不同表面密度的分子的制备和应用的制作方法

专利名称：不同表面密度的分子的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微阵列合成的定量和数量的方面以及用微阵列作为脱离微阵列表面应用的合成分 子的高容動恪器件和用微阵列作为在微阵列表面应用的分析器件.
本发明特别涉及到在一个微阵列的不同位点控制表面分子密度来制备一个密度变化阵列的方 法。这些阵列可以用于在阵列表面^l兌离表面的应用，如用于高通量定量测量蛋白结合、核酸结合 及生物标志物的灵敏检测。阵列所包含的密度变化位点可用于获得^^化合物的结合和解离曲线， 并U寸于有精确检观嚅要的临床医学应用有特殊的价值。
本发明也涉及《針布微阵列表面的领域，用于至少提高平行阵列合成^f数量至10倍以上。这 些高容量阵列将在阵列表面ISI兑离表面的情况下应用于基因组或蛋白质组范围的检测分析。分子的
斷布也樹共了大量材料用于准备纳米阵列、单5H^阵列、结构研究或核酸、蛋白和多聚糖的序列分 析或其他 的生物多聚物和嵌合生物多聚物、亲和纯化、药物筛选、生物标志4,测、遗传分析、 核酸图谱、蛋白或其他类型的生物6吁表达谱、临床诊断及病患样品分析、序列文库制备、基于微 珠的核酸序列文库制备、蛋白、多肽和其他类型分子的文库制备。
本发明也涉及至恰成包含修饰^^阵列的方法。阵列上所合成的分子将在阵列表面或脱离表面 应用于基因组或蛋白质组范围的分析。分子{針布将樹共独特的配体阵歹,于不仅可以分析蛋白质、 核酸、糖，也包括细胞和细胞生物,分子修饰也^f共大量的材料用于准备纳米阵列、单好阵列的 制备、核酸、蛋白质、多糖、其他类生物聚合体和嵌合生物聚合体的结构和序列分析、亲和纯化、 药物筛选、生物标志物检测、遗传分析、核酸图谱、蛋白或其他类型的生物分子的表达谱、临床诊 断及病患样品分析、序列文库制备、基于微珠的核 列文库制备、蛋白、多肽和其他鄉好的 文库制备。
相关现有技术的描述
基因组学(在这里基因组学广泛定义为细胞舒及其相互作用相关的科目，包括核酸、蛋白、多 肽、糖、月旨质、代谢分子和其他功能分子)和相关科学的快速发展创造了微型化技术的需要。A^f 周知，每一轮在现有技术上进一步微型化都需要在方法和器件上有重 展。当今，受人关注的人
类基因组中的30亿碱基X寸和超过十万个蛋白及其异构体正是需要微型化技术研究的一个明显的例子。对于这么大数字的遗传密码和它们的产物，己经有大量关于对它们的分析战出编码子)和做表 达徵检测它们有多少存在，及存在的数量)的信息。这對言肩对于从根本上理解细胞^T关联准则， 鉴定个Ait传问题、健康状况、疾病状况、药物反应、免疫反应是必要的。
对生物^4行分析和做表达谱要求保证特异性和灵敏性。虽然i^^对于当前很多分析手棘 说普遍具备，但这，析方法一次只倉ga行一个反应或分析。在理想情况下，至少样品的一种成分 不存在竞對或交叉反应的可勒。因此，获得的结果可能尉寺异性的。例如，用Northern杂魏分 析RNA需要选择一啊寺异的探针与耙标肝杂魏与其他非特异探针竞争。另一韩仔是，在蛋 白激R^析试剂盒需要包括蛋白激酶和一个多肽作为酶的底物或是在蛋白激酶分析试剂盒里需要 包括蛋白'鹏、多肽和一个用于衡量酶活性或抑制影响的多肽抑制剂。传统分析的结果由于其简单 的实验斜牛而变得更加可靠。这些实验不需要较多的重复或是检测特异性的完整曲线。
高通量分析意味着同时处理多个不同样品和/或进行广泛分析，也可同时分析同个生物系统的 多种样品。当前的微 L板能同时进行96， 384或1536个平行反应，反应〗斩只在微升到亚微升之间。 使用鹏微 L板需要液控自动器件、加样板和巨大的储存空间。如果用微 L^34行基因纟I7K平上的 高通量分析在实际操作上会有困难，因为这魏至蛇费太高，消耗太大的问题。例如，假如一个l 百万人的群体需要测试1万个重要的遗传位点，那总的实验数量将达到100亿次。如果每次实验消 耗10微升的试齐iJ/溶液，总共将需要10万升分析溶液。显然，即使我们目前已经有丰富的信息关 于人类基因组、疾病相关的基因组、单核苷酸多态性(SNP)、 DNA甲基化、组蛋白修饰、DNA插 A/缺力置换和其他类型的基因组信息(见国家生物信息中心，NCBI， http://www.ncbi.nlranih.gov/)， 但只能负担起很少的测试。因此，减少分析体禾只及分析器件的微型化十分有必要。
高通量分析也广Si也用于全细胞和活细胞^^析，如分析细胞凋亡、蛋白，或细胞中酶活、基 于表型的显性药物筛选、细胞毒性和细胞周期。当前的平台，如贝克曼细胞实验室(Beckman Coulter's Cell LabTM)支持样品杯，微离心管和24， 96， 384孑L板或细胞计数器，能以每秒大于10万次的速 度进行分析。现在它在高容量的荧光标己下可能同时分析多个鄉和参数。这離术上的进步以及 现代光学显微设备，如共聚焦和全内反荧;)tM微镜，对于我们深度M体内系统提供了强有力的工 具。对于在当前系^U:进一步M也显得十分必要。如，平均在一个1千或1百万的人群中有一个 事例对于诊断或研究具有重要意义。这就期望来收集这些感兴趣的细鹏事例，如上面戶;fi寸论，使
用适当的工具或方法，尽量详细地分Dm些细胸单体。
微阵列是一种在最近20年发M^来并且飞速用作高通量筛选工具的反应和i辦分析元件。微 阵列M位点尺度在m^t间，在^F方厘米的范围里有成千到百万的分析位点。某些i^tf可會晦 个芯片只需要皮升甚至更少的反应溶液。微阵列不需要用至i條微 L板方法里的液体分配器件，并且 首次倉激行基因组范围的高通量分析，且大大"或少了反应溶液的使用量。
正如上述，当一种高通量的方法能平行进行单个反应分析，那可以;EM成multiplex反应分析， 包括用混合分析为^和样品
基于微珠库的multiplex检测已经完成了，針微珠带有一种类型的^T，如多肽、小好有 机物、寡核苷酸或其他类型的分析分子和样品。
许多微型化器件己经出现，他们共同的特征是能以纳升或更小的反应体积邀行分析。然而，在 微型化器件縮小的同时，M增加在其中放置多样内容的困难。这样就妨碍了许多研发器件成为廉价、易用、多用途的商业产品。
一种制备分析器件内容的方法是预先合成或是准备大量不同的^T然后将其放在分析器件的不 同的反应位点上，例如cDNA或是DNA寡核苷酸点样微阵列。随着分析数量的增加和材料量的减 少，材禾4T隹备的花费变得繁重，并且有时不可能去合成或准絲析所要用的众多不同的舒。因此， 该方法对于需要分析几百^ftt[D(t象的时候有局限性，如抗体微阵列、多糖微阵列或小好微阵列， 但还题用于寡核苷酸DNA，这^mEX像数量在1千或少于3万。对于分析纳升级顿小術只 时，自动化器件魏到许多技术上的挑战，并且它们达不到足够的精确度，也难以准确将分析材料 分配到反应位点。能皿这些功能的器件对于常规实验上的flffl也显得过于昂贵。
己经开发了可供选择的方、絲原位合成高密度的分子阵列，艮P，这m^通舰步加入单体或 封闭体直接在固相表面合成。这些方法克月艮了预合成的困难，并且己辛,泛用于基于DNA寡核苷 酸微阵列的分析(例如，Affymetrix，s GeneChip ,Nimblegen DNA微阵列,Agilent's喷墨DNA微 阵歹J, Atactic Technologies/LC Sciences' pParaflo DNA/RNA微阵歹U)和基于多肽微阵列的分析 (synthesis石削七纤维结构原料上的JPT点合成，Atactic Technologies' joParafloTM多肽微阵列)。
多数的高密度阵列包含标m^核苷酸DNA，这主要受限于合成方法是基于依靠光去^J户机制 的单体合成。扭可标准化学基团的斷布需魏备与之相关的 于划跌的新的单体，帝ij作阵列的 相应合成也需要被优化。广泛的努力涉及一， 列及其他们与标准合劍,有关的未知结果， 使基于光依赖的保护基团的方法受限于包括标mS核苷酸DNA的阵列。 常规的化学和可以修 饰化学残基的化学本身共同协作，ilit使用喷墨器件可以合成阵列。然而，这种合成方法要求一套 兼容的合 件来^{共额外的试剂，从而也使喷墨方法受限于包括标准寡核苷酸DNA的阵列。
MPamflo微阵列合成方法克月艮了，的各种限制。该方^S于传统的化学，如用于DNA.和RNA 寡核苷酸的DMTSfel刻七化学，用于多肽化学的Boc或Fmoc化学和光激活的光化生成试剂，如一 种酸或iW于合皿核苷酸DNA和RNA或是多肽。该方法^131直接使用商品化的单#^阵列 ^T中加入微布，并且包含的斷布腦己被合成。寡核苷酸或多肽的傲顿武予了它们新颖的结舒寺 征或酶活性。这种阵列不仅在研究上有重要的应用，同时也应用于诊断、药物筛选、疾病处理和其 它领域。
