专利名称：：通过发酵生产法尼基化二苯并二氮杂酮的方法
技术领域：
：本发明涉及用于从发酵液制备包含大量法尼基化二苯并二氮杂萆嗣(farnesylateddibenzodiazepinone),即ECO-4601j农缩物的方法。本发明进一步涉及包含大量法尼基化二苯并二氮杂萆酮，即ECO-4601的浓缩物，其中，所述浓缩物可被加工用于药物供应，以施予需要这种药物的哺乳动物以便治疗如癌症等疾病情形。
背景技术：
：化合物ECO-04601(以下简称ECO-4601)是一种新型法尼基化二苯并二氮杂萆酮，即10-法尼基-4,6,8-三羟基-二苯并二氮杂萆-11-酮，其具有如下式1所示的结构。式1ECO-4601已经从放线菌(actinomycete)小单孢菌属(A^crawo"o^ora)的新菌林的发酵培养物中分离，如2004年1月21日提交的美国专利申请第10/762,107号中所公开的(2005年2月24日作为US2005-0043297公布，2006年9月5日作为美国专利第7,101,872号公告)，也如2004年8月5日PCT国际申请WO2004/065591中所公布的。ECO-4601的结构随后由查兰(Charan)等人(2004),A^.尸racZ.，vol.67，p.1431-1433所公开，该化合物已经从小单孢菌林DPJ12的发酵液收集的固体中提取，所述小单孢菌抹DPJ12从日本狮子岛(ShishijimaIsland)的海洋海鞘戴4寻姆普牙牛4争(Z)We附www/ra/z/eriwzKott.)中分离。查兰等人称这些分离的法尼基化二苯并二氮杂萆酮为"戴兹平诺米辛(diazepi誦icin)"。化合物ECO-4601随后由嵐结花(Igarashi)等人(2005)，丄vol.58,p.350-352所公开，该组通过提取放线菌小单孢菌属TP-A086培养物的发酵液来分离所述化合物，所述小单孢菌属TP-A086从日本大沢野(Osawano)收集的固体样品中分离。已经显示ECO-4601拥有抗菌和抗癌活性，且从动物才莫型研究结果表明了ECO-4601的体内抗癌性能(参见2004年9月27日提交的美国专利申请第10/951,436号(2005年5月19日作为US2005-010736Al公布，2007年3月6日作为美国专利第7,186,713号公告)，以及2005年5月16日提交的美国专利申请第11/130,295号(2006年4月13日作为US2006-0079508Al公布))。已经公开了经由发酵方法可生产限量的ECO-460L美国专利申请第11/130,295号公开了ECO-4601能够通过如下方法来生产给培养基接种能够生产ECO-4601的微生物样品，例如小单孢菌抹046-ECO11或菌林[S01]046;然后在水浴或发酵罐中通过搅拌(如振荡)通风，或者通过向培养基中注射空气、氧气或合适的气体混合物给所述已接种的培养物接种。接种能够在约18至40CTC和pH值约6至9条件下合适的培养基中持续大约3至4天，所述培养基包含可同化的碳、氮、任意无机盐和其它已知生长因子源。完成培养后，能够通过如离心、吸附、层析和过滤等本领域已知技术来分离ECO-4601。有机溶剂例如乙酸乙酯、正丁醇、乙酸正丁酯或4-曱基-2-戊酮等可以与所培养的培养基混合，离心分离有机层，接着通过蒸发干燥或通过真空蒸发干燥除去溶剂，生成含残余物的ECO-4601。通过以下方法能够进行下游纯化选一奪地重组所述残余物和乙醇、乙酸乙酯、曱醇或它们的混合物；使用合适的有机溶剂例如己烷、乙腈、乙酸乙酯、曱醇和四氯化碳、二氯甲烷或它们的混合物在二相体系中二次提取；接着采用本领域中已知技术如层析进一步纯化。用于生产本发明的限量法尼基化二苯并二氮杂革酮的发酵方法已经在本领域中描述。例如，風结花等人(见前)描述了一种方法，其中，使用正丁醇提取5升发酵液，真空浓缩有机层生成17克油性提取物。层析纯化所述提取物(先硅胶后LH-20)生成16毫克淡黄色针状物。在查兰等人(见前)的文章中描述了一种方法，其中离心4升小单孢菌DPJ12发酵液，用水洗涤所生成的细胞群和HP20树脂(50g/L发酵液)并用曱醇(3x250mL)提取。在真空中浓缩合并的甲醇提取物并用乙酸乙酯(4x60mL)提取以生成278毫克的提取物。进一步纯化(先葡萄糖凝胶LH-20柱后反相HPLC)产生4.8毫克戴兹平诺米辛产物。由于ECO-4601向商业药物产品的发展，将要求所述化合物的发酵生产在一定规模以便产生所述化合物的数量足以满足用于临床试验测试方案，以及其后用于制剂和剂量(其将开给需要治疗的病人)的后续商业制备的要求。同样，对于与小单孢菌属(其用于生产对临床测试和药物产品的商业生产有用数量的ECO-4601)的发酵有关的稳健的和商业实用的发酵方法有需求。有利的是，所述发酵方法应当在从实验室水平到各种水平的商业生产方面提供了若干好处，尽管同时不要求增加发酵容器的数目或其他种类的设备和/或参与下游处理和纯化步骤的步骤也不要求超出与增加的发酵体积直接成比例的增加体积的提取溶剂。也存在用于ECO-4601的生产(其从发酵液提供高产率的化合物)的发酵方法的需求，其允许所述化合物从所述发酵液中高效提取，并且以一定形式，优选地为浓缩形式(其是稳定的，方便运输的)提供，且其随后易受用于ECO-4601晶型生产的下游处理的影响，所述ECO-4601晶型随后可被制为药物可接受的组合物，供需要这种组合物的病人使用。发明概述本发明提供用于回收和浓缩结构式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>式1包括以下步骤a)在水培养基中发酵能够产生所述法尼基化二苯并二氮杂革酮的微生物菌林，从而产生包含所述结构式1的法尼基化二苯并二氮杂革酮的发酵液；b)通过酸化调节所述发酵液允许所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮与存在于所述发酵液中的颗粒物相締合(associate);c)从所述发酵液中收获所述颗粒物以获得收获颗粒物；d)以体积是所迷收获颗粒物的体积大约2:1至大约5:1的比例的合适的有机溶剂提取所述收获颗粒物，从而形成提取物；以及e)处理所述提取物以形成包含所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮第一浓缩物，其中所述第一浓缩物包含所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮，所述法尼基化二苯并二氮杂革酮的浓度比所述a)发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂革酮高大约50倍，并且其中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮从所述a)的发酵液中回收，其数量至少大约是所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂革酮数量的50%。另一方面，本发明的方法进一步包括处理所述第一浓缩物以便降低所述第一浓缩物中的杂质的水平，从而产生第二浓缩物。根据本发明的一方面，第二浓缩物中除了式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮外实际上没有分子。根据本发明的另一方面，本发明的方法还进一步包括从所述第二浓缩物中结晶式1的法尼基化二苯并二氮杂革酮的步骤，从而产生适合用于制备药物制剂的式1的结晶法尼基化二苯并二氮杂革酮。根据本发明的另一方面，所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮从所述a)的发酵液中回收，其数量至少大约为所迷发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮数量的60%，另一方面，所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮从所述a)的发酵液中回收，其数量至少大约为所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮数量的65%。根据本发明的方法的另一方面，所述颗粒物包含存在于发酵液中的发酵微生物。根据本发明的方法的另一方面，所述颗粒物进一步包含吸附树脂(absorbentresin)。根据本发明方法的另一方面，所述发酵液被调节至pH值为大约2至大约4,且根据本发明方法的另一方面，所述发酵液进一步被调节至大约2匸至大约4。C的温度范围，而根据本发明的另一方面，所述发酵液在所述温度范围内维持大约16小时至大约72小时。根据本发明方法的另一方面，所述发酵在大约48小时至110小时内完成。根据本发明方法的另一方面，微生物是细菌，更进一步，所述细菌是放线菌，且更进一步所述放线菌是小单孢菌(A^crawo"o^or")、链霉菌(S"e/^om少ces)或红球菌(A/zot/ococcws)属，且更进一步，所述放线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。根据本发明方法的另一方面，所述合适的有机溶剂包括至少一种低级烷基醇，另一方面所述低级烷基醇是曱醇、或乙醇、或丙醇、或异丙醇或丁醇或这些低级烷基醇中两种的混合物。另一方面，所述合适的有机溶剂为乙酸乙酯或乙腈。根据本发明方法的另一方面，微生物菌抹在其中发酵的水培养基是AP、CA、DZ、GP、HI、JA、MI、PI、QI、QP或YB,另一方面，所述水培养基是QB、MA、KH、RM、JA、FA或HI。根据本发明方法的另一方面，从所述发酵液中收获颗粒物使用超滤系统来进行，另一方面，所述超滤系统具有一个或多个过滤元件，所述过滤器元件具有孔径尺寸大约0.2至大约0.45微米。根据本发明方法的另一方面，从所述发酵液中收获颗粒物通过离心来进行。根据本发明的另一方面，收获颗粒物的提取包括一至三轮使用合适的有机溶剂的提取，另一方面，提取进一步包括在温度大约39X:至大约45。C,以流速(flowrate)大约30Hz至大约50Hz,循环体系中所述颗粒物和合适的有机溶剂，且更进一步，循环大约50分钟至120分钟。另一方面，提取包括使所述颗粒物与合适的有机溶剂一起离心处理。根据本发明方法的另一方面，用于提取的合适的有机溶剂的体积按与收获颗粒物质量成比例(体积质量)或按与收获的颗粒物体积成比例(体积体积)来计算。根据本发明方法的另一方面，提取、收获的颗粒物的处理是蒸发处理，另一方面，蒸发处理在减压下进行，另一方面，当以吸附树脂(例如，HP20树脂)培养提取物时进行蒸发，其中蒸发处理在减压下进行。根据本发明方法的另一方面，提取、收获的颗粒物的处理包括以吸附树脂培养提取物以形成混合物，接着通过向混合物中添加水而将式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮置换(displace)至树脂上。另一方面，与所迷提取物混合的所述吸附树脂以比率(W/W)是所述提取物中所述式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的大约10倍至大约40倍来提供。根据本发明方法的另一方面，所述水以体积比(v/v)是混合物体积的大约0.5%至大约20%添加到所述混合物中，另一方面，体积流速(volumeflowrate)是所述混合物体积的大约0.5%至大约5%。另一方面，所述添加到混合物中的总体积为是混合物体积的大约1.0至大约1.5倍。另一方面，所述添加到所述混合物中水的总体积是所述混合物的体积的大约1.2至大约1.5倍。在本发明的另一实施方式中，本发明提供了包含结构式1的法尼基化二苯并二氮杂革酮的浓缩物，式1其中，所述浓缩物根据本发明的方法而获得。另一方面，本发明提供的浓缩物包含式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮，其中所述式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮从所述a)的发酵液中回收，其量是所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮的量的至少大约60%,另一方面，所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮从所述a)的发酵液中回收，其量是所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮的量的至少大约65%。在本发明的另一实施方式中，本发明提供了能够在发酵期间在水培养基体积中生产结构式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物，式l<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中在所述发酵期间平均产率是大约0.073mg/L/h至大约5.065.06mg/L/h。根据本发明的另一方面，当在发酵期间平均时，微生物的产率大约为2.15至5.06mg/L/h,根据本发明的另一方面，当在发酵期间平均时，所述微生物的产率是大约3.00mg/L/h至大约5.06mg/L/h。另一方面，所述微生物是细菌，更具体地，所述细菌是放线菌，更具体地，所述放线菌是小单孢菌、链霉菌或红球菌属；更具体地，所述放线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。在另一实施方式中，本发明提供放线菌属，即具有IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。在另一实施方式中，本发明提供各种用于培养细菌的培养基组合物和用于培养细菌的方法，其中，根据本发明的另一方面，例如，这样的培养基和方法可用于在水环境下生长细菌从而产生发酵液培养物。一方面，所述培养基組合物包含10g/L葡萄糖、20g/L可溶性淀粉、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨(Bacto-peptone)和2g/LCaC〇3。另一方面，所述培养基组合物包含10g/L葡萄糖、40g/L马铃薯糊精、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨和2g/LCaC〇3。另一方面，所述培养基组合物包含10g/L葡萄糖、25g/L可溶性淀粉、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨和3g/LCaC03。另一方面，所述培养基包括12g/L葡萄糖、10g/L马铃薯糊精、5g/L玉米浆(cornsteepliquor)、10g/L药用培养基(Pharmamedia)和4g/LProflo(美国的一种食用商品名，TraderOilMil.Co.出品)油。另一方面，所述培养基包含20g/L马铃薯糊精、8.34g/L酵母提取物、30g/L甘油、2.5g/L细菌蛋白胨和3g/LCaC03。附图简述图1至4表示参与ECO-04601生物合成路径的不同步骤。图1至4分别表示三种生物合成基因座A、B和C，其中ORF由箭头表示。加深表示的(highlighted)ORF参与示意图中所述的步骤。参与示意图中所描述的步骤的生物合成酶由它们的家族名称和每个基因座A、B和C中的各自的ORF号(例如，8/7/7)来显示。图1表示用于生产提供ECO-04601的法尼基基团的法尼基焦磷酸的生物合成路径的示意图。图2表示用于生产二苯并二氮杂萆酮基团的3-羟基邻氨基笨曱酸-腺普酸(3-hydroxy-anthranilate-adenylate)前体的生物合成^各径的示意图。图3表示用于生产核心二苯并二氮杂萆酮的2-氨基-6羟基-[l,4]苯醌前体的生物合成路线的示意图。图4表示ECO-04601前体、法尼基焦磷酸、3-羟基邻氨基苯曱酸-腺苷酸和2-氨基-6羟基-[l,4]苯醌组合的生物合成路径的示意图。图5是描述参与制备用于中试发酵生产的主种子(seed)储备物和工作种子储备物的程序的多个步骤的流程图。图6是描述参与种子摇瓶发酵、用于与中试发酵一起使用的接种体发酵和中试发酵的准备生产的程序的多个步骤的流程图。图7是描述在收获之前调节发酵液、收获颗粒物、提取收获颗粒物和处理提取物以便形成浓缩物的多个步骤的流程图。图8是描述参与将ECO-4601从混合提取物置换至树脂程序的多个步骤的流程图。发明详述本发明提供一种用于法尼基化二苯并二氮杂萆酮的发酵生产的可计量(scalable)方法1、定义。除非另外指出，本文所使用的技术和科学术语具有如本发明所属
