专利名称：：前列腺特异性转录物及其在前列腺癌治疗和诊断中的应用的制作方法前列腺特异性转录物及其在前列腺癌治疗和诊断中的应用发明领域本发明涉及鉴定对应于前列腺癌细胞表达的基因中选择性剪接事件的DNA序列。这些基因或它们相应的蛋白，将作为差异调控和/或剪接这些基因的癌症、特别是前列腺癌的治疗、预防和/或诊断的靶标。
背景技术：
：人类疾病状态的遗传检测是正在快速发展的领域(Taparowsky等，1982;Slamon等，1989;Sidransky等，1992;Miki等，1994;Dong等，1995;Morahan等，1996;Lifton，1996;Barinaga，1996)。但是，这种途径存在一些问题。许多已知的遗传病变仅仅使个体倾向于发展特定的疾病状态。带有遗传病变的个体可能不发展成疾病状态，而不具有该特定遗传病变的其它个体却可能发展成疾病状态。在人类癌症中，遗传缺陷可能潜在发生于众多已知的肿瘤抑制基因和原癌基因中。癌症的遗传检测有很长的历史。一些显示出对癌症倾向性的最早的遗传病变是ras癌基因中转化性点突变(Taparowsky等，1982)。转化性ras点突变可以在患有良性和恶性结肠直肠肿瘤的个体的粪便中检测到(Sidransky等，1992)。但是，只有50%这样的肿瘤含有ras突变(Sidransky等，1992)。在乳腺和前列腺癌中扩增HER-2/neu(Slamon等，1989)、在膀胱癌中缺失或突变p53(Sidransky等，1991)、在结肠直肠癌中缺失DCC(Fearon等，1990)以及在乳腺和前列腺癌中突变BRCA1(Miki等，1994)时，获得了类似的结果。这些遗传病变都不能预测大多数个体的癌症，并且多数需要对疑似肿瘤直接取样，这使得筛查困难。此外，上述标志都不能区分转移和非转移形式的癌症。在癌症患者的有效治理中，鉴定那些肿瘤已经转移或可能转移的个体是关键的。因为转移癌在美国每年杀死560,000人(ACS主页)，转移性前列腺癌标志的鉴定将是重要的进展。癌症检测和诊断中的特定问题发生在前列腺癌。前列腺癌是美国男性中最常诊断出的癌症(Veltri等，1996)。1998年约189,500男性诊断出前列腺癌，大约40,000男性死于该恶性肿瘤(Landis等，1998)。尽管在患者的一生中发展到有临床意义的前列腺肿瘤相对较少，但那些本质上是进行性的前列腺肿瘤在检测时可能已经转移。患有转移性前列腺癌的个体的存活率相当低。在这些极端情况之间的，是患有将要转移但还没有转移的前列腺肿瘤的患者，对于他们来说，手术移除前列腺是治愈性的。确定患者属于哪一组，对于决定最佳治疗和患者存活是关键的。1984年，FDA批准了血清前列腺特异性抗原(PSA)试验，这改变了前列腺疾病的治理方式(Allhoff等，1989;Cooner等，1990;Jacobson等，1995;Orozco等，1998)。PSA被广泛用作血清生物标志，在前列腺癌患者中检测和监测治疗反应(Badalament等，1996;O'Dowd等，1997)。对PSA分析的几个修改(Partin禾POesterling,1994;Babian等，1996;Zlotta等1997)导致了早期诊断和改进的治疗。尽管从1988年起，PSA已经被广泛用作前列腺癌的临床标志(Partin和Oesterling,1994)，但单独利用PSA或与直肠指检(DRE)组合利用的筛査程序，还未能成功改善患有前列腺癌的男性的存活率(Partin和Oesterling,1994)。尽管PSA对前列腺组织是特异性的，但它由正常和良性以及恶性前列腺上皮产生，导致前列腺癌检测中的假阳性率高(Partin和Oesterling，1994)。尽管当PSA血清水平相对高时是前列腺癌的有效指示物，但是当仅仅适量升高，例如当水平在2-10ng/ml之间时，PSA血清水平对前列腺癌来说更是含糊的指示物。在这些适量升高的情况中，血清PSA可能源自非癌性疾病状态，例如BPH(良性前列腺增生)、前列腺炎或物理创伤(McCormack等，1995)。尽管使用较低的血清PSA癌症检测截止浓度2.0ng/ml增加了前列腺癌的诊断，特别是在患有不可触知的早期肿瘤(Tlc期)的年轻男性中(Soh等，1997;Carter和Coffey,1997;Harris等，1997;Orozco等，1998)，但在低血清PSA水平下，PSA分析对前列腺癌检测的特异性仍有问题。几位研究人员通过研究血清PSA浓度之外的其它各种生物标志，寻求改进前列腺癌血清检测的特异性(Ralph和Veltri,1997)。这些其它生物标志中研究最深入的一种是患者血液中游离的与总的PSA的比率(f/tPSA)。血清中大部分PSA处于与其它蛋白例如al-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)或a2-巨球蛋白结合的分子形式(Christensson等，1993;Stenman等，1991;Lilja等，1991)。游离的PSA不与其它蛋白结合。在BPH患者中游离的与总的PSA的比率(f/tPSA)通常明显高于患有器官局限性前列腺癌的患者(Marley等，1996;Oesterling等，1995;Pettersson等，1995)。当为f/tPSA分析确定适合的截止值时，在血清PSA水平仅适量升高的情况下，f/tPSA分析可以帮助辨别BPH患者和前列腺癌患者(Marley等，1996;Partin和Oesterling，1996)。不幸的是，尽管f/tPSA可以改进前列腺癌的检测，但f/tPSA比率中的信息还不足以将前列腺癌血清检测的灵敏度和特异性提高到所希望的水平。其它已经用于前列腺癌检测的标志包括前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺分泌蛋白(PSP)。PAP由前列腺细胞在激素控制下分泌(Brawn等，1996)。它比PSA的特异性和灵敏度低。因此，现在对它的使用要少得多，尽管PAP对监测初次治疗失败的转移患者中可能仍然有一些应用。总的来说，PSP是比PAP更灵敏的生物标志，但仍不如PSA灵敏(Huang等，1993)。与PSA相似，PSP水平通常在BPH患者和前列腺癌患者中都升高。另一种与前列腺疾病相关的血清标志是前列腺特异性膜抗原(PSMA)(Horoszewicz等，1987;Carter禾卩Coffey,1996;Murphy等，1996)。PSMA是II型细胞膜蛋白，已经被鉴定为叶酸水解酶(FAH)(Carter和Coffey，1996)。针对PSMA的抗体与正常前列腺组织和前列腺癌组织都起反应(Horoszewicz等，1987)。Murphy等(1995)使用ELISA在晚期前列腺癌中检测血清PSMA。作为血清测试来说，PSMA水平是相对差的前列腺癌指示物。但是，PSMA在某些情况下可能有用。PSMA在转移性前列腺肿瘤的毛细血管床中表达(Silver等，1997)，并据报道在转移性癌症患者的血液中更丰富(Murphy等，1996)。LNCaP前列腺癌细胞系在暴露于5-a-二羟基睾酮(DHT)后，PSMA信使RNA(mRNA)被下调8-10倍，并且在剥夺激素的状态下以高水平表达(Israeli等，1994)。PSMA表达的激素调节可以有利于更清楚地了解它在前列腺癌中的调控和重要性。前列腺癌的两种相对新的潜在生物标志是人激肽释放酶2(HK2)(Piironen等，1996)和前列腺特异性转谷氨酰胺酶(pTGase)(Dubbink等，1996)。HK2是由前列腺腺体分泌的激肽释放酶家族的成员(Piironen等，1996)。前列腺特异性转谷氨酰胺酶是前列腺细胞中表达的钙依赖性酶，催化蛋白的翻译后交联(Dubbink等，1996)。理论上，HK2或pTGase的血清浓度可利用于前列腺癌检测或诊断，但这些标志的有用性仍在评估中。已报道白介素8(IL-8)用作前列腺癌的标志(Veltri等，1999)。据报道，血清IL-8浓度与前列腺癌的分期升高有关联，并且能够区分BPH和恶性前列腺肿瘤(同上)。该标志对前列腺癌检测和诊断的大规模适用性仍在研究中。除了前列腺癌的这些蛋白标志之外，己经报道了几种遗传改变与前列腺癌相关，包括等位基因丢失(Bova等，1993;Macoska等，1994;Carter等，1990);DNA过度甲基化(Isaacs等，1994);视网膜母细胞瘤(Rb)、p53和KAIl基因的突变或缺失(Bookstein等1990a;Bookstein等1990b;Isaacs等，1991;Dong等，1995);以及通过荧光原位杂交(FISH)检测到的染色体的非整倍体性和异倍体性(Macoska等，1994;Visakorpi等，1994;Takahashi等，1994;Alcaraz等，1994)。这些无一被报道表现出足够的灵敏度和特异性，可用作无症状前列腺癌的通用筛查工具。在目前的临床实践中，使用血清PSA分析和直肠指检(DRE)来指示哪些患者应该进行前列腺活组织检查(L池rup等，1994;Orozco等，1998)。活检组织的组织学检查被用于作出前列腺癌诊断。根据1998年189,500例诊断出的前列腺癌(Landis,1998)以及大约35%的已知癌症检出率(Parker等，1996)，估计1998年在美国进行了超过五十万例前列腺活组织检查(Orozco等，1998;Veltri等，1998)。显然，灵敏性足以检测小的和早期前列腺肿瘤、并且也具有足够的特异性排除较大部分患有非癌性或不具临床意义的病症的患者的血清学测试，将更为有益。现有技术在鉴定与前列腺癌进展有关的基因和发展监测疾病进展的诊断方法方面，仍有不足之处。