因为在基因组和蛋白质组领域需要在纳升或更小体积下进行上百万次的分析，因此极大地需要 招艮小的规申肚而非当前的96 L板上平行合成針。同时也急需有一种技术能用高密度阵列合臓 件中来合成不同的M，例如^t布的寡核苷酸、修饰的多肽、带i^的^HS用于脱离阵列表面后 的各种检测、定量分析和先导化学物的开发。在过去的+^里，阵列作为高通量分析的手段已经被 很好的接受，但大多数原位平行合成阵列的方法(GeneChip of 15 Afifymetrix,Nimbleg叫Fe賊 Agilei^Combimatrix)是局限于制备未llt布的DNAS核苷酸。作为生物分析制作的的阵列没有达到 从阵列表面上切除的用于下一步反应所要求的合，量或者没有办法得到足够的数量，以及从表面 移除，如制备纳米阵列、单分子分析、用于基因组扩增的基因组范围特意引物制备或是基因组范围 的用于DNA^RNA的特异探针。目前， 一个Paraflo反应器已，細于平行合j^千上万个寡核苷酸 DNA，并可获得这些产物用于组装构建长^DNA。这些DNA构建子可以作为蛋白基因用于产生天 然类型或自定义的蛋白。使用微型化的器件合^DNA减少了至少30倍的花费，并皿少提高十倍以 上的分析容量。在这里并不需要液控自动器件来分配样品。尽管可能咴复对每种类型的分子斜虫合成，但许多需要multiplex反应的应用需要有針文库，因此，需要《顿含大量不同的好混合物或 分组的混^4勿。
多样化合成阵列^T的领鹏，由于糖基结合，如醇肽、甘油类似物，在细胞活性的糖调节、 细胞转移、细te:作、细胞蛋白互作和蛋白间互作的重要功能，因此它们备受关注。这些互作阐明 了很多由传染性病原、恶性弓拨的免鹏答、受精、胚胎发育、淋巴细胞交换、肿瘤源、癌症转移 引起的病原性、免疫原性的信号路径。因此，糖謝七多肽具有潜在作为疫苗的化^4勿模型。迄今， 基于糖基化多肽的分析依靠传统的免疫学方法通量较低，但存在有许多这，合物的异构体。我们 对这對七合物基团的了解十分有限。合成糖謝七和糖超彦饰的多肽阵歹脂咖速研究这个重要领±或并 且开发基于糖基化多肽的试剂用于分析、诊断和治疗应用。
可寻址阵列与随机阵列相比， 一个明显的优势为具有可S跟宇、的分析位点作为参照、阳性或阴性 对照和其它类型的控制，并且有重复数据点用于 处理分析。这里必要的特征是能确保高质量和 可靠的分析结果。执行的功能如合成或分析的质控点分析、基线信号纠正以S)(邻车列上的信号3艘 或是重复结果的多套数据归一化和根据这^t寺征推算出定量结果。在可寻址阵列上，总可以通过设 计和观赋比较翻组来排除可能的假阳性和/或阴性信号。合成的微珠分子文库不带有编码机制而 不能达到这些要求。
发明
本发明描述用阵列原位平行合成控制*表面反应位点分子密度的方法。这些密度变化的W 阵列在应用分析中有常例可寻，通常有微孔板(如96， 384微孔板)装有分析肝或浓度变化的底物 或检测和做图谱的生物5^T，如核酸、蛋白、抗体、酶、糖和各种诊断5仔'；诊断分析；疾病治疗； 个人 分析和其它微型化生物分析中有类似方法的分析出现。这些密度变化的分子阵列也在其他 应用分析中发现，如生物化合物分析、细胞组分分析、细M化合4勿分析和全细胞分析。
这种密度变化^ia控制混合常规的合成的单体来实现的。这些单体有的能在去保护后与表面 的下个单体官偶联，另有的单体能与表面官能团反应但不能在去保护后继尔与表面的下个单体官偶
銜终止单元)。试剂的混合比例决定了表面密度的稀释因子。
这种密度变化特征将:13i^ffl肯g与表面官能团反应的试剂来控制，并且连续反应也允许产生比 例大于1的另夕卜的单元位点(多分枝单元)。
这种密度变化特征将iffii表面固定有官t讓团的微珠的表面^t布来控制。这种^t布是将带在， 从而能够进行后续的反应。
将描述用于原位平行合成的表面固定微珠的方法。微珠具有不同的大小、 和减由不同材 料制备以适用多步反应或合成。
上述用于在表面控制密度变化的方法可结合使用于产生整数或非整数的倍数变化。
这里也描述了减小合颇量又寸 的影响的方法。当在表面合成不同的舒时，其合成的质量 不总是可知的。因此，必须减少合颇量对于最终i^数量的影响。
这里也描述了在表面合成分子的方法，这幽it布的^TM:标;隹的，^F万周知的化学合成方法
获得。其中的一种{針布方法是{顿Huisgen环加反应(点击化学)。
这里也描述了在表面合成分子的方法，这^fit布的^T通过标准的，X^ff周知的化学合成方法获得。方法之一披露的修饰方法是aa联M珠到合成的分子上形成偶联微珠的分子。
这里所描述的合成方法并不局限于每个位点一种类型的分子;两种或更多的不同类型^f倉腿
过使用混合物或两步34i:合成步骤在一个位点合成。
《顿上述方法之一合成的表面^T可以在表面上使用，也可以从表面上mS解收集为混合物或 几组混合物使用。可以在不同的连接节点进fi^lf反应，并且在一些例子中可以产生连 微珠 的6吁库， 一个微珠带有一种类型的M。
对连接在表面或脱离表面分子的应用包括但不局限于单^T阵列、纳米阵列、微珠阵列、基于,: 微珠的DNA测序、单^T测序、合成纯化所合成的舒、分析物的亲和纯化、multiplex PCR、基 因组范围的耙M寺异PCR、基因组范围的耙标待异结合和分析、构MS核苷酸、多肽、糖/低聚糖 或其他类型的舒文库。


图1-说明分子阵列里的密度变化反应或分析位点概念。
图2-说明一组密度变化的阵列位点。
图3-是在密度变化的阵列位点上合成表面分子的步骤图。
图4-是在阵列密度变化位点上合成的的抗原表位肽YPYDVPDYA的荧光信号条形图。
图5-是一例荧光图显示在所合成的分子上直接标记后的密度变化的分子阵列位点。
图6-是一例在密度变化的分子阵列位点上抗体与合成分子结合条形图。
图7-说明一个蛋白激酶底物多肽阵列，并舰磷^t寺异结^i式剂检测磷酸化。
图8-说明一个蛋白激酶底物的多肽阵列。
图9-说明一个包含了密度变化位点的蛋白激酶底物多肽阵列。
图10-说明一个包含了密度变化位点的蛋白激酶底物多肽阵列检测蛋白磷酸化的曲线图。
图11-说明在多肽阵列结合数据上用依赖 长的校正因子来弥补合成无效产生的负信号的曲线图。
图12-显示了部分微流体阵列芯片图。(A)图示空微流体微室；(B)图示包含有固定微珠的微室。 图13-是一个在含有TentaGel微珠的玻璃社合成寡核苷酸的显mi竟图(白光)。该图是在合成寡核 苷酸反应多次循环后拍摄的。
图14-说明在含微珠阵列位点上合成，并且含微珠的位点是可以有密度变化的。 图15-说明叠M^:烃化物Huisgen环加化学反应(点击化学)。
图16-说明使用叠織烃化物Huisgen环加化学反应(点击化学)合成共轭生物聚合物阵列。 图17-显示抗半乳糖在糖基化多肽阵列上的结合。 图18-说明合成微剩針市的^^阵列
发明内容
详述
除非另有定义，否则这里使用的所有禾报术语的含义与该领fe彌常所働 的含义相同。另外， 特别的要素已在下面定义，以便更清楚容易地参考。
此处使用的定义，下列术语和用语应具有的含义如下。除非另有规定，所有的技斜麻斗学所用词汇具有作为一般的在领域中普通技巧理解的相同涵义。
这里单数形式'V"叫"和"the"也可以是复数，除非上下文另外注明。 下列在此文中出现的术语通常的含义在横线后出现 激活-在化学反应里，激活表示斷氐能^f吏化学反应发生。 可寻址阵列-是分子在该阵列的特定位置是可知的。
阵列分子-是由阵列总点数和单位面积中的点数来定义的多个不同的分子在不同的表面位 点有低、中、高或很高的阵列密度。当前， 一个在,方厘米区±或上有几千个^^的阵列是高密度
阵列；非常高或极度高的阵列在一张片上有百万个分子『x3";i。阵列的这些不同特征主要取决于
它们制备方法。
样品- 一种底物或是化合物，是检测或分析的X寸象。阵列实验的一种分析物处理后用于阵列 分析的可以是蛋白、蛋白溶液、生物蛋白样品，如细胞溶解物、核 列、核酸溶液、生物核酸样 品，如基因组DNA或总RNA。
阵列控制位点，参照位点-阵列包含了一些位点，这些位点并不用于样品分析，但用于技术 的质ftifi古，如合成、结合等。
阵列部署-可寻址阵列的二维图，一^ha含写有鉴定序列及位置的文件。
阵列位点-在多位点表面上的离散的区域。
阵列、芯片-这些术语可交劍顿来指分割一个空间的一套位点。这些位点的数魏常至少 两排和两列。每排、每列或^^阵列位点数量的上限设置3131H原子^HH周节尺寸。位点的单位密 度至少9軒方厘米并且每单位区域的数量上限设置衝1H原子肝调节尺寸。阵列位点可能但并 不需要在表面调衝立置。針阵列有牧先确定的格式，如玻璃板有或没有阵列位点边界每个阵列 位点也叫特征点。在^ti位点上的:^P不需要有同样的化学结构。重要的阵列特征包括阵列位点 几何形、表面、^BI阵列室、阵列室、子阵列、阵列限制区(96-孔阵列)。
力、析^ -用于分析样品的M。
分析样品陽包含分析物的样品。
微珠阵列—阵列内容是由微珠樹共。
微珠、粒子、微球、纳^f立子、纳米微珠-这些术语可互换使用，指小的物俠尺寸从麟到 纳米)。本描述中较频嶽顿微珠。微珠可以但不局限于下列材料来审格，塑料、陶瓷、玻璃、聚 苯乙烯、甲基苯乙烯、聚丙烯酸、顺磁性材料、氧化钍溶胶、石墨、二氧化钛、橡胶或交耳魏聚糖， 如琼脂糖、纤维素、尼龙、交K^和聚四氟乙烯。微珠可以是或不是球形，可以是长的，可以是或 不是多孔的，可以是或不是表面包被，可以是或不是包含如 ^1圣基的功能基团，可以是或不是 滑的，可以有或没有光学特性、磁性、亲和纯化特性。
结合/溶解曲线-结合与舒浓度相关的曲线图，这里的好是分析物或是与分析物互作用的 配体。
建造单元、单体-这些术语可以互换使用，但更常用单体来代表核苷酸或受保护的氨基酸。 碳7K化合物、糖类、低聚糖、多聚糖、多糖-这些术语可互换指糖基团或分子。
嵌合体或嵌合分子- 一种化合物包含至少两个基团、基序、序列或部分来自不同的共同家族
