肝再生中脂肪衍生的成体干细胞的制作方法

专利名称：：肝再生中脂肪衍生的成体干细胞的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及基于细胞治疗的领域。更具体说，本发明涉及自非肝组织的干细胞衍生肝干细胞。
背景技术：
：肝炎、肝毒素暴露和肝硬化的继发性肝衰竭仅在美国威胁数千人的生命。在美国，每年用于肝疾病的直接护理费用估计为600亿美元至1000多亿美元。社会保险每年为这些丧失劳动力的患者及其家庭支付额外200-400亿美元。不幸的是，这时，肝移植对于患者是不同于治标措施的唯一治疗选择。但是，因为供体器官的缺乏，等待肝的全部患者中不足三分之一实际得到一个肝。根据美国器官分享的联合网络(UNOS)，目前在美国有15，700患者等待肝移植，但是每年仅有4，000至5，000个可移植的供体肝是可获得的。因为，几乎无例外地，一个供体器官仅帮助一个受体，在过去十年，可用供体和等待移植的候选者之间的鸿沟不断加大。因此，需要新的疗法。干细胞疗法为需要全部或部分重建肝功能的那些人提供了替代的治疗选择。在许多方面，肝细胞疗法是完整器官移植的希望的替代，因为一个肝可以用于治疗多个患者，还因为细胞疗法中涉及的4外科手术对于患者而言更安全、更容易且花费更少。干细胞移植提供了安全有效改善衰竭肝的生化功能的治疗程式。因此，需要从非肝组织衍生肝干细胞的方法。
发明内容在本发明的一个实施方案中，提供了从非肝细胞衍生肝干细胞的方法，其包括(a)提供了衍生自非肝组织的干细胞；和(b)在包含至少一种纤维基质蛋白的细胞外基质上和包含肝生长因子(HGF)的不含血清的培养基中培养干细胞，其中衍生自非肝组织的干细胞分化成肝干细胞。非肝组织的实例包括但不限于脾、肠和脂肪组织。在优选实施方案中，脂肪干细胞衍生自非肝干细胞的脂肪组织源；但是，非肝组织可以来自任何成体哺乳动物。至少一种纤维基质蛋白优选选自胶原i和胶原n工。在本发明的一些实施方案中，培养基可以进一步包含制瘤素M、DMS0或两者，且细胞外基质可以进一步包含纤维结合素、基质胶、vitrogen或其组合。在一些实施方案中，超过约70%的衍生自非肝组织的干细胞分化成肝干细胞。在本发明的另一实施方案中，提供了从非肝干细胞诱导HGF表达的方法，该方法包括(a)提供衍生自非肝组织的干细胞；和(b)在包含至少一种纤维基质蛋白的细胞外基质上和包含EGF、bFGF或两者的不含血清的培养基中培养干细胞，其中衍生自非肝组织的干细胞生成HGF。培养基可以进一步包含抗坏血酸二磷酸钠。图1是根据本发明从非肝干细胞(例如ASC)衍生肝干细胞的示意图。图2显示了从ASC衍生的肝干细胞中表达相对白蛋白(ALB)和a-胎蛋白(AFP)mRNA。图3显示了从ASC衍生的肝干细胞中的糖原贮积。图4显示了从ASC衍生的肝干细胞的形态。图5提供了显示EGF和抗坏血酸二磷酸钠具有诱导人类ASC中HGF表达的协调能力的图。图6提供了比较有或没有抗坏血酸二磷酸盐的EGF和bFGF诱导ASC中HGF表达的能力的图。图7是ASC中表达的受体的RT-PCR分析。图8显示选择的细胞因子暴露于脂多糖0至24小时后不同时间的分泌(n:6至8的ASC供体)。具体实施例方式本发明涉及从非肝组织衍生肝干细胞的方法。本发明不限于生命任何一个阶段的组织。即，本发明方法可以包括成体、胎儿或胚胎组织。更甚者，组织来源广泛涉及任何非肝组织。"非肝"组织的非限制性实例包括脂肪组织、肠、脑、脐带血液和骨髓。因此，虽然本文更多地引用成体脂肪组织描述本发明，但是这种引用仅是示例性的，并不应该解释为限制性的。从非肝组织衍生非肝干细胞非肝干细胞可以衍生自脂肪组织(即，脂肪干细胞，"ASC")，或者衍生自人类或其他哺乳动物源。