技术领域：
的技术人员普遍理解的含义。为了方便，下面提供了在说明书、实施例和所附权利要求书中所用的某些术语和短语的含义。本文所用的术语"法尼基化二苯并二氮杂萆酮"是指一类包含法尼基部分的二苯并二氮杂萆酮化合物。该术语包括，但不限于，本发明所列举的化合物10-法尼基-4,6,8-三羟基-二苯并二氮杂萆-11-酮，其在本文中表示为"ECO-04601"。本文所用的术语"法尼基化二苯并二氮杂萆酮"包括这类在化学合成中能够用作中间体的化合物。本文所用的术语"浓缩物"表示液体、半固体或部分包含大量法尼基化二苯并二氮杂革酮，即ECO-4601的固体。如果以半固体或固体的形式，所述浓缩物可基本上不含水和/或基本上不含任何用以生产浓缩物的溶剂。应该理解无论是半固体还是固体，所述浓缩物可以采取高粘液状的形式。以固体形式存在的浓缩物基本上不含任何可被提供与吸附树脂相混合的溶剂。本文所用的术语"第一浓缩物"是指部分包含式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮，即ECO-4601的浓缩物，其中所述第一浓缩物通过处理包含式1的法尼基化二苯并二氮杂革酮的发酵液的提取物而形成。随后，可以使所述第一浓缩物或这些第一浓缩物的混合经过处理，以降低存在于第一浓缩物中杂质的水平，例如，在包含至少一轮纯化的柱纯化程序中处理，从而使得包含式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的第二浓缩物形成。第二浓缩物除式1的法尼基化二苯并二氮杂蕈酮之外，基本上不含其它分子。随后，可使第二浓缩物结晶处理，以产生适合用于制备药物制剂的结晶ECO-4601。本文所用的术语"比率(W/W)"表示彼此成相对比例的两个质量的比。优选地，该术语表示相对于存在于发酵液中ECO-4601的质量而言，存在于浓缩物中法尼基化二苯并二氮杂萆酮，即ECO-4601的质量。此外，术语"比率(W/W)"包括，并且可以与相对于彼此根据两个质量百分数表示的比率的表达式互换，例如，通过存在于浓缩物中ECO-4601的质量的表达式作为存在于发酵液或混合发酵液中ECO-4601的质量分数。所述发酵液可以为单一发酵液，或可以为两种或多种分离的发酵液(其在提取之前已经被组合)的组合。应当理解相对于存在于发酵液中ECO-4601的质量，在描述存在于浓缩物中ECO-4601的含量时，将使用当量质量单位，例如，微克(pg)对微克(pg)、毫克(mg)对毫克(mg)、克(g)对克(g)、或千克(kg)对千克(kg)。这样，应当理解，用于表达比率(W/W)的质量单位不受单位具体量级或大小的限制(例如仅为kg)，且当表示浓缩物中ECO-4601的重量(第二质量)相对发酵液中ECO-4601重量(第一质量)的比率w/w时，应当理解包括所有的单位。本文所用的"菌抹"含义是具有给定类型微生物(例如细菌)，或特定种类、种属和血型的普遍特征的一个细胞或多个细胞。如果所述菌林包括多个细胞，本领域技术人员将承认所述细胞将来自单一微生物或纯培养分离物。本文所用的术语"能够产生法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物"是指携带了产生法尼基二笨并二氮杂萆酮化合物必需的基因信息的微生物，不管所述微生物是否自然产生所述化合物。该术语同样适用于当微生物存在于其自然环境时，其中产生法尼基二苯并二氮杂萆酮化合物的基因信息在微生物中被发现的那些微生物中，以及其中基因信息由重组技术引入的那些微生物中。本文预期的具体微生物包括，但不局限于，小单孢菌科(M/c'ramo冊^oraceae)，其中优选的菌属包括小单孢菌、游动放线菌(Jc""o;/(2wes)和指孢嚢菌(Z)"c(y/c^/on2wg/wm);链霉菌科(&rc/^ow_yce^ceae),其中优选的菌属包括链霉菌和北里孢菌(A7tosa^w/ora);假诺卡氏菌科(尸sew(iowocaniz'aceae)，其中优选的菌属包括拟无枝菌酸菌(^myco/Wo/w*)和糖多孢菌(5^cc/^TO/7o/"/7ora);束丝放线菌科(y4c〃wc^j^mematoceae),其中优选的菌属包括糖丝菌(Sacc/zaraAn;c)和束丝放线菌(^"/was^wzewa);以及红球菌种属类；然而所述术语意图嚢括所有包含产生法尼基二苯并二氮杂萆酮化合物必需的基因信息的微生物。优选的法尼基二苯并二氮杂萆酮化合物的制造者包括小单孢菌属菌株[S01U02]046,其于2005年9月7日，在加拿大R3E3R2，马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015的加拿大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构作了保藏，保藏号为IDAC070卯5-01。本文所用的"水培养基"含义是包含一种或多种可同化的碳、氮和无机盐源的培养基，且其能够支持能够合成ECO-4601的微生物的生长。本文所用的术语"调节"表示变化，所述变化在完成发酵培养期间，在一个或多个物理或化学条件或包含法尼基二苯并二氮杂革酮发酵液的条件中诱导。所迷发酵液的化学条件的调节包括，但不限于，诱导所述发酵液酸化。所述发酵液的物理调节包括，但不限于，降低所述发酵液的温度。可以使用本领域熟知的技术或试剂完成具体调节，例如，用来降低所述发酵液温度的不同机械手段。所述术语同样适用于由一系列与单一调节相对的分级或分步调节产生的一种或多种条件的调节。另外，所述术语应当理解包括一个以上条件的同时调节，不论各条件是否由一系列与单一调节相对的分级或分步调节产生。本文所用的术语"颗粒物"表示一种或多种类型的微颗粒物，其存在于包含法尼基化二苯并二氮杂萆酮的发酵液中。所述术语包括，但不限于，能够产生法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物，其将缺省地(bydefault)存在于发酵液中。应当理解所述术语同样适用于能够至少结合法尼基化二苯并二氮杂萆酮的吸附树脂。所述吸附树脂在开始发酵过程时可存在于发酵液中，或者可在规定时间期满时或发酵液达到预定条件例如，具体密度或时期时加入发酵液中。许多种类的吸附树脂为本领域所熟知，并可用于本发明。这样的树脂包括，但不限于，XAD2、XAD4、XAD7、XAD8和XAD16(罗姆(Rohm)和哈斯(Haas));HP20、HP20S、HP20SS和SP70(Diaion);和反相硅胶如C-8、C-10和C-18。本文所用的术语"相締合，，表示化学或物理作用，该作用可以发生在法尼基化二苯并二氮杂萆酮的分子与存在于发酵液中颗粒物的一个或多个表面之间，这样使得法尼基化二笨并二氮杂萆酮通过颗粒物而保持或基本保持。所述术语包括，但不限于，弱的相互作用，其可以发生在法尼基化二苯并二氮杂萆酮分子与存在于发酵液中颗粒物的一个或多个表面之间，例如，氢键、静电吸引、范德华力、疏水力或分配。举例来说，所述术语应当理解包括通过合成吸附树脂(例如DiaionHP20树脂)吸附法尼基化二苯并二氮杂萆酮。本文所用的术语"合适的有机溶剂"表示法尼基化二苯并二氮杂萆酮，即ECO-4601在其中易溶的有机溶剂。对于易溶，其含义是所迷溶剂将以足够的浓度溶解大多数ECO-4601，要求提取浆液(由本发明包含ECO-4601的发酵液提供)的溶剂体积将在所述浆液体积的大约2至大约5倍范围内。应当理解所述术语同样适用于法尼基化二苯并二氮杂革酮，即ECO-4601在其中易溶的有机溶剂的混合物。用于从浆液提取法尼基化二苯并二氮杂萆酮的具体合适的有机溶剂或合适的有机溶剂的混合物的选择可依赖与溶剂中法尼基化二苯并二氮杂萆酮的溶解度相关的各种因素。这样的因素可包含，但不限于，溶剂成本、实用性、加工容易性、环境效应、危险潜力(例如，爆炸性)和可处理性。本领域所属技术人员将理解可以选择许多不同的合适的有机溶剂。优选地，所述合适的有机溶剂可以是1碳至4碳溶剂或芳香族溶剂。更优选地，所述合适的有机溶剂或合适有机溶剂的混合物可选自如下一种或多种溶剂类或具体溶剂低级烷基醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丁醇、丙二醇)；乙腈；曱苯；含氧有机溶剂如二烷基酮(例如丙酮、2-丁酮)、四氢呋喃、二氧杂环己烷、乙酸烷基酯(例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯)；和二烷基醚(例如二异丙基醚、叔丁基甲基醚)。本文所用的术语"按比例合适的有机溶剂的体积"表示当测量相对于所述溶剂混合的溶解物的质量或体积时的溶剂的体积数。应当理解为了本发明，当相对于从发酵液收获的颗粒物的体积或质量来描述合适的有机溶剂的体积时，将使用当量体积单位。例如，对于1L体积的颗粒物，将使用3L体积的合适的有机溶剂，如果从发酵液收获IOO克质量的颗粒物，将使用300mL体积的合适的有机溶剂。本领域所属技术人员将理解，所述收获的颗粒物可使用相等或不等体积的合适的有机溶剂、溶剂或它们的混合物、预提取进行两或三轮提取。此外，本领域所属技术人员应当理解倘若法尼基化二苯并二氮杂萆酮，即ECO-4601溶于混合物，则合适的有机溶剂可以是两种或多种有机溶剂的混合物。本文所用的术语"处理"表示使本发明的提取物经过物理或化学处理或它们的组合。所述物理或化学处理或它们的组合可以物理或化学方法的形式发生，其可应用于提取物，其中所述方法部分要求以一种或多种具体物质培养提取物。所述物理或化学处理或它们的组合应当足以实现从所述提取物中除去或基本除去合适的有机溶剂、溶剂或它们的混合物。所述术语包括，但不限于，蒸发过程，优选地当所述蒸发过程在减压下进行时，更优选地当所述蒸发过程结合提取物的升温操作时。此外，所述术语包括向提取物中添加吸附树脂，不管这种添加是选择的或与提取物蒸发过程相结合。此外，所述术语包括微过滤以除去大量溶剂，接着蒸发来干燥。此外，所述术语包括离心以从发酵液分离如菌丝体，以及在所述溶剂存在下从菌丝体中协助提取法尼基化二苯并二氮杂萆酮。本文所用的术语"置换"含义是从一种环境或条件向另一种环境、条件或状态移动或转换对象或分子(例如法尼基化二苯并二氮杂革酮)，其可以包括某一分子的物理或化学状态的变化，例如通过进行一步或多步，不论这样的步骤是机械还是化学步骤，从而导致这样的分子从溶液或浆液中移除。从溶液中除去这样的分子可以通过例如将这样的分子从溶液或浆液置换至吸附树脂上来实现。'本文所用的术语"基本上不含其它分子"含义是包含式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的浓缩物或化合物或混合物，以重量计，其是100%纯式l的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的至少60%、至少70%、至少大约80%、至少大约90%、至少大约91%、至少大约92%、至少大约93%、至少大约94%、至少大约95%、至少大约96%、至少大约97%、至少大约98%、至少大约99%。2、通过发酵生产法尼基化二苯并二氮杂萆酮A微生物、基因和重组微生物i)微生物本发明的法尼基化二苯并二氮杂萆酮可通过各种微生物生物合成。可以合成本发明的化合物的微生物包括，但不限于，放线菌目细菌，也称为放线菌。属于放线菌的非限定性实施例包括诺卡氏菌属(Mc"Wa)、地嗜皮菌属(Ge。cfer腦啤/z//1^)、游动放线菌属(Jc""o尸/頭M)、小单孢菌、嗜盐碱放线菌(iVbcara^oW^)、糖丝脔(5"acc/2(2raf/7h义)、拟无枝菌酸菌(」myco/加o/w^)、库特那尼亚(Kutzneria)、糖单孑包菌属(Sacc/wrawo"c^/7ora)、糖多孢菌(S"c'c/7"ra/o/少5pora)、北里孢菌(A^<xy"/oA7ora)、链霉菌、小双孑包菌(Mcra6邵or")、链孑包嚢菌(5Vr一fw/ora"g,.画)和马杜拉放线菌(爿","ow"^ra)。放线菌的分类是复杂的，参考古德菲勒(Goodfellow)SupragenericClassificationofActinomycetes(1989);Bergey'sManualofSystematicBacteriology,Vol.4(威廉斯(Williams)和威尔金^t(Wilkins),巴尔的摩(Baltimore),pp.2322-2339);以及爱伯利(Embley)和斯戴克勃兰特(Stackebrandt),"Themolecularphylogenyandsystematicsoftheactinomycetes,"Annu.Rev.Microbiol.(1994)48:257-289,各文献在此整体引入作为参考，用作可以合成本发明的化合物的菌属。优选地，根据本发明的方法用于ECO-4601发酵生产的微生物将具有对于所述微生物固有的基因信息，该信息对于允许所述微生物生物合成所述化合物是必需的。