的分子。嵌合体或嵌合^T的例子如嵌合DNA-RNA寡核苷酸、来自两个不同蛋白的嵌合多肽或嵌铺-多肽。
键裂解、偶联-打断或形成一个化学键。 偶联-在两个^f间形成化学键。
树状聚合物-有分枝结构的分子，尤其本发明的丛枝聚合物有多个分枝臂，可用于在W合 成时生长多条链。
三原子分子尺寸-如水分子(H-O-H)，它的宽度是2,75埃。
DNA阵列-DNA寡核苷酸阵列、RNA寡核苷酸阵歹iJ、 DNA/RNA寡核苷酸阵列、RNA阵列 可以互换叫做核酸和寡核苷酸阵列。
功能化表面、合成启动基-表面能被激活进行化学反应。通常，这些官能团是氨基gggM 团或是分别有两者mj户的基团。
糖基化多肽芯片-糖基斷市多肽。
高容量阵列_阵列(齡阵列位点产生皮摩尔或更多)作为合麟产生比常规阵列(齡阵列位 点产生法摩尔或更多)更多的分子。
杂交、清洗、剥离-核酸杂交实验步骤，杂交描述了两条互补链结合的过程。 固定-使分子与表面反应在它们之间形成化学键。 原位平行合成-同时从头合成多序列M阵列。
连接臂、表面f,臂、空间臂-"连接臂"和"空间彎"是锚定基团，在分子间起到锚或拴的 作用。连接臂或空间臂的链长由它们的线性旋转智决定。连接臂也确定了M与固相支持物表面的 第一个分子间的锚定。氨基^^基硅烷常在M表面作为连接臂。空间臂的例子包括但不局限于聚 乙二醇、烷基、包含分枝侧链^^f.丛枝聚合譯勿、寡核苷酸、多肽、'多肽类似物。
亍針布的核苷酸、{針布的多肽、斷布的糖基-化，包含的化学基团不同于或客砂卜多于它们的天 然组成。
multiplex反应、单一反应-包含多于两个参与分子的反应或分析，如10个纟對及和20个引物的 PCR反应。
纳^lt子(纳米棒、纳米壳、纳米晶体、胶体微粒)
中和试剂、感光剂、稳定剂-这齢成试齐俩于反应溶液中的酸或碱中和，转移放射能量和/ 或捕获基团。
核酸-由核苷酸聚合形成，核糖核苷酸和/繊氧核糖核苷酸或是两者的^t布形式。该术语也应 被働率包括作为由核苷酸类似物制备成的RNA或DNA對以物，在具体应用中所描述的单敏如正 义链或反义链)或双链聚核苷酸。
寡陽与化学基团名字结合f顿。如寡核苷酸、m，表示化学基团链较敏一些m百个残萄。
寡核苷酸-是寡聚核苷酸的縮写。
在阵列表面、在表面对离阵列表面、离表面阵列分子应用-在表面应用阵列分子或使用化学或 酶法来剥离表面分子并且收集进行其fei^用，如作为寡核苷酸混合物用于突变或DNA合成。 多肽-由20个天然的氨基酸聚合的氨基酸低聚物。 多肽阵列-表面区±或包含多于96个多月游列固定于1平方厘米的区域。
PGA-P,PGB-P，光化 酸前体、光化生成碰体、光化生成酸、光化生成碱、光稳基团傲户单体-这些是平行合成试剂，fflilM线激活。
多聚-与化学基团名字结合使用。如多聚核苷酸、多聚糖，表示化学基团链较长(几百、上千 和更长的延伸BS)。
预定陽实验前所it^J、安排的目标乂豫。
傲户基团、傲户和去傲户-这些术语指化学基团會娃寸闭5H^中的官能团，其中的化学行为叫"保 护"和"去保护"。
蛋白激酶底物多肽阵列- 一个阵列包含蛋白激酶底物蛋白多肽或多肽阵列用于蛋白激R^析。 蛋白磷酸化多肽阵列- 一个阵列包含磷酸化的多肽并且用于探观隨白的磷酸化结合位点，如 SH2蛋白。
方謝弓驢-方謝的齐懂，起至顿懂方謝时间和方謝能量的作用。 反应位点、阵歹啦点、分析位点-互换使用来描述自然和激活状态的阵列位点。 常规M3t单元-用成熟的DMT化学或Boc或Fmoc化学合成寡核苷酸或多肽。使用标准的单
体进《豫^"成，常规離单元。常规離单元也暗示了它们在合成循环中有典型的去{射户和{跌步骤。
SNP, Chip《n-Chip, CGH-核酸分析和做图谱的相关技术。SNP:单核苷酸多态性，Chipon-Chip:
用芯片(微阵列)进行染色体免疫沉淀分析，CGH:比较基因组杂交。
固相支持物-合 质物，差异于气相或溶液相物质。固相支持物包括二氧化硅、无机质、 有机聚合物、和共聚物，如多聚苯乙烯树脂或磁珠.嫁接多聚苯乙烯-多聚乙二醇树脂或磁珠。
点、打印、印、喷-这些术语指液体处理的方式。
表面-设定板、磁珠或固体X豫朝外的ii/区域。表面是易于顿用于含成或分析。 表面密度、稀释、、緣密度变化位点-表面密度魏过单位表面区鹏含有肝的数量来
衡量。表面密度增加是反之是"稀释"。阵列的位点有不同的表面密度。
合成循环、合成步骤-在寡核苷酸或多肽合成时重复的反应步骤。每个反应循环由几个合成
步骤组成。
标签、标记-在蛋白上连上分子、蛋白、组织或细胞样品。亲和l^例如用于抗Flag抗体结 合的多肽Flag,用于标记和检测^^和细胞组分观察的荧光染料f碟。
终止单元、多分枝单元-终止单元如添加在合成中能终止进一步的反应；多分枝单元是二、三 或更多分枝的树状聚合物。终止单元是可逆或不可逆的。
TFMSA-化学名三氟甲磺酸。
下述包括的例子是本发明的具体阐明。在这些例子中所揭示的技术在该领域应当更有价值。发 明者所揭示的这些代泰性技术在本发明实践中起到非常好的作用。然而，依照本发明所揭示的，该 领域的这，术可以在特殊的实例中做许多变化来提升价值。这些所揭示和获得的同样或类似的结 果没有背离本发明的范围和主旨。
这M^描述的方法是用于制造SH顿阵列器件。这些阵列器件是根据合成^ 的浓度变化和质 量要微行功能和容量上的鹏。 一个阵列由很多分离的反应位点组成，这些位点可以用于肝的 合成，如寡核苷酸、多肽、糖类、其他类似物或其他类型的有机^H1。在这些反应位点合成的好 有一定的密度分布，这种密度^M过单位面积所含有的分子数来衡量。以一个线性多肽为例，它单独占有40埃空间，夷P么在50x50平^微的阵列位点上平均能合成法摩尔数量的針。針阵列 位点平均需要纳升或更少的分析溶液用于实验。与96、 384或1536 L板相比，这SBff描述使用的 阵列在^t位点所需要的分析溶液至少能节省1000倍。由于在基因组或蛋白质组增加成万的分析， 在很多实验室，这些实验将消耗大量的试剂和溶^荒在实际中进行高通量大规模的实验。这将会 用到上千升分析溶液，因而购买、储存和处理的费用将高的惊人。因此，只能大量减少分析材料的 使用量才能克服广泛分析基因组和蛋白质组实验的障碍。这些大规模的实验对于了解人类生物学和 高等生物医学科学将会掛共非常有价值的信息。
謝门非常期望能在阵列平台±34行目鹏96、 384、 1536孑W肚进行的实验。微孔顿常l細 估妨文ais物分子，如一系列已知的多肽按照不同的浓度放置于孔板上，然后添加蛋白结合溶液和检 测抗 液。ffl3l读取检测信号，通常有荧光、化学发光或比色信号，来获得生物物理参数，如蛋 白的结合/解离常数、抗体底物系统中的酶联免疫分析、酶底物话性检测，蛋白、核酸、糖、月詩口/ 或各种小肝系统 于时间的参数。在謝足分析中，包含底物針的密度变化位点与,目互作用， 获得的系列 能反应出作为浓缩的底物^产物的构成。在M时间点记录实验。这 會調 于获得謝足反应的参数，如最大反iS3I^和平衡常数。战的这雖本知识能在大量的文献和书籍， 如物理化学中找到。
因此，本发明掛共了用于控制表面密度的合成方法。本发明尤其揭示了恒定戯面密度变化的 肝阵列的制备方法，不同类型的表面也适合于合成。合成的应用包括生成高密度的滴定板来同时 进行对核酸、蛋白和其他类型的分子小体积定量分析，而传统的方法需要在微孔板里甚至有时是在 单个反应试管里{顿大量体积的溶舰行反应。定量分析衛共了多个定量相关的M点，因此，这 种分析提供了更加可靠的信息。这结果应当适于直接关系人类健康的关键分析，如病人的临床诊断、 预测、监控，个人基因型分析和应用。
本发明的合成方法是基于在含有众多反应位点的固相表面或阵列表面，并且这對立点适^4行 原位平行合成。用于平行合成的表面可以是，、二氧化硅、多聚物，如多聚苯乙烯、处理的多聚 苯丙烯、嵌合的多聚苯乙烯-多聚乙烯乙二醇、聚二甲基硅家游和它们的《封制勿或其他耐化学试剂 的物质，如二氯甲烷或甲酰二甲胺。对于打算在阵列表面应用的合成，表面也将不会产生检测干扰， 如吸收或发散背景信号，这對言号可t捉够强到掩盖了分析物中一些比较弱的信号。表面可以是平 的或多孔的，可以有薄膜包被而确定阵列的位点也可以没有，可以是包含构造的式样而确定阵列的 位点也可以没有。表面可以包含分割栏或分栏使阵列的位点显露，并允许在合成过程中或结束后进 行不同的处理。对于每种表面，将会根据该领域已知的阵列合成技术选择统的平行合成方法。
本发明所描述的阵列将在装载有微珠的表面进行合成，这里装载微珠是Jlffi31在微珠和表面形 成化学 固定微珠，并在微珠上进行原位平行合成分子。
一个具体实施例，图1阐明在不同反应位点有可控密度变化的分子阵列的概念。第一SKioo) 说明密度变化位点的位置，第二排(105)说明密度变化因子是使用没稀释或浓縮合成的初始密度1 的倍数。该因子的大小是由使用的反应试剂决定。图1显示在相邻的位点该因子等于2，在12个 位点里分子的密度总的有2048倍的变化。实际上，可以通过稀释和l缩在不同的反应位点构建连 续比例的密度变化。在一个有3849位点的阵列上，将等同于构建了 40个传统的96 L板。这个微 型化的分析设备将至少提高40倍的通量但仅消耗小部分的试剂和像M只需要一小部分人力。高密度阵列甚至有更大的潜力， 一个阵列包含IOO， 200， 400， 800， 10000， 100000或更多传统96 微孑L板都是可能的。