人类ASC可以从皮下脂肪组织分离，所述脂肪组织获自优选健康男性或女性患者，例如那些经历选择性抽脂过程的患者。鼠类ASC也可以从皮下脂肪组织分离，所述脂肪组织获自优选雄性C57BL/6小鼠和/或雄性ROSA-26小鼠。根据这些来源，在5天培养中，从1毫升抽脂抽吸物回收约250，000ASC是典型的。平均人类抽脂样品大于约500ml。从相同体积的鼠类脂肪组织回收甚至更大数目的细胞，可能是因为供体动物年龄小。从脂肪组织衍生脂肪干细胞的方法示于USPNo.6153432，6391297,6429013，6555374，6841150，7001746和7033587，其公开内容通过引用整体并入本文。简言之，在一个实施例中，一旦获得组织，其经受差速离心并培养扩增。1克组织在24小时培养中通常产生50，000至100，000干细胞。扩增培养基优选包含60%DMEM(低葡萄糖)和40%MCDB-201，添加有10。/。肽牛血清(FBS);5pg/ml胰岛素、5pg/ml转铁蛋白和5ng/ml硒；10_9M地塞米松；10ng/ml表皮生长因子(EGF)和/或10ng/ml成纤维细胞生长因子，碱性(bFGF);10—M抗坏血酸2-磷酸盐；100U/ml青霉素；禾P100U/ml链霉素。不受理论限制或束缚，但认为向培养基中添加EGF、bFGF或两者提高了ASC后来分化成肝干细胞的能力。抗坏血酸2-磷酸盐可以具有对ASC的类似作用，特别是它们表达HGF的能力(下文讨论)。HGF促进干细胞向肝谱系分化。向所示本培养条件添加HGF，被认为能够辅助分化过程。因此，在本发明的一个实施方案中，从本文描述的细胞群生成HGF，可以在体外和体内(例如，移植后)用于辅助其他"新生"干细胞分化成功能肝细胞。分化培养基在地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤和噻唑烷二酮存在下，ASC经历了脂肪形成。细胞累积了脂质空胞，其可以因中性脂质而被染色并表达脂肪细胞特异性标志，包括分泌的细胞因子来普汀和脂肪酸结合蛋白aP2。但是，ASC的分化能力不限于脂肪细胞谱系。为分化成肝干细胞和肝细胞，无血清扩增培养基进一步添加有10ng/mlEGF和/或10ng/mlbFGF、10ng/mlHGF、10ng/ml制瘤素M(OSM)、1%DMSO或其组合。分化条件ASC最初以约5-15X103细胞/0112的密度与扩增培养基一起涂布于预包被有胶原I的组织培养皿或孔。胶原-1包被的组织培养皿可商业途径获得(例如，来自BectonDickinson的MATRIGEL，来自PureGel的VITROGEN)，其任何可用于本发明。另外，不受理论限制或束缚，本发明人发现使用纤维肝基质蛋白(例如，胶原，优选胶原I和胶原III)在本发明方法中是优选的，由于使用它们表现出更好地再现成体肝组织中存在的干细胞的体内环境。换言之，纤维基质蛋白表现为提供不可用也不如其他基质蛋白强的分化信号。例如，纤维结合蛋白是非纤维分子；它是糖蛋白(胶原不是糖蛋白)，其主要使细胞连接至其他基质分子或组织培养皿。即，纤维结合蛋白被认为是使细胞表面的整联蛋白连接至器官中下面的胶原基质(体内)或组织培养皿底部(体外)的桥。因此，由纤维结合蛋白结合而活化的信号可能非常不同于由胶原结合而活化的信号。当需要使用非纤维蛋白例如纤维结合蛋白时，它们可以与根据本发明的纤维蛋白结合使用。在一些实施方案中，细胞外基质不包含纤维结合蛋白。这样，认为本方法指导非肝干细胞"转化"为肝干细胞，其然后在一些情况下可以分化为成熟肝细胞，而不是直接将非肝干细胞分化成肝细胞，绕过了所有肝干细胞阶段。这个概念图示于图l。可适合本发明的其他基质蛋白的实例包括胚胎肝基质蛋白。