优选地，所述微生物是小单孢菌属，更优选地是小单孢菌属046-ECO11,其于2003年3月7日，在加拿大R3E3R2,马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015的加拿大卫生局微生物(IDAC),BureauofMicrobiology,HealthCanada,1015ArlingtonStreet,Winnipeg,Manitoba,CanadaR3E3R2)作了保藏，保藏号为IDAC070303-01;更优选地是小单孢菌属[S01]046,其于2003年12月23曰，在加拿大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构(加拿大R3E3R2,马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015)(theInternationalDepositoryAuthorityofCanada(IDAC),BureauofMicrobiology,HealthCanada)作了保藏，保藏号为IDAC231203-01;更优选地是小单孢菌菌抹，其因其大量生产ECO-4601的能力而被选择；最优选地是小单孢菌菌林[S01U02]046,其于2005年9月7日，在加拿大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构(加拿大R3E3R2,马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015)(theInternationalDepositoryAuthorityofCanada(IDAC),BureauofMicrobiology,HealthCanada,1015ArlingtonStreet,Winnipeg,Manitoba,CanadaR3E3R2)作了保藏，保藏号为IDAC070905-01,以及净束孑包小单孑包菌查利其斤(A^'cramowosporaec/n力c^porac/za〃&ews/s)NRRL12255和制癌菌素链霉菌新抗霉菌素(S^/^om>>cMcam"oWWcwsweoc(2rzz力o加〃'cws)ATCC15944。已经根据"国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约"对保藏菌株进行了保藏。当专利公布时所述保藏菌株将对公众不能取消且没有限制或条件。所述保藏菌林仅作为方便提供给本领域技术人员，并不承认保藏对于授权是必需的，例如35U.S.C.§112所要求的。制备、使用或销售所述保藏菌株以及由此获得的化合物要求许可，且没有据此授予这样的许可。根据指定的发酵条件生产能够生物合成较高水平的具体生物活性化合物的微生物菌抹的方法是本领域熟知的，例如，拥有抗菌活性或抗癌活性的化合物。这样的方法可依赖由于自然发生的突变或由于使用诱变剂诱导的突变产生的突变菌林的选择。合适的诱变剂的实例包括，但不限于，N-曱基-N'-硝基-N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸、紫外辐射、x-射线和伽马辐射、uv和补骨脂素的结合、以及转座子诱变。使用这样的诱变剂处理放线菌的方案和参数是本领域所熟知的，能够通过参考以下文献来找到ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,2ndedition(1999)，(由德曼A丄.(DemainA丄.)和戴维斯J,E.(DaviesJ.E.)纟扁著)(AmericanSocietyofMicrobiology,Washington,D.C.)第353-361页和第717-724页。对于能够大量产生感兴趣的生物活性化合物的突变放线菌菌抹的产生和选择，其中导致显型大量产生的突变事件作为自然发生事件而发生，可以参考希玛(Shima)等人(1996)"InductionofActinorhodinProductionbyrpsL(EncodingRibosomalProteinSI2)MutationsThatconferStreptomycinResistanceinStreptomyceslividansandStreptomycescoelicolorA3(2)"JournalofBacteriology,volume178，p.7276-7284,该文献描述了获取变铅青链霉菌(S.//v^"m')和天蓝色链霉菌(5".coe/,co/or)菌林的方法，所述菌林通过筛选产生供自然发生的突变(其对抗生素链霉菌显示自动抑阻)的高水平抗菌化合物放线紫红素("《or/zoc//")。随后通过欧次(Ochi)等人的研究组(参见赫斯克斯A.(Hesketh，A.)和欧次K.(Ochi,K.)(1997)"ANovelMethodforImprovingStreptomycescoelicolorA3(2)forProductionofActinorhodinbyIntroductionofrpsL(EncodingRibosomalProteinSI2)MutationsconferringResistancetoStreptomycin",J.Antibiotics,volume50,p.532-535)所公开的某个转录相关联的突变的出现(核糖体蛋白S12中88位点赖氨酸残基的改变，其能够通过筛选被选择为链霉菌菌林来抑阻链霉素)和所选择的生物合成较大量放线紫红素的菌抹的能力之间的似乎可信的关联来进行工作。也可以使用方法的组合来产生能够产生高水平感兴趣的生物活性化合物的放线菌菌林。在一个实施方式中，本发明的能够在发酵培养基中产生高水平化合物ECO-4601的小单孢菌通过将亲代小单孢菌菌林暴露于抗生素链霉菌的浓缩物中来产生，其中所用的浓度的范围大于最小抑制浓度。链霉素的最小抑制浓度范围的实例为大约0.5pg/mL至大约1.0mg/mL。优选地，用于选作对抗生素自然发生抑阻的链霉素的浓度范围是大约IOmg/ml至大约100mg/ml。更优选地，抗生素的浓度是达到至少95%的杀伤率的浓度，最优选地，抗生素的浓度是达到至少99%的杀伤率的浓度。使暴露于一定水平的链霉菌保持存活的细菌菌落进一步突变处理，例如暴露于紫外线，所述一定水平的链霉菌提供至少95%的杀伤率，更优选地提供至少99%的杀伤率。适用于放线菌中诱导突变的紫外辐射的水平是本领域所熟知的。(参见上述，ManualoflndustrialMicrobiologyandBiotechnology),在本发明的一个实施方式中，因其对高浓度链霉菌抑阻的能力所选择的小单孢菌菌林的处理包括暴露于暴露水平大约40Joles/m2至大约45Joles/n^的紫外辐射中。在本发明的一个实施方式中，当与从中获得5倍水平的生产菌林的未经紫外辐射的菌抹相比时，这样紫外辐射突变处理导致能够增加至少5倍范围ECO-4601发酵产品的小单孢菌菌林。ii)重组微生物在另一个实施方式中，能够产生法尼基化二苯并二氮杂萆酮ECO-4601的微生物可通过重组核酸分子来提供，所述核酸分子编码在生产法尼基化二苯并二氮杂萆酮中有用的蛋白。具体来说，能够产生法尼基化二苯并二氮杂革酮ECO-4601的微生物可通过提供重组DNA载体和编码菌林046-ECO11(其引导ECO-04601产生，在本文称为"046D")中全部或部分生物合成基因座的核酸分子来提供。大肠杆菌co/ODH10B载体的保藏，分别包含来自小单孢菌属菌抹046-ECO11用于法尼基化二苯并二氮杂萆酮的部分生物合成基因座的柯斯质粒克隆(分别代表046KM和046KQ)和共同跨越用于ECO-04601生产的全部生物合成基因座，其已经在2003年2月25日保藏于加拿大卫生局微生物署加拿大国际保藏机构(加拿大R3E3R2,马尼托巴湖，温尼伯湖，阿林顿街1015)。指定为046KM的柯斯质粒克隆被分派保藏号IDAC250203-06,指定为046KQ的柯斯质粒克隆被分派保藏号IDAC250203-07。包含柯斯质粒克隆的所包藏的柯斯质粒克隆已经根据"国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约"作了保藏。当专利公布时所述保藏克隆将对公众不能取消且没有限制或条件。所述保藏克隆仅作为方便提供给本领域技术人员，并不承认保藏对于授权是必需的，例如35U.S.C.§112所要求的。制备、使用或销售所述保藏菌抹以及由此获得的化合物要求许可，且没有据此授予这样的许可。此外，本发明可使用常规基因重组技术例如核酸的突变、灭活、置换通过进一步包括046D的一种或多种基因修饰以产生ECO-04601的化学变体来提供。法尼基二苯并二氮杂革酮化合物可通过如下方法来提供其中转化的宿主细胞包括编码ECO-4601的生物合成所必需的一个或多个多肽的重组DNA载体，并且在使法尼基二苯并二氮杂萆酮化合物产生的条件下培养宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是原核生物。在另一个实施方式中，宿主细胞是放线菌。在另一实施方式中，宿主细胞是链霉素宿主细胞。在又一实施方式中，宿主细胞是非链霉菌放线菌，例如，红球菌属、分枝杆菌属(A<yco6^enwm)、拟无枝菌酸菌属(v4m少co/Wo/w7J),或非》文线菌纟田菌^口#豆#干菌(jBrevz力a"e〃'wm)或凌占液5求菌(A^;cococc'w)属如黄色凌占J求菌(A^xococcwsx"w/7ws)(参见朱莉B.(JulienB.)和莎哈S.(ShahS.)(2002)"HeterologousExpressionofEpothiloneBiosyntheticGenesinMyxococcusxanthus."AntimicrobialAgentsandChemotherapy46:2772-2778)。在又一实施方式中，本发明可结合重组核酸纟皮利用，所述重组核酸产生许多法尼基二苯并二氮杂萆酮化合物、或带有酰基而非法尼基部分的二苯并二氮杂萆酮，其不能够单独通过化学方法容易地合成。根据本发明，本发明允许经由参与法尼基二苯并二氮杂萆酮或其类似物生物合成的霉基因工程直接操作046D生物合成基因座。法尼基二苯并二氮杂革酮和类似物能够通过以下方法产生向包含编码本发明的一种或多种多肽的重组DNA载体的宿主细胞输送一种或多种关键中间体或生物合成前体或相近结构的类似物，以及在产生法尼基二苯并二氮杂革酮或类似物条件下培养宿主细胞(如图1至4所定义的)。关键的中间体与本发明的分离蛋白直接接触以进行用于法尼基二苯并二氮杂革酮生产的必需步骤(例如，法尼基二磷酸和二苯并二氮杂革酮能够使用本发明的IPTN蛋白而耦合)的蛋白质来制备:例:::尼基:;酸和3-羟基邻氨基i曱酸是商业可行的。(例如,FlukaF6892和Aldrich148776)。3-氨基-5羟基苯甲酸，2-氨基-6-羟基苯醌的前体，如赫尔特(Herlt)等人(1981)，Aust.J.Chem.，volume34,pagesl319-1324中所述来制备。iii)重组DNA载体可以结合本发明使用的载体通常包括传递剂的DNA,外源DNA插入其中。普通的将DNA的一个片段插入DNA的另一个片断的方法涉及使用特定的称为限制性酶的酶，该酶在称为限制性位点的特定位点(核普的特定基团)剪切DNA。"盒"表示DNA编码序列或编码能在指定的限制位点插入载体的表达产品的DNA片断。指定盒限制位点以确保盒在合适的阅读框中插入所述盒。通常，编码在法尼基二苯并二氮杂革酮生产中有用的蛋白的核酸分子被插入一个或多个载体DNA的限制位点，然后通过转染或转化由载体携带进入原核生物例如放线菌(参见下文)。已经插入或添加DNA的DNA片断或序列，例如表达载体，也能够称为"DNA结构"。常见的载体的类型是"质粒"，其通常为双链DNA的自含分子，通常为细菌成因，能够易于接受另外的(外源)DNA且其能够易于引入合适的宿主细胞。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，其具有一个或多个适合插入外源DNA的限制位点。合适的载体系统也可包含细菌人工染色体(BAC)例如在马丁尼兹(Martinez)等人(2004),AppliedandEnvironmentalMicrobiology,volume70，p.2452-2463中所述。编码DNA是编码特定蛋白或酶的特定氨基酸序列的DNA序列。在一个本发明的实施方式中，所述编码DNA编码对法尼基二苯并二氮杂萆酮的生物合成有用的多肽。重组载体的启动子DNA是启动、调节或其他调节或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码可来自相同或不同的生物体。重组克隆载体将通常包括一种或多种供克隆或表达的复制系统、一种或多种供宿主内选"^的标记物，例如抗生素耐药性、以及一种或多种技术来生产。这样的技术在文献中充分说明。参见，例如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork(此处"Sambrook等人，1989");DNACloning:APracticalApproach,VolumesIandII(D.N.Glovered.1985);F.M.Ausubel等人(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.(1994)。用在放线菌(例如链霉菌)中启动子的实例在美国专利第5,830,695和5,466,590中教导。在放线菌表达载体中有用的转录启动子的实例为tipA,其是抗生素硫链丝菌(thiostrepton)诱导的启动子。[c.f.Murakami,T.,等人，(1989),J.Bacteriol,171,1459]。iv)放线菌的转化供放线菌使用的合适的转化方法包括使用溶解酵素使放线菌培养基形成原生质球。然后例如通过使用汤普森(Thompson)或凯瑟(Keiser)[c.f.Thompson,C.丄，等人，(1982),J.Bacteriol.,151,668-677或Keiser,T.等人(2000),"PracticalStreptomycesGenetics",TheJohnInnesFoundation,Norwich]的方法添加包含重组DNA载体和聚乙二醇的《爰冲溶液以便将载体引入宿主细胞。在转化质粒中硫链丝菌素抗性基因常常用作选择性标记物[c.f.Hopwood，D.A.,爭乂，(1987),"MethodsinEnzymology"153,116,AcademicPress，NewYork],但是本发明并不限于此。放线菌转化的其他方法在美国5,393,665中所教导，也参见Martinez等人(2004)(参见上文)，其教导了通过结合放线菌的转化。