该领域的专业人士很清楚，表面肝的密度M单位面积的舒数量，因此是二维参数，而分 子歉缩M单位空间的^T，因此是个三维参数。即使这样，如果考虑由两个針中心到中心所定 义的空间分离距离，这两个参数可以比较，两个表面位点的相对表面密度代表了在同个反应器里两 个样品的相赠农度。因此，密度变化阵列的意义在于它能应用于分析物与表面^^互作的定量分析。 当前的国内标准里，用己知的序列和相关的密度变化,点来分析未知的分析物倉調于获得参数， 并颇于传统生化分析。
密度变化位点可以fflil几种方法建立。 一禾中方法是允许在表面{吏表面官能团和添加的、#>活^^ 部分激活或反应。 一个具体实施例，表面的官能团是受傲户的氨錢团。这个傲户基是光敏的，完
全的光射线将会完全去除这个保护基；而部分光发射剂量将只会部分去除表面的氨基。去保护的百 分比与舰齐糧的 艘是成比例的。另一个方法是表面的f射户錢是酸或碱敏感的，如DMT或Boc 的酸敏基团和Fmoc的碱敏感基团。去傲户的百分比与不同光剂影秀导产生的酸或碱是成比例的。 这些酸或 鹏由已存在的光化生成酸前体^t化生成石/繊^枯光照下产生的，这在PeMs等(2001) 和LeProust等.(2001)的工作中已有说明。(Pellois，丄P, Wang, W. and Gao， X. (2000) Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids (基于t-Boc化学和光化生成酸溶液的多肽合 成).J.-Comb. Chem. 2,355-360; Lepro赋E.， Zhang, H., P" Zhou^ X" Gao, X. (2001) Characterization of oligodeoxyribonucleotide synthesis on glass plates (鹏平面上脱氧寡核苷酸的合成特性).Nucleic Acids Res. 29， 2171-2180)。然而，靠光射来控制的方法不倉g用于提高表面^T'的密度。 ，
謝门可以选择化学合成方法，il31添加统的试剂可达到增力口、不变或M^、阵歹啦点上好的 密與图2)。本发明的一个具体实施例，该方法是让分枝单元肝(205)与表面官能团反棘增加在 预设位点(200)的分子密度。理论上，表面密度可以在*双配位 状聚合物的偶联步骤中提高2 倍，并且在4个合成循环后，表面积的舒应当提高8倍以上(210)。本发明的另一个具体实施例， 将常规单体与(215)与表面官能团反应从而使表面好密度不变(220)。而另一个本发明的具体实施 例，将含有终止单元(225)的混合物与表面官能团反应来减少在预设位点的^^密度(230)。所{顿 试剂的相对浓度可以根据图1表銜105)的第二排，其中#9点是根据图2(215)，如Boc-或Fmoc-保 护的錢酸与表面氨基基团偶联，并且这^S酸将进行下一步的合成反应。根据图l，点#8舰 #1进行8步合成并且将参入多分枝单元，如NW-(Boc)2LysC02H或N，(Fmoc)2LysC02H或 N,N-(NPPOC)2LysC02H (这里NPPOC是2-(2-nitrophenyl)propoxycarbonyl,—个光敏基团)。根据图 1，步!默10至附2将被合成3步，合成试剂常规的单体和终止单元以l: l的比例混合。常规的单 体可以如受保护的氨基酸，如Boc-Ala、 Fmoc-Ala或NPPOC-Ala，终止单元可以如Ac-Ala。在每 个合成步骤，混^i式剂中的终止单元将会封闭50%表面舒。随后的制备密度变化(密度增力口、不 变或降銜位点的步骤在图3中说明。
通常在微型化器件idffii原位合成的每种类型，或不同位点的几种类型，或同一位点的几种类 型的舒数量能提高到几倍或更多。这并不局限于战的方法，但是可招艮多偶联和链的延伸反应 里4顿。双配位對对状聚合物将会提高合成时的63密度，在齡循环步骤以2的因子在增加，类 似于聚魏式扩增中的指数增长。对于一个有n分枝的位点扩增因子，針数是nk， k是反应的循环数。
该领域的专业人士清楚地知道，由于在合^i程中有一些^ ^^足，实际上表面的密度变 化因子比起理论上的偏小。影响在密度变化位点的合成的因子，也包括表面修饰的影响。尤其当表 面^H^密度增加时，能让^^平行直接对准的空间会变小。对于一定禾號的一定的^ 系统，可能 会有不适宜的空间互作或表面能带正负电荷，可1蹴^1>或限制了肝密度进一步提高。其中，对 于一个阵列最终的表面密度必须考虑将影响最优合成的因素和其他不适宜的因子斷氐到最小。
密度变化的位点可以像96孑L板那样安排，整个阵列的部署可以仔细考虑，在阵列表面预先设
定的位S/地址合成每种序列和密度变化的位点。〗顿原位平行合成方法对于一个阵列位点的特定 密度或与其相关的其他阵列位点的相对密度不需要相同。在不同的反应位点，在《艇伸过程中舰
合成不同数量的丛枝聚^ti可倉^就有不同的"扩增"因子。这样会有不同的按化学计ma成配比值
的^^产生。所合成的^T不局限于多肽，也可以是DNA和RNA的寡核苷酸、糖类、其他种类 的多聚物和混合合成的^ 1。
，阵列合成方法的方案开始于密度变化方式的设计，合成的步骤ffi31X寸要合成的序列的部 署进行合成。从阵列上至少收集一套最低是一个的序列的密度变化的数据。最终的阵列部署文件用 于指导合成阵列。
一个多肽阵列合成的具体实施例，在密度变化的位点合成人类流感病毒iOfil球凝聚素(HA)抗 原魏多肽YPYDWDYA(序列号NO: 4)。这些多肽在不同阵歹啦点合成并偶联荧光^T:来检测信 号，这對言号与齡密度变化位点的 密 比例(图4)。合成的密度变化从16倍稀释(1/16)到 16倍浓縮(16)，产生1/16,1/8, 1/4, 1/2,1, 2,4， 8, 16的密度位点。曲线上显示了两组密度变化位点2 倍稀释或 的比例关系。溶于lxPBS缓冲液中的抗HA抗俠100g/mL)用于多肽阵列表面，密度 变化位点的结合数据揭示了两组密度变化位点2倍稀释或浓縮的比例关系。S形曲线图说明了多肽 的密度变化产生的曲线等同于浓度变化产生的曲线。这个结合曲线产生的结合常辦艮据经典的等温 结合^莫型M曲线拟合通常求得在10^-7) M，与在多肽阵列上用高亲和的抗体结合的结果是一致 的。由于已知的抗HA抗体与它的抗原表达的结合常数人约是I(T(-8) M，因而J^获得的结合常 数可以作为校正值使用。从阵列或溶液中测得的数据差异可以互相弥补。
更进一步的结合实验阐明了在包含有多肽配体序列的多肽芯片上同时观懂多个结合曲线。结合 实验使用抗HA抗体(Roche)，浓度从O.l到60000 ng/mL。结^il程在pH 6.8的TBS缓冲液中4 。C反应1小时以上。信号由偶联一个荧光染树cy3或cy5)二抗产生，该二抗能识另航HA而结合到 多形存列。根据激光扫描ftM私只的标准曲线来获得扫描的信号强度。 ^ffl Origin软件进行曲线拟 合来获得结合常数。
在实施例中，可以ffiii在最新合成一步里直接标记荧光^T或给在表面合成的好结合一个荧
光丰蔬的^^来监控合成过程。图5是一幅密度变化位点多肽阵歹抱含了抗体结合序歹啲荧光图 片。密度变化位点合成从第一循环的16倍浓度稀释，循环9给出了9个位点的，序歹伪DYKH， DYKW, DYKA DYA和一个单氨基酸A。这些阵列位点的相对密度fflil荧光信号强度梯度变化来 显示。对A分子观测荧光信号。明确的讲，荧光信号强度来自阵列表面多肽所结合的cy3标记的 抗FLGA多肽抗俠AFM2)。多月游列由单个氮基酸代码字母歸(A:丙氨酸，D:天冬氨酸，H:
组氨酸，K:赖氨酸，W:色氨酸，Y:酪氨勒(图6)。合成反繊始于表面的Boc ES团，选择位点进行去fwsm吏氨基暴露，然后与i: 16比例混合的常规氨基酸和链终止ma酸偶联反应。
在第二批位点再进行去傲户反应使氨基暴露，然后与l: 8比例混合的常规氨基酸和链终止錢酸 偶联反应。用l: 4禾B1: 2比例混合的常规氨基酸和链终止,酸重复去^對户和偶联反应。随后进 行去保护以及使用常规的氨基酸进行偶联反应。再次重复去保护反应使氨基暴露，然后偶联 N,N'-(Boc)2赖氨酸。去f尉户和与HN'-(Boc)2偶联反应重复进行三次以上。如上显示，合成的第9 步产生密度变化的W位点。随后合成多肽的如当前所描述的进行。 一个实施例，在预设的密度变 化位点去除Boc基团来产生自由,用于随后与Boc丙氨酸偶联。在反复的合成循环中，在预设 位点进fi^择性去傲户和偶联反应产生的多肽阵列包含了多肽密度变化位点。结合曲线图(图6)进 一步显示了多肽密度变化位点等同于浓度变化位点，与抗体结合后产生不同的结合强度。多肽阵列 能作为测定结合曲线的滴定板用于检测结合反应和抗体对多个抗原表达亲和性能的比较研究。
多种抗体会交叉结合至眵月th导額降寺异的结合。禾,抗体作为纯化标签或是作为诊断式剂是 为了避免出现非特异地结合。高密度多肽阵列劇共了大范围多肽与抗体非特异结合的检测，而且提 供了这些多肽的序列，并且进一步掛共这种互作的定量检测(结合曲线)。多肽具有的这些作用对于 特异抗体和抗原魏扫描，减少假阳性和假阴性掛共强有力的工具。^顿结合曲线而非单个结合数 据点也是鉴定生物标志物的有效方法，能使该方法更灵敏、可靠。
