文使用的"对比窗"包括选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150个邻近位置数目中的任一个区段，其中在最佳地比对2个序列后，可以将序列与相同数目的邻近位置的参照序列相对比。用于对比的序列比对方法是本领域众所周知的。可以进行用于对比的最佳序列比对，例如，通过31^让& Waterman, Adv.Appl. Math. 2482 ( 1981 )的局部同源性算法，通过Needleman &200780021087.9
Wunsch， J. Mol. Biol. 48443 ( 1970 )的同源性比对算法，通过Pearson& Lipman， Proc. Nat". Acad. Sci. USA 852444 ( 1988 )的搜索相似性方法，通过计算机执行的这些算法(G AP， BESTFIT， FASTA，和TFASTA，在Wisconsin Genetics軟件包中，Genetics ComputerGroup, 575 Science Dr. ， Madison, Wis.)，或通过手工t匕对和目检(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology ( Ausubel等人，编.1995增刊))。适用于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2. 0算法，它们分别描述在Altschul等人，Nucl. Acids Res. 253389-3402 ( 1977 )和Altschul等人，J.Mol. Biol. 215403-410 ( 1990 )。使用具有本文所述参数的BLAST和BLAST 2. Q来测定本发明核酸和蛋白的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可以从国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information) 7>开得到。该算法包含，首先通过鉴定查询序列中长度W的短字，鉴定高计分序列对(HSPs)，所述短字在与数据库序列中相同长度的字比对时，匹配或满足一些正值阈值计分T。 T称作邻域字计分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字采样用作开始发现含有它们的更长HSP的搜索的种子。然后沿着每个序列的两个方向延伸所述字采样，直到累积的比对计分提高。对于核苷酸序列，使用参数M (匹配的残基对的奖励分；总是>0)和N (错配残基的罚分；总是<0)来计算累积的计分。对于氨基酸序列，使用计分矩阵来计算累积的分数。在下述情况时停止在每个方向上字采样的延伸累积的比对分数从其达到的最大值下降了数值X;
由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积的计分达到零或低于零；或到达任何一个序列的结尾。BLAST算法参数W、 T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用的是wordlength (W) 11， expectation (E) 10， M = 5， N - -4，比较两个链。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用的是，wordlength(W)3， expectation (E) 10，和BL0SUM62计分矩阵(参JS Henikoff &
53Henikoff，尸roc. ScA89:10915 ( 1989 ))比对
(B) 50， expectation (E) 10， M=5， N=-4，比较两个链。"核酸"是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其单链或 双链形式的聚合物，和其补体。该术语包括含有已知的核苷酸类似物 或修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成的、天然产生的和非天 然产生的，具有与参照核酸类似的结合性质，且以与参照核苷酸类似 的方式代谢。这样的类似物的实例包括、但不限于，硫代磷酸酯，氨 基磷酸酯，甲基磷酸酯，手性-甲基磷酸酯，2-0-曱基核糖核苷酸， 肽-核酸(PNAs)。除非另有说明，特定核酸序也暗含其保守修饰变体(例
如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言， 简并密码子置换可以通过产生其中一个或多个选定的(或全部)密码
子的第三个位置被置换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基的序列来实现 (Batzer等人，Nucleic acid Res. 195081 ( 1991 ) ; 0htsuka等 人，J. Biol. Chem. 2602605-2608 ( 1985 ) ; Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 891-98 ( 1994 ))。术语核酸与基因、cDNA、 mRM、 寡核苷酸和多核苷酸互换地使用。特定核酸序列也暗含"拼接变体"。类似地，由核酸编 码的特定蛋白暗含由该核酸的拼接变体编码的任意蛋白。如名称所指 出的，"拼接变体，，是基因的替换拼接的产物。转录后，可以拼接最 初的核酸转录物，使得不同的(替换的)核酸拼接产物编码不同的多 肽。生成拼接变体的机理可以变化，但是包括外显子的替换拼接。该 定义也包括通过通读转录从相同核酸衍生的替换多肽。该定义包括拼 接反应的任意产物，包括拼接产物的重组形式。在Leicher，等人，J. Biol. Chem. 273 ( 52 ) 35095-35101 ( 1998 )中讨论了钾通道拼接 变体的一个实例。术语"多肽，，、"肽"和"蛋白，，在本文中互换地用于 指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是 对应的天然存在的氨基酸的人工化学模仿物的氨基酸聚合物、以及天