链霉菌和非链霉菌放线菌的转化的方案是本领域所熟知的。[参见，例^口,Dijkhuizen,L."GeneticsofNon-StreptomycesActinomycetes"inManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,2edition,A.L.DemainandJ.E.Davies(ed.)[1999,ASMPress,Washington,D.C.]第368-378页；以及NakashimaN.等人(2005)"Actinomycetesashostcellfactoriesforproductionofrecombinantproteins"MicrobialCellFactories4:7]。穿梭载体，其可用于克隆参与法尼基化二苯并二氮杂萆酮生物合成路径的一个或多个基因至非链霉菌放线菌宿主。这样的穿梭载体通过已知分子基因技术，通过从一个或多个非链霉菌，例如红球菌、质粒DNA到大肠杆菌质粒或衍生质粒重组基因序列以产生质粒载体来制备，所述质粒载体能够在大肠杆菌或红球菌(尽管携带了感兴趣的插入的基因)中复制。这样的宿主可包括红球菌属，例如红平红球菌(蟲cxiococcwse，/zro/ofe)、马红球菌(朋O(iococcws)和圆红球菌(W/zot/ococciM'g/Wen^^)。其他非链霉菌放线菌包括分支杆菌属(例如，耻祐分枝杆菌(A^co6a"ehwmswegma"'力),和拟无枝菌酸菌属(例附W/z(2"o/z'C(2),和才奉軒菌属(Cor少"e/)(3"er/wm),所述非链審菌放线菌可使用对细菌的特定基因具有特异性的穿梭载体转化并可用于参与法尼基化二苯并二氮杂革酮生物合成的一种或多种基因的异源表达。参与小单孢菌属中第二代谢物生物合成的基因的异源表达已经成功完成。例如，红色糖多孢菌(Sacc/^ra/o/";oraeo^raeayK巨霉素非生产者)使用小单孑包菌巨霉素(M/cTO附ow"7oramega/o脂c'e")基因转化，编码用于生产麦戈赛明(megosamine)。通过所转化的宿主细胞经转化的红色糖多孢菌的培养导致巨霉素的产生。(参见，VolchegurskyY.等人(2000)"Biosynthesisoftheanti-parasiticagentmegalomicin:transformationoferythromycintomegalomicininSaccharopolysporaerythaea，'MolecularMicrobiology37:752-762)。已经报道了供基因簇异源表达的放线菌的用途，所述基因簇编码用作抗癌剂的微生物第二代谢物的生产。(参见SdnchezC.爭乂(2002)"TheBiosyntheticGeneClusterfortheAntitumorRebeccamycin:CharacterizationandGenerationofIndolocarbazoleDerivatives"Chemistry&Biology9:519-531;以及S^ichezC.爭乂(2005)"Combinatorialbiosynthesisofantitumorindolocarbazolecompounds"Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)102(2):461-466)。此外，用于克隆向放线菌转化的DNA巨大片段(高达100千碱基)的细菌人工染色体是本领域所熟知的(参见SosioM.爭乂(2000)"Artificialchromosomesforantibiotic-producingactinomycetes"NatureBiotechnology18:343-345),其可用来克隆全部基因簇，所述基因簇编码用于生产微生物第二代谢物或它们的自然生物类似物。v)法尼基二苯并二氮杂萆酮或生物合成中间体的检测在法尼基二苯并二氮杂萆酮生物合成中有缺陷的放线菌可使用在法尼基二笨并二氮杂革酮生物合成路径中编码一种或多种蛋白的一种或多种表达载体来转化，从而通过特定缺陷的遗传互补修复(以顺式或以反式)法尼基二苯并二氮杂萆酮生物合成。在重组放线菌中，生物合成路径(参见图1至4)中有或无法尼基二苯并二氮杂萆酮或中间体能够使用本领域技术人员所熟知的方法来测定。例如，可以产生用于重组放线菌培养基的发酵培养基的乙酸乙酯提取物，如实施例1所述，并且得到的包含法尼基二苯并二氮杂萆酮或中间体的级份可通过TLC在商业Kieselgel60F254平板上检测。法尼基二苯并二氮杂萆酮和中间体化合物通过在UV光下观测平板或通过使用包含乙醇中香草醛(0.75%)和浓硝酸(1.5%,v/v)的喷雾剂喷所述平板并且加热所述平板而观察到。然后使用液相色谱-质语测定由TLC分离的化合物的确切身份。质谱方法在公开的美国专利公开第US2003/0052268号中教导。vi)突变在另一实施方式中，能够产生法尼基化二苯并二氮杂革酮或其类似物的微生物(其可与本发明结合使用)可经由参与ECO-4601法尼基二苯并二氮杂萆酮的生物合成的酶基因工程部分提供用于直接操作046D生物合成基因座。本领域所熟知的许多方法允许本发明中DNA序列随才几和定位突变(例如参见，奥苏伯尔(Ausubel)等人ShortProtocolsinMolecularBiology(1995)3rdEdJohnWiley&Sons,Inc.)。此外，存在许多供定点突变的商业可行试剂盒，包括传统和以PCR为基础的方法。实例包括得自Stratagene公司(货号200502)的EXSITEPCR-Based定点突变和得自Stratagene公司(货号200509)的CHAMELEON⑧双链定点突变试剂盒。此外，根据本领域技术人员所熟知的方法，在046D基因座的核苷序列中的突变可通过插入突变或切断(N-末端、内部或C-末端)来产生。本领域所熟知的定点突变的较老的方法依赖将突变为载体，如M13抗菌素载体的序列的亚克隆，所述载体使得单链DNA模板分离。在这些方法中，人们退火单链模板的突变引物(即，能够退火将要突变位点但包含一种或多种在将要突变位点错配的核普的引物)然后聚合起始于突变引物3，端模板的补码。然后将得到的双方转化为宿主细菌并为期望的突变筛选斑块。最近，定点突变已经使用了PCR方法，其具有不要求单链模板的优点。此外，已经发展的方法不要求亚克隆。当进行以PCR为基础的定点突变时，必须考虑若干问题。首先，在这些方法中，需要减少PCR循环数以防止由聚合酶引发的不期望突变的扩增。第二，为了减少存在于反应中非突变亲代分子数，必需使用选择。第三，为了允许使用单PCR引物套件，优选为延伸长度PCR方法。第四，由于某些耐热聚合酶的非模板依赖末端延伸活性，常常必需在PCR产生突变产物的钝端连接之前将端抛光步骤合并入所述程序。以下所述方案通过以下步骤适合这些考虑。首先，所用的模板浓度大约比在传统PCR反应中所用的高1000倍，其在不大量降低产物产量情况下使得循环数从25至30降低至5至10。第二，限制性核酸内切酶DpnI(识别目标序列5-Gm6ATC-3，其中残基被甲基化)用来选择对抗亲代DNA,因为大多数普通大肠杆菌菌林Dam在序列5-GATC-3曱基化其DNA。第三，ra《混合剂用在PCR混合物中以便提高长(即，全部质粒长度)PCR产物的比例。最后，尸/wDNA聚合酶用来在使用T4DNA连接酶分子内连接之前抛光PCR产物末端。下面详细描述突变聚核苷酸分离的非限制性实施例将质粒模板DNA(大约0.5皮摩尔)加入包含以下组成的PCR緩冲液lx突变緩沖液(20mMTrisHCl，pH7.5;8mMMgC12;4Q)ig/mlBSA);各引物12-20皮摩尔(如需要，考虑如碱基组成、引物长度和设计的影响低聚核苷酸引物的退火特征的緩冲盐浓度等因素，本领域技术人员可以设计突变引物；一个引物必须包含期望的突变和一个(相同或其它的)必须包含5，磷酸盐便于随后连接)，250^M各dNTP、2.5UTaqDNA聚合酶和2.5UTaq混合剂(得自Stratagene公司；参见尼尔森(Nielson)等人(1994)Strategies7:27,和美国专利第5,556,772号)。引物可使用马特乌奇(Matteucci)等人1981,J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191的三酯方法来制备，在此引入作为参考。其他自动化合成是优选的，例如，使用氰乙基亚磷酰胺(cyanoethylphosphoramidite)化学在生物检索8700DNA合成器上。PCR循环进行如下94。C下4分钟、5(TC下2分钟和72°C下2分钟的一次循环，随后94。C下1分钟、54。C下2分钟和72。C下1分钟的5至10次循环。亲代模板DNA和线性PCR产生的合并所述突变引物的DNA使用Dpnl(10U)和PfuDNA聚合酶(2.5U)处理。这导致体内曱基化亲代才莫板和杂合DNA的Dpnl消化，且通过PfuDNA聚合酶，线性PCR产物上非模板导向TaqDNA聚合酶延伸碱基的移除。反应在37。C下培养30分钟，然后转移到72i:下再培养30分钟。将包含0.5mMATP的突变緩冲液加入Dpnl消化的、PfuDNA聚合酶抛光的PCR产物。混合溶液，并将10ul移入心的微量离心管，并加入T4DNA连接酶(2-4U)。在37。C培养连接酶60分钟以上。最后，根据标准方法将经处理的溶液转化为大肠杆菌细胞。随机突变方法存在于本领域，其将导致一组拥有一个或多个随机定位突变的突变体。这样的一组突变体然后可筛选相对于野生型聚合酶显示降低的尿嘧。定检测活性的那些(例如，通过测量存在200pMdUTP时和给定DNA聚合酶的最佳温度下，30分钟内10纳摩尔dNTPs结合为多聚形)。随机突变方法的实例为所谓的"过失倾向PCR方法"。如名称所暗示的，在DNA聚合酶不支持高保真结合的条件下所述方法扩大了给定序列。不同DNA聚合酶鼓励过失倾向结合的条件不同，然而本领域技术人员可以确定给定酶的这样的条件。在扩大的保真度中，许多DNA聚合酶的关键变量，例如，为緩沖溶液中二价金属离子的种类和浓度。因此，使用锰离子和/或镁或锰离子浓度的变化来反应聚合酶的误差率。由突变产生的期望突变体多肽的基因可排序以识别突变的位点和数目。对于包含一种以上突变的那些突变体，给定突变的影响可由以下方法来评估在通过具体突变体从其它突变分离中，通过直接位点突变将确定的突变的引入野生型基因。这样产生的单突变体的筛选检测将随后允许确定单独那种突变的效果。B培养基和设备能够产生ECO-4601的微生物在培养基，优选地为包含已知供放线菌的营养来源的水培养基中培养。这样的培养基包含碳、氮、各种无机盐和其它营养物以及可由放线菌同化的生长因子源。根据本发明，优选的能够生产法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物发酵的培养基，优选为小单孢菌属[S01U02]046,包括但不限于表1所列的培养基，其它优选的合适的培养基包括但不限于表2中所列的培养基。对于将在大体积规模上进行的发酵过程，根据本发明能够生产法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物接种体种子培养物的制备，优选地小单孢菌属[S01U02]046能够通过使用培养基KH来进行，培养基HI能够用作供大体积发酵的培养基。在本发明的另一实施方式中，种子培养基是FBB(成分配料马铃薯糊精(24g/L),牛肉提取物(3g/L)。细菌蛋白胨(5g/L)，葡萄糖(5g/L),酵母提取物(5g/L)和CaC03(4g/L,调节培养基pH值为7.0后添加))。在本发明的又一实施方式中，培养基HI可被用作种子培养基。表1优选培养基的实例<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*pH没有被调节。表2:合适的发酵培养基的实例每种培养基的組成'(g/L)ABACCIDAFAHAKHMAMYQB應VAVBZLPH2**7.07.07.0*7.07.57.07.26.857.07.0*葡萄糖510101010121050103蔗糖34010020麦芽糖4甘蔗糖蜜101520玉米淀粉可溶性淀粉251552510马铃薯糊精2020402010玉米固体5玉米浆105玉米粉10玉米淀粉大豆面粉(Soybeanflour)530大豆粉15干酵母2圆酵母4酵母提取物3545麦芽提取物310药用培养基10甘油252010甘露醇25N-Z胺A105L-谷氨酰胺5.84L-精氨酸1.46大豆粉鱼铜料10510细菌蛋白胨5<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>以g/L描述的培养基组分，另有说明除外。添加CaC03前如所指出的调节pH值。符号*表示未调节pH值。微量元素溶液#1包含(每100mL溶液，在去离子、蒸镏(dd)H20中制备)ZnSO4.7H2O(10mg),FeS04.7H20(100mg),CuS04.5H20(10mg),MnS04H20(10mg)，Na2B407.10H2O(10mg)，(NH4)6M〇7024.4H20(lOmg)。4微量元素溶液#2包含(每1000mL溶液，在去离子、蒸馏(dd)H20中制备)ZnCl2(40mg),FeCl2.6H20(200mg),CuCl2.2H20(10mg),MnCl2.4H2O(10mg),Na2B407.10H2O(10mg),(NH4)6Mo7024.4H2〇(10mg)。根据本发明，用于培养能够产生法尼基化二苯并二氮杂革酮的微生物的发酵程序符合设备消毒和安全操作以及技术以符合本领域技术人员所实践的涉及微生物的培养的无菌生长条件(通常参见，ManualofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology,参见上文)。根据本发明，用于使用能够产生法尼基化二苯并二氮杂革酮的微生物接种的培养基发酵的合适容器是本领域所熟知的，且能够依赖要求生产的发酵液的体积而选择。例如，用于在实验室规模水平生产的发酵的容器包括消过毒的、泡沫塞2升、三角锥瓶的使用，该容器包含大约500毫升培养基并使用能够生产法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物接种。包含接种培养基的容器能够被搅拌，例如通过在旋转振荡器上或热水浴中以旋转速度大约250转/分钟振荡以维持足够接种的微生物生长的培养基中溶解氧的水平。培养期间，也可通过向培养基中注射空气、氧气或合适的气体混合物来实现通风。以这样的实验室规模水平，生产包含法尼基化二苯并二氮杂革酮的发酵液的合适的发酵温度范围和时间分别为大约27。C至大约29°C，和大约72小时至大约100小时。