多肽阵列包含蛋白激酶底物多肽，并且用战抗原毅多肽阵歹啲方 始成密度变化的位点。 图7说明一种蛋白激酶的分析方式，包括多肽芯片和蛋白激酶。芯片表面的多肽序列暴te酶和酶 反应溶液中。这些作为酶底物的多肽也因此被磷酸化。磷酸化基团舰偶联一个離寺异识别磷酸基 团的雜染料針来检测。本领域专业人士都了解，蛋白激,析有许多不同的方式，因此基于多 汰芯片的激齢析并不局限于所提至啲方式。
本发明麟了用于在密度变化多肽阵列序列上的磷酸盐難各种染料的方法。舰4顿磷激寺 异试剂cy3-Pro-Q (Iiwitrog叫CA, USA)与含有pS和pT底物的磷酸化多肽序列的多肽芯片反I^获 得荧光图片。观薪寻到pS和pT底物的磷酸化多月太获得的信号一致，也能获得密度梯度曲线。可 以根据信号强度来定量在^i位点的多肽密度。磷酸盐^fe试剂可以是在磁成像里使用的化^tl或 其它在生物样品里f顿的对照试剂。由于这些多肽与抗体结合较弱并游列特异性不强，使X寸它们 的检测较困难，但该方法克服了 pS和pT多肽检测遇到的常见问题。本发明方法可用于在多肽芯 片上灵敏地检测和定量分析激酶活性。
本发明樹共平行合成包含密度变化位点的磷酸化多肽阵歹啲方法。根据在图l、图2和图3所 描述的化^l呈序，首次设计了包含密度变化位点的阵列，并且表面根据表面密度变化的部署进行官 能团4fc。在该表面，通过巳有平行合成多肽阵列的方法，如Zhou等(2004)所描述的uParaflo方法 合成磷酸化多肽阵列，也可选择^顿Frank及其合作者所描述的喷点方法18,19。
图8是一幅蛋白激酶在pY-磷酸化多肽芯片上反应的荧光图片。实验〗顿Src激酶，p60c-src (Invi加gen)。芯片包含了 23个已知的激酶底物和它们的从序列长度和组成上改变的突变体， 一些 阳性和阴性参照位点和一些Ait多I游列。对于齡多B媳物，在磷酸化位点，以YEEI中的酪氨 酸(Y)为例，有3个序列存在，分别是YEEI,pYEEI和AEEI。包含pY的序列参考包含Y的序列 直接合成(作为激酶反应的底物)。也还有8-22个未合成多肽的位点作为背景位点。在图中显示的多 肽序歹提YVPM(第一列)和YEEIP(第z:列)相关的两个重复的序列。序歹依图片右边列出。结果显示，YEE和YEEI在使用Src激酶后被磷酸化，并且比,看，YEEIP是活性较低的底物，而YVPM 活性最低。激酶反应和磷酸化检测餅是10X繊存液(0.5mg/mL)， 50 )aLpH 7.5的反应缓冲液 (50 mM HEPES, 0.1 mM EDTA，禾口 0.01% Brij35, 0.1 mg/mL BSA， 0.1% B-巯基乙醇,0,07 mM AIP, 10mMMgCl2)25°C反应30 6H中。旨阵列添加200 pLcy3-Pro-Q溶液(磷酸盐着色试剂)，室温 持续放置20 ^H中。然后按产品说明用2mLpH4.0的脱色缓冲液(50mMNa2CO3， 20。/。的乙lf)洗涤 芯片。用常规的芯片扫描仪(AxonGenPix4000B)采集图片并且扣除背景信号强度后进行显示。
信号强度分析使用下面的方程
相对磷酸化效率/P = (IY-IA)/(IpY-IA)
对于一个多肽，I代表信号5贼，Iy代表含Y的序列，会受激酶的磷酸化作用，IpY代表合成的
磷酸化多肽，Ia代表含Y的序列中Y替换成A。 ffii^顿阳性参照(pY序列)和阴性参照(A序列或 其他不能磷酸化的氨基酸)来获得相X寸磷酸化效率，/p作为分数或百分数，对激酶反应的结果进行定 量分析。该方法利用多肽阵歹何寻址的优势来减少假阳性的读出并提高数据分析的可靠性。
如图9所示， 一个蛋白激酶底物多肽阵列给出对PKA分析的荧光图片。舰来自cy3-ProQ (特 异的磷酸盐^fe试剂,Invitogen)的附性信号来显示包含有磷酸^M氮酸(pS)残基的多ttm列。两列 的序列是1. RR-X-SL(序列号NO: 17-31) 2. RR-X-AL, X (序列号NO: 31,)在图9中标记，并且 N端乙酰化。提出了两套冗余数据。使用本发明所揭示的合成方法使密度变化的范围从初始合成密 度的32倍稀释到16倍。争卜多S诉列在10个密度变化的位点合成。包含X-S的序列是PKA潜 在的底物，包含X-A的序列作为阴'歐寸照，而包含X-pS的序列作为阳'(4X寸照。PKA反应剝牛1 mL PKA激酶反应缓冲液(50 mM Tn、 10 mM MgCl2, 2 mM ATP, 0.1% BS,\ pH 7.5)进流入芯片20 min。然后用2500 U的cAMP-独立蛋白激,KA) (New England BioLabs)催化亚单位的50&激酶 反应溶液替换先前溶液，并且在30 °C反应30 min或更长时间。舰4 mL廳-Q水清繊冬止反 应。检测200pLPro-Q着色溶液(Invitrogen)循环通过芯片20min，然后4 mL Milli-Q水清洗。最 后，多肽芯片用4mL去色缓冲液(IOO mMNaHC03/CH3C02H, pH4.5,20%乙職在室温下清洗，然 后进4于图片采集。
PKA对20 RR-X-SL多月诉列反应随密度变化相关数难的曲线图如图10所示。針序歹ij在变 化密度的位点合成(图9)。曲线图反映了观l腐的荧光信号/反应时间(30併中)对密度变化的任意位点 (AU)。个别来讲，在一个多肽的齡密度位点，能作图确定反应时间对应的反^SI率。針多肽 在^密度位点的反应初^I率(v。)从曲线图的斜率获得。类似于上述的一个曲线图而速率是v。得 到一条曲线，在该图上根据生化教科书(例如，Biochemistiy(生物化学),池Ed. Beig, J. M., Tymoczko， J. L., Stiyer， L. (2002) W. H. Freeman and Company, New Yorh pp. 200-222)可以确定最大反应速率 (Vmax)和KM值。这些动力学参数也可以从Lineweaver-Burke双倒数曲线图X轴(；I/KM)禾口 Y轴(-
1/Vmax)的距离获得。
蛋白激酶底物阵列的应用与多^w斜目关。多肽阵列可以作为激酶检湖江具来鉴定复杂生物样 品中的激酶或新蛋白鉴定，也可以用于作细胞激酶图谱。由于蛋白激酶起着重要的作用，多肽阵列 的应用不^a寸研究有重大的影响，而且也在诸如疾病诊断、治疗耙标鉴定和抑制子扫描方面影响重 大。
本发明樹共了一个改善阵列实验定量检测性能的方法。下面的繊处理禾S)^括从结合信号中去除噪音。值得注意的，这些噪音是合，量的差异产生的。对于阵列的不同^T基团，由于合成 质量的不确定性，不正确的检测信号在增加，并且也难以十針美地合成。因此，在阵列繊分析 里考虑至恰自量参数将十分有用。按照本发明方法，在芯片最后合成一步用1%的荧光素与表面 所合成好的官能团，如多月i^^詣驢，直接偶联。合鹏激活荧光素并采集图片。fr代表荧光信 号，Ibg!代表背景信号。该多肽阵列包含抗FLGA抗原就多肽(总共414个序列)和各种长度在2 到12 mer的多肽，針至少4个重复(#050013)。支链多月細Boc化学合成的TTMSA方法去f對户。 合成的阵列用7JC和结合TBS缓冲液清洗。结合实验用100 n^mL的抗FLGA M2 (AFM2)， pH 7.5 . 的TBS缓冲液在4 。C反应1 h。通过添加cy5-IgG (100 ng/mL),在pH 7.5的TBS缓冲液4 。C反应 30 min着被检测结合斷兄。用微阵列扫描仪(Axon GenPix 4000B)来采集抗体结合所带有的cy5 信号。整套i鄉包括cy5信号(Ib)、背景信号(Ibg2)和先前图片的荧光信号(lF)。从这些繊中，原始
结合弓驢通过It^Ib-Ibg2确定，直接荧光素銜己的强度ffilAIr^lF —Iw确定。比率RbF(^b/lF)给
出了合成^T单位荧光读数或该数值叫校正结合数。下一步，RbF和AIb通过整体信号弓雖平衡，通 过比较对比两组结合强度(校JE/原始)得至(J矫正因子。414序列产生的 舰±^方法作图在图11 显示。对每种长，列，有获得两组校正因子分别皿1110线禾口 1120线。mo线的斜率大于 1120线。与相同的序列相比，线11]0的序列组有较大的校正因子。产生较大校正因子的原因是对 于某些氨基酸合成的产量偏低。对于每条线，线1110或1120，表现的趋势，列越长，校正因子 就越大。这种结果与合成效率受长度影响是一致的。当校正因子小于l时，如对于一徵豆序列，实 际分析的信号强度会小于没有校正的信号强度。
对于合成上的缺陷，结合信号校正的方法有许多益处。通常， 一种假定是结合 驢越高，在无 需考虑链长的区别和/5游列组成时，则结繊强。然而，以多肽合成为例合成的产率达不到100% 并且20个氨基酸也会导致不同的合#率。合成中的这些缺陷可能会导致分析结合翻时的错误。 例如，如果每步的合成产率是95.0%， 一个3 mer的序列将是12 mer序列的1.6倍。当评估结合数 据时，就必须考虑合成产率的差异。直接荧光标记Jii共了用于定量合成好数量的手段，合成时受 链长度影响的因素也会被扣除。同样的方法，由于不同,MM导致的合成产率的不同也会被扣除。
分析i^基于信号比^i:(表面^^)来评估。