同样，鉴定在前列腺癌中差异剪接和/或差异表达的基因，在开发快速的不昂贵的癌症诊断方法中将是相当重要的。尽管已经克隆了几个前列腺特异性基因(PSA，PSMA，HK2，pTGase等)，但它们一般在前列腺癌中不被上调。鉴定与非恶性前列腺组织相比，在前列腺癌中差异表达的新的、前列腺特异性转录物，将代表前列腺癌诊断、预后和治疗中重要的、不可预料的进展。CD8+T淋巴细胞亚型在针对肿瘤发生的免疫监视中扮演了重要角色(Knutson等，2005)。由I类主要组织相容性复合物(MHC)分子在患病细胞上呈递的肽可以被CD8+T细胞识别(Flutter等，2004)。通过与呈递肽抗原的特化抗原呈递细胞(APC)——树突状细胞相互作用，CD8+T细胞被活化，导致它们的增殖。在起始活化后，CD8+T细胞是有力的杀伤细胞，当它们所特异性针对的活化肽抗原被自身MHC分子呈递时，能够裂解表达所述抗原的细胞。由I类MHC分子呈递的肽，源自主要由胞质多催化性蛋白酶体复合物介导的细胞内蛋白水解加工事件(Guermonprez等，2005)。一旦抗原特异性T细胞受体与MHC/肽抗原复合物相互作用，CD8+溶细胞性T淋巴细胞(CTL)就分泌形成孔的蛋白穿孔蛋白，以及粒酶包括粒酶B。这些颗粒蛋白在靶细胞中协调胱天蛋白酶(caspase)级联的蛋白水解活化，导致凋亡性死亡(Ashton-Richardt，2005)。这对于通过鉴定由选择性剪接产生的前列腺和前列腺癌特异性转录物和蛋白以开发新的前列腺癌疫苗具有极大的潜力。为了开发基于细胞的肿瘤疫苗疗法，呈递抗原的树突状细胞受到了关注。树突状细胞是专门的抗原呈递细胞，是幼稚T细胞的最有力的激活齐廿(Banchereau禾口Steinman，1998;Fong禾口Engleman,2000;Schuler等，2003)。这些细胞可以用抗原性肽、共刺激分子和/或生长因子进行机械和/或遗传操作，以产生能够特异性活化€08+CTL的细胞群，用来特异性靶定要破坏的肿瘤细胞(Gabrilovich等，1996;Nair等，1997;Paglia等，1996;Zitvogel等，1996;Ashley等，1997;Mayordomo等，1996;Siders等，2003;Chen等，2003;Akiyama等，2000;Wan等，1997;Esslinger等，2002;Bonifaz等，2002)。各种不同的基于树突状细胞的癌症疫苗正在临床实验中检验(Berzofsky等，2004)。例如，21位患有复发或转移的前列腺癌并具有升高的血清前列腺酸性磷酸酶(PAP)的患者，用啮齿类PAP冲击过的树突状细胞进行治疗。10位被治疗的患者发展出对PAP的T细胞增殖应答(Fong等，2001)。最近，将树突状细胞前体暴露于PAP融合蛋白，然后给患者施用，以引发CTL应答(DrugsR&D，2006)。使用治疗癌症的靶定表面蛋白的治疗性抗体是已知的。其例子包括靶定B细胞淋巴瘤上CD20的利妥昔(RITUXAN)，靶定由慢性淋巴细胞性白血病表达的表面抗原CD52的Campath,靶定乳腺和其它癌症上的erbB2的赫赛汀(Herceptin)，以及靶定在白血病细胞上表达的CD33表面抗原的Mybtara。但是，到目前为止，还没有用于前列腺癌治疗的单克隆抗体被批准治疗性应用。发明概述本发明涉及鉴定新的核酸和氨基酸序列，所述核酸和氨基酸序列是前列腺癌细胞或组织特征性并且代表了在对象中治疗或诊断这种病症的耙标。更具体来说，本发明公开了23个特异性的、编码新肽序列的分离的核酸分子。这些新的序列被发现在正常前列腺和前列腺癌之间差异表达。这些序列和分子代表开发前列腺癌的检测、诊断和治疗的方法和材料的靶标和有价值的信息。本发明的目的是提供用于前列腺癌治疗和诊断的方法和材料。本发明的更具体的目的是鉴定由前列腺癌组织表达的新的外显子(新的剪接变异体)，其是前列腺癌治疗和诊断的有潜力的基因靶标。本发明的具体目的是开发治疗前列腺癌的新疗法，包括施用或使用对应于前列腺癌特异性表达的新基因靶标的反义寡核苷酸。本发明的另一个具体目的是鉴定在前列腺癌细胞中被特异性上调的外显子以及那些外显子编码的相应的蛋白结构域。本发明的另一个具体目标是产生与外显子编码的、被某些前列腺癌表达成蛋白结构域的抗原所结合的配体，包括但不限于单克隆抗体。本发明的另一个具体目标是为前列腺癌的治疗提供新的治疗方案，包括单独或与佐剂组合施用或使用由某些前列腺癌表达的抗原，所述佐剂引发针对表达这些抗原的癌症细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞淋巴细胞应答。本发明的另一个目的是为前列腺癌的治疗提供新的治疗方案，包括施用或使用与某些前列腺癌表达的新抗原特异性结合的配体、特别是单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供含有上面定义的配体或抗原、并与可药用载体或赋形剂和/或佐剂相组合的药物组合物。本发明的另一个目的是为前列腺癌的治疗提供新的治疗方案，包括通过用表达前列腺肿瘤相关抗原的病毒载体转导、直接注射前列腺肿瘤相关抗原或裸DNA表达构建体，施用或使用基于细胞的抗肿瘤疫苗、特别是直接荷载有肽的抗原呈递性树突状细胞。本发明的另一个目的是为前列腺癌的治疗提供新的治疗方案，包括施用或使用含有上述荷载有抗原性肽的树突状细胞的基于细胞的抗肿瘤疫苗，该树突状细胞已经用细菌LPS、TNF-a、CD40配体、单核细胞条件培养基或细胞因子混合物使之成熟。本发明的另一个目的是提供使用配体例如单克隆抗体诊断前列腺癌的新方法，该配体与某些前列腺癌特异性表达的抗原特异性结合，以便检测对象是否患有前列腺癌或是否发展前列腺癌的风险增加。本发明的另一个目的是通过使用与某些前列腺癌表达的新基因靶杂交的标记DNA，提供检测人患有前列腺癌或发展前列腺癌的风险增加的新方法。本发明的另一个目的是提供检测人患有前列腺癌或发展前列腺癌14的风险增加的诊断试剂盒，其包括与前列腺癌细胞表达的抗原特异性结合的配体、例如单克隆抗体，以及可检测的标记，例如指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。本发明的另一个目的是提供检测人患有前列腺癌或发展前列腺癌的风险增加的诊断试剂盒，其包括特异性针对前列腺癌细胞特异性表达的新基因靶的核酸(例如DNA)引物或探针，以及可检测的标记，例如指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。本发明的另一个目的是提供选择、鉴定、筛选、表征或优化生物活性化合物的方法，包括确定候选化合物是否与本申请中公开的抗原或多核苷酸结合、优选为选择性结合。这样的化合物代表了治疗癌症疾病、特别是前列腺癌的药物候选物或先导物。本发明的另一个目的是鉴定以改变的形式在前列腺癌细胞中表达的基因。这些形式代表了基因的剪接变异体，其中DATAStm片段或者1)指示了在基因内发生的剪接事件，或者2)指出被活性剪接以产生不同基因产物的基因。这些不同的剪接变异体或同种型可以作为治疗性干预的靶标。发明详述DATAS(具有选择性剪接的转录物的差异分析)分析了表达的基因之间的结构差异，并为RNA剪接中的变化提供了系统性访问(公开在美国专利No.6,251，590中，其公开内容以其全文引入作为参考)。访问这些对细胞稳态关键的剪接序列，代表了功能基因组学的有用进展。当比较两个样品、例如正常和肿瘤组织时，DATAS技术产生了两个文库。每个文库特异性包含了在一个样品中存在并表达更高的序列的克隆。例如，文库A将包含在正常样品中存在、但在肿瘤样品中不存在的基因序列。这些序列被鉴定为在肿瘤样品中从基因中移除或剪接掉了。相反，文库B将包含只在肿瘤样品中存在而不在正常样品中存在的序列。这些代表了作为被选择性剪接成只在肿瘤样品中表达的基因的外显子/内含子。本发明部分基于外显子的鉴定，所述外显子使用DATAS分离，然后确定为在前列腺肿瘤样品中被差异调控或表达。此外，本发明提供了前列腺肿瘤特异性或前列腺特异性的、不在细胞表面上表达的外显子，它们可用于制备前列腺肿瘤疫苗，包括预防性和治疗性疫苗。具体来说，通过DATAS鉴定了23个表达的序列标签，并证实了它们在正常前列腺组织和前列腺肿瘤组织间是差异表达的。这些DATAS片段(DF)是小的基因区段，在一个样品中被选择包含或排除，但在另一个样品中则不是。这些小区段是表达基因转录物的一部分，可以由来自基因的几个不同区域的序列组成，所述序列包括但不限于单个外显子的部分、几个外显子、来自内含子的序列、以及来自外显子和内含子的序列。这种外显子在不同生物样品中的选择性使用，通过在本
技术领域：