54然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语"氨基酸，，是指天然产生的和合成的氨基酸，以及 氨基酸类似物和氨基酸模仿物，它们以类似于天然存在的氨基酸的方 式起作用。天然产生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及以后 修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸，Y -羧基谷氨酸，和0-磷酸丝氨 酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构 的化合物，即碳结合氩、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸，正 亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基 团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基 酸相同的基本化学结构。氨基酸模仿物是指具有不同于氨基酸的一般 化学结构的结构、但是以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化 合物。氨基酸在本文中可以用IUPAC-IUB生化命名委员会推荐 的它们的普遍已知的三字母符号或单字母符号来表示。同样地，核苷 酸可以用它们的普遍接受的单字母代码来表示。"保守修饰的变体"适用于氨基酸和核酸序列。对于特定 核酸序列，保守修饰变体是指编码相同的或基本上相同的氨基酸序列 的那些核酸，或其中核酸不编码氨基酸序列，至基本相同的序列。因 为遗传密码的简并，大量功能上相同的核酸编码任意给定蛋白。例如， 密码子GCA， GCC, GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因而，在密码子 指定为丙氨酸的每个位置，可以将密码子改变为任意的对应的所述密 码子，而不改变编码的多肽。这样的核酸变化是沉默变化，它们是保 守修饰变化的一种类型。本文的编码多肽的每个核酸序列也描述了核 酸的每个可能的沉默变化。技术人员会认识到，可以修饰核酸中的每 个密码子(例外是AUG，它通常是蛋氨酸的唯一密码子，和TGG，它通 常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能上相同的分子。因此，编码 多肽的核酸的每个沉默变化暗含在每个所述的序列中，这是就表达产 物而言，而不是就实际的探针序列而言。关于氨基酸序列，技术人员会认识到，对核酸、肽、多
55肽或蛋白序列的单个置换、删除或添加(它会改变、添加或删除编码 的序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸)是保守修饰变体，其中 改变导致化学类似的氨基酸对氨基酸的置换。提供功能上类似的氨基 酸的保守置换表是本领域众所周知的。这样的保守修饰变体在本发明 的多形变体、种间同系物和等位基因之外，且不排除它们。下面的8组各自含有彼此可保守置换的氨基酸1)丙 氨酸(A )，甘氨酸(G ) ; 2 )天冬氨酸(D )，谷氨酸(E ) ; 3 ) 天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)，赖氨酸(K);
5) 异亮氨酸U)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V);
6) 苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W); 7)丝氨酸(S)， 苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(参见，例如， Creighton, Proteins (1984))。大分子结构例如多肽结构可以以不同的组构水平来描 述。关于该组构的一般讨论，参见，例如，Alberts等人，Molecular Biology of the Cell (第3版，1994 )和Cantor和Schimmel， Biophysical Chemistry Part I : The Conformation of Biological Macromoleculars ( 1980 )。"一级结构，，是指特定肽的氨基酸序列。 "二级结构，，是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常称作 结构域，例如，跨膜结构域、孔结构域和胞质尾结构域。结构域是形 成多肽的紧凑单元的多肽部分，通常是15至350个氨基酸长。示例性 的结构域包括胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。典型的结构域 由更小的组构件组成，例如多个p-折叠和ot-螺旋。"三级结构"是 指多肽单体的完整三维结构。"四级结构，，是指由独立的三级单元的
单价结合形成的三维结构。各向异性术语也称作能量术语。"标记"或"可检测部分"是通过分光、光化学、生化、 免疫化学、化学或其它物理方式可检测出的组分。例如，有用的标记 包括"P，荧光染料，电子密度试剂，酶(例如，常用于ELISA)，生 物素，异羟基洋地黄毒戒元，或半抗原和蛋白，它们可以通过例如将放 射性标记掺入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体来变得可检测。