必须注意的是荧光或其他类型的标记分子较高的背景信号可^影响后续的分析。这点可ffil降 低丰射己的百分比^M31偶联带有标记的可切除连接子来克服。在获取合成的信号后，去除不影响后 续分析应用的标记。 一个可去除的在表面所合成的序歹诉財示记物之间的连接子可以是5蕭急定的，如 酉旨连接，或含l-2二醇基团的连接子，或是酸稳定的，如那些切除后产生甲翻安基团，还原性切除， 如二^J化物连接子，或是光稳定的，或可酶切的，或是其他该领il^ff周知的技术。为了合成后读 取的信号与在表面序歹啲数量成比例，选擀斜己和劍牛非常重要。
上面的讨论必须普鹏用于酶反应、杂交和其他各种阵列翻的信号分析。对于不同的阵列系 统，如多肽、{針布的多肽、磷酸化多肽、彩l带染料多肽、寡核苷酸、糖类，比率参数会有不同并 且对于不同的合成、分子和直接标记信号有相应的校正方法。
本发明方法如上述讨论的用于密度变化阵列设计、合成、质控和翻分析不局限于多肽阵列。 通常的禾，和步骤适用于制备和使用DNA/RNA寡核苷酸阵列、糖阵列和包含这些基团M化学 斷布的不同家族阵列。本发明衝共了有效合成多肽阵歹啲方法。基于光化生成试剂，如光化生成酸或碱的传统的化学 方、 評行合成己经被阐明用于合成DNA/RNA、多肽阵列和f針布的DNA/RNA、多肽阵列。多肽阵 列里的一个实施例，合成时的去M^09—种光化生成酸前体，三芳基硫盐。在该条件下，去除在 f絲端的N-Boc基团的去保护时间多于10併中，或多于12 ^H中更完全地去^M基基团。对于多 肽合成中需要如此长的时间是有问题的。比较硫盐和碘盐的去保护效率，后者仅需要少于1射中 或少于30秒的时间就能完全去除Bod斜户基团，大大节省了多肽阵列合成的时间。新式剂适合多
肽阵列合成，由于需要增加合成步骤，因itkx寸于密度变化的阵列非常重要。
比较两组去f斜户剝牛的实验反应A用碘盐和含有2-异丙M杂蒽酮的CH2Cl2在去f對户歩
骤里去除表面氨S^团酸稳定的Boc基团。反应B是使用不同的光化生成酸前体。去保护使用不 同的光照时间(从1秒到10 iH中)。在全部的去j尉户步骤完成后将荧光基团偶联到表面的多肽。点 越黑，强度越强，去保护的^i牛越有效。反应A在20秒到1力H中里比起反应B在7射中或更多 的时间里更有效。去亍尉户Boc基团能在秒的时间尺度里被激活。《顿碘盐合成多肽阵列用抗FLAG 抗体AFM2的标准结合实验验证，并且实验结果与先前的结果具有可比性。
减少循环合成时间对于实际进行原位平行合成多肽十分关键。合成循环时间也是合成设备的 一个功能参数，因此，舰设备也魏短合成时间。这離括强的检测光源(不会斷氐光解析衝， 给芯片传热，在芯片合成区J^Z用微波和其他A^周知的用于加快有机反iSil度的方法。
本发明提供了一个极大提高阵列作为合，件的能力的方法。这SB斤定义的高密度阵列表面 是在单位合成区域有数目众多的'好，因此，高容量的阵列由高密度阵列表面组成。 一个方法是在 支持表面装载和固定多孑L合成媒介，如当前所用的平面玻璃作为阵列合成的表面。多 L合成媒介如 聚苯乙烯微珠(Pierce，美国)、TentaGel微珠(Rapi:-Polymere,德国)和可控多孔玻璃珠(CPG or LCAA-CPQSigma^美国)能产輕少10倍以上的材料，并且也可以获得100， 1000倍或更多。本 发明的一个具体实施例，将10 Mm的TentaGel微^A，敞流体阵列芯片，如Zhouetal. 2004所描述 (ZhoA X" Cai, S" Hong, A" Ya P., Sheng, N" Srivannavit O., Yong, Q" Muranj叫S" Rouilard, J. M.， Xia^ Y" Zhang, X., Xiang, Q., Ganesh, R, Zhu^ Q" Makejko, A., Gulari, E., and Gao, X. (2004) Microfluidic picoarray synthesis of oligodeoxynucleotides and simultaneously assembling of multiple DNA sequences (脱氧寡核苷酸的微流体皮克阵列合成以及多序列DNA共组装).Nucleic Acids Res. 32， 5409-5417)。芯片表面用氨基丙基硅皿接子引出，而后氨 团与琥珀酸酐反应。TentaGel微珠 来自德国Rapp-Polymere,公司。微珠^A阵列位点(微流做敫室)(图l2， mo是空的反应鹏而m5 是装有微珠的微室)。微珠与阵列表面的氮基基团反应显著地增加了表面合成的能力。TentaGel微 珠广泛地作为固相支持用于寡核苷酸和多肽的合成。
图13所示的一个实施例，在具有10 urn TentaGel微珠自fch合成寡核苷酸。按照Zhou等 叙述的玻璃表面功倉旨化的方法(2001 (ZhoA X., Cai, S., Hong, A., Yu^ R, Sheng, N., Srivannavit O.， Yong, Q" Muranj叫S., Rouilard,丄M., Xia^ Y" Zhang, X" Xiang, Q., Ganesh^ R， Zhu^ Q" Makejko, A" Gulari, E., and Gao, X. (2004) Microfluidic pico扁y synthesis of oligodeoxynucleotides and simultaneously assembling of multiple DNA sequences (脱氧寡核苷酸的微流体皮克阵列合成以及多序 列DNA共组装).Nucleic Acids Res. 32,5409-5417)，并且置于一个1 umol DNA合成柱。柱子连接 到DNA合成仪(Expedite 8909, Applied Biosystems (应用生物系统))并且用标准的DMT化学和供货商掛共的标准方fe^成15 mer的寡核苷酸。合成后，去除核酸ff鹏的微基团。进行四个测试 来^i正合成(a)用荧光素直接标记合成的寡核苷酸，用所描述的方ffi(Lepro赋E., Zhang, H.,Yia, Zhou^ X.， Gao, X. (2001) Characterization of oligodeoxyribonucleotide synthesis on glass plates (在玻璃平 面上的脱氧鎌苷齢成的特性).NucleicAcidsRes.29，2171-2180)检测荧光信号。(b)对从表面切 除的产物謝豫外吸收扫面，在260nm处作阳性信号读取。駭TentaGel微珠的合成比直接在玻 璃表面合#生至少1000倍的寡核苷酸产物。(c)用高效液相分析从^W微珠玻璃板上合成的寡核 苷酸，观i照的保留时间为16min，与标准样品一致的^fKHPLC(RC列)C18， 8X101(K箭速 1.5mL/min，紫外检测波长200-600 nm，、蹄ljA是CH3CN，流动相B是0.05 MIEAA缓冲、鄉口 1。/o的CH3CN，梯度5%A ， 2min，， 5-35%A， 20min)。 (d)在駭微珠的玻璃板上进行杂交反 应。与在^W微珠的玻璃feh合成的寡核苷,交反应的互补,i^CPGai:合成。用500A含有 0.5 ,的cy3标己的寡核苷M行杂交反应。用同样的反应剝牛及试剂与未进行寡核苷齢成的装 有微珠的玻璃板反应用于对比。用落射荧光显，敛 集 板图像，有合成寡核苷酸的玻璃板慰见 观倒强烈的荧光信号。
如上述本发明的方法，在装有微珠的,^Jt合成的寡核苷M/人表面切除用于进行脱离阵列的 应用(图14)。所有的阵列位点无需相同的表面密度或容量(14100,14105,14110)。表面和微fe间以 及微辦P^f亥苷酸之间的连接子在所描述的合成和去保护的条fKGao， X. and Yu^ P. 'Wovel reagents .compounds and methods of making and using the same"(新型试剂4t^)以及其制作和应用的方法). PCT International Publication WO 2005/000859) F是稳定的。例如，连接子可以是靠氨基離接的烷 烃链。对于在阵列表面的应用(14115)，.在齡阵歹啦点有大量的表面分子，可以提高检独啲灵敏 性。由于检测的下限与传统的DNA寡核苷酸阵列一样，而检测上线大大提高从而也提高了该阵列 的检测动力学范围。对于离阵列表面的应用(14,120,14,125)，设计了可切除的键使切除的产物可以 不带有微珠(14,120)或带有微珠(14，125)。尽管能在M合成的最后去保护阶段进fi^]除反应，但最 佳情况是在最后去保护成功之后进行切除反应。在寡核苷酸合成中使用连接子有详细的讨论(Gao, X. and P. 'TSfovel reagents compounds and methods of making and using the same"(新型试齐U化^4勿 以及其制作和应用的方法).PCT International Publication WO 2005/000859)。