在这个初始时期，使细胞达到超过约80%融合，这可能需要达3天，并培养于上述扩增培养基。一旦达到超过约80%融合，用单独的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞两次或三次，并随后置于无血清分化培养基。ASC在这些培养条件下保持4到20天额外的时段，以发生分化。可以以规则的间隔收集代表性的培养物，用于分析。实施例1人类ASC被置于(无血清)扩增培养基。2-3代后，细胞群用胰岛素分散，并以5，000至10，000细胞/ci^的密度接种于胶原I包被的皿上。细胞繁殖，直至达到约80%的融合，此时将培养基更换为肝分化培养基[包括无血清扩增培养基，添加了10ng/mlHGF、10ng/ml制瘤素M(OSM)和O.1%DMSO]。培养基每三天更换一次。在分化后各个时间点收集细胞溶解产物用于RT-PCR分析，或者固定用于肝生物标志组织学分析。一些用于评价体内肝原性的生物标志包括(a)通过RT-PCR的白蛋白(ALB)和a-胎蛋白(AFP)表达；和(b)糖原贮积(通过阳性PAS染色分析后期肝标志)。图2显示在分化培养基中培养10天的ASC的AFP和ALB表达。总RNA使用商业途径获得的试剂盒从细胞纯化。2pg总RNA使用OligodT，利用MMLV-RT以20pl反应在42。C下反转录1小时，使用2pl稀释的(l:10)cDNA进行40个循环的PCR。5pl的扩增产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并用EtBr可视化(亲环蛋白B(Cyclo)用作输入cDNA的对照)。数据显示，虽然白蛋白在群体中表达，但是几乎没有至没有AFP在相同群体中存在，这表明细胞群体主要含有肝干细胞。实际上，认为AFP表达表明更多的从肝干细胞分化的成熟肝细胞的存在。进一步分析证实，这些细胞表现出肝干细胞的其他标志，包括Ep-CAM和ICAM-I的阳性表达和Ia类MHC的阴性表达。图3显示早代[p3]ASC接种在6孔皿上，培养至约80%融合并转移至肝分化培养基。个体孔在第0天(图A)和第17天(图B)固定，并对糖原染色(阴影)。图4进一步显示在分化条件下培养18天的细胞具有肝细胞形态。这些数据汇总表明，ASC可以分化成肝干细胞。然后这些干细胞的一些可以成熟为肝细胞或胆细胞，(图l)但也可以自我再生。在本发明的另一个实施方案中，提供了用于诱导细胞因子表达的方法，所述细胞因子可以在从ASC的肝再生中起作用。这样的细胞因子可以包括HGF、VEGF、IL-6、LIF、TNFa、来普汀及其组合。本发明提供了用于增强一种或全部这些细胞因子生成的培养条件。同样，不受理论限制或束缚，本发明人发现使用纤维基质蛋白(例如胶原I)一般在本发明方法中是优选的，因为它们的使用表现出在更好地再现成体组织中肝干细胞的体内环境。更重要的是，EGF单独加入或与抗坏血酸钠一起加入，表现为大大提高细胞因子在这些条件下的生成。可以促进肝再生细胞因子生成的其他因子/条件包括佛波醇酯、FGF、肝素、低氧(定义为〈5%02)或其组合。实施例2人类ASC在添加有3%血清的DMEM/F12培养基中繁殖，测定了EGF和抗坏血酸二磷酸钠的对细胞因子生成的作用。以5-10x10:i细胞/0112接种的三个孔用浓度为0、0.1、1或10ng/ml的EGF+/-抗坏血酸二磷酸钠培养。72小时后，收集培养基用于ELISA检测HGF。图5是代表性的数据，标准化为pgHGF/106细胞(n=3)。单独培养基不含HGF。数据说明，当缺乏EGF和抗坏血酸钠时，HGF以超过10，680pg/10e细胞合成。但是，该生成在存在两种因子时增加了近5倍。实施例3未分化的人类ASC在添加了3%血清和10ng/mlEGF或bFGF的DMEM/F12培养基中繁殖。