当提及例如细胞、或核酸、蛋白或载体时使用的术语"重 组"是指，该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白 或天然核酸或蛋白的改变来修饰，或该细胞源自这样修饰的细胞。因 而，例如，重组细胞表达在天然的(非重组的)形式的细胞中不存在 的基因，或表达否则异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。当提及核酸的一部分时使用的术语"异源"是指，该核 酸包含在自然界中在彼此相同的关系中不存在的2个或多个子序列。 例如，该核酸通常是重组生产的，具有2个或多个来自不相关基因的 序列，它们排列产生一个新的功能核酸，例如，来自一个来源的启动 子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白是指，该蛋白包含 在自然界中在彼此相同的关系中不存在的2个或多个子序列(例如， 融合蛋白)。短语"严格杂交条件"是指这样的条件，在该条件下， 探针会与它的目标子序列杂交，通常在核酸的复杂混合物中，但是不 与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的，且在不同环境下是不同 的。更长的序列在更高的温度特异性地杂交。核酸杂交的广泛指南参 见Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays ( 1993 )。 一般而言，选择的严格条件比特定序列在确定的离子强度、pH下的热 解链点(Tm)低约5-10t:。 Tm是50n/。的与靶物互补的探针与靶序列杂 交平衡时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序 列过量存在，在Tm， 50。/。的探针被平衡地占据)。严格条件也可以通 过加入去稳定剂例如曱酰胺来实现。对于选择性的或特异性的杂交， 阳性信号至少是背景的2倍，优选背景杂交的10倍。示例性的严格杂 交条件可以如下50°/。甲酰胺，5X SSC，和1。/。 SDS，在"1C温育，或 者，5X SSC， 1% SDS，在65匸温育，在65T在0. 2X SSC和0. 1% SDS 中洗涤。如果它们编码的多肽是基本上相同的，在严格条件下彼
57此不杂交的核酸是基本上相同的。这发生在例如使用遗传密码允许的 最大密码子简并建立核酸拷贝时。在这样的情况下，核酸通常在中等
严格杂交条件下杂交。示例性的中等严格杂交条件包括，在37匸在40% 曱酰胺、1 M NaCl、 1 % SDS的緩冲液中杂交，和在45X:在1 X SSC 中洗涤。阳性杂交至少是背景的2倍。普通技术人员会容易地认识到， 可以使用替代杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。确定杂交参 数的其它指导提供在许多参考文献中，例如，Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel， 等人编。对于PCR,约36。C的温度对于低严格性扩增是典型的， 尽管退火温度可以随引物长度在约32t)至48。C之间变化。对于高严格 性PCR扩增，约62匸的温度是典型的，尽管高严格性退火温度可以随 引物长度和特异性在约50'C至约651c之间变化。高和低严格性扩增的 典型循环条件包括，在90C-95'C的变性阶段30秒至2分钟，退火阶 段持续30秒至2分钟，在约72C的延伸阶段1-2分钟。低和高严格 性扩增反应的方法和指南提供在例如，Innis等人 (1990 ) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y.)。"抗体"是指包含来自免疫球蛋白基因的框架区或其片 段的多肽，它特异性地结合和鉴定抗原。被鉴定的免疫球蛋白基因包 括k，入，oc， y， 5， s，和p恒定区基因，以及无数免疫球蛋
白可变区基因。轻链被分类成K或入。重链被分类成y， p， a, 5， 或s,它们又分别定义了免疫球蛋白类别IgG， IgM， IgA， IgD和IgE。
通常，抗体的抗原结合区对于结合的特异性和亲和力是最关键的。本文使用的术语抗体也包括，通过修饰完整抗体生成的 抗体片段，或使用重组DNA方法从新合成(例如，单链Fv)，嵌合的、 人化的、或使用噬菌体展示文库鉴定出的那些(参见，例如， McCafferty等人，Nature 348552-554 ( 1990 ))。对于抗体的制 备，例如，重组的、单克隆的、或多克隆抗体，可以使用本领域已知 的i午多4支术(参见，例如，Kohler & Milstein， Nature 256: 495-97
58(1975 ) ; Kozbor等人，Immunology Today 4 72 ( 1983 ) ; Cole等 人，pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc. ( 1985 ); Coligan， Current Protocols in Immunology
(1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual ( 1988 ) 和Harlow & Lane， Using Antibodies， A Laboratory Manual ( 1999 ); 和Goding， Monoclonal Antibodies Principles and Practice (2d ed. 1986 ))。当提及蛋白或肽时，短语"特异性地(或选择性地)结 合"抗体或"与......特异性地(或选择性地)免疫反应性的"是指，
指示蛋白的存在的结合反应，经常在蛋白的异质群体和其它生物学中。 因而，在指定的免疫测定条件下，特定的抗体与特定蛋白的结合是背 景的至少2倍，更通常超过背景的10至100倍。在这样的条件下与抗 体的特异性结合需要针对特定蛋白选择它的特异性的抗体。例如，可 以选择针对蛋白、多形变体、等位基因、定向进化同源、和保守^f务饰 的变体或拼接变体或其一部分产生的多克隆抗体，以便仅得到与编码 在本申请中鉴定出的蛋白的基因产物特异性地免疫反应的、而不与其
它蛋白反应的那些多克隆抗体。该选择可以通过减去与其它分子交叉 反应的抗体来实现。多种免疫测定形式可以用于选择与特定蛋白特异 性地免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定常规地用于选择与 蛋白特异性地免疫反应的抗体(关于可以用于测定特异性免疫反应的 免疫测定形式和条件的描述，参见，例如，Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988))。本文的"治疗有效剂量"是指产生施用的预期效应的剂 量。精确剂量依赖于治疗目的，由本领域技术人员使用已知的技术来 确定(参见，例如，Lieberman, Pharmaceut ical Dosage Forms (vols. 1-3， 1992 ) ; Lloyd， The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding ( 1999 );和 Pickar， Dosage Calculations ( 1999 ))。本文鉴定出的味觉(咸的)基因的重组表达