中熟知的被称为选择性RNA剪接的过程，从同样的基因产生了不同的基因产物。具体来说，从DATAS片段序列中鉴定了23个选择性剪接的同种型，并产生了适合下面对靶和基因产物的所有描述的选择性基因产物。从相同基因产生的选择性剪接的mRNA含有不同的核糖核苷酸序列，因此翻译成具有不同氨基酸序列的蛋白。选择性剪接到基因产物中或从中被剪除的核酸序列，可以从原始的基因序列框内(inframe)或框外(outofframe)插入或缺失。这导致从每个变异体翻译出不同的蛋白。差异可以包括简单的序列缺失，或插入到基因产物中的新序列信息。框外插入的序列可能导致产生早期终止密码子，产生截短形式的蛋白。或者，核酸的框内插入可能导致从mRNA表达附加的蛋白结构域。终期目标是包含新的表位或功能的新蛋白。已经鉴定了已知基因的许多变异，它们产生的蛋白变异体可以竞争或拮抗蛋白的原始生物活性。因此，DATAS片段鉴定了在前列腺癌细胞中受到了差异调控和选择性剪接的基因和蛋白。因此，DATAS片段可以定义适合前列腺癌诊断和治疗的靶分子，其中靶分子包含所有或一部分含有DATAS片段序列的基因或RNA,或产生DATAS片段序列的基因或RNA，以及相应的多肽或蛋白及其变异体。本发明的具体目标是分离的核酸(例如DNA、RNA等)分子(由人类前列腺癌细胞表达)，它们选自(i)含有SEQIDNO:1到23任何一个序列的核酸；(ii)(i)的变异体，其中所述变异体具有当进行无缺口比对时，与(i)的序列至少70。/。相同的核酸序列；以及(m)(i)或(ii)的大小为至少20个核苷酸长度的片段。本发明的另一个目标是多肽(抗原)(由人类前列腺癌细胞表达)，其中所述多肽选自(i)由与SEQIDNO:1到23任何一个具有至少卯％序列同一性的核酸序列编码的抗原；(ii)从含有与SEQIDNO:1到23任何一个具有至少90%同一性的序列的蛋白衍生的抗原；以及(Hi)(i)或(ii)的抗原性片段。第一种类型的靶分子是所含有的完整基因或RNA分子的序列包含本申请公开的DATAS片段序列的靶核酸分子。事实上，因为DATAS鉴定了与前列腺肿瘤相关的基因失调，因此产生所述DATAS片段的完整基因或RNA序列可用作治疗性干预或诊断的耙标。同样地，另一种类型的靶分子是所含有的全长蛋白序列包含本申请公开的DATAS片段编码的氨基酸序列的靶多肽分子。另一种类型的靶分子是含有上面公开的基因或RNA的片段的靶核酸分子。事实上，因为DATAS鉴定了在前列腺肿瘤细胞中改变的基因和RNA，这些基因或RNA的部分，包括不含有DATAS片段序列的部分，可以用作治疗性干预或诊断的靶标。这样的部分的例子包括DATAS片段、其部分、所述基因或RNA的选择性外显子或内含子、通过在该RNA中剪接产生的外显子-外显子、外显子-内含子或内含子-内含子连接序列，等等。具体的部分包括编码多肽的细胞外结构域的序列。同样，另一种类型的靶分子是含有本申请中公开的DATAS片段编码的氨基酸序列的蛋白的片段。这样的片段可以包含或不包含DATAS序列，并且可以包含由例如移码、新的外显子-外显子或外显子-内含子连接、产生新的终止密码子等导致的新产生的氨基酸序列。这些靶分子(包括基因、片段、蛋白和它们的变异体)可以用作诊断剂和开发治疗方法的靶标。例如，这些治疗方法可以调节与前列腺肿瘤生存力相关的生物学过程。也可以鉴定在前列腺肿瘤细胞中与诱导凋亡(细胞死亡)相关的药剂。也可以开发其它能够与蛋白或其变异体结合并改变对细胞生长重要的生物学过程的药剂，例如单克隆抗体。或者，抗体可以投送能够抑制细胞生长并导致细胞死亡的毒素。具体来说，本发明提供了在变异体蛋白中表达的、并且是前列腺肿瘤特异性或前列腺特异性的序列。这些序列是通过生物信息学分析鉴定在细胞质膜中的基因的部分，本发明的这些具体序列表达在蛋白的细胞外区域上，以便所述序列可用于制备前列腺肿瘤疫苗，包括预防性和治疗性的、基于细胞的和不基于细胞的疫苗。在此基础上，预期本文公开的与差异表达的序列和相应的变异体蛋白相关的基因，将成为前列腺癌治疗、预防或诊断的适合靶标，例18如用于开发抗体、小分子抑制剂、反义治疗物和核酶。下面将对潜在的疗法进行更详细的描述。这些疗法将包括合成寡核苷酸，所述寡核苷酸的序列相对于在前列腺癌中表现为上调的目标核酸反义取向。适合的治疗性反义寡核苷酸的长度一般在2到几百个核苷酸长度内变化，更通常长度为大约50-70核苷酸或更短。这些反义寡核苷酸可以作为裸核酸或以被保护的形式例如包裹在脂质体中的形式给药。使用脂质体或其它被保护的形式可能是有利的，因为它可以增强体内稳定性，从而便于投送到靶位点，即前列腺肿瘤细胞。此外，目标新基因可用于设计耙定前列腺肿瘤细胞中相应mRNA的裂解的新核酶。同样，这些核酶可以以游离的(裸的)形式、或通过使用增加稳定性和/或定向的投送系统、例如脂质体来给药。此外，本发明包括施用或使用核酸，所述核酸与下面鉴定的新核酸靶杂交的、连接治疗性效应部分例如放射性标记(例如^Y、1311)、细胞毒素、细胞毒性酶等以选择性靶定并杀死表达这些核酸的细胞，即前列腺肿瘤细胞。此外，本发明包括通过靶定以改变的形式在前列腺肿瘤细胞中表达的改变的基因或相应的改变蛋白特别是剪接变异体，来治疗和/或诊断前列腺癌。这些方法将提供对细胞的选择性检测和/或对表达这些改变形式的细胞的根除，从而使对正常细胞的不良作用最小化。还有，本发明包涵不基于核酸的疗法。例如，本发明包涵使用含有本文中鉴定的新抗原所对应的新cDNA之一的DNA。预计这样编码的抗原可用作治疗性或预防性抗肿瘤疫苗。例如，这些抗原被考虑到的具体应用包括将它们与以诱导细胞毒性T淋巴细胞应答的佐剂一起给药。目标新抗原与佐剂组合给药可以产生针对这些抗原的体液免疫应答，从而延迟或防止前列腺癌的发展。本发明的这些实施方案将包括施用一种或多种新的目标前列腺癌抗原，理想的是与佐剂组合，所述佐剂特别是例如PROVAXTM、ISCOM'S、DETOX、、SAF、弗氏佐剂、Alum、Saponin②等。该组合物将以足以治疗或预防有效的量给药，例如50到20，000mg/kg体重、在100到5000mg/kg体重的量级。本发明的其它实施方案将包括通过直接混合、用表达前列腺肿瘤相关抗原的病毒载体转导、直接注射前列腺肿瘤相关抗原、或裸DNA表达构建体，施用荷载有新的抗原性肽的抗原呈递性树突状细胞。在施用前，这些荷载的树突状细胞可以用细菌LPS、TNF-a、CD40配体、单核细胞条件培养基或其它的细胞因子混合物使之成熟。本发明的另一个实施方案将包括制备针对由含有下文公开的核酸序列的新基因编码的抗原的单克隆抗体。这些单克隆抗体可以通过常规方法生产，包括人类单克隆抗体、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、单链抗体例如scFV和结合抗原的抗体片段例如Fab和Fab'片段。制备单克隆抗体的方法对于本
技术领域：
的专业人员来说是熟知的。一般来说，单克隆抗体的制备包括用目标前列腺癌抗原免疫适合的(非同源的)宿主，从其中分离免疫细胞，使用这些免疫细胞分离单克隆抗体，以及筛选与任意这些抗原特异性结合的单克隆抗体。抗体片段可以通过已知的方法制备，例如单克隆抗体的酶法改变。这些单克隆抗体和片段可用于被动抗肿瘤免疫疗法，或可以与治疗效应部分例如放射性标记、细胞毒素、治疗性酶、诱导凋亡的药剂等连接，以便提供定向的细胞毒性，即杀死人类前列腺肿瘤细胞。由于事实上目标基因显然不被许多正常组织显著表达，这应该不会导致明显的不利副作用(对非靶组织的毒性)。在本发明的一个实施方案中，这些抗体或片段将以标记或未标记的形式、单独或与其它治疗药物例如适合前列腺癌治疗的化疗药物如顺铂、氨甲蝶呤、阿霉素等组合进行给药。所施用的组合物通常还包含可药用载体，以及任选的在治疗性应用的抗体组合物中使用的佐剂、稳定剂等。优选目标单克隆抗体以高亲和力与靶抗原结合，例如具有10—6到10'^M量级的结合亲和力(Kd)。如所述，本发明还包括诊断应用，为本文公开的前列腺特异性剪接变异体的表达提供检测。这包括在RNA水平和/或蛋白水平上检测一个或多个这些基因的表达。对于核酸来说，目标基因的表达可以通过已知的核酸检测方法来检测，例如Northern印迹杂交、链置换扩增(SDA)、催化杂交扩增(CHA)、以及其它已知的核酸检测方法。优选，从待检验前列腺癌的对象获得的前列腺细胞中，通过使用对应于本申请公开的新的同种型的引物进行PCR，制备cDNA文库。可以根据是否获得PCR产物以及表达的水平，来确定前列腺癌是否存在。可以对这些PCR产物的表达水平进行定量，以确定具体的前列腺癌患者的预后(因为PCR产物的表达水平通常将随着疾病进展而显著增加或降低)。这可以提供监测前列腺癌患者状态的方法。或者，待检验前列腺癌的对象的状态，也可以通过用与本文公开的新的前列腺肿瘤抗原特异性结合的抗体或片段测试生物流体，例如血液、尿液、淋巴液等，来进行评估。使用抗体检测抗原表达的方法是众所周知的，包括ELISA、竞争性结合分析等。一般来说，这样的分析使用与靶抗原特异性结合的抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段直接或间接地结合提供检测的标记物，例如指示酶、放射性标记、荧光团或顺磁颗粒。被测试为前列腺细胞上存在的抗原增加为阳性的患者，被诊断为患有前列腺癌或处于发展前列腺癌的风险增加。此外，抗原的表达水平可用于确定患者的状态，即疾病进展到何种程度(前列腺癌的阶段)。如上所述，本发明提供了编码与人类前列腺癌相关的抗原的新剪接变异体。本发明还包含其变异体。本文使用的"变异体"，是指当这些DNA序列与编码目标DNA或其大小至少为大约50个核苷酸的片段的核酸序列比较时，与其至少大约75%相同、更有选至少大约85%相同、最优选至少90%相同，并更加优选至少大约95-99%相同的序列。这包括目标基因的等位基因变异体和剪接变异体。本发明还包涵在如下文描述的高度、中度或低度严紧条件下，与目标剪接变异体杂交的核酸序列。此外，本发明提供了引物对，所述引物对在从所需细胞源、典型为人类前列腺细胞或组织样品获得的mRNA文库中，导致编码目标新基因或其部分的DNA扩增。通常，这些引物的长度在12到IOO个核苷酸的量级，将被构建成使得它们提供靶基因的全部或大部分的扩增。此外，本发明包含由目标DNA或其片段编码的、结合或引发特异性针对全长抗原的抗体的抗原。通常，这样的片段长度为至少IO个氨基酸，更通常长度为至少25个氨基酸。如所述，目标DNA片段在大多数测试的前列腺肿瘤样品中表达。本发明还考虑到了表达这种基因的其它癌症的鉴定，以及使用它们检测和治疗这样的癌症。