本发明方法中，装载微珠阵列的合成密度是由微珠的特殊构造决定的。这里的例子使用的是 10 um的TentaGeH敖珠，^微珠有亚，尔的官能团，每克有百万个微珠。如果阵列位点有50 X50平别絲，那^t阵列位点可能合成有好几百鹏^T或多于1(ni4)的好。因此，装载有 微珠的玻璃板可用于合成生产，举一个例子，如合成纳摩的W(图13)。重要的是，在阵列合 件里成百上千或百万的舒同时合成。当需要多批次合成制备上百万不同的分子时，它优于96或 384孑L板。ffil先前的合成技术来利用所合成的材料在面对大规模应用时也会受到限制。阵列合成 劉银术优于先前基于微孔板的合成技术已经有至lM0的评估，并郎寸于纳级鞭小级别的生物分 析器件进行超高通量的基因组或蛋白质组实验是必不可少的。
这里所阐述的方法不局限于玻璃板材料和TentaGel微珠，微珠尺寸不局限于10 um和球形。 其他来源的不同化学(如PDMS，聚苯乙烯)或物理(total plat^ having etoh喊layer喊multi-sided (总 平面，蚀刻，分层，多面))结构的在其领域里用于高密度合成的材料也可选择用于阵列的合成。 阵列表面可以修改成包含 L、洞、浅或深的難或其他的物理f針布，使阵歹拨面分成亚区或增加其他特征方便随后的各种处理，包括装iT微珠、合成和在阵列或离阵列的应用。微珠的选择有多种考 虑微珠的尺寸可以从 到纳米，微珠的几何形态可以是球状、凹状、方形^K，微珠的特性 包括磁性、光学特性或其他鄉的活性特征，微珠的材料可以是多聚物、AX多聚物、金、银或其
他金属复，、小晶体或其他能形i^;f期望尺寸的功能微珠。我们所需要的微珠有一种飢种上述
的特征。
这里所阐述的方法不局限于寡核苷酸合成，也不局限于在一个阵列位点合成一种类型的分子。 本领域的一些技术己经具有较高的价值，包括多肽、寡核苷^j以物、多肽类似物或普通的聚翻安 和聚磷酸二酯序列、糖类(Synthesis and medical applications of oligosaccharides (低聚糖的合成和医学 应用).Nature446,1046-1051)和它们的共轭物。4糊该领m^f周知的在一个阵列位点合成一种类 型以上的分子的技术，该项技术可以随机合成或正交合成两个或更多不同的分子。
这里衝共制备寡核苷酸混合物，或每聽载一个序列或没有。寡核苷酸混合物有广泛的应用 附着微珠的混合物样品會調于检测特异性耙标的应用，如作为探针来富集鹏择DNA测序，基于 微珠的快速DNA测序，如454 Life Sciences禾口 Roche (www.454.com)禾口 Applied Biosystems (www邻pliedsystems.com)的技术,基因组范围的DNA湖!j序,如Solexa-fllumina (www.illuminaconi) 技术，纳级阵列，单分子阵列，？E标特异的实时定量PCR，基因组范围的各种DNA合成(SNP, Chip-on-Chip,CGH,methylationampping)， RNA测序和作图，标签纯化，标记，检测，或条形码， 微珠阵列分析核酸、蛋白和其他类型的針。这些应用要求微珠上有l， 10， 100或1000个同样的 肝或探针，并且偶联微珠的^T能结合同样多的耙标肝。 一个阵列合離件倉都恪法摩尔(6.0 X1(T8个分子)的材料用于100,000或更多的实验。装载有微珠的阵歹棉恪的材料用于l,OOO，OOO 或更多的实验。寡核苷酸混合物能用于如Zhou等(2004)描述的合成DNA，它们能作为前体材料用 于构建功能DNA、 RNAs、蛋白、生物聚合复合物、小型基因组、生物体或细胞。
应用的一个具体实施例， 一组癌激活相关的50,000基因(平均长度1.5 kbp)进行1,000,000次测 试，重复3次(齡序列读3次)(总共读取50,000,000,000个序列)。这项任务只能靠当前的大规模测 序技术完成。然而，目前已知的技术如454DNA观a雜术是f顿空白微珠随禾鹏辦列进行测序。 这种处理会出测艮多微珠捕获了太多的序列，也新艮多微珠没有捕获樹可序列。 一部分微麟有正 确数量的序列3If盾经典的统计分布。此外，微珠载有的单一序列可能是冗余的，这种趋势取决^P^寺 殊序歹啲丰度。丰度越高，微珠上载有i娇列的几率,鹏大。 一种解决的办法是在微珠上载有单一 探针，使之与预定的耙标杂交。然而，这种简单的解决办法要求高通量合成寡核苷酸。樹共一组从 总RNA中选择3,000个基因的探针，那么就可以保证每次测序序列^Mii杂交而非随H^择的。 该技术能确保测序的效率和覆盖全部序列，否则不可能誠该任务。如^5开究在低通量和随机i微 的^#下没办法完成，这种深度测序能充分帮助获得基因乡脾列以及获得深度认识。
本发明提供合成分子阵列表面化学修饰的方法。化對針制吏给阵列合成分子引入新的特征，因 此给阵列自开辟新的方向，^i了核,交和经典的基于多肽的分析。 一个《針布反应的例子^M 过共4纖将糖基团和多肽连接，产4ff的銜布多力媚于扫描抗体结合、细胞受体结合、蛋白结合、 疫苗筛选和其他包括糖类及小分子的常规应用。 一种有用的反应是Huisgen cydoaddition(点击化 学)(图15)，它能使末端與1505)与叠氮化物(1510)反应复合形成trizo1(1515)，该反应偶联了R和R1 的基团使飽赵申。叠氮化物的连接基团化合1520可以是烷基、乙烯基、寡聚甘油和聚翻安等。由于点击化学反应斜牛比较容易满足并且在水环境中适合生化M反应，因此在过去几年里已经腿
普及。这里描述的实验是将一个a半乳糖多糖叠氮化物连接至眵ftLh，在阵列表面形成生物共轭 物。 一个合成首选的实施例(图16), —^^含受Boc {對户的氨基表面基团的多肽阵列(1605)。选 择性地去保护阵歹啦点，来激活表面MM欧1610)，然后jl隨禹联丙炔酸(X-无)(1615)，形成 彩1,1620)。在点击反应^f牛下，叠氮化合物(1625)的R是个连接子，连接了荧光素。这， 厕1625)再"单击"到^^'鹏形成共轭物(2=^20的(1630)。在这个阵列表面，舰点击化学方法 不断重复去^^户、偶 ^皿羧酸反应步骤，并且在不同阵列位点生成含R1、.R2或R3基团的生物 共轭物(1635)文库。例如，这种生物共轭物是多肽衍生化合物。
在阵列上合成^T的4針布方法不局限于点击化学的应用，其他生物共轭化学，如通过马来M 月^ffll、乙酚胺或肼、硫醇减醇和二芳基腙化合物(SoluLbk，美国)形成交联也是在选择范围内。
本发明一个首选的具体实施例，反应^ffl当前所描述的光化生成酸法和Boc化学合成多月， 列，包括首次合成。在制备多肽后，对第一组反应位点去{斜户，并且氨錢团与丙炔酸偶联，第二 组^立点去保护，并且氨 团与冬戊酸偶联，重复去iS^户和偶联步l聚，在该{立点偶联6-庚炔酸。 这些位点包含末端'^S。然后多肽芯片表面与FITC-叠氮化物在乙醇和7JC混合液，存在CuS04和 Ph3P斜牛下反应2小时。^ 署图片在图17顶部显示。显示一张荧光图片以》據终止的多月链 接有FITC(荧光素)在环加成FITC-叠氮化物和表面炔基之后。显示的荧光信号与设计的部署一致， 说明了点击化学方法非常适合用在阵列表面合成{針布的多肽。
另一个较佳的具体微制列子，反应劍牛与，方法类似，并且安排好所选择的去保护和偶联步 骤，如在一个序列的不同位点进行multipld針布(1640)(图16)。
阵列包含了斷布的^T，如糖割七的多肽，其具有作为生物标志物结合配体的价值，它们比常 规的DNA或多肽^h 有更多的官能团。
本发明樹斜顿原位平行合成的方法制备《針布分子的阵列。这种合成方法基于合成循环中iKl 照相平板光鄉法、光化生成酸或碱、电产酸或石棘歡活，或是将反应试剂输送至阪应位点。阵列 合成不局限于一定的特殊结构，如阵列附属的器件或开放表面、阵列亚区fe域限制区域、阵列的尺 寸。然而，关键的是阵列必须允许在第一和第二预定的区域进行^t布反应等等。
在阵列表面的斷布和生物共轭反应不局限于糖基共轭的多肽、寡核苷酸、糖，好基团可倉提 蛋白、抗体、细胞、微珠，如TentaGel珠。这里所提到的微珠也包括胶体CdSe-ZnS或其他类型用 于组织和体内離的磁珠，磁珠，对于快速纯化样品十分有用。微珠的表面可能带有的官能团，如 羟基、氨基、巯基、生物素基、N-琥珀酰亚胺、叠氮化物、烯烃基5S^。微 面可以有选择的 由活性^^包被，如链霉素、抗体、GST、 fflS6等。
本发明的一个首选具体实施例， 一个微珠， 一种混WW成千到百万的包含了不同的化合物的 微珠将在接下来几年里在高通量分析和生化微型化应用里有巨大的需求。这些微珠可以作为特异结 合的探针、,析的底物、聚，反应的引物和目前高通量模式里的众多应用。 一个设想是fflii使 用数百万的纳米级微珠在表面形成阵列来使当前的一些应用微型化。该表面可以或不必要有分离微 珠的栅格，可以舰包l棘保持微珠。很多不同类型的微珠由不同的材料制备，如金、合成的多聚 物和交接合成的多聚物、溶胶和玻璃，并且尺寸可以从纳米至iJ!M。
本发明掛共利用阵列作为合成工具制备微珠文库的方法。当前熟知的用分离组合的方法制 珠文库，但该方法只是一个库并且它的随机性使控制变得困难。自动点样蝶它将好固定至微珠 的方、法己有f顿，但这些方齒又适用于制备上千个不同化合物的微珠文库。这是由于化^tf需要预 先合成而后合成几千以上的大量化剖勿又受到财力和时间的限制。本发明樹共在表面合成阵列化合 物来构建微珠文库。
特别地讲，本发明揭示了直接"拷贝"表面包含的各种化合物制备成微珠文库的方法。下面给 出该方法的几个例子。