为了得到克隆的基因的高水平表达，例如编码主题基因 的那些cDNA，通常将该基因亚克隆进含有指导转录的强启动子、转录 /翻译终止子的表达载体中，对于编码蛋白的核酸，该表达载体还含有 翻译起始的核糖体结合位点。合适的真核和原核启动子是本领域众所 周知的，且描述在例如，Sambrook等人，和Ausubel等人，同上。例
如，用于表达味觉特异性的蛋白的细菌表达系统可以在例如大肠杆菌、 芽孢杆菌属和沙门氏菌中得到(Palva等人，Gene 22229-235 ( 1983 ); Mosbach等人，Nature 302543-545 ( 1983 )。这样的表达系统的试 剂盒可商业获得。哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是 本领域众所周知的，且也可商业获得。例如，在本发明中可以使用反 转录表达系统。如下文所述，主题推定的咸味影响基因优选在人细胞 例如在高通量筛选中广泛使用的HEK-293细胞中表达。用于指导异源核酸表达的启动子的选择依赖于特定用 途。启动子的位置离异源转录起始位点的距离优选地与在它的天然环
境中离转录起始位点的距离大致相同。但是，如本领域已知的，可以 调节该距离的一些变化，而不丧失启动子功能。除了启动子以外，表达载体通常含有转录单元或表达盒， 它含有核酸在宿主细胞中表达所需的所有额外元件。典型的表达盒因 而含有可操作地连接至编码鉴定出的基因的核酸序列的启动子，和转 录的有效多腺苷酸化所需的信号，核糖体结合位点，和翻译终止。所 述盒的额外元件可以包括增强子，和，如果使用基因组DNA作为结构 基因，具有功能性拼接供体和受体位点的内含子。除了启动子序列外，表达框也应该含有机构基因的转录 终止区下游区以提供有效终止。所述终止区可以从作为启动子的相同
的基因获得或从不同的基因获得。用来将遗传信息转移至细胞的特殊的表达载体不是特别 重要。可以使用任何用于真核或原核细胞的表达的调控载体。标准细 菌表达载体包括质粒，例如基于质粒的pRB322、 pSKF、 pET23D和融合 表达系统例如MBP、 GST和LacZ。能够将附加表位加入重组蛋白质以提供分离的便捷的方法，例如c-myc。为核酸交叉再活化(rescue) 序列标记可以包括在表达框中。标记物例如荧光蛋白、绿或红荧光蛋 白、p-gal、 CAT等等能够包括在载体中作为载体转导的标记物。包含来自真核病毒的调控元件典型地用于真核表达载体 中，例如SV40载体、乳头瘤病毒载体、逆转录病毒载体和源自EB病 毒(Epstein-Barr virus)的载体。其它示例真核载体包括pMSG、 pAV009/A+、 pMT010/A+、 pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和其它允许在 CMV启动子的指导下的蛋白质的表达的载体、SV40早期启动子、SV40 后期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤 病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它对核细胞内表达有效的其它启 动子。本发明中使用的载体可以包括调控载体，例如tet-调控 系统和RU-486系统(见，例如，Gossen & Bujard， Pro" Nat'1 Acad. Sci USA 89:5547 (1992); Oligino et al.， Gene Ther. 5:491-496 (1998); Wang et al. ， Gene Ther. 4: 432-441 (1997); Neering et al.， Blood 88:1147-1155 (1996); and Rendahl et al.， Nat, Biotechnol. 16: 757-761 (1998))。这些将小分子控制传递至候选 靶向核酸的表达。该有益的特征能够用于确定所需的表型通过转染的 cDNA而非体细胞突变引起。在表达载体被引入该细胞中后，被转染的细胞在有利的基 因表达条件下培养。在一些情况下，这种多肽可以使用下文所确定的 标准技术从培养恢复。针对本文所鉴定假定的味觉细胞特异性基因产物的调节 剂的检测使用多种检测能够特别地检测离子通道蛋白的通道活性 来测量离子流的变化，包括膜片钳技术、整个细胞电流的测定、放射 标记的离子流检测或与原子吸收光傳联用的流检测和荧光检测(使用 电压敏感染料或锂或钠敏感的染料)(见，例如Vestergarrd-Bogind et al.， J. Membrane Biol. 88: 67-75 (1988); Daniel et al.， J. Pharmacol. Meth. 25:185- 193 (1991); Hoevinsky et al. ， J. Membrane Biol. 137:59-70 (1994))。例如能够将编码离子通道蛋
白或其同系物的氨基酸注射入爪蟾卵或转染至哺乳动物细胞，优选地 人类细胞例如HEK-293细胞。随后通过测定膜极化(即膜电位的变化) 的变化来评估通道活性。获得电生理测量的优选的方法是通过使用膜片钳技术测 定电流，例如，"细胞粘附"模式、"翻转"模式、和"全细胞"模 式(见，例如Ackermanet al. ， New Engl. J. Med. 336:1575-1595， 1997 )。能够使用标准方法(例如在Hamil et al. ， Pflugers. Archiv. 391:185 (1981)中所述的)全细胞电流确定全细胞电流。通道活性也通过测定细胞内离子水平(即钠或锂离子)来 评估。本文实施这类方法。例如，通过使用适合的荧光染料评估放标 记的吸收来测量钠流。在典型的显微荧光测定检测中，经历结合单钠 离子荧光变化的染料被载入味觉细胞特异性离子通道表达细胞的胞质 溶胶。对于激动剂的暴露，通过当钠被结合时发生的荧光的变化来反 映细胞溶质的钠的增加。在另一个实施方式中，能够通过蛋白质或oiRNA的水平测 量来确定特异性靶向味觉多肽的细胞多肽水平。