例如，目标DNA片段或其变异体可以在其它癌22症上表达，例如乳腺、卵巢、胰腺、肺或前列腺癌。本质上说，本发明包含检测其中目标新基因或其变异体的表达与癌症或癌症的可能性增加相关的任何癌症。为了便于掌握(under-study)本发明，提供了下面的定义。"分离的肿瘤抗原或肿瘤蛋白"是指不处在其正常细胞环境中的任何蛋白。这包括例如含有由下面公开的基因编码的重组蛋白的组合物、含有这样的纯化蛋白的药物组合物、含有这样的纯化蛋白的诊断组合物以及含有这样的蛋白的分离蛋白组合物。在优选实施方案中，本发明的分离的前列腺肿瘤蛋白包含基本上纯的蛋白，因为它基本上不含其它蛋白，优选至少为卯％纯，含有本文包含的氨基酸序列或具有基本上同样序列的天然同源物或突变体。在例如表达编码本发明突变蛋白的基因的肿瘤细胞中，可能发现天然存在的突变体。"天然肿瘤抗原或肿瘤蛋白"是指蛋白，其是具有下文包含的氨基酸序列的蛋白的非人类灵长类同源物。"分离的前列腺肿瘤基因或核酸序列"是指编码本发明的肿瘤抗原的核酸分子，其没有处于其正常的人类细胞环境中，例如没有包含在人类或非人类灵长类染色体DNA中。这包括例如含有本发明的基因的载体，含有本发明的基因的探针，与可检测的部分例如荧光或放射性标记直接或间接结合的核酸序列，或含有编码本发明的基因的核酸分子、并在其5'或3'末端融合了不同的DNA例如启动子或编码可检测标志或效应部分的DNA的DNA融合物。此外还包括具有基本上同样序列的天然同源物或突变体。简并的天然存在的同源物编码含有核苷酸差异但不改变相应的氨基酸序列的相同蛋白。天然存在的突变体可以在肿瘤细胞中发现，其中这样的核苷酸差异可能产生突变的肿瘤抗原。还包涵含有保守取代的天然存在的同源物。"前列腺肿瘤抗原或肿瘤蛋白的变异体"是指蛋白，其具有的氨基酸序列与相应的天然肿瘤抗原具有至少90%序列同一性、更优选至少91%序列同一性、更优选至少92%序列同一性、更优选至少93%序列同一性、更优选至少94%序列同一性、更优选至少95%序列同一性、更优选至少96%序列同一性、更优选至少97%序列同一性、更优选至少98%序列同一性、最优选至少99%序列同一性，其中序列同一性在下面定义。优选该变异体具有与天然蛋白有至少一种共同的生物学性质。"前列腺肿瘤基因或核酸分子或序列的变异体"是指核酸序列，其与相应的天然人类核酸序列具有至少90%序列同一性、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%的序列同一性、并最优选至少99%的序列同一性，其中"序列同一性"在下面定义。"编码前列腺抗原的核酸分子或序列的片段"是指对应于天然人类基因的一部分的核酸序列，其中所述部分长度为至少大约50或100个核苷酸，更优选长度为至少150个核苷酸。"前列腺肿瘤抗原的抗原性片段"是指对应于前列腺蛋白或其变异体或同源物的片段的多肽，该多肽当自身使用或与免疫原性载体连接使用时，引发与所述蛋白特异性结合的抗体。通常，这样的抗原性片段长度为至少8-15个氨基酸，并可以长得多。序列同一性或百分同一性是指在两个被称为人类蛋白A或蛋白B或者基因A或基因B的序列之间，当使用Lasergene生物计算软件(DNASTAR,INC，Madison,WI)中的多序列比对的Clustal方法[Higgins等，Cabios8:189-191C1992)]、或从GenecticsComputerGroup(GCGWisconsin软件包，Accdrys,SanDiego,CA)获得的比对程序进行比对这两个序列时，其共有的相同残基的百分率。在该方法中，以渐进性的方式进行多重比对，其中使用从一系列两两比对计算的相似性分值汇集起越来越大的比对组。最优序列比对通过发现最大的比对分值而获得，该比对分值是比对中不同的残基之间所有分值的平均值，从代表了在给定的演化区间(evolutionaryinterval)内两个相关蛋白中发生的给定氨基酸变化的概率的残基权重表确定。比对中对开口(叩ening)和延长性缺口(lengtheninggaps)的罚分对分值产生贡献。该程序使用的缺省参数如下多重比对的间隙罚分=10;多重比对的间隙长度罚分=10;两两比对中的k-元组值—；两两比对中的间隙罚分=3;两两比对中的窗口值=5;两两比对中保存的对角线1=5。用于比对程序的残基权重表是PAM250[Dayhoffet等，《蛋白序列和结构图集》(AtlasofProteinSequenceandStructure)Dayhoff主编，NDRF,Washington,Vol.5，suppl.3，p.345,(1978)]。保守百分数从上面的比对中通过将一致的残基的百分数加上其中两个残基代表保守取代(被定义为在PAM250残基权重表中具有大于或等于0.3的对数优势(logodds)值)的位置的百分数来计算。当确定保守百分数时，在用非人类基因A或基因B例如小鼠基因A或基因B确定保守百分数时，保守性是对于人类基因A或基因B来说的。满足这种要求的保守的氨基酸变化包括R-K;E-D，Y-F，L-M;V-I，Q-H。多肽片段本发明提供了公开的蛋白的多肽片段。本发明的多肽片段可以包含蛋白或其类似物的至少8个、更优选至少25个、更优选至少50个氨基酸残基。更具体来说，这样的片段含有相应基因编码的多肽的至少75、100、125、150、175、200、225、250、275个残基。更优选蛋白片段含有天然蛋白的大部分，例如天然蛋白的大约100个连续的残基。生物活性变异体本发明还包涵下面公开的新前列腺蛋白的突变体，它们包含的氨基酸序列与天然蛋白至少80%、更优选90%、更加优选95-99%相似。关于确定哪个氨基酸残基可以被取代、插入或缺失而不丧失生物学或免疫学活性的准则，可以使用本
技术领域：
熟知的计算机程序来发现，例如DNASTAR或来自GenecticsComputerGroup(GCG)的软件。优选，蛋白变异体中氨基酸的变化是保守氨基酸变化，即相似的带电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守的氨基酸变化涉及侧链相关的氨基酸类型之一的取代。天然存在的氨基酸一般被分成4类酸性(天冬氨酸，谷氨酸)，碱性(赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，非极性(丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，和不带电荷的极性(甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被联合归类为芳香族氨基酸。被称为突变蛋白(mutein)的突变体亚类，是一组其中中性氨基酸例如丝氨酸取代了不参与二硫键的半胱氨酸残基的多肽。这些突变体比天然的分泌蛋白在更宽的温度范围内可以是稳定的。参见Mark等的美国专利4,959,314。可以合理地预期，分别用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸进行氨基酸的相似取代，将不会对产生的分泌蛋白或多肽变异体的生物学性质具有显著的影响。蛋白变异体包括糖基化的形式、与其它分子的聚集结合物、与无关化学部分的共价结合物。此外，蛋白变异体还包括等位基因变异体、种变异体和突变蛋白。不影响基因差异表达的区域的截短或缺失也是变异体。共价变异体可以通过将官能团连接到在氨基酸链中或者N-或C-末端残基上发现的基团上来制备，这是本领域已知的。在本
技术领域：
中应该认识到，本发明的前列腺蛋白的某些氨基酸序列可以改变，而不显著影响蛋白的结构或功能。在考虑这些序列差异时，应该记得蛋白上有决定活性的关键区域。一般来说，可以取代形成三级结构的残基，只要使用执行类似功能的残基就行。在其它情况下，如果变化发生在蛋白的非关键区域，残基的类型可以完全不重要。氨基酸的取代也可以改变与细胞表面受体结合的选择性。Ostade等，Nature361:266-268(1993)描述了某些突变导致TNF-a仅仅与两种已知类型的TNF受体中的一种选择性结合。因此，本发明的多肽可以包含一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，来自天然突变或人工操作。本发明还包括下面公开的前列腺蛋白的变异体，其显示出可比较的表达模式或包含抗原性区域。这样的突变体包括缺失、插入、倒置、重复和点取代。关于哪个氨基酸变化可能在表现型上沉默的准则，可以在Bowie，J.U.等的"破译蛋白序列中的信息对氨基酸取代的耐受"("DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutions,"Science247:1306-1310(1990))中发现。特别关注的是用另一个带电荷的氨基酸和中性或带负电荷的氨基酸取代带电荷的氨基酸。后一种例子产生的正电荷减少的蛋白，以改进所公开的蛋白的性质。防止聚集是非常需要的。蛋白的聚集不仅导致活性的丧失，而且在制备药物制剂时也是成问题的，因为它们可能是免疫原性的。(Pinckard等，Clin.Exp.Immunol.2:331-340(1967);Robbins等，Diabetes36:838-845(1987);Cleland等，Crit.Rev.TherapeuticDrugCarrierSystems10:307-377(1993))。本发明的多肽中对于功能来说必需的氨基酸可以通过本
技术领域：