在培养期间，合适的培养条件也包括维持发酵液pH值范围为大约6至大约9，更优选地为大约7至大约8。在研究实验室设备中，自动台式发酵罐可用来生产一定量包含法尼基化二苯并二氮杂萆酮的发酵液。这样的发酵罐是本领域技术人员所熟知的，且得自许多供应商，例如新布伦兹威克科学/>司(NewBrunswickScientificInc.)或赛多利斯乂^司(SartoriusAG)。这样的发酵罐可提供发酵体积范围例如，为大约1升至大约20升，工作体积范围低于1升至大约15升。优选地，这样的发酵罐装有控制和监控发酵条件的系统和附件，例如热毯或水套不锈钢或玻璃发酵容器或具有浸没加热/制冷盘管；装有一个或多个合适的叶轮的机械密封搅拌轴(例如，拉斯通(Rushton)型叶轮)，其能够以适合达到发酵液合适搅拌的不同旋转速度来操作；一个或多个供液体添加或移除的蠕动泵；一个或多个自动操作和监控液体添加/移除并控制发酵液泡沫的探针；监控和调节发酵液pH值和溶解氧含量的探针和控制器；使得期望气体向发酵液连续添加的电磁阀；以及装备(其可包括视景显示系统)有合适软件供编程和监控发酵条件的电控单元，其可提供发酵的电子和/或打印记录。在本发明的一个优选实施方式中，新布伦兹威克科学公司BioFlo110发酵罐用于发酵能够产生ECO-4601微生物的菌株。在本发明的另一实施方式中，能够产生ECO-4601的微生物菌林的发酵能够使用大体积发酵罐，更优选地使用一个或多个中试发酵容器来发生。如本领域技术人员所公知的，中试发酵容器的体积容量大小可在大约20升至大约7500升，更优选地为大约75升至大约3000升容器，最优选地为大约100升至大约2000升容器范围内变化。许多大比例发酵容器和附件系统的制造商和供应商对本领域技术人员来说是可行的。这样的供应商和制造商可包括，但不限于，新布伦兹威克科学公司(爱迪生，新泽西)、Chemap公司(Volketswil(地名，沃尔科兹维尔)，瑞士)、欧谱公司(Applikonlnc.)(斯西丹，荷兰)、赛多利斯集团贝朗国际生物工程系统公司(SartoriusBBISystems,Inc.)(伯利恒，宾夕法尼亚)、丸菱实验室设备有限公司(MarubishiLaboratoryEquipmentCo.,Ltd.X日本)和L.H.工程有限公司(L.H.EngineeringCo.)(联合王国)。如霍索布驰M.(HosobuchiM.)和吉川(Yoshikawa)的"微生物方法的扩大"(在工业微生物和微生物技术手册)，第2版(1999),(由DemainA丄.和DaviesJ.E.编著)(美国微生物学会，华盛顿哥伦比亚特区)第353-361页)和JunkerB在化学工程2003年2月第l至6页"多用途发酵罐设计批判性思考"中所说明的，为了使大规模发酵生产条件最优化，许多因素可要求依赖选择供使用的发酵容器的大小和类型来调节。例如，这样的因素可包括那些机械/物理性质，例如叶轮和挡板的种类和数目、每单位体积的搅拌速度和功率、叶轮外缘速度(其可影响在微生物上造成的剪切力)和通风速率和压力。如本领域技术人员将理解的，依赖将被使用的大体积发酵容器的容量，在选择的大体积发酵容器中的培养基的接种可要求作为能够产生法尼基化二苯并二氮杂革酮(其随后用于生产数量足以接种大体积发酵容器中的培养基的接种体)的微生物的一种或多种种子培养的发酵生产。例如，种子培养物可在一个或多个被维持作为在实验室规模水平的发酵生产的每个条件的挡板种子摇瓶中制备，在接种体发酵罐接种之前，在获得培养物纯度和生存力期间，一个或多个取自这样的种子培养物的等分试样可被收回。生产一定体积的接种体发酵液应当与将在大发酵容器中接种的培养基的体积相匹配。根据本发明，所使用的优选的接种体发酵液的体积范围是包含在大体积发酵容器中培养基体积的大约2%至大约10%,更优选地是包含在大体积发酵容器中培养基体积的大约3%至大约4%,最优选地是包含在大体积发酵容器中培养基体积的大约3.2%至大约3.5%。根据本发明，ChemapAG型M16K接种体发酵罐可用来生产接种体培养物，其能够用来接种一定体积包含在大体积发酵罐中的培养基。根据本发明，可以使用具有总容积为750升，带有安装在驱动器上(当从容器底部测量时)并位于大约70升刻度、大约200升刻度和大约340升刻度处的叶轮的ChemapAG型CF/569。化二苯并二氮杂萆酮的第一浓缩物可被第一浓缩物产品下游处理以便减少第一浓缩物中杂质的水平。这样的处理可发生在本领域技术人员所公认的各种方法中的任意一种，例如在以下一个或多个实施例中，其不应考虑被限制为可被选择从而达到这样的下游处理的具体方法。实施例除非另外指出，用在以下实施例中的试剂和溶剂由西格玛奥德里奇(Sigma-Aldnch)和/或飞世尔科技(FisherScientific)公司所提供。除非另外指出，用在本说明书和权利要求书中的表示组分和性质数量的全部数目将被理解为在全部实例中通过术语"大约"被修改。因此，相反除非指出，在本发明和附属权利要求中所提出的数值参数为近似值。至少，并非意图将等同原则的申请限制于权利要求范围内，各数值参数至少应该根据有效数字的数目和通过普通舍入方法来分析。尽管说明本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在实施例、表格和附图中设置的数值尽可能精确地被报道。任何数值可内在地包含一定的误差，其由实验、测试方法、统计分析等中的变化产生。除非另外定义，本文所用的各技术和科学术语具有如本领域所属技术人员普遍理解的相同的含义。尽管类似或等价于本文所描述的那些方法和材料能够用在本发明的实践或测试，但是合适的方法和材料描述如下。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非意图为限制性的。实施例1:小单孢菌属菌林[S01U02]的生产1.1第一轮菌抹改良小单孢菌菌抹046(保藏号IDAC070303-01)在含10至,g/mL链霉素的GYM琼脂培养基的培养平板上被划线。GYM琼脂培养基的组分包含(以g/L计)葡萄糖(4g)、酵母提取物(4g)、麦芽提取物(10g)、N-Z胺A(1g)、NaCl(2g)、琼脂(20g),用蒸馏水制为lOOOmL,pH值为7.2(参见ShimaJ.等人(1996)"InductionofActinorhodinProductionbyrpsL(EncodingRibosomalProteinSI2)MutationsthatConferResistanceinStreptomyceslividansandStreptomycescoelicolorA3(2)"J.Bacteriol.，vol.178(24),p.7276-7284)。在28。C下培养接种盘4至10天。获得对抗生素显示自然抗性的单菌落，随后划线至包含相似浓度链霉素的GYM琼脂培养平板作为所选择的具体菌落的平板。在28。C下培养所述平板15至20天。来自各平板的表面生长被用来接种(对各平板)一个包含5mL培养基KH(种子培养基中没有加入链霉素)的玻璃培养管(150mmx20mm)。在28。C下，以250RPM运转的旋转混合器上培养接种的培养管70至72小时以使得细菌培养生长。培养期后，从各培养管(种子培养基)取0.250mL等分试样并转入包含10mL培养基CI的类似管中。在28。C下，以250RPM运转的旋转混合器上培养接种的培养管7天以使得细菌培养生长并产生ECO-4601。发酵完成后，向各管加入10mL乙酸乙酯，所述管被送回混合器搅拌20min。各管的内含物-故转移进分开的45mLFalcon管中并在4500RPM下离心10min以在管中生成上有机相和下水相。从各管取5mL有机相(上相)并转移入分开的小玻璃管中(100xl3mm),在氮气流中蒸发溶剂以在管内获得干燥的残余物。所述干燥残余物重新溶于0.5mL甲醇中，并通过LCMS检测ECO-4601的含量。大约850个单菌落被筛选，从中鉴定单菌落(克隆)，产生产量大约10至25mg/mL的ECO-4601,这样的产率大约高于对照(亲代菌林的等价培养)所产生的10倍。所选择克隆对高浓度的链霉素(100pg/mL)是有抵抗的，小单孢菌属菌林[S01]046(保藏号IDAC231203-01)4皮指派。1.2第二轮菌林改良在第二轮菌抹改良中，在包含GYM琼脂培养基的培养平板中划线小单孢菌属菌林[S01]046。所述平板在28。C下培养15至20天直到丰富的孢子形成产生。通过使用5mL无菌蒸馏水浸没所述平板、从整个平板刮去孢子以及将悬浮孢子移入15mL锥形管，然后以5000RPM在4'C下离心10分钟来从各平板收集孢子。上层清液通过移液管从离心管取出丢弃，且孢子颗粒在lOmL无菌蒸馏水中重悬浮，并充分振荡。琼脂块(如果存在)通过以下方法来从孢子悬浮液中通过放置于注射器中的棉花过滤该重悬浮液，接着在室温下以5000RPM重离心10分钟，然后通过移液管取出来倾析上层清液。离心的孢子使用无菌蒸馏水重悬浮并稀释以达到浓度为8000至20000孢子/毫升。从稀释的孢子悬浮液中(经棉花过滤或者没有)取0.5mL,液滴均匀分散至GYM琼脂平板的琼脂表面。使平板在无菌条件下层流中干燥10分钟，在干燥期间每个所使用的平板的盖子保持微开。然后使平板孢子以强度为琼脂表面的40~45焦耳/立方米经历紫外(UV)辐射。在UV处理期间从平板移除盖子。为了通过光能力预防由UV引诱的突变的逆转，使平板经历UV处理，然后维持于28。C不透光容器至少24小时。随后在28。C培养经照射的平板4~10或直到单菌落出现。选取幸存的菌落(大约0.1%),划线GYM琼脂培养平板上，并在28。C培养15~20天或直到丰富的孢子形成出现。筛选来自幸存菌落的克隆以生产如上所述的ECO-4601用于第一轮筛选以获得抗生素耐药克隆。在相似条件下生长菌抹[S01]046的未经UV处理的培养用作对照。从本筛选的第二轮，单菌林被鉴定以产生高于对照菌株4~6倍的ECO-4601。该新菌林;故指定为小单孢菌属菌林[S01U02]046(保藏号为IDAC070905-01)。当在包含IOL培养基HI(表1)的14-L发酵罐中生长时，发现菌林[S01U02]046产生产率大约为172±24mg/L的ECO-4601。实施例2:小规模实验室生产为了评估是否发酵条件的变化可导致发酵液中ECO-4601产率增加，采用了如下小规模发酵和提取程序。2.1摇瓶的制备在两个中的各一个中放入3个玻璃珠，将125mL厄伦美厄(Erlenmeyer)摇瓶和所述摇瓶高温灭菌。然后将体积为25mL经灭菌的HI培养基无菌转移进各摇瓶。随后，向各摇瓶加入一份条件、无菌HP20树脂悬浮液以产生每摇瓶1%HP20树脂含量(0.25g/mL无菌储备液中1mL)。HP20树脂悬浮液的制备包括测量一定量干HP20置于大口杯中并加入一定体积100%曱醇足以覆盖所述干树脂。彻底混合大口杯中的内含物以从树脂中排出全部气泡，使得HP20树脂在大口杯中沉淀。沉淀之后，轻轻倒出甲醇，且再重复一次甲醇处理步骤。然后用蒸馏水洗涤甲醇条件HP20树脂5次，洗涤5次后，向无菌条件HP20树脂中添加足量的水以获得含浓度0.25g/mL的储备液，制得的摇瓶在高压灭菌器(121°C)中灭菌30min。2.2种子培养物的制备小单孢菌属菌林[S01U02]046的种子培养物通过将两个甘油储备瓶(各瓶在-8(TC维持直到使用并包含1.5mL水冻细菌培养)的内含物转移进一个2-L包含500mL水培养基KH的挡板摇瓶来制备。所述种子培养物在28。C、以250RPM振荡下生长3天。为了生产甘油储备管，在28。C下培养17~20天的[S01U02]046的来自孢子GYM平板的表面生长转移入3个、2-L各包含500mLKH培养基的挡板摇瓶中。然后培养物在28。C、以250RPM搅拌下生长3天。通过在无菌条件下，在各无菌摇瓶(共300mL)中混合来自各摇瓶的100mL制备混合培养物。向混合培养物中添加等体积来自无菌40%(v/V)甘油水溶液，混合并分配于2mL螺紋盖管中的1.5mL等分试样中，并储存在-8(TC。2.3生产培养基的接种对于各实验，如2.1部分制备两份厄伦美厄摇瓶，使用0.5mL(2%V/V)如上所述在250RPM下生长的种子培养物接种各摇瓶。经接种的摇瓶置于在250RPM下运行的旋转混合器中，在28。C下生长培养物4天。2.4提取在发酵培养的第4天(96小时)，从各摇瓶移出2mL发酵液并转入15mL添加了2mL乙酸乙酯的螺紋盖管中。所述管然后在高速下漩涡振荡大约2分钟，接着在室温下5350RPM离心(SorvalLegendRT)IO分钟以在所述管内产生上有机相合下水相(包含细菌菌丝体和HP20树脂)。移出0.5mL上相，转移入硼硅玻璃管(13xl00mm)，所述玻璃管的内含物在氮气中40。C下干燥10分钟。生成的干燥残余物在0.5mL100%曱醇中重悬浮(短暂凝涡振荡以确保完全重悬浮液)。取150pL残余物重悬浮液分析ECO-4601含量。2.4结果从重复实验获得的结果在下表3中出示，所述重复实验为了评估在发酵期间发酵培养液中存在一定量曱醇条件HP20树脂是否导致ECO-4601增加的生产。表3ECO-4601的小规模发酵液的浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>上述结果表明发酵液中存在树脂可能与ECO-4601生产的增加相关，从而导致提高的ECO-4601产率。实施例3:小规模实验室生产如以上实施例2所述，生长和提取小规模发酵培养物，与之例外的是，每个实验生长三份摇瓶。从三份摇瓶获得的结果如下表4所示。表4ECO-4601的小规冲莫发酵液的浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>上述结果进一步表明发酵液中存在树脂可能与ECO-4601生产的增加相关，从而导致提高的ECO-4601产率。实施例4:放大生产-台式发酵分批培养物4.1接种体生产和台式发酵在GYM琼脂的琼脂平板上维持小单孢菌属菌林[S01U02](保藏号IDAC070905-01)。通过从琼脂平板向2-L包含500mL无菌KH培养基的摇瓶转移小单孢菌属的表面生长制备供台式发酵(benchtopfermentation)的接种体。每升KH培养基包含10g葡萄糖、20g马铃薯糊精、5g酵母提取物、5gNZ-胺A和lgCaC03,用水(pH7.0)补充为1升。在大约28°C,设置为250rpm的旋转混合器上培养接种体培养物大约70小时。培养之后，将300mL培养物转入14.5L包含10L无菌生产培养基HI的BioFlo110发酵罐(新布伦兹威克科学公司，爱迪生，新泽西)中。每升生产培养基HI包括20g马铃薯糊精、30g甘油、2.5g细菌蛋白胨、8.34g酵母提取物和3gCaCO"(调剂pH值后添加)(使用0.3mL硅去沫油(化学服务)和0.05mlProflooil(商业蛋白)作为防沫剂)。