使用免疫测定法(诸 如西式印迹法、ELISA等等)、使用选择性与多肽或其片段结合的抗 体来测量蛋白质或与离子通道活性相关的蛋白质的水平。优选mRNA、 扩增(例如使用PCR、 LCR)或杂交检测(例如RNA印迹杂交、RNA酶 保护术、点渍法)的测量。使用直接或间接标记检测剂来检测蛋白或 mRNA的水平，例如本文所述的荧光性或放射性标记核酸、放射性或酶 标记抗体等等。另外，能够使用报道基因系统测量蛋白质表达。能够使用 与可操作性地结合的报道基因(例如氯霉素乙酰转移酶、荧火虫荧光 素酶、细菌荧光素酶、p-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶)的启动子来设计 这种系统。另外，通过与第二指示器诸如红或绿荧光蛋白(见，例如 Mistili & Spector， Nature Biotechnology 15:961-964 (1997)) 相关蛋白质能够用作间接指示器。将所述指示器构造典型地转染至细 胞。在用潜在的调节剂处理后，根据本领域技术人员已知的标准技术 测量指示器基因转录、翻译或活性的量。动物模型也用于针对基因活性的调节剂筛选。相似地，包 括siRNA和基因剔除技术的转基因动物技术(例如因为与适当的基因 靶向载体、或基因过表达同源重组)，将导致所述靶向基因的缺失或 增强的表达。也能够应用相同的技术来制备基因的细胞。当需要时， 组织特异性的表达或靶向基因剔除可以是必须的。通过这种方法产生 的转基因动物作为与基因靶向相关应答的动物模型。例如这种表达基 因或本发明的基因的动物可以用于获得品味超人(supertaster )表型 例如在化学和生物毒素、腐败的/损坏的/污染的食物、和饮料的筛选 中使用，或者针对调节味觉干细胞分化的治疗化合物的筛选。能够通过在小鼠基因组中使用基因重组将标记基因或其 它异源基因插入内原基因位点来制备基因剔除细胞和转基因小鼠。也 能够制备这种小鼠，其是通过用靶向基因的突变型置换内原基因，或 通过使内原基因突变(例如暴露于已知诱变剂)。将DNA构造引入胚胎干细胞的细胞核。包含新设计的基因 损伤的细胞被注入宿主小鼠胚胎中，其被再植入雌性接受体。这些胚 胎中的一些发育成嵌合子小鼠，其具有从突变细胞林部分衍生的生殖 细胞。因此，通过培育嵌合子小鼠，可能获得包含引种的基因损伤的 小鼠的新型祙(见，例如Capecchi et al.， Science 244: 1288 (1989)). Chimeric targeted mice can be derived according to Hogan et al.， Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (1988) andTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (Robertson, ed. ， 1987 )。
进一步地，对于文中指明的味觉细胞具有特异性的基因和 基因制品能够用于鉴定在以下方面有作用的化合物调节味觉细胞的 调亡、调节对味觉受体表达进行控制的转录因子、调节苦味受体表达 (例如为了减轻某些蔬菜、药物、咖啡等中的不良味道)、调节味觉 细胞发展的自分泌/旁分泌调节、延长味蕾寿命、产生超级味觉动物显 型用于筛选诸如生物恐怖物品(bioterrorism)或产生动物用于筛选 将干细胞的活化和差异化引导至活体中的味觉细胞的化合物。进一步地，本发明的基因和基因制品以及表达的细胞能够 用于鉴定下述化合物其再生味觉细胞-例如在老年人或患有癌症、 化疗辐射、影响味觉的伤害或外科手术、药物导致的味觉障碍、味觉 缺失的患者中，从而用于减轻味蕾损失。再进一步地，本发明的基因和基因制品以及表达的细胞能 够用于筛选下述化合物其影响口腔卫生、口臭、口腔中有害物质的 消毒，以及细菌、病毒和唾液/嘴或消化道中的其它免疫原的中和/消 除。实施例8: SCN3A在对甜味、苦味和鲜味感觉起作用的TRPM5细胞中 被表达。因此，调节SCN3A功能的化合物可用来增强或阻断甜味、苦 味和/或鲜味。实施例9:实施例10:本实验的结果包含在图10中，该实验是说明不同味觉细 胞中PKD2L1和TRPM5表达的双标记免疫组织化学的实施例。左侧图像 出示以对抗PKD2L1 (绿色)的商业抗体标记的小鼠CV ^^木蕾；中间图 像出示使用Senomyx (红色)开发的抗体以TRPM5标记；右侧图像出 示PKD2L1和TRPM5标记物的融合。底部4个图像出示高放大倍率下单 个味蕾-注意PKD2L1与TRPM5 (标记物在分别的细胞种类中表达)不 共位，其表明PKD2L1在甜味、苦味和/或鲜味味觉细胞(以TRPM5标 记)中不表达。。相同的数字也出示PKD2L1延伸到味觉受体细胞(图像的 上部)的尖端，而HCN4不在所述味孔区域。PKD2L1和HCN4在细胞体 中共位，但是只有PKD2L1在所述顶端膜中表达。底部图像出示所述融 合的图像中虛线框画出的区域的放大图。
双-四{(乙酰氧基)甲基}酯(分子探针公司)。
29. 权利要求22的方法，其中所述钠离子敏感染料是四乙酸绿钠(分子探针公司)或钠-敏感染料试剂盒(分子装置公司)。
30. 权利要求15的方法，其中该测定通过离子流测定来测量活性。
31. 权利要求30的方法，其使用原子吸收光语测定离子流。
32. 权利要求15的方法，其中推定的咸味影响基因在可调节启动子的控制下表达。
33. 权利要求15的方法，其使用荧光板阅读器(FLIPR)。
34. 权利要求15的方法，其使用电位成像板(VIPR)阅读器用来增加钠离子或液体吸收。
35. 权利要求15的方法，其中选择的化合物促进钠离子运输到味
36. 权利要求15的方法，其使用膜电位染料，所述膜电位染料选自分子装置膜电位试剂盒(Cat#R8034 ) 、 二-4-ANEPPS (吡啶盐，4-(2- ( 6- ( 二丁基氨基)-2-萘-基)乙烯基)-1「 ( 3-磺丙基))氢氧化物、内盐、DiSBACC4 (2)(双-(1， 2-二巴比妥酸)-三乙炔氧洛希尔)、DiSBACC4 (3)(双-(1， 3-二巴比妥酸)-三乙炔氧洛希尔)、Cc-2-DMPE(太平洋蓝1， 2-双十四酰-sn-丙三醇-3-磷酸乙醇胺，三乙基铵盐)和SBFI-AM(1，3-苯二羧酸，4，4-[1，4， lO-三氧杂-7， 13- 二氮杂环十五烷-7， 13-二基双(5-甲氧基-6，1，2-苯并呋喃二基)]双-四[(乙酰氧基)甲基]酉旨(分子探针公司)。