已知的方法来鉴定，例如位点定向诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。后一种方法在分子中每个残基处导入单个丙氨酸突变。然后测试获得的突变分子的生物学活性，27例如与天然的或合成的结合配偶体的结合。对于配体-受体结合关键的位点也可以通过结构分析来确定，例如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith等，JMol.Biol.224:899-卯4(1992)和deVos等，Science255:306-312(1992)).如所述，优选改变是轻微的，例如对蛋白的折叠或活性没有显著影响的保守氨基酸取代。当然，专业技术人员要进行的氨基酸取代的数量依赖于许多因素，包括上述的那些。一般来说，对于任何给定的多肽来说，取代的数量不超过50、40、30、25、20、15、10、5或3个。融合蛋白也可以构建含有目标前列腺肿瘤抗原的蛋白或多肽片段的融合蛋白。融合蛋白可用于产生针对氨基酸序列的抗体，并可用于各种不同的分析系统中。例如，融合蛋白可用于鉴定与本发明的蛋白相互作用或干扰其生物学功能的蛋白。物理学方法例如蛋白亲和层析，或基于文库的蛋白-蛋白相互作用分析例如酵母双杂交或噬菌体展示系统，也可用于此目的。这些方法在本
技术领域：
中是众所周知的，也可用于药物筛查。含有本发明的蛋白或其片段的信号序列和/或跨膜结构域的融合蛋白，可用于将其它蛋白结构域靶向正常情况下不能发现这些结构域的细胞位点，例如与细胞膜结合或细胞外分泌。融合蛋白含有两个蛋白区段，它们通过肽键融合在一起。如所述，这些片段的大小可以从大约8个氨基酸直到蛋白的全长。第二个蛋白区段可以是全长蛋白或多肽片段。在融合蛋白构建中常用的蛋白包括B-半乳糖苷酶、fi-葡萄糖醛酸酶、绿色荧光蛋白(GFP)、自身荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、荧光素酶、辣根过氧化物酶(HRP)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)。此外，表位标签可以用于融合蛋白构建中，包括组氨酸(His)标签、FLAG标签、流感红细胞凝集素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。其它的融合构建可以包括麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、LexaDNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4DNA结合结构域融合物和单纯性疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。这些融合物可以通过例如将两个蛋白区段共价连接或通过分子生物学
技术领域：
中的标准方法来制备。重组DNA方法可用于制备融合蛋白，例如象本
技术领域：
中已知的那样，制备DNA构建体，所述构建体含有在适合的阅读框中编码本发明的可能抗原或其片段的编码序列以及编码第二个蛋白区段的核苷酸，并将该DNA构建体在宿主细胞中表达。许多用于构建融合蛋白的试剂盒可以从为研究实验室提供实验工具的公司获得，包括例如PromegaCorporation(Madison,WI)、Stratagene(LaJolla，CA)、Clontech(MountainView,CA)、SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA)、MBLInternationalCorporation(MIC;Watertown,MA)以及QuantumBiotechnologies(Montreal,Canada;1-888-DNA-KITS)。本发明的蛋白、融合蛋白或多肽可以通过重组DNA方法生产。为了生产重组蛋白、融合蛋白或多肽，可以使用本
技术领域：
已知的表达系统将编码蛋白的序列在原核或真核宿主细胞中表达。这些表达系统包括细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。然后可以使用本
技术领域：
已知的纯化方法，将获得的表达蛋白从培养基或培养的细胞的提取物中纯化出来。例如，对于完全分泌到培养基中的蛋白来说，可以将无细胞培养基用乙酸钠稀释，并与阳离子交换树脂接触，然后进行疏水相互作用层析。使用该方法，所需的蛋白或多肽通常纯度高于95%。可以使用例如任何上面列出的技术来进行进一步纯化。为了获得有功能的蛋白，可能需要在酵母或细菌中度产生的蛋白进行修饰，例如对适当的位点进行磷酸化或糖基化。这样的共价连接可以使用已知的化学或酶学方法来进行。本发明的蛋白或多肽也可以以便于纯化的形式在培养的宿主细胞中表达。例如，蛋白或多肽可以表达成含有例如麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶或硫氧还蛋白的融合蛋白，并使用可商购的试剂盒纯化。用于表达和纯化这些融合蛋白的试剂盒可以从公司得到，例如NewEnglandBioLabs、Pharmacia禾QInvitrogen。蛋白、融合蛋白或多肽也可以用表位挂上标签，例如"Flag"表位(Kodak)，并使用与该表位特异性结合的抗体进行纯化。通过本文公开的序列鉴定的蛋白变异体的编码序列也可用于构建转基因动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、奶牛、山羊、猪或绵羊。然后雌性转基因动物可以在它们的奶中产生本发明的蛋白、多肽或融合蛋白。构建这类动物的方法在本
技术领域：
中是已知的，并被广泛使用。或者，合成化学的方法例如固相肽合成，可用于合成分泌蛋白或多肽。生产肽、类似物或衍生物的通用方法被概述在B.Weinstein(1983)主编的《氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学一一最新进展调查》(ChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins--ASurveyofRecentDevelopments)中。可以用D-氨基酸取代正常的L-型立体异构体，以增加分子的半衰期。通常，同源的多核苷酸序列可以通过本
技术领域：
已知的在严紧条件下进行杂交来证实。例如，使用下列清洗条件2xSSC(0.3MNaCl，0.03M柠檬酸钠，pH7.0)，0.1%SDS，室温两次，每次30分钟；然后2xSSC，0.1%SDS，50。C一次，30分钟；然后2xSSC，室温两次，每次10分钟，可以鉴定含有最多大约25-30%碱基对错配的同源序列。更优选，同源的核酸链含有15-25%的碱基对错配，更加优选5-15%的碱基对错配。30本发明还提供了可以在例如杂交方案如Northern或Southern印迹或原位杂交中用来检测互补核苷酸序列的多核苷酸探针。本发明的多核苷酸探针含有本文提供的核酸序列的至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、30或40个或更多个连续的核苷酸。本发明的多核苷酸探针可以含有可检测标记物，例如放射性同位素、荧光、酶或化学发光标记物。还提供了对应于本文公开的cDNA序列的分离基因。可以使用标准的分子生物学方法，利用本文提供的cDNA序列分离相应基因。这些方法包括从本文公开的核苷酸序列制备探针或引物，用于从哺乳动物包括人类的基因组文库或其它人类基因组DNA源鉴定或扩增基因。本发明的多核苷酸分子也可以用作引物，使用多核苷酸扩增方法获得多核苷酸的其他拷贝。多核苷酸分子可以在载体和细胞系中使用本
技术领域：
已知的技术来增殖。多核苷酸分子可以是线性或环状分子。它们可以在自主复制的分子或没有复制序列的分子上。它们可以被自己的或本
技术领域：
已知的其它调控序列调控。多核苷酸构建体含有通过本文公开的序列鉴定的基因变异体编码序列的多核苷酸分子，可用于多核苷酸构建体、例如DNA或RNA构建体中。本发明的多核苷酸分子可用在例如表达构建体中，以在宿主细胞中表达蛋白、变异体、融合蛋白或单链抗体的全部或一部分。表达构建体含有在选定的宿主细胞中有功能的启动子。专业技术人员可以从本