使用搅拌机以中速运转将培养基内含物混入3L蒸馏水大约30分钟，将内含物调节至pH值为7.0,接着添加CaC03,Proflo油和硅去沫剂。容器在121。C下灭菌40分钟。在28。C下通过发酵生长培养物96土4小时，控制连续回路中溶解氧在25%处，搅拌在350-650RPM范围变化，通风设置为固定速率0.5V/V/M。为了测试完成发酵时，存在与发酵液中ECO-4601的量，同样移出5mL发酵液(在发酵取样过程中，也在第2和3天早晚对各发酵培养物进行提取)。如以上实施例2中2.3部分所述，使5mL经历乙酸乙酯提取程序，例外的是5mL发酵液在50mL螺紋管中使用5mL乙酸乙酯提取，且干的残余物在lmL100%曱醇中重悬浮。曱醇重悬浮的残余物从而经2x的因子稀释用于HPLC/UV检测以确定发酵液中ECO-4601的产率(浓度表示为mg/L)。HPLC/UV检测使用装备有沃特斯(Waters)双波长2487检测器沃特斯Alliance2690分离才莫块(Waters公司，米尔福德，马萨诸塞州)或装备有沃特斯双波长2487检测器的沃特斯Alliance2695分离模块来进行。所用的HPLC柱选自ACE3AQC18,3.0chx100mm+3.0x10mmguard3u(力口拿大，安大略，4皮《急堡，力口拿大生命科学公司)或对称C18,4.6x150mm+3.0x20mmguard5u(沃特尔公司)。对于两种管型，所用的溶剂是溶剂A-!^20+0.4%曱酸(996:4mL);溶剂B-乙腈十0.4%曱酸(996:4mL)。ACE柱的流速和时间设置为1.00mL/min和16分钟，而对称柱的流速设置为1.30mL/min和15分钟。对于两种柱型，在室温下注射20qL样品，设置压力最小20巴和最大300巴，；险测发生在294处。可选择地，；险测可在230nm进行。如上所述生长许多分离发酵液培养物。如上所述，在发酵的第2天早上和晚上，发酵第3天早上、下午和晚上和发酵第4天早上从各发酵液取进行中样品等分试样。对于各发酵培养物，产率(其为以mg(ECO-4601)/L(发酵液)/h为单位的ECO-4601生产率)可被给定的各发酵培养物的总时间和在发酵完成时存在于发酵液中的ECO-4601的质量评估。另外，对于各发酵培养物，观察到ECO-4601产率在整个发酵培养期间的数值范围内变化，但是在发酵培养的第2和第3天增加更快。基于在发酵的第2天下午和笫3天早上所取的进行中的样品等分试样计算的，直接记录的发酵培养系列的产率值出示于表5，直接记录如下。表5进行中的发酵培养物分析<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表5所示的结果表明当产率能够在发酵批次之间变化时，达到5mg/L/h以上的产率。下面表6出示了来自如上所述生长的各分离发酵液培养物的数据，其表示在完成各发酵液培养物的培养期时单位发酵液培养物的ECO-4601发酵液浓度和质量。表6ECO-4601的发酵液浓度(在发酵完成时)BioFlo110发酵液批号135136137138139140141142ECO-4601的发酵液浓度(mg/L)97.5688.71122137.6130.4108.8754.49115.08发酵液中ECO-4601的质量(mg)878798.410981238.41173.61088.7517.71093.34.2收获、提取和浓缩对于各发酵批次培养物，从发酵液除去检测等分试样后，通过逐滴添加20%的H2S04(硫酸)水溶液将发酵液的pH值调节为3.0±0.2,同时持续搅拌。生成的酸化的混合物通过冷却至4。C并在该温下培养12小时~48小时(最大72小时)来进一步处理。将各批次合并入较大的持瓶或大瓶(如需要，10L或20L体积)，该阶段保持在4'C。在4。C培养期间完成时，冷发酵液分装放入750mL聚丙烯离心管中，在3000~3500rpm离心(SorvalRT-7)15~20分钟。丢弃上层清液，合并菌丝体颗粒得到总合并颗粒质量1400克。然后使用100%甲醇(HPLC级，丄T.Baker)提取合并的菌丝体颗粒三次(90分钟、90分钟、30分钟，以中到高速搅拌)(对于每100g菌丝体每轮提取使用甲醇体积300±5mL)。混合所述甲醇4是取物，并通过Whatman#4滤纸过滤。如下处理经过滤的提取物以形成第一浓缩物将330gHP20树脂装入10L旋转蒸发摇瓶，其然后安装至旋转蒸发系统(装备有设置为40。C的步琪(Buchi)加热锅(模型B-490)和步琪真空泵(模型V-500)的步琪旋转蒸发器⑧(模型R-200))。在持续22±2小时蒸发的蒸发过程期间，将过滤的提取物等分试样引入所述蒸发摇瓶。完成蒸发过程时，体积为2200mL残留水留在蒸发摇瓶中，并且所述ECO-4601吸附于HP20上。所述残留水的HPLC-UV分析表明69mgECO-4601留在该残留水(31.36mg/L)中，从而表明来自过滤的提取物的99%以上的ECO-4601吸附到HP20树脂上。实施例5:放大生产-台式发酵分批培养物45在台式发酵的另一实施例中，如实施例4所述使用BioFlo110发酵罐产生发酵培养物。当各批次发酵完成时，各发酵批次的等分试样，如实施例4所述通过HPLC-UV分析以确定ECO-4601的浓度，从而获这些分析的结果出示于下面表7中。表7ECO-4601的发酵液浓度(在发酵完成时)BioFlo110发酵液批号4001x024001x034002105106107108109ECO-4601的浓度(mg/L)101.5613990.4315291117157122发酵液中ECO-4601质量(mg)810.241320.5723.441216864.51111.51491.51159当发酵完成时，在通过离心从合并的发酵液中收获颗粒物(菌丝体)之前，如上所述酸化、合并(经合并的发酵液的总体积大约为71.5L)和冷却发酵培养物。如实施例4所述使收获的菌丝体进行3轮曱醇提取。甲醇提取物的HPLC-UV分析显示ECO-4601的提取质量为7470mg。实施例6:放大生产-大体积/中试发酵6.1主种子储备的制备如图5所描述的制备试制主种子储备。从小单孢菌属[S01U02]046的冻干的主瓶获得孢子颗粒，并无菌转入消毒的、50mL已经添加2.5mLTSB培养基(胰酶大豆发酵液，得自贝迪公司)的管中。然后旋涡振荡该管以获得冻干的孢子颗粒的均匀悬浮物。从所述管中取两份0.5mL所述颗粒悬浮物等分试样，在分离GYM琼脂对照平板(GYM琼脂培养基(每1000mL):葡萄糖(4g);酵母提取物；(4g);麦芽提取物(10g);NZ-胺A(lg);NaCl(2g);琼脂(20g),pH7.2)中均匀展开以评估所述细菌的纯度和生长。接种的GYM平板在28士rC中培养大约72小时。伴随所述GYM对照平板的接种，0.5mL颗粒悬浮液等分试样被接种入两个各包含25mLKH培养基和3个玻璃珠(5mm直径)的125mL摇瓶中的每一个。接种的摇瓶在28土rC下，以250300RPM运转的旋转混合器中培养大约72小时大约96小时(直到培养基中出现桔黄色菌丝体)。然后125mL摇瓶中的等分试样置于GYM琼脂平板上，培养17.5±2.5天以在菌丝体表面获得暗色孢子。孢子通过使用大约5mL无菌蒸馏水浸没各平板并使用无菌细菌学环刮擦来收集(在无菌操作台上)，通过经由棉花塞过滤将重悬浮的孢子转移入50mL锥形管来流动。然后离心(5000RPM,4。C10分钟)孢子悬浮液以获得孢子颗粒，其随后使用10mL无菌水洗涤(漩涡振荡)并重离心(5000RPM,4°CIO分钟)。然后在水中12%脱脂的悬浮液(Sigma)中重悬浮最终的孢子颗粒得到均一的悬浮物，然后无菌分散于冻干瓶中0.5mL等分试样中。然后冷冻所述瓶，接着冻干，冻干的主种子储备瓶在真空中密封并在室温下储存或在冰箱中维持在5±3°C较长期保存。6.2工作储备的制备供中试规模发酵制备的工作储备的制备遵循图5所描述的程序(下半部分)。将经冻干的主储备瓶中的内含物转入包含KH培养基的管中，通过淡涡振荡悬浮。悬浮的颗粒转入包含KH培养基和玻璃珠的摇瓶中，其如以上A部分所描述的在轨道振荡器中培养84±12小时。随后将培养摇瓶的内含物转移至GYM琼脂平板上并且如上所述进行培养。然后如上所述收集孢子，洗涤并无菌转移入管中，如上所述进行离心。离心之后，颗粒物在水中重悬浮、过滤、重离心，并且除去上层清液。然后孢子颗粒在20:80甘油水溶液中重悬浮、并在瓶中分装作为用于生产中试发酵培养的工作储备。工作储备等分试样储备于-70±10。C。6.3工作种子平板的制备从储藏库中重新得到工作储备瓶，保持于干冰中。GYM琼脂平板随后使用细菌学环(bacteriologicalloop)加条紋或划线(streak),所述细菌环包含从带环的瓶刮擦的工作储备。反转被加条紋平板并在28±1.0。C下培养大约15天~大约20天以在表面获得带有暗色柔软孢子的菌苔。6.4种子摇瓶的培养供中试规模发酵制备的种子摇瓶的制备遵循如图6(上部分)所描述的程序。来自各GYM琼脂平板的表面生长(包括细胞质量和孢子)转移入3个2L挡板摇瓶，其中每个摇瓶包含500mL无菌KH培养基，并且在28±l.O"C,在运转在大约300RPM的轨道振荡器上培养70小时~72小时以产生种子培养物。所述种子培养物的纯度和生存力通过包含在摇瓶接种后大约48小时和大约72小时取自生长培养物的等分试样的微观检查的过程中测试，以及还通过在这些接种点的时间点划线GYM琼脂来检验。6.5接种体发酵罐的发酵来自三个种子摇瓶的培养物材料被混合(图6,下部分)，在无菌条件下，pH值为7时，将相当于出现在28L容量接种体发酵罐(ChemapAG，TypeM16K)中大约3%培养基体积的混合材料的体积(450mL)无菌转入包含15LKH水培养基的接种体发酵罐中。培养基使用3mL珪去沫油(ChemSeervice,化学服务)和0.75mLProflo油(商业蛋白；SouthernCottonOilCo.)悬浮。在28±1.0。C进行发酵48±1小时，溶解氧维持在25%(与搅拌相关联)，通风0.55(V/V/M),混合速度110~400RPM。对接种体发酵罐培养物的纯度和生存力进行的测试检测，包括在GYM琼脂平板上24小时后培养和48小时后培养等分试样的微观检查和划线。6.6中试发酵罐中的发酵将接种体发酵罐的整个体积(图6,下部分)转移入750L容量包含MOL调节至pH值为7.1的HI培养基的中试发酵罐(ChemapAG,typeCF/569)中。被转移的接种体的体积相应于中试发酵罐中培养基体积的大约3.3%。在121。C杀毒40分钟之前，也向所述培养基中添加硅去沫油(135mL)和0Proflo油(22.5mL)。在28±1.0。C进行发酵95±1小时，溶解氧维持在25%(与搅拌相关联)，通风0.5~0.7(V/V/M)，发酵液的混合速度80~160RPM,优选地为100RPM,混合至溶解氧25%。对于纯度和生长生存力的过程中控制的测试包括微观检查和48、72和96小时后接种时间点在GYM琼脂平板上发酵液等分试样的划线。6.7发酵液的收获和提取当发酵完成时(图7),通过持续搅拌下緩慢添加99%的EbS04在中试发酵罐中将发酵液的pH值调节为pH3士0.1的水平。然后将所述发酵液在所述中试发酵罐中冷却至14±2°C,随后转入储存器中，并在水箱中4土2。C下保持16~72小时。当冷却期完成时，然后使用0.2-0.45微米孔大小的滤膜使经冷却的发酵液超滤(过滤时间大约为20分48钟)以产生收获的菌丝体的粘稠浆液。为了确定完成发酵时发酵液中ECO-460]的浓度和质量的值，两份0.5克分离(过滤)的菌丝体等分试样被置入分开的50mL离心管中。然后向各管加入20mL曱醇，接着超声5分钟并在高速下漩涡振荡30分钟。然后将管在4000-5000RPM下离心10-15分钟，各管的上层清夜移入干净的50mL瓶中。如上所述使用20mL曱醇重新提取各管的残留菌丝体。然后合并每管两份甲醇提取物(总体积大约40mL),通过0.45iim滤膜过滤lmL合并的甲醇提取物的等分试样。制备经过滤的等分试样的10x稀释物(甲醇中)，使通过HPLC-UV进行ECO-4601的定量分析。作为过滤酸化的和冷却的发酵液完成后定性和定量检查，也化验了分离的发酵液上层清液中ECO-4601的存在。将两份5mL发酵液上层清液的等分试样置于分开的50mL离心管，接着添加5mL乙酸乙酯。然后将管在高速下漩涡振荡1分钟，在4000~5000RPM离心10~15分钟。从各离心管取出lmL乙酸乙酯层的等分试样，放入10mL玻璃培养管中，在氮气流中蒸发至干。将各管中干燥的残余物重新溶解于lmL曱醇中，过滤生成的溶液。然后使各管的滤出液进行HPLC-UV分析以获得ECO-4601的含量。通过以下方法来从收获的菌丝体的浆液中提取ECO-4601:向每1L浆液中添加3L100。/。的曱醇，接着通过在高速(大约30~50赫兹)下通过超滤系统循环曱醇-菌丝体浆液混合物对于初始提取大约60±20分钟。高循环速度用来帮助破坏菌丝体聚集体，循环期间使温度增加至42土3。C。可选择地，可以增加循环时间，例如120分钟，然而如果利用低循环速度因此避免了提取物的可能的过热和降解。一旦菌丝体浆液与提取溶剂适当混合，超滤系统阀门打开，使得曱醇提取物能被收集。甲醇提取物被放于一容器，使用曱醇体积与第一次提取所用的相同的甲醇重提取残留的菌丝体。第二轮提取的残留菌丝体使用甲醇体积大约为第一和第二轮每次提取所用的38倍甲醇重新提取。与前两轮提取相比较，用于第三轮提取的循环时间减少。混合三次曱醇提取物并使用BiichiRotavaporModelR-153(BUCHILabortechnikAG,Flawil,Switzerland)以产生粘稠的第一浓缩物。包含在每轮提取的曱醇提取物中的ECO-4601的量化进行如下。取两份lmL曱醇提取物等分试样，使用曱醇稀释10倍并过滤。经过滤的、稀释的等分试样进行HPLC-UV分析以获得ECO-4601的含量。作为菌丝体的曱醇提取完成后定性和定量检查，评估经过滤废弃的菌丝体(第三轮提取之后的菌丝体)以获得ECO-4601的含量。将两份〗克经过滤废弃的菌丝体样置于分开的50mL离心管，接着添加10mL乙酸乙酯。然后将管超声5分钟，在高速下漩涡振荡30分钟，在4000~5000RPM离心10~15分钟。从各离心管取出2mL乙酸乙酯层的等分试样，放入lOmL玻璃培养管中，在氮气流中蒸发至干。将各管中干燥的残余物重新溶解于lmL曱醇中，过滤生成的溶液。然后使各管的滤出液进行HPLC-UV分析以获得ECO-4601的含量。