合成阵列在玻璃板表面图18 (18000)的运作如所发表的进行(5)。对于合成的^生物多聚物 有一W苗定基团加入，例如在^^位置((18100), (18105), (18110))。锚定好是那些能与弓!入的肝 形成共《，或高亲和键。在阵列合成后，表面^ 有粘附性的微珠装载到阵列表面(18115)。阵列 表面分子能与微珠接触结合(18120)。然后从阵列表面切下表面^T(18125)。在*劍虫区域，仅 有一种类型的分子与微珠结合。因此，实验结果产生了一个微珠带有一种化合物的微珠文库 (18130)。
另外一个具体实例，在微^A至U位点后分隔3拉的反应位点。在表面分子与微珠结合后从表 面切下这^f 。该实验产生了一个微珠带有一种化合物的文库。
在上述实验中，在微珠iSA到位点后，反应位点3蚊分隔。在表面分子与微珠结合后从表面切 下这m^。该实验产生了一种化合物带有一个微珠的文库。
在表面离散的位点合成或固定分子。对于M合成的生物多聚物的末端位置都连接了一^H苗 定基团。锚定基团是个可反应基团或是一个能被激活的基团以形成能与 的微珠反应的连接子。 合成后，能粘附表面^f的微鄉载到阵歹暖面。在織虫时，表面針与微珠结合。然后，从阵列 表面切下表面少仔。在齡^f足区域， 一种类型的分子与一个微珠结合，因此，该实验产生了一种 化合物带有一个微珠的文库。
在上述实验中，合成完成后，能粘附表面分子的，敫珠装载到阵列表面。在接触时，表面分子 与微珠结合。然后，从阵列表面切下表面肝。在針撤虫区域， 一种类型的^T与一个微珠结合， 因此，该实验产生了一种化合物带有一个微珠的文库。
在上述实验中，合成分子结合的锚定基团可以是生物素，它能与链霉素或抗生素蛋白微珠结
合；可以是硫醇基团，它能结合金粒子；可以是M^团，它能结合乙,被的微珠；可以是硫醇， 它与小球表面的顺丁稀二酷亚胺反应；也可以是其他类型的适配系统。
可以调整表面分子的密度和微珠的直径，以便于控制与微珠结合的肝数量。 测试显示了表面分子与微珠紧密结合或键合，使微珠固定。表面分子的锚定基团和微珠表面 受体的锚定基团产生强烈的互作，以致包含合成分子的表面甜敛珠有自发的粘性。
本发明一个首选具体实例是微珠文库制备的应用。下面描述的方法用于"用基因组测序系统 超决速从头测序人类解脲棒杆菌基因组"(www.454.com)，获得基因组DNA样品。制备一个包含 所需要序列的寡核苷酸阵列，并且以生物素估W端，从阵列表面上切下的这些序列有3'OH。所制 备的微珠文库是作为靶DNA序列特异的弓,(DNA序列信息可以从NCBI或EBI获徵。^!^[珠与 基因组DNA混合，舰PCR扩增靶DNA。这些样品舰454基因组测j^义测序。革欧斜寺异的测
序能提高总的碱基读数并且测序覆盖唯一的i!S。
在不脱离本发明的范围和宗旨的斜牛下，对本发明中提至啲方法和系统可以进行各种修改和变更。虽然本发明在特殊的例子中已经描皿，但是应当清楚本发明权力声明绝不仅仅局限于这些 特殊的例子。确实，精通分子生物学、遗传学、化学謝目关领域的AM然明白本发明的执行方式可 以有各种不同的修改，以下的权力声明中就包括了这些修改。
虽然为了更清楚的了解，本发明先前已经M说明和例子作了一些细节上的描述，fiM而易
见，本发明领 常的专业人士可以根据本发明的描述，在不脱离本发明的范围和宗旨的条件下，
x寸本发明中提到的方法和系统可以进行各种修改和变化。
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权利要求
1.一种由两个或更多位点组成的表面功能化的方法包括(a)把第一组预定浓度的分子定位到至少一个表面的位点；(b)把第二组预定浓度的分子定位到至少一个表面的位点；(c)重复步骤a和b形成表面，其中两个或更多位点的预定密度是不同的；(d)用第一个反应分子作用于表面的密度变化位点；(e)用第二组反应分子作用于表面的密度变化位点，由此不同表面密度的功能化位点经过至少两步连续的化学反应，以形成每个反应位点至少形成两个新的化学键。
2.权利要求l中的表面包括(a) ^h爽型分子至少有两个^5E多的密度变化位点(b) 争 —+或更多的不同奖型分子；
3. 鹏权利要求1的施，腿功能4t&m包繊加预定鹏的鹏鄉，可會抱^§"^^构单元，^^止单元，繊"^多分支单元。
4. 職柳要求l的旅，继表面功能化包括(a) 用预娜照波t《辐MM少-个第-位点以、 至少，+第1点；(b) 用预定辐照波K辐照全'少 个第二位点以激活至少一个第二位点(c) 赏复歩骤a和b形成表面，这里预定的辐照波长3致^^肝在两个成更多的位点密度不 同；
5. 根据权利要求1的施，^M^^i:(a) 添加第—单体到包含密度变化位点的功能似口活化的表面；(b) 添加第二个单体到包含密度变化似点的功能腳活化的表面；W形成一"HH^阵列'这虽表必至^含两种^H1，并且齿i"种同H;m—以上密度变化的 位点
6. 权利要求5中的^^l^了密;g5Bfc位点^^用于蛋白质的翻御定量分析
7. —种由附啦点鹏的表面功能化的^^括(a) 把第-邻预定浓度的分子定位到争:少- '个表而的位点；(b) 〗碟二组预定鹏的肝定魁(I至i!)^r^lfif的位点；(c) 重复步骤a和b形成发面，^&針阵列位点的舰密度是不同的；(d) 用第-^gj必hf作用于表面的密度变化位点；(e) 用第二个JX^好作用于表面的密皮变化位点；(f) iE^歩骤d和e'由llt/T、'同表而密度的功能化似点纟^l全'少两i^^的化学^R以形成毎个Si血位点至少形成两个新的化^^
8. 权利要求7的表面包括Ca) ^1>1噢型的分子全少打—个密度靴位点 (b)至少'外或者史多类型分 -
9. ^g权利要求7,包^S加^a^U的功能tt^，可以包S^Mt鹏构单元，^h^止单 元，螂~"^多分支单元。
10. 权利要求7的功能條面的^^括(a) 至少在辐照波长7辐照第-组位点以至少^S第一甜位点；(b) 争:少在辐照波长T^'照第:^i位点以全:少鹏第二组位点；(c) 宽复步骤a和b形戯而，这鬼预定的辐服w皇':;i起活化的附i股点上的的分子密度不同 u.;
11.据权承展求7中eti^,皿^^o中平行合成的g^as包括(a) 添加第一个制小到包含'浙度变化位点的功能化和活化表面；(b) 添加第二个舉体到包';T密度對七位点的功能tt^J活化表而(c) 形成，个分f阵列，这巫表面,yj^i含两种^"予，并且^t同时有-冲以上密^g^Hfc的位点；
12. 权利要求7中阵列麟了密^fc位点^^用于蛋白质的翻鹏定量分析
13. —种平行合成密;SM;位点多肽阵列的;^括(a) 具有一个阵列部署文档，包^^密度变化位点和在预定位覽的多肤序列；(b) 根据外列部署，，把第一组预^g的^定位到至少一个表面的位点； (C)根据附鹏文档，綠二组预定浓度的肝定翻至少.—个表面的位点；(d) 觅复歩骤b和c形成表面，^M板据歩骤a产-'生職的密度变化位点(c) 在根据歩骤a预定的位^^一个活化^細^^用于歩骤d的表面，闲而第—活化的分 了邻农而功能基闭之问发生鹏；(i)在根据歩骤a顶定的位点第二个活化fl，斷乍用于歩骤e的表面，因而第二个活化的分子和农面功能基隨晚JLW" ⑧观复在根据歩骤all^的位点活化的ES謝乍用歩戮形成位于不同密度劑七位点的两个或史多多肽的多肽阼列；
14. 权利要求13中的多欣阵列部著乜含相当於四个或#更多的96-孔滴定平板的密度^^位点。
15. 权利要求13中的表面i^i位点包含受"W'lKl^ilK白由,。
16. 权利耍求13中的提"附l股点密度的分子是单链受保护的赖氨酸
17. 权利要求13中的附氏阵列位点密度的分了是-寸alpha-^CS^^^S酸,《别"基团在鹏的合^S^中是稳定的。
18. 权利要求13中的活^多肽合成中^^的i[S酸。
19. 权利要求B的表面包^iia原位平行合鹏到的密度变化位点。
20. 权利要求13的表面包含通过原位平行合戯!l的多肽。
21. *^傻求13中的多IJU^0il^了^^i^lW密度的表面附着的4H1。
22. 权利要求13中的多1^抱含了己知结^# 多肽。
23. 权利要求13中的多J3JU^U是为了翻眵肽-蛋白JlffiSa左中蛋白Jl^i和定量分析。
24. 权利要求13中的多JIU^lJ是为了测量蛋白,的^tt。
25. 权利要求13中的多,列是为了测量蛋白质酶的活性。
26. 权利要求13中的多IJb^!j是为了测M^合磷蛋白的蛋白质。
27. 权利要求13中的多IJU^U^了测1^:体结合。
28. 权利要求13中的多Jlb^l提为了测觀白质结合。
29. 权利要求13中的多JSb^^默了测l^酸结合。
30. 权利要求13中的多!ib^!j是为了测量多糖结合。
31. 权利要求13中的多IJU^!j是为了^M二jy^翻的^^J^mr湖聚物共轭。
全文摘要
本发明涉及微阵列合成的定量和数量的方面以及用微阵列作为脱离微阵列表面应用的合成分子的高容量制备器件和用微阵列作为在微阵列表面应用的分析器件。
文档编号C12N11/00GK101583580SQ200780024729
公开日2009年11月18日 申请日期2007年6月29日 优先权日2006年6月29日
发明者周小川, 张小林, 奇 朱, 洪爱玲, 虞佩琳, 高晓莲 申请人:高晓莲;周小川;张小林;洪爱玲;朱 奇;虞佩琳