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中已知和使用的大量细胞类型特异性启动子中容易地选出适合的启动子。表达构建体也可以含有在宿主细胞中有功能的转录终止子。表达构建体含有编码所需蛋白的全部或一部分的多核苷酸区段。多核苷酸区段位于启动子的下游。多核苷酸区段的转录从启动子处开始。表达构建体可以是线性或环状的，如果需要，可以含有用于自主复制的序列。还包括了含有目标新基因的启动子和UTR序列的多核苷酸分子，它们与相关的蛋白编码序列和/或其它编码可检测或选择性标志的序列可操作地连接。这样的基于启动子和/或UTR的构建体可用于研究蛋白表达的转录和翻译调控，以及用于鉴定激活和/或抑制性调控蛋白。宿主细胞表达构建体可以被导入宿主细胞。含有表达构建体的宿主细胞可以是任何适合的原核或真核细胞。细菌中的表达系统包括在Chang等，Nature275:615(1978);Goeddel等，Nature281:544(1979);Goeddel等，NucleicAcidsRes.8:4057(1980);EP36,776;U.S.4,551,433;deBoer等Proc.Natl.AcadSci.USA80:21-25(1983);和Siebenlist等，Cell20:269(1980)中描述的那些。酵母中的表达系统包括在Hinnnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1929(1978);Ito等，JBacteriol153:163(1983);Kurtz等，Mol.Cell.Biol.6:142(1986);Kunze等，JBasicMicrobiol.25:141(1985);Gleeson等，J.Gen.Microbiol.132:3459(1986);Roggenkamp等，Mol.Gen.Genet.202:302(1986);Das等，JBacteriol.158:1165(1984);DeLouvencourt等，JBacteriol.154:737(1983);VandenBerg等，Bio/Technology8:135(1990);Kunze等，J.BasicMicrobiol.25:141(1985);Cregg等，Mol.Cell.Biol.5:3376(1985);U.S.4,837,148;U.S.4,929,555;Beach和Nurse,Nature300:706(1981);Davidow等，Curr.Genet.10:380(1985);Gaillardin等，Curr.Genet.10:49(1985);Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.112:284-289(1983);Tilburn等，Gene26:205-22(1983);Yelton等，Proc.Natl.Acad,Sci.USA81:1470-1474(1984);Kelly和Hynes,EMBOJ.4:475479(1985);EP244,234;以及WO91/00357中描述的那些。在昆虫中表达异源基因可以按照下面文献中的描述来实现U.S.4,745,051;W.Doerfler主编的《杆状病毒的分子生物学》(THEMOLECULARBIOLOGYOFBACULOVIRUSES)中(1986)，Friesen等的"杆状病毒基因表达的调控"(TheRegulationofBacuiovirusGeneExpression);EP127,839;EP155,476;Vlak等，J.Gen.Virol.69:765-776(1988);Miller等，Ann.Rev.Microbiol.42:177(1988);Carbonell等，Gene73:409(1988);Maeda等，Nature315:592-594(1985);Lebacq-Verheyden等，Mol.CellBiol.8:3129(1988);Smith等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:8404(1985);Miyajima等，Gene58:273(1987);和Martin等，DNA7:99(1988)。大量的杆状病毒株和变异体以及来自宿主的相应的允许昆虫宿主细胞被描述在Luckow等，Bio/Technology(1988)6:47-55;Miller等，GENETICENGINEERING(《基因工程》)(Setlow,J.K.等主编)，第8巻277-279页(PlenumPublishing,1986);和Maeda等Nature,315:592-594(1985)中。哺乳动物表达可以按照Dijkema等，EMBOJ.4:761(1985);Gormanetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:6777(1982b);Boshart等，Cell41:521(1985);和U.S.4,399,216中的描述来实现。哺乳动物表达的其它特点可以按照Ham和Wallace,MethEnz.58:44(1979)中的描述来促成。可以使用任何本
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已知的技术将表达构建体导入宿主细胞。这些技术包括转铁蛋白-聚阳离子介导的DNA转移、用裸露的或包裹的核酸转染、脂质体介导的细胞融合、DNA包被的乳胶珠的细胞内转运、原生质体融合、病毒感染、电穿孔、"基因枪"和磷酸钙介导的转染。本发明还可以包括杂合体及其修饰的形式，包括融合蛋白、片段和杂合体以及修饰的形式，其中某些氨基酸已经被缺失或取代、修饰，例如一个或多个氨基酸已经被改变成修饰的氨基酸或不常见氨基酸。基本上同源的意义中还包括任何人类或非人类灵长动物的蛋白，所述蛋白可以利用与针对本文描述的基因编码的蛋白抗体的交叉反应性而分离，或其编码核苷酸序列，包括基因组DNA、mRNA或cDNA，可以通过与本文的基因或其片段的基因组或亚基因组核苷酸序列或cDNA的互补序列进行杂交来分离。本
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的专业人员也将认识到，简并的DNA序列可以编码本发明的肿瘤蛋白，目标基因的等位基因变异体也旨在包含在本发明内。优选通过重组DNA技术制备本发明的前列腺蛋白。"纯的形式"或"纯化形式"或"基本上纯化的形式"是指蛋白组合物基本上不含不是所需蛋白的其它蛋白。本发明还包括含有治疗患病患者的有效量本发明蛋白的药物组合物，以及包括施用治疗有效量的蛋白的方法。这些组合物和方法可用于治疗与目标蛋白有关的癌症，例如前列腺癌。本
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的专业人员可以容易地使用本
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已知的各种不同的分析方法，以确定蛋白在具体的细胞类型中是否可用于促进存活或发挥功能。抗前列腺抗原抗体如所述，本发明包括制备和使用用作诊断和治疗药剂的抗前列腺抗原抗体及片段。这些抗体可以是多克隆或单克隆的。多克隆抗体可以通过注射抗原免疫兔或其它动物、然后以适当的时间间隔进行加强来制备。从动物取血，并通常以ELISA或基于阻断相应基因作用的能力的生物分析方法，针对纯化的蛋白进行血清分析。当使用禽类物种例如鸡、火鸡等时，可以从蛋黄分离抗体。单克隆抗体可以按照Milstein和Kohler的方法，通过将来自免疫小鼠的脾细胞与连续复制的肿瘤细胞例如骨髓瘤或淋巴瘤细胞进行融合来制备。[Milstein和Kohler，Nature256:495-497(1975);Gulfre和Milstein,"酶学方法:免疫化学技术，，(MethodsinEnzymology:ImmunochemicalTechniques)73:1-46,Langone禾卩Banatis主编，AcademicPress,(1981)，在此引为参考]。然34后通过有限稀释方法对这样形成的杂交瘤细胞进行克隆，通过ELISA、RIA或生物分析方法分析上清液中抗体的产生。抗体识别和特异性结合靶蛋白的独特能力，提供了治疗蛋白过度表达的方法。因此，本发明的另一方面，提供了通过用针对蛋白的特异性抗体治疗患者而防止或治疗与蛋白的过表达有关的疾病的方法。蛋白的特异性抗体，多克隆或单克隆的，可以通过上面讨论的本
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中已知的任何适合的方法来生产。例如，通过重组方法，优选在真核细胞中，可以通过杂交瘤技术来生产鼠或人的单克隆抗体，或可选地，可以给动物施用蛋白或其免疫活性片段、或抗独特型抗体或其片段，以引发能够识别和结合蛋白的抗体产生。适合的抗体可以来自任何抗体类型，包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，或在禽类物种的情况下，IgY，以及来自任何抗体亚类。分离蛋白的可用性，使得可以通过常规应用高通量筛选方法(HTS)，来鉴定抑制蛋白与结合配偶体结合的小分子和低分子量化合物。HTS方法通常是指允许对前导化合物的治疗潜力进行快速分析的技术。HTS技术利用机器人操作试验材料、检测阳性信号和解释数据。通过掺入放射活性或通过依靠吸收值、荧光或发光作为读出值的光学分析方法，可以鉴定前导化合物[Gonzalez,J.E.等，Curr.Opin.Biotech.9:624-631(1998)]。可以适合用于高通量筛选例如通过与蛋白竞争结合配体而抑制蛋白与其配体的相互作用的化合物的模型系统是已有的。Sarubbi等，Ana1.Biochem.237:70-75(1996)描述了无细胞的、非同位素的分析方法，用于发现与天然配体竞争与IL-1受体活性位点的结合的分子。Martens,C.等，Anal.Biochem.273:20-31(1999)描述了基于遗传颗粒的非放射性方法，其中标记的配体与其固定在颗粒上的受体结合；在存在与标记配体竞争受体结合的分子的情况下，颗粒上的标记减少了。抗体制备(i)原料与方法免疫球蛋白(Ig)及其某些变异体是已知的，许多已经在重组细胞培养中制备。例如参见美国专利No.4,745,055;EP256,654;EP120,694;EP125,023;EP255,694;EP266,663;WO3088/03559;Faulkner等，Nature,298:286(1982);Morrison,J.Immun"123:793(1979);Koehler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:2197(1980);Raso等，CancerRes.,41:2073(1981);Morrison等，Ann.Rev.Immunol.,2:239(1984);Morrison,Science,229:1202(1985);和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851(1984)。