7个分离的中试发酵的结果出示于下表8中表8中试发酵中试收获使发酵提取物中提取物中提取物中浓缩物中从发酵液到发酵液中ECO-ECO-4601ECO-4601的ECO-4601ECO-4601第一浓縮物批号4601的含量的质量质量的质量的质量)的近似浓度(第一轮)(第二轮)(第三轮)因数PE02878.8g(175mg/L)54.8g122g2.7g69.7g57PE02976.5g(17()mg/L)43Jgl"g4.4g60.4g51PE03167.1g(149mg/L)37.4g11.2g3.8g52.4g50PE03366.6g(148mg/L)46.0g8.4g2.0g56.4g54PE03457.2g(127mg/L)33.6gU.3g1.8g斗6.7g52reo3665.3g(145mg/L)42.5g10.7g2.4g55PE037".3g(147mg/L)16.0g3.1g61.6g61PE03876.1g(169mg/L)49.3g16.3g3.9g5950如上表8最后一栏所示，第一浓缩物的平均体积大约为7L。中试发酵的结果表明在第一轮提取中，包含在从发酵液(其甚至可在初始提取后被蒸发形成浓缩物)回收的曱醇提取物中的ECO-4601的质量为在计算出的存在于发酵液的ECO-4601含量的大约55%~大约70%范围内。完成全部三轮提取，合并曱醇提取物，出现在第一浓缩物中ECO-4601的质量为在计算出的存在于发酵液的ECO-4601含量的大约78%~大约94%范围内。实施例7:使用不同培养基提高ECO-4601的产品7.1普通程序测试各种培养基的性能以提供相对于具体优选的培养基(HI)的高水平ECO-4601的发酵生产。在上面实施例l所述的条件下，使用表9中所提供的单独培养基生长小单孢菌属菌抹[S01U02]046的小规模发酵培养物，下面立即说明。表1说明了被测试的每种培养基的组分。对于各小规模发酵培养，发酵液的收获和提取也遵循实施例1所提供的程序，同样经提取的发酵液的HPLC分析是为了定量所使用的每种培养基的ECO-4601的产品。7.2结果每种培养基类型生产的ECO-4601的含量表达为相对于培养基HI的改进因数，所述改进因数以两个分开的发酵培养实验(每个实验每种培养基两个125mL的摇瓶)中所测试的每个培养基(mg/L)的平均产量与HI培养基中两个对照培养物生长的平均产量的比率来计算。这些小规模发酵培养实验的结果总结于表9。表9使用不同培养基的小规模发酵培养<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>*不可行-一次实验的结果实施例8:放大生产-大体积/中试发酵如实施例6所述，制备中试制种子储备、工作储备、工作种子平板、种子摇瓶、接种体发酵罐的发酵和中试发酵罐中的发酵。8.1发酵液的收获和提取当发酵完成时，通过持续搅拌下緩慢添加99%的H2S04在中试发酵罐中将发酵液的pH值调节为pH3±0.1的水平。然后将所述发酵液在所述中试发酵罐中冷却至4士2。C，随后转入储存器中，并在冰箱中4°C士2。C下保持16-72小时。当冷却期完成时，使冷却的发酵液连续离心(5,000-20,000RPM)或间隙离心(5,000-20,000RPM)以产生菌丝体膏。在发酵完成时，也在收获菌丝体浆液的后收集时，如实施例6所述，也如图8所描述的来操作发酵液中ECO-4601质量浓度的计算。可选一奪地，在完成冷却期间，如实施例6所述的方法可使冷却的发酵液超滤以产生收获的菌丝体的浆液。8.2菌丝体膏的提取如前面实施例6所述，向每一千克菌丝体膏中添加8L(可使用5~8L的范围)100%甲醇，接着在25士3。C下，以250±50RPM混合30±10分钟，然后在过滤体系中循环甲醇-菌丝体混合物来从收获的菌丝体膏中提取ECO-4601。第一轮提取之后，使用与第一轮提取相符的曱醇的体积使提取的菌丝体膏经历第二轮残留菌丝体的提取。根据实施例6进行每轮提取包含在甲醇提取物中的ECO04601的定量。8.3提取的ECO-4601向吸附树脂的转移在完成提取后，合并每轮的ECO-4601曱醇提取物，混合，放入体积大约合并提取物体积的2.5~3倍的不锈钢的大容器(与有机溶剂例如甲醇等相兼容)中，如图8所示。预清洁、干燥，然后向所述大容器中添加HP20树脂，在室温(5°C-40°C)下以100-300的速度与合并的提取物相混合。根据每1克计算的将出现在合并提取物中的ECO-4601中10克树脂，计算添加的HP20的含量，尽管对于每1克计算的将出现在合并提取物中的ECO-4601能够添加树脂的含量在大约10克~大约40克范围内。第二轮曱醇提取完成时，用另外250L体积的曱醇洗涤经提取的菌丝体(和进行提取的容器和系统的内表面)以除去残余量的ECO-4601,其可能已经保持在经提取的菌丝体或表面。包含ECO-4601的洗液然后与第一和第二轮提取合并以形成合并甲醇提取物。为了将合并的ECO-4601甲醇提取物中的ECO-4601转移至被添加到合并的曱醇提取物的吸附HP20树脂上，将水(USP-级)以体积率为每分钟合并提取物体积的大约0.5%~大约20%(即，对于100L合并的提取物，将水以每分钟大约0.5L~大约20L的比率抽入所述大容器中)，更优选地为每分钟合并提取物体积的0.5%~5%。抽入所述大容器的水的总体积为所述合并提取物总体积的大约1.2~大约1.5倍。为了提供将ECO-4601从合并的曱醇提取物相HP20树脂的转移，抽入所述大容器的总体积可包括大约等于所述合并的提取物的总体积。当将水的总体积抽入包含合并的ECO-4601甲醇提取物/HP20树脂混合物的大容器完成时，使所述合并的提取物/HP20树脂/水混合物在室温(5°C~40°C)搅拌(100~300RPM)下培养大约7.5分钟。可选择地，使混合物培养大约5分钟~大约60分钟。当培养完成时，经过滤回收包含吸附ECO-4601的HP20树脂，例如通过使用喜活袋式过滤装配单元；装备有50喜活袋式过滤膜(GAF尼龙过滤器，零件#:PO2Z-E-20S)的FBF-0102-AB10型(喜活公司)，本领域技术人员可以实现。在完成从所述树脂回收ECO-4601时，留在合并的曱醇提取物中ECO-4601的含量通过取两份lmL曱醇提取物等分试样来化验，随后HPLC-UV分析过滤的稀释的等分试样中ECO-4601的含量。8.4结果中试发酵的结果出示于表10中，其中ECO-4601被提取并使用如上所述的水转移技术转移5"吸附树脂上。表10中试发酵(1000L)收获时发酵液中ECO-4601的含量提取物中ECO-4601的质量(第一轮)提取物中ECO-4601的质量(第二轮)洗液中ECO-4601的质量废弃菌丝体中ECO-4601的质量浓缩物中ECO-4601的质量(第二轮)125.1g85.3g11.4g".2g3.2g121.9g中试发酵的结果表明从发酵液(完成转移步骤时，如所计算的出现在从合并的甲醇提取物中回收的提取-结合树脂)回收的ECO-4601的质量将大约为所计算的发酵液中所存在ECO-4601含量的97.4%实施例9:树脂吸附的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的下游加工过程包含树脂吸附的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的第一浓缩物能够经历进一步下游加工过程以便降低杂质的水平，这样的杂质潜在地对例如ECO-4601的结晶具有不良影响或影响。为了降低这样的杂质的水平，使得已经转移到吸附树脂上的ECO-4601经历柱纯化循环，其中对于第一轮纯化，通过将20%曱醇水溶液中2.5±0.2kg预清洗的HP20转移入30L容量的柱中来制备HP20柱，然后洗脱所述柱直到所述HP20树脂固定在所述柱中从而在所述柱中形成树脂床。然后在不扰乱HP20的洁净床条件下，将包含大约315克ECO-4601(包含ECO-4601的HP20树脂的颜色是从微红色到呈褐色/暗褐色)的HP20树脂转移入所述柱。所述HP20树脂包含大约315克ECO-4601,如以上实施例8所述，所述ECO-4601由提取物的转移处理产生，所述提取物具有339.2克ECO-4601。当包含315克ECO-4601的HP20树脂向所述柱的转移完成时，然后以流速400mL/min使用150±5L65%的曱醇水溶液洗脱所述柱，丢弃使用65%曱醇水溶液洗脱的流出物。65%曱醇水溶液的洗脱步骤之后，然后以流速400mL/min使用150±5L70%的曱醇水溶液洗脱所述柱，流出液收集在20L的级份(fraction)中。当70%水洗脱完成后，然后以流速400mL/min使用100±5L90%的甲醇水溶液洗脱所述柱，流出液收集在20L的级份中。检测从所述70%曱醇水溶液和90%曱醇水溶液洗脱步骤中得到的20L级份中ECO-4601的存在，合并大于或等于1%ECO-4601的级份以便形成甲醇水溶液级份的混合，所述曱醇水溶液包含第一轮纯化的ECO-4601。然后使得包含大约304克ECO-4601的曱醇水溶液级份的混合经历第二轮纯化。对于第二轮纯化，将从第一轮纯化获得的包含大约304克ECO-4601的曱醇水溶液级份的混合转移入350L混合槽。然后向所述混合槽中加入数量为18±2L的预清洁的HP20树脂，搅拌器以120±10RPM旋转。然后以体积率为2±0.5L/min向所述槽中抽入水(UPS-级)直到总体积等于第一轮纯化的混合的曱醇级份的体积。完成将水抽入所述槽时，使用如实施例8所述的袋式过滤装配单元和过滤器回收包含ECO-4601的HP20。对于第二轮纯化，通过将5L20%甲醇水溶液54中2.5土0.2kg预清洁的HP20转移到柱上来制备HP20柱，之后使用20%的甲醇水溶液洗涤所述柱，所述HP20^皮允许固定在所述柱上从而在所述柱中形成树脂床。柱固定完成后，已经转移到HP20树脂上的ECO-4601被转移到所述柱，使用30%曱醇水溶液洗涤所述柱。随后，以流速400mL/min使用150±5L65%的甲醇水溶液洗脱所述柱，丢弃使用65%曱醇水溶液洗脱的流出物。65%曱醇水溶液的洗脱步骤之后，然后以流速400mL/min使用150±5L70%的曱醇水溶液洗脱所述柱，流出液以20L级份收集。当70。/Q水洗脱完成后，然后以流速400mL/min使用100±5L90。/o的曱醇水溶液洗脱所述柱，流出液以20L级份收集。检测从所述70%甲醇水溶液和90%曱醇水溶液洗脱步骤中得到的20L级份中ECO-4601的存在，合并大于或等于1%ECO-4601的级份以侵_形成曱醇水溶液级份的混合，所述曱醇水溶液包含第二轮纯化的ECO-4601。然后蒸发包含大约278克ECO-4601的曱醇水溶液级份的混合和曱醇水溶液级份的混合以提供具有浅灰色到灰褐色的第二浓缩物。尽管可残留在所述第二浓缩物中的任意具体杂质的水平可变化，但是所述第二浓缩物将被认为基本不含分子，所述式1法尼基化二苯并二氮杂萆酮除外。从所述第二浓缩物中，式1的结晶态法尼基化二苯并二氮杂蕈酮可通过使所述第二浓缩物结晶过程来生产。实施例10:结晶第二浓缩物可被用于结晶ECO-4601的生产。33%的乙醇结晶溶液能够以140土20RPM搅拌下在500L结晶槽中制备。允许结晶溶液的温度在30±2°C处平衡120±10分钟。结晶的样品溶液能够通过溶解所述第二浓缩物(由所述两轮纯化处理所述HP20柱(如以上实施例8所述)产生)和通过在无水乙醇中混合所述第二浓缩物(24±3g/L)来制备。所述第二浓缩物将与所述无水乙醇充分混合以便将所述第二浓缩物溶解于所述无水乙醇中，例如通过人工混合7.5士2.5分钟。然后当搅拌时，向乙醇溶液中加入纯化的水，生成的溶液通过0.45~10nm膜的过滤器来过滤。然后所述所述样品溶液可以大约10mg/min/10L结晶溶液体积的速率抽入结晶槽中。抽所述结晶溶液期间，氮气或纯化空气以20±2L/min流速在结晶槽上方流动。所述槽的温度被维持在30±2°C，同时在40±10RPM处使用33%乙醇溶液混合所述样品溶液。当所述样品溶55液抽入所述结晶槽时，所述结晶槽将使用水中75±25mgECO-4601接种，完成所述样品溶液向所述结晶槽的传输。允许ECO-4601晶体成熟14±2小时，氮气以10±2L/min流速在结晶槽上方流动，混合发生在40±10RPM,同时槽温度维持在30土2。C。然后将纯化的水以速率(mL/min)大约等于以1200份来添加水的体积被抽入所述结晶槽，允许晶体在结晶槽上方以流动速率为10±2L/min的氮气流中成熟24±4小时，混合发生在40土10处，同时所述槽的温度维持在30土2。C。成熟期完成时，停止混合，允许晶体沉淀18±6小时。为了从结晶槽中收获沉淀的晶体，结晶槽中的上层清液被排入收集器，沉淀的晶体(以浆液的形式)被排入接受器，通过10-20pm烧结玻璃砂滤漏斗过滤来回收。然后回收的晶体在冷(大约4°C)的10%的乙醇中重悬浮，再次过滤，重复两次重悬浮和过滤。然后允许晶体在真空炉(运行在大约至少等于或大于25英尺Hg柱压力，68士2。C处)中退火21土5小时。退火完成时，然后经退火的晶体可转入容器，优选地为聚丙烯容器，储存于25±2°C。实施例11:相对于发酵液中ECO-4601的纯化，产生增加的ECO-4601的纯度水平的具体批次的纯化演示作为测量从发酵液阶段到产生结晶ECO-4601中ECO-4601纯度水平增加的实例，450L中试规模发酵液批次(记录号DR00116)(根据实施例6所述的程序来生产)被计算出包含大约78克ECO-4601。大约22.5kg(当完成发酵过程时，包含大约5%的发酵液质量)产生式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物的细胞质量被计算出现在所述发酵液中。因此，发酵期完成时，纯度水平大约0.35%的ECO-4601:帔计算出现在所述发酵液中(78克除以(0.05ch3450，000克))。发酵期完成时，发酵液中的ECO-4601的纯度水平被评估为至少在大约0.3%~大约1%范围内。当使第一浓缩物(从发酵液提取物的处理中产生)经历第一轮柱纯化时，计算的从这第一轮纯化中产生的ECO-4601的纯度大约为66%,当第二轮纯化(如以上实施例9所述)完成时，包含如此形成的第二浓缩物的ECO-4601的纯度被计算出大约是88.5%。随后，使第二浓缩物经历结晶过程，生成的结晶体被计算大约是99%ECO-4601。在沖突的情况下，本发明的说明书，包括定义，将支配。尽管已经结合其优选实施方式对本发明作了详细说明和描述，但是本领域所属技术人员将理解在不脱离所附权利要求书所限定的本发明范围的情况下，可作各种形式和细节的变化。权利要求1.