37. 权利要求15的方法，其中所述细胞稳定表达所述推定咸味影响基因。
38. 权利要求15的方法，其中所述细胞短暂表达所述推定咸味影响基因。
39. 权利要求15的方法，其中使用钠离子敏感性染料监控活性。
40. 权利要求39的方法，其中所述染料是四乙酸绿钠(分子探针公司)或钠-敏感染料试剂盒(分子装置公司)。
41. 权利要求15的方法，其中通过膜片钳或双电极电压钳在蛙卵母细胞中在电生理学上测定活性。
42. 权利要求41的方法，其使用自动成像仪。
43. 权利要求42的方法，其中所述仪器是荧光板阅读器(FLIPR)。
44. 权利要求42的方法，其中所述仪器是电压成像板阅读器(VIPR)。
45. 权利要求15的方法，其中表达所述基因序列的细胞，选自HEK-293、 BHK、 CH0、 C0S、猴L细胞、非洲绿猴肾细胞、Ltk-细胞和卵母细胞。
46. 权利要求l-45中任一项的方法，其中筛选的基因包括包含于表l-3中任何一个的基因。
47. 权利要求45的方法，其中所述细胞是HEK-293细胞。
48. —种用于鉴定具有潜在的调节人甜味、苦味或鲜味味觉的体内应用的化合物的测定，包括以下U)用至少一个推定的增强剂化合物接触细胞，所述细胞表达表1-3中列出的存在于TRPM5 p未觉细胞中的基因；(U)在存在和不存在所述推定的增强剂的情况下，测定钠电导、受体活性或钠转运；和(iii)基于其是否提高钠电导、所述受体的活性或钠转运来鉴定作为甜味、苦味或鲜味味觉的潜在增强剂的化合物。
49. 权利要求48的测定，其中所述细胞是哺乳动物细胞或蛙卵母细胞。
50. 权利要求48的测定，其中所迷哺乳动物细胞是CH0、 Cos、BHK或HEK-293细胞。
51. 权利要求50的测定，其中所述细胞是HEK-293细胞。
52. 权利要求48的测定，其中在味觉试验中证实所述化合物对甜味味觉的影响。
53. 权利要求48的测定，其中在味觉试验中证实所述化合物在鲜味味觉的影响。
54. 权利要求48的测定，其中在味觉试验中证实所述化合物在苦味味觉的影响。
55. 权利要求52-54中任一项的测定，其中用人志愿者实现味觉试验。
56. —种用于鉴定推定的酸味味觉调节剂的测定，包括(i)用化合物接触细胞，所述细胞表达表1-3中列出的存在于PKD2L1/PKD1L3味觉细胞的基因和任选地涉及酸味感觉的另一基因；(U)测定所述化合物对离子转运、离子电导或由所述通道引起的活性的影响；和(iii)如果它对离子转运、离子电导或由所述通道引起的活性是具有影响，则鉴定所述化合物为酸味味觉调节剂。
57. 权利要求56的测定，其中所述离子是钠离子。
58. 权利要求56的测定，其中在味觉测试中证实所述化合物对酸味味觉的影响。
59. 权利要求58的测定，其中用人志愿者实现所述味觉试验。
60. 权利要求56的测定，其包括加入已知引起酸味的化合物且所述篩选所述化合物对离子转运、离子电导或通过所述通道引起的活性的影响。
61. 权利要求56的测定，其中所述细胞也表达PKD2L1/PKD1L3。
62. —种方法，其在筛选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表l或表2或表3中叙迷的基因或其直向同源物或与其相比具有至少90%的序列一致的其变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定推定地调节至少一种味觉细胞生长、衰老、凋亡或味蕾再生的化合物。
63. 权利要求62的方法，其中所述筛选测定在表达所述基因的转基因动物或在遗传修饰动物中实现，所迷遗传修饰动物利用siRNA或基因敲除法展示降低的或消除的所述基因的表达。
64. —种方法，其在筛选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表l或表2或表3中叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90%的序列一致的其变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定推定地调节胃肠功能的化合物。
65. 权利要求64的方法，其中所述细胞是味觉或胃肠细胞，且所述测定筛选影响胃动力、食物辩别力、食物吸收或肽分泌之一的化合物。
66. 权利要求65的方法，其中筛选的化合物影响淀粉酶、GLP-1(胰高血糖素类肽l)、促胰液素、胃蛋白酶和GIP (葡萄糖依赖性促胰岛素多肽)的至少一种的分泌。
67. 权利要求64的方法，其中体内评估鉴定的化合物对味觉或胃肠功能的影响。
68. 权利要求64的方法，其中胃肠功能包括营养吸收、营养辩别、离子转运、肽或激素或酶分泌和/或食欲。
69. —种方法，其在篩选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表1或表2或表3中叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90%的序列一致的变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定在治 疗或预防涉及消化系统或消化器官的病理学病况中具有潜在治疗效能 的化合物。
70. 权利要求69的方法，其中所述病况是功能性消化不良或其它 溃疡或非溃疡相关的消化不良。
71. 权利要求69的方法，其中所述治疗性化合物影响与饥饿或消 化力相关的激素。
72. 权利要求71的方法，其中所述蛋白选自促胃液素、促胰液素、 淀粉酶、缩胆囊肽、葡萄糖依赖性促胰岛素多肽、胰高血糖素类肽1生 长素或瘦素。
73. 权利要求69的方法，其中所述治疗性化合物用于治疗炎性或 自身免疫性胃肠疾病。
74. 权利要求73的方法，其中所述疾病选自脂泻病、炎性肠综合 症、克罗恩氏病、Sjogren氏综合症、胃炎、憩室炎或溃疡性结肠炎。
75. 权利要求69的方法，其中所述治疗性化合物用于治疗或预防 消化系统或消化器官相关的癌症。
76. 权利要求75的方法，其中所述癌症侵袭选自结肠、小或大肠、 肛门、肝脏、胰腺、胆囊、食道、舌、唾液腺、味蕾或胃癌或癌相伴 恶病质的器官.