重配的免疫球蛋白链也是已知的。参见例如美国专利No.4,444,878;WO88/03565;和EP68,763,在此引为参考。本发明的嵌合体中的免疫球蛋白部分可以从IgG-l、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得，但是优选从IgG-l或IgG-3获得。(ii)多克隆抗体针对目标前列腺抗原的多克隆抗体一般在多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射抗原和佐剂的动物中产生。通过使用双功能的或衍生化试剂例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基连接)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛或琥珀酸酐，可以用于将含有靶氨基酸序列的抗原或片段与在被免疫的物种中具有免疫原性的蛋白、例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂相连接。通过将大约lmg或l.吗肽或结合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积弗氏完全佐剂混合，并将溶液在多个位点进行皮内注射，从而将动物针对多肽或片段、免疫原性结合物或衍生物进行接种。一个月后，用1/5或1/10原始量的弗氏完全佐剂中的肽或结合物通过在多个位点进行皮下注射，对动物进行加强免疫。7到14天后，动物取血，分析36血清中针对抗原或其片段的抗体滴度。对动物进行加强免疫直到滴度达到平台。优选，用同样的多肽或其片段但与不同的蛋白和/或通过不同的交联试剂结合的结合物对动物进行加强。结合物也可以在重组细胞培养物中作为蛋白融合物而制备。此外，聚集剂例如明矾适合用于增强免疫应答。(iii)单克隆抗体单克隆抗体从基本上同源的抗体种群获得，即种群包含的个体抗体除了少量存在的可能自然存在的突变之外，都是相同的。因此，修饰语"单克隆的"表明抗体不是不同抗体的混合物这种特征。例如，用于实践本发明的单克隆抗体可以使用Kohler和Milstein,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA方法(Cabilly等，同上)来制备。在杂交瘤方法中，按照本文上面的描述对小鼠或其它适合的宿主动物例如仓鼠进行免疫，以引发产生或能够产生与免疫所用的抗原或其片段特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞也可以被体外免疫。然后使用适合的融合剂例如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，《单克隆抗体原理与实践》(MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice)，pp.59-103[Academict\_____ir\oa，人这样制备的杂交瘤细胞在适合的培养基中接种和生长，该培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或生存的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺少酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),用于杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷的细胞生长。优选的骨髓瘤细胞是有效融合、支持选出的抗体产生细胞的稳定地高水平生产抗体、并且对培养基例如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，例如可以从Salk研究所细胞配送中心(theSalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生系，以及可以从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Md.USA)获得的SP-2细胞。分析了生长杂交瘤细胞的培养基针对前列腺抗原产生的单克隆抗/丄/l\、山、Si、丄h,r^.、".VP^~、S1、_L/丄iLl/丄八/、丄广/t^.I丄—上LA.LA,i"i^/V丄「Znt*人1伞。1儿逃，旭3i児没讥征现旭;ai今外^甘ar机i列卯力乂刑兄汉or忻、ki/w或酶联免疫吸附分析(ELISA)，来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可以通过例如Munson禾BPollard,Anal.Biochem"107:220(1980)中的Scatchard分析来测定。在鉴定了产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释方法对克隆进行亚克隆和通过标准方法生长(Goding，同上)。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以在动物中作为腹水肿瘤进行体内生长。通过常规的免疫球蛋白纯化程序例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水液或血清中适当地分离出来。编码本发明的单克隆抗体的DNA易使用常规程序分离和测序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞可用作这些DNA的优选来源。一旦分离后，就可以将DNA置于表达载体中，然后转染到宿主细胞例如原本不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中重组表达的综述文献包括Skerra等，C亂OpinioninImmunol"5:256-262(1993)禾口Pluckthun,Immunol.Revs"130:151-188(1992)。DNA也可以被修饰，例如，通过用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源的鼠序歹U(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851[1984])，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。通过这种方式，制备了"嵌合的"或"杂合的"抗体，它们具有本文的抗前列腺抗原单克隆抗体的结合特异性。通常，这些非免疫球蛋白多肽取代了本发明的抗体的恒定结构域，或它们取代了本发明的抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，从而产生嵌合的二价抗体，所述抗体包含对本发明的前列腺抗原具有特异性的一个抗原结合位点，和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。嵌合的或杂合的抗体也可以使用合成蛋白化学中已知的方法体外制备，包括涉及交联剂的方法。例如，可以使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适合此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚胺甲酯。(iv)人源化抗体将非人类抗体人源化的方法在本
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中是众所周知的。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人类来源引入的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为"输入"残基，一般是从"输入"可变结构域获取的。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法(Jones等，Nature321,522-525[1986];Riechmann等，Nature332,323-327[1988];Verhoeyen等，Science239,1534-1536[1988])，通过用啮齿动物CDR或CDR序列代替人类抗体的相应序列来进行。因此，这些"人源化"抗体是嵌合抗体(Cabilly等，同上)，其中显著小于完整的人类可变结构域的部分已经被来自非人类物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人类抗体，其中某些CDR残基以及可能某些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。选择用于制备人源化抗体的人类轻链和重链可变结构域，对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的"最佳配合"方法，针对已知人类可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后将与啮齿动物的序列最接近的人类序列采纳为人源化抗体的人类框架(FR)(Sims等，J.Immunol"151:2296[1993];Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.，196:901[1987])。另一种方法使用了从特定亚类的轻链或重链的所有人类抗体共有序列衍生的特定的框架。同样的框架可用于几个不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285[1992];Presta等，J.Immnol.,151:2623[1993])。另一个重要之处是，抗体的人源化应保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了达到这个目的，按照优选的方法，人源化抗体使用亲本和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和各种不同的概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型对于本