图6A显示，在EGF存在时，ASC以高于3000ng/百万细胞的水平表达HGF，这反应了相对基线水平2倍的增加。抗坏血酸2-磷酸盐的存在进一歩增加了EGF达25倍诱导的诱导作用。在相同条件下，在抗坏血酸2-磷酸盐不存在或存在下脂肪细胞分化的ASC分别以额外2.0-和6.3-倍的水平表达HGF(图6B)。在存在bFGF时，由未分化huASC表达的HGF也显著增加(图6C)。但是，bFGF未能影响脂肪细胞分化的ASC的HGF表达(图6D)。随后通过RT-PCR分析总RNA，证明未分化的huASC和脂肪细胞分化的huASC都表达了bFGF和EGF受体以及HGF(c-met)受体(图7)。ASC细胞因子表达除了HGF，人类ASC分泌多种造血和其他功能细胞因子。当用脂多糖(LPS,100ng/ml)诱导时，其他静息ASC培养物表现出以下因子增加的mRNA稳态水平白介素6、7、8和11(工L-6，-7，-8，-11);白血病抑制因子(LIF);巨噬细胞集落剌激因子(M-CSF);粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);粒细胞集落刺激因子(G-CSF);图8所示flt-3配体(Flt3L)以及kit配体(KL，也称为干细胞因子)；肿瘤坏死因子a(TNFa);和骨形成蛋白2和4(BMP-2，-4)。鼠类和人类骨髓衍生的干细胞也表达这些相同的细胞因子。如下表1和图8所示，ASC在LPS刺激后24小时内显著增加了IL-6、IL-7、IL-8、GM-CSF和M-CSF的分泌。表l.分泌的细胞因子的LPS诱导(ELISA，pg/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>这样，在肝损伤后立即或很快移植的ASC能够部分通过HGF和VEGF的局部释放增强肝再生。ASC导入哺乳动物可以通过本领域已知和可用的任何方法来实现，包括注射。在另一种细胞递送方法中，ASC经由包囊后实质内或肝内注射而移植入受体哺乳动物。包埋入例如藻酸盐基质的移植细胞提供了几个优点，包括(a)为细胞提供提高移植后生存能力的〃3-D环境〃；(b)允许更高数目的细胞被植入；(c)产生支持生长和分化的微环境；和(d)在移植之前实现因子(例如，上述生长因子或多细胞类型)的共包囊。另外，由于细胞被包埋入水凝胶中，它们较不易于分散至机体其他部位，所述部位在细胞混旋物用于移植时很少被观察到。简言之，细胞包囊在将细胞混合入海藻酸钠溶液之后使用静电珠生成装置进行。所述珠再悬浮于PBS中，细胞浓度相当于约107细胞/ml。小切口开腹术切口在实现受体足够麻醉和镇静后使用无菌技术进行。细胞混旋物通过针头直接注射入组织外周而递送(小鼠中递送O.lml是通常的)，通过局部压迫实现止血。该技术同样适用于人类和鼠类模型。在第二种移植方法中，达106个细胞可以在连接至Cytodex3tm(AmershamPharmacia)微载体珠之后脾内注射。在移植后，细胞快速转移至肝窦状腺，并可以在移植两小时内在肝中被检测到。给药对于人类，当直接注射入肝循环系统时，根据使用该剂量在小鼠研究中的经验，约3x109细胞或1%肝质量是优选的。实际上，小鼠中2百万细胞的剂量是优选的。分别为4和6百万细胞的中和高剂量水平基于初步急性致死研究结果，其中多组(每组三只)雄性N0D-SCID小鼠被施用1毫升体积中0、2.5、5、10、20和40百万人类肝细胞的剂量。10、20和40百万细胞的移植导致100%死亡率，5百万细胞的移植导致20小时内3只小鼠中1只死亡，而每只小鼠2.5百万细胞良好耐受。