77. 权利要求69的方法，其中所述治疗性化合物用于治疗或预防 食欲相关的疾病或功能失调。
78. 权利要求77的方法，其中所述食欲相关的疾病或病况是贪食 症或厌食或与之相关的恶病质。
79. 权利要求69的方法，其中所述治疗性化合物用于治疗或预防 胃返流相关的病症或疾病。
80. 权利要求79的方法，其中所述病症或疾病选自胃食道返流 病、食管炎、Barrett氏食管或胃灼热。
81. —种方法，其在筛选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多 肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表1或表 2或表3中叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90%的序列一 致的变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定对调 节口腔或胃肠道中的免疫系统有用的化合物。
82. 权利要求81的方法，其用来筛选用于治疗牙龈炎、口臭或中 和或抑制其中有害物质或微生物的化合物。
83. —种方法，其在篩选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多 肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表1或表 2或表3叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90。/。的序列一致的变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定对治疗 口干症(例如，在干燥综合症中)、味觉障碍或味觉缺乏症之一有用 的化合物。
84. —种方法，其在筛选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用通过选自表1或表2或表3中叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90%的序 列一致的变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定 对治疗涉及味觉或消化细胞功能的代谢紊乱有用的化合物。
85. 权利要求84的方法，其中所述代谢紊乱是糖尿病或肥胖。
86. —种方法，其在筛选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多 肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表l或表 2或表3中叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90%的序列一 致的其变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述筛选测定来鉴定化合物所述化合物影响味觉细胞受体的运输、味觉细胞神经递质释放、 味觉受体功能的自分泌/旁泌性调节机制和味觉细胞动作电位放电频 率/膜电位中的至少一种。
87. —种方法，其在筛选特异性结合和/或调节所述味觉特异性多 肽的活性的化合物的结合或功能性测定方法中，使用由选自表1或表 2或表3中叙述的基因或直向同源物或与其相比具有至少90%的序列一致的变异体编码的味觉特异性多肽，并基于所述篩选测定来鉴定对治 疗创伤、癌症、化疗、辐射、损伤或手术后的味觉细胞损失或者老年 相关味蕾损失的后果潜在有用的化合物。
88. —种分离或纯化的味觉或胃肠细胞，其表达至少一种表l、 2 或3中叙述的基因。
89. 权利要求88的分离的味觉细胞，其进一步表达ot ENaC、细 胞角蛋白19和/或C6orfl5。
90. 权利要求88的分离的味觉细胞，其不表达T1R。
91. 权利要求88的分离的味觉细胞，其不表达T2R。
92. 权利要求88的分离的味觉细胞，其不表达PKD2L1/PKD1L3 和/或TRPM5。
93. 权利要求88的分离的味觉细胞，其是人细胞。
94. 权利要求88的分离的味觉细胞，其不表达T1R、 T2R或 PKD2L1/PKD1L3。
95. 权利要求88的分离的味觉细胞，其表达干细胞相关的基因。
96. 权利要求88的分离的味觉细胞，其表达选自TNF、 MIF、千 扰素和白细胞间介素的细胞因子基因。
97. 权利要求88的分离的味觉细胞，其表达生长因子.