一种用于回收和浓缩结构式1的法尼基化二苯并二氮杂id="icf0001"file="A2007800222160002C1.tif"wi="4"he="5"top="27"left="174"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的方法，id="icf0002"file="A2007800222160002C2.tif"wi="102"he="39"top="52"left="48"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>式1所述方法包括如下步骤a)使能够产生所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0003"file="A2007800222160002C3.tif"wi="4"he="5"top="111"left="136"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的微生物菌株发酵，从而产生包含所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0004"file="A2007800222160002C4.tif"wi="4"he="5"top="119"left="129"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的发酵液；b)调节所述发酵液以允许所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0005"file="A2007800222160002C5.tif"wi="4"he="5"top="126"left="158"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮与存在于所述发酵液中的颗粒物相缔合；c)从所述发酵液收获所述颗粒物，以便获得收获的颗粒物；d)以与所述收获颗粒物成大约2∶1至大约5∶1的比例的合适的有机溶剂体积提取所述收获的颗粒物，从而形成提取物；以及e)处理所述提取物以形成包含所述式1的法尼基化二苯并二氮杂id="icf0006"file="A2007800222160002C6.tif"wi="4"he="5"top="172"left="27"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的第一浓缩物，其中所述浓缩物包含所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0007"file="A2007800222160002C7.tif"wi="4"he="5"top="180"left="22"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮，所述浓缩物中法尼基化二苯并二氮杂id="icf0008"file="A2007800222160002C8.tif"wi="4"he="5"top="181"left="122"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的浓度比a)的所述发酵液中的所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0009"file="A2007800222160002C9.tif"wi="4"he="5"top="188"left="107"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的浓度高大约50倍，并且其中所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0010"file="A2007800222160002C10.tif"wi="4"he="5"top="196"left="92"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮以所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂id="icf0011"file="A2007800222160002C11.tif"wi="4"he="5"top="204"left="43"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>酮的量的至少大约50％的量从a)的所述发酵液回收2.如权利要求1所述的方法，其中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮以所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮的量的至少大约60。/o的量从a)的所述发酵液回收。3.如权利要求1所述的方法，其中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮以所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮的量的至少大约65。/o的量从a)的所述发酵液中回收。4.如权利要求1所述的方法，其中所述颗粒物包含存在于所述发酵液中的微生物。5.如权利要求4所述的方法，其中所述颗粒物进一步包含吸附树脂a。6.如权利要求4和5中任一项所述的方法，其中在步骤b)中将所述发酵液的pH值调节至大约2至大约4。7.如权利要求6所述的方法，其中所述发酵液进一步被调节至大约2。C至大约l(TC的温度范围。8.如权利要求7所述的方法，其中将所述发酵液在所述温度范围处维持大约16小时至大约72小时。9.如权利要求1所述的方法，其中所述发酵在大约48小时至大约110小时内完成。10.如权利要求l所述的方法，其中所述微生物是细菌。11.如权利要求10所述的方法，其中所迷细菌是放线菌。12.如权利要求11所述的方法，其中所述放线菌是小单孢菌、链霉菌或红球菌属。13.如权利要求12所述的方法，其中所述放线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。14.如权利要求l所述的方法，其中所述合适的有机溶剂包括i)至少一种低级烷基醇；或ii)乙酸乙酯；或iii)乙腈。15.如权利要求14所述的方法，其中所述低级烷基醇是乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或甲醇、或它们的混合物。16.如权利要求15所述的方法，其中所述低级烷基醇是曱醇。17.如权利要求1所述的方法，其中所述水培养基是如表1中所示的AP、CA、DZ、GP、HI、JA、MI、PI、QI、QP或YB。18.如权利要求l所述的方法，其中所述水培养基是如表1和表2中所示的QB、MA、KH、RM、JA、FA或HI。19.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)使用超滤系统来进行。20.如权利要求19所述的方法，其中所述超滤系统具有一个或多个过滤器元件，所述过滤器元件具有大约0.2~大约0.45微米的孔径尺寸。21.如权利要求1所述的方法，其中步骤(C)通过离心来进行。22.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括一至三轮使用所述合适的有机溶剂进行的提取。23.如权利要求22所述的方法，其中所述提取进一步包括在大约39匸至大约45X:的温度下、以大约30Hz至大约50Hz的流速、在系统中将所述颗粒物和所述合适的有机溶剂一起循环。24.如权利要求23所述的方法，其中所述循环持续大约50分钟~大约120分钟的一段时间。25.如权利要求22所述的方法，其中所述提取包括使所述颗粒物和所述合适的有机溶剂一起承受离心处理。26.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中所述合适的有机溶剂的体积按与所述收获颗粒物的质量的比例(体积质量)来计算。27.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中所述合适的有机溶剂的体积按与所述收获颗粒物的体积的比例(体积体积)来计算。28.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)的所述处理是蒸发处理。29.如权利要求28所述的方法，其中所述蒸发处理在减压下进行。30.如权利要求28所述的方法，其中步骤(e)的所述处理所述蒸发在以吸附树脂b培养所述提取物时进行。31.如权利要求30所述的方法，其中所述蒸发处理在减压下进行。32.如权利要求30和31中任一项所述的方法，其中所述吸附树脂b是HP20。33.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)的所述处理包括以吸附树脂c培养所述提取物以形成混合物，接着通过向所迷混合物中添加水而将所述式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮置换至所述树脂c上。34.如权利要求33所述的方法，其中与所述提取物混合的所述吸附树脂c以与所述提取物中所述式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮成大约IO倍至大约40倍的比率(W/W)来提供。35.如权利要求32和33中任一项所述的方法，其中所述水以所述混合物体积的大约0.5%至大约20%的体积流速(V/V)添加到所述混合物中。36.如权利要求35所述的方法，其中所述体积流速是所述混合物体积的大约0.5%至大约5%。37.如权利要求35和36中任一项所述的方法，其中添加到所述混合物中的所述水的总体积是所述混合物的体积的大约1.0至大约1.5倍。38.如权利要求37所述的方法，其中添加到所述混合物中的所述水的总体积是所述混合物的体积的大约1.2至大约1.5倍。39.如权利要求1所述的方法，其中a)的所述发酵液包括大约10mg/L至大约465mg/L的所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮。40.如权利要求1所述的方法，进一步包括处理通过权利要求1的方法获得的所述浓缩物，以降低所述浓缩物中杂质的水平，从而产生第二浓缩物。41.如权利要求41所述的方法，进一步包括从所述第二浓缩物中结晶所述式1的法尼基化二笨并二氮杂萆酮的步骤，从而产生适合在制备药物制剂中使用的所述式1的法尼基化二苯并二氮杂革酮的晶体。42.通过权利要求1所述的方法获得的浓缩物。43.如权利要求42所述的浓缩物，其中所述法尼基化二苯并二氮杂革酮以所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮量的至少大约6CT/。的量从a)的所述发酵液中回收。44.如权利要求42所述的浓缩物，其中所述法尼基化二苯并二氮杂革酮以所述发酵液中所述法尼基化二苯并二氮杂革酮量的至少大约65。/o的量从a)的所述发酵液中回收。45.如权利要求42至44中任一项所述的浓缩物，其中所述发酵液包括能够产生所述法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物。46.如权利要求45所述的浓缩物，其中所述微生物是细菌。47.如权利要求46所迷的浓缩物，其中所述细菌是放线菌。48.如权利要求46所述的浓缩物，其中所述放线菌是小单孢菌、链霉菌或红球菌属。49.如权利要求48所述的浓缩物，其中所述放线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有IDAC保藏号070卯5-01的小单孢菌属[S01U02]046。50.如权利要求42所述的浓缩物，其中所述提取物与吸附树脂混合以形成混合物，其中所述树脂以存在于所述提取物中所述式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的大约10倍至大约40倍的比率(W/W)添加到所述提取物中，以及其中所述水以所述混合物体积的大约0.5%至大约20%的体积流速(V/V)添加到所述混合物中。51.能够在一定体积的水培养基中于发酵期间产生结构式1的法尼基化二苯并二氮杂萆酮的微生物，HO式1其中在所述发酵期间平均产率是大约0.073mg/L/h至大约5.06mg/L/h。52.如权利要求51所述的微生物，其中在所述发酵期间平均产率是大约2.15mg/L/h至大约5.06mg/L/h。53.如权利要求51所述的微生物，其中在所述发酵期间平均产率是大约3.00mg/L/h至大约5.06mg/L/h。54.如权利要求51至53中任一项所述的微生物，其中所述微生物是细菌。55.如权利要求54所述的微生物，其中所述细菌是放线菌。56.如权利要求55所述的微生物，其中所述放线菌是小单孢菌、链霉菌或红球菌属。57.如权利要求56所述的微生物，其中所述放线菌是具有IDAC保藏号231203-01的小单孢菌属[S01]046或具有IDAC保藏号070905-01的小单孢菌属[S01U02]046。58.具有IDAC保藏号070905-01的微生物小单孢菌属[S01U02]046。59.用于培养细菌的培养基组合物，其中所述培养基包括10g/L葡萄糖、20g/L可溶性淀粉、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨和2g/LCaC03;10g/L葡萄糖、40g/L马铃薯糊精、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨和2g/LCaC03;10g/L葡萄糖、25g/L可溶性淀粉、5g/L酵母提取物、5g/L细菌蛋白胨和3g/LCaC03;12g/L葡萄糖、10g/L马铃薯糊精、5g/L玉米浆、10g/L药用培养基和4g/LProflo油；或20g/L马铃薯糊精、8.34g/L酵母提取物、30g/L甘油、2.5g/L细菌蛋白胨和3g/LCaC03。60.用于生长细菌培养物的方法，所述方法包括下述步骤提供如权利要求59所述的培养基以及在存在所述培养基的情况下培养细菌。61.如权利要求60所述的方法，其中所述培养在pH值为大约6.8至大约7.2的水性条件下进行。全文摘要本发明提供了用于制备包含大量法尼基化二苯并二氮杂酮的浓缩物的可计量方法，所述方法包括使能够产生法尼基化二苯并二氮杂酮的微生物菌株发酵，发酵完成后收获发酵液并且提取发酵液以获得提取物，然后处理提取物以形成浓缩物。所由此生成的浓缩物可用于生产药物化合物的下游方法中。提供了能够以高产率产生法尼基化二苯并二氮杂酮的小单孢菌属以及用于培养微生物的培养基，和用于产生浓缩物的法尼基化二苯并二氮杂酮的发酵条件。文档编号C12N1/20GK101495616SQ200780022216公开日2009年7月29日申请日期2007年4月16日优先权日2006年4月14日发明者F·耶博亚,M·皮拉伊申请人:塔利昂制药公司