以0.2ml剂量体积施用的6百万细胞的高剂量被选择，因为它被认为是可以且施用的最大剂量且无脾破裂，并且预期大部分动物耐受该剂量(S卩，MTD)。作为低和高剂量水平之间的中点，4百万细胞的中剂量是优选的。特别是当治疗人时，所有处理步骤应该根据具有适当S0P的GMP标准进行。人类ASC如果冷藏保存，将被融解并悬浮于无血清的离子等渗培养基，其适合以不低于约0.1至不超过10百万细胞/ml的浓度输注。细胞生存能力可以通过台盼蓝排除或等效分析来评价。细胞将贮存于室温或湿冰上，并通过显微镜检査来评价，以证明任何凝集。如果观察到，则细胞将通过尼龙网(40微米)过滤器选择，再次确定细胞的最终浓度。细胞将以每kg体重1至10百万细胞的剂量静脉内灌入经受肝损伤的受体(例如，由于急性毒素暴露)。受体将被跟踪任何急性反应的迹象，例如发热、发冷或精神状态变化，如果观察到这些，则将通过标准医疗实践来对症治疗。然后受治疗者在接下来2个月时段内将被跟踪，通过每周血清化验来评价肝功能恢复。这样，本发明可以利于多种形式的肝衰竭(包括急性和慢性)的治疗。自体或异体人类ASC作为改善肝功能的成体细胞的可用性对于继毒性暴露(四氯化碳、扑热息痛)、感染剂(肝炎、细胞巨化病毒)或由于瘤转移或创伤的外科切除后的肝损伤患者具有价值。人类ASC分化成功能肝细胞和/或释放支持内源性肝祖细胞繁殖和分化的生长因子的能力可以提供改善和加速这些条件下肝功能恢复的虽然本发明已经结合其具体实施方案描述，但应理解，其能够进一步调整，且本申请预期涵盖下述发明的任何改变、使用或变化。一般，本发明的原理，包括如下对本公开内容的变化落入本发明所属领域已知或惯常实践，可适用上文提出的本质特征以及落入所附权利要求的范围内。权利要求1.一种从非肝干细胞衍生肝干细胞的方法，该方法包括(a)提供了衍生自非肝组织的干细胞；和(b)在包含至少一种纤维基质蛋白的细胞外基质上和包含肝生长因子(HGF)的不含血清的培养基中培养干细胞，其中衍生自非肝组织的干细胞分化成肝干细胞。2.根据权利要求l的方法3.根据权利要求1的方法物的组织。4.根据权利要求1的方法原i和胶原ni。5.根据权利要求4的方法I。6.根据权利要求1的方法M、DMS0或两者。7.根据权利要求1的方法维结合素、基质胶、vitrogen或其组合。8.根据权利要求l的方法，其中超过约70%的衍生自非肝组织的干细胞分化成肝干细胞。9.根据权利要求l的方法，其中衍生自非肝组织的干细胞进一步通过培养传代衍生。10.—种从非肝干细胞诱导HGF表达的方法，该方法包括(a)提供衍生自非肝组织的干细胞；和(b)在包含至少一种纤维基质蛋白的细胞外基质上和包含EGF、bFGF或两者的不含血清的培养基中培养干细胞，其中衍生自非肝组织的干细胞生成HGF。，其中所述非肝组织是脂肪组织。，其中所述非肝组织来自成体哺乳动，其中至少一种纤维基质蛋白选自胶，其中至少一种纤维基质蛋白是胶原，其中所述培养基进一步包含制瘤素，其中所述细胞外基质进一步包含纤11.根据权利要求10的方法，其中所述培养基包含EGF和bFGF。12.根据权利要求10的方法，其中所述培养基进一步包含抗坏血酸二磷酸钠。13.根据权利要求ll的方法，其中所述培养基进一步包含抗坏血酸二磷酸钠。全文摘要本发明提供了从衍生自非肝组织的干细胞衍生肝干细胞的方法。在本发明的一个实施方案中，肝干细胞衍生自脂肪干细胞。本发明还提供了提高从ASC生成肝细胞因子的方法，其在体内移植时可用于再生肝组织。提供了组织培养条件，包括培养基条件。文档编号C12N5/00GK101605884SQ200780023036公开日2009年12月16日申请日期2007年4月23日优先权日2006年4月25日发明者J·M·吉姆鲍尔,J·W·路德楼申请人:路易斯安娜州立大学农业机械学院监事会;阿特塞尔有限公司