98. 权利要求88的分离的味觉细胞，其表达味导素或转导蛋白。
99. 权利要求88的分离的味觉细胞，其不表达味导素或转导蛋白。
100. —种方法，其在细胞分离、纯化、富集或标记技术中使用 至少一种包含于表1、2或3中的基因或其直向同源物或编码与其相比 具有至少90%的同一性的蛋白的变异体，所述细胞分离、纯化、富集 或标记技术基于至少一种包含于表1、 2或3的基因或其直向同源物、 或编码与所迷基因或其直向同源物至少90%同 一性的蛋白的基因的表 达或不表达，分离、纯化、富集和/或标记包含于混合细胞群体或细胞悬浮液的至少一种想要的味觉细胞类型或镨系，所述混合细胞群体或 细胞悬浮液包含想要的味觉细胞类型或镨系。
101. 权利要求100的方法，其中通过包括使用激发荧光细胞分离 器(FACS)的方法分离、纯化、富集或标记想要的味觉细胞类型或镨 系。
102. 权利要求100的方法，其中通过包括使带用标记磁珠的方法 分离、纯化、富集或标记想要的味觉细胞类型或谱系。
103. 权利要求100的方法，其中通过含有p未觉细胞的組织的酶消 化和/或组织解聚制备混合细胞群体或细胞悬浮液。
104. 权利要求103的方法，其中细胞源自于至少舌、口腔、胃肠 道或相关的器官或者泌尿道中的至少一种。
105. 权利要求100的方法，其中通过包括基于至少一种包含于表 1、 2或3的基因的表达或不表达至少一种除去的非靶标细胞亚类或谱 系的阴性细胞选择技术的方法来分离、纯化、富集或标记想要的味觉 细胞亚类或i普系。
106. 权利要求100的方法，其中该方法使用细胞毒素抗体特异性 杀死至少一种非靶标细胞亚类或谱系。
107. 权利要求100的方法，其中富集、分离、纯化或标记的味觉 细胞亚类包括甜味味觉细胞。
108. 权利要求100的方法，其中富集、分离、纯化或标记的味觉 细胞亚类包括鲜味味觉细胞。
109. 权利要求100的方法， 细胞亚类包括苦味味觉细胞。
110. 权利要求100的方法， 细胞亚类包括酸p未p木觉细胞。
111. 权利要求100的方法，细胞亚类包括咸味味觉细胞。
112. 权利要求100的方法， 细胞亚类包括油脂味味觉细胞。
113. 权利要求100的方法， 细胞亚类包括味觉干细胞。
114. 权利要求100的方法， 细胞亚类包括味觉细胞神经原。
115. 权利要求100的方法, 细胞亚类包括味觉免疫细胞。权利要求书第15/16页 其中富集、分离、纯化或标记的味觉其中富集、分离、纯化或标记的味觉其中富集、分离、纯化或标记的味觉其中富集、分离、纯化或标记的味觉其中富集、分离、纯化或标记的味觉其中富集、分离、纯化或标记的味觉其中富集、分离、纯化或标记的味觉
116. —种在篩选味觉调节化合物的方法中使用根据权利要求 100-112中任一项的分离、纯化、富集或标记的细胞的方法。
117. —种在筛选诱导所述富集、分离、纯化或标记的味觉干细胞 分化为一种或多种味觉细胞谱系或亚型或味蕾的化合物的方法中，使 用根据权利要求113制备的分离、富集、纯化或标记的味觉干细胞的 方法。
118. 权利要求117的方法，其中基于至少一种包含于表l、 2或 3的味觉特异性基因的表达或不表达来鉴定所述味觉细胞谱系或亚
119. 根据权利要求100-118中任一项制备的分离、纯化、富集或 标记的味觉细胞镨系或亚型。
120. 权利要求119的分离、纯化、富集或标记的细胞谱系或亚型， 其包括甜味、鲜味、苦味、酸味、咸味、油脂味或金属味觉细胞或味 觉细胞神经元、免疫或千细胞。
121. 权利要求119的分离、纯化、富集或标记的细胞谱系或亚型， 其是人的细胞镨系或亚型。
122. 权利要求119的分离、纯化、富集或标记细胞谱系或亚型源 自于人的舌、口腔、胃肠道或相关的器官或者泌尿道或泌尿器官。
123. 根据权利要求119的味觉特异性细胞在筛选调节至少一种 甜味、鲜味、苦味、酸味、咸味、油脂味或金属味觉中至少一种的化 合物的测定中的用途。
124. 根据权利要求119的细胞在筛选调节味觉细胞分化或更新 的化合物的方法中的用途。
125. 根据权利要求119的味觉细胞在筛选调节或治疗消化功能、 味觉细胞更新、食物辩别、口腔免疫、食欲、胃肠代谢紊乱、营养吸 收、营养排泄、消化液、肽、酶或激素分泌、味觉受体运输或自身免 疫、肿瘤或炎性胃肠疾病或病症中至少一种的化合物的测定中的用途。
全文摘要
更具体地说，本发明涉及鉴定味觉特异基因的新基本原理和方法，所述新的味觉特异基因包括涉及咸味味觉感知的基因、以及涉及其它味觉细胞或味觉受体相关活动(诸如消化功能和与消化相关的疾病、味觉细胞紊乱、口或消化道的免疫调节，以及诸如的糖尿病和肥胖的代谢调节)的基因，使用这些方法所鉴定的基因用于使用这些基因鉴定味觉调节子(增强子或阻断子)以及潜在疗法的测定。这些化合物在调节(增强或阻断)味觉感测(特别是咸味味觉感测)以及作为潜在疗法方面具有潜在的应用。此外，本发明涉及鉴定味觉特异基因的新方法，其中所述味觉特异基因能够用作标记用于哺乳动物中的不同味觉细胞类型，包括甜味、苦味、鲜味、酸味、咸味和其它味觉细胞，以及在存在这些基因时测量甜味、苦味、鲜味或酸味受体的活性以鉴定甜味、苦味、鲜味和酸味的调节子以及以便鉴定特别用于治疗消化或代谢紊乱、味觉确实和口腔感染。进一步地，本发明特异方法用于纯化、富集、隔离或标记所需的味觉细胞子类型或族——诸如甜味、鲜味、苦味、咸味、酸味、油脂味或干细胞等，例如通过使用FACS、磁珠或纯化、富集、标记或消除的其它方法，诸如通过使用表达或不表达一种或多种味觉特异基因的标记的细胞毒素、细胞。
文档编号C12Q1/68GK101460635SQ200780021087
公开日2009年6月17日 申请日期2007年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者B·莫耶, D·卡拉巴特, F·埃韦里, P·哈韦齐, 娜 高, 敏 鲁 申请人:塞诺米克斯公司