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的专业人员来说是通常可获得的和熟悉的。说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是已有的。对这些显示的观察，允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能起到的作用进行分析，即分析残基影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力。通过这种方法，可以从共有和输入序列中选择FR残基并进行结合，以便获得所需的抗体特性、例如对靶抗原的亲和力增加。一般来说，CDR残基直接并且最实质性地参与影响抗原结合。(v)人类抗体人类单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备。生产人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系，已经描述在例如Kozbor，J.Immunol.133,3001(1984);Brodeur等，《单克隆抗体生产技术和应用》(MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987));以及Boerner等，J.Immunol.,147:86-95C1991)中。现在可以产生在不存在内源免疫球蛋白生产的情况下，在免疫后能够产生人类抗体所有组成成分的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了在嵌合的和种系突变的小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到该种系突变小鼠中，在抗原激惹后将导致人类抗体的产生。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits等，Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等，YearinImmuno.，7:33(1993)。或者，噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature,348:552-553[1990])可用于从未被免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因全部组成成分体外产生人类抗体和抗体片段。根据该技术，抗体V结构域基因被框内克隆到丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体粒子的表面上。因为丝状粒子含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，因此根据抗体的功能性质进行的选择也导致对显示出那些性质的抗体的编码基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的某些性质。噬菌体展示可以以各种不同的形式进行；对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Curr.Op.Struct.Biol.,3:564-571(1993)。几种来源的V基因区段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature,352:624-628(1991)从免疫小鼠的脾脏得到的V基因的随机组合小文库中，分离到多样化的抗噁唑酮抗体阵列。基本上按照Marks等，J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Griffith等，EMBOJ.，12:725-734(1993)描述的技术，可以从未被免疫的人类供体构建V基因的全部组成成分，并且可以分离到针对抗原(包括自体抗原)的各种阵列的抗体。在天然免疫应答中，抗体基因以高速度积累突变(体细胞高变)。某些导入的变化将赋予较高的亲和力，展示了高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞在随后的抗原激惹过程中被优先复制和分化。这种自然过程可以通过采用被称为"链改组"的技术进行模拟(Marks等，Bio/Technology,10:779-783[1992])。在该方法中，通过噬菌体展示获得的"初级"人类抗体的亲和力，可以通过用从未被免疫的供体获得的V结构域基因天然存在的变异体的全部组成成分相继取代重链和轻链V区来改进。这种技术允许产生亲和力在nM范围的抗体和抗体片段。制备非常大的噬菌体抗体全部组成成分的策略已经被Waterhouse等，Nucl.AcidsRes"21:2265-2266(1993)描述。基因改组也可用于从啮齿动物抗体衍生人类抗体，其中人类抗体与初始的啮齿动物抗体具有相似的亲和力和特异性。按照这种也被称为"表位印记"的方法，通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因被人类V结构域基因的全部组成成分取代，产生了啮齿动物-人类嵌合体。对抗原的筛选导致能够恢复功能性抗原结合位点的人类可变区的分离，即表位控制(印记)配偶体的选择。当为了替换剩余的啮齿动物V结构域而重复该过程时，获得了人类抗体(参见PCTWO93/06213，1993年4月1日公布)。与传统的通过CDR移植进行啮齿动物抗体人源化不同，该技术提供了完全人类的抗体，没有啮齿动物来源的框架或CDR残基。(vi)双特异性抗体双特异性抗体是单克隆的、优选为人类或人源化的抗体，具有对至少两种不同抗原的结合特异性。在本发明的情况下，结合特异性之一将针对本发明的前列腺抗原。制备双特异性抗体的方法在本
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中是已知的。42传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello,Nature,305:537-539[1983])。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(四源杂交瘤，quadromas)产生了IO种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和层析步骤进行，是相当繁琐的，并且产物收率低。类似的方法被公开在1993年5月13日公布的WO93/08829，以及Traunecker等，EMBOJ.,10:3655-3659(1991)中。根据一种不同的并且更优选的方法，具有所需结合特异性的抗体-可变结构域(抗体-抗原结合位点)被融合到免疫球蛋白恒定结构域序列中。优选与免疫球蛋白重链恒定结构域进行融合，包括至少部分铰链、CH2和CH3区。优选使含有轻链结合所必需的位点的第一个重链恒定区(CH1)存在于至少一个融合物中。编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要的话，免疫球蛋白轻链的DNA被插入到不同的表达载体中，并共转染到适合的宿主生物体中。这在构建中使用比例不相等的三种多肽链提供最优产出时，为调整实施方案中三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，当至少两种多肽链等比例生产将导致高产量或当比例不特别重要时，可以将两种或所有三种多肽链的编码序列插入到一个表达载体中。在本方法的优选实施方案中，双特异性抗体由在一个臂上的具有第一种结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和在另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)构成。已经发现，这种不对称的结构便于所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分离，因为在仅仅半个双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了方便的分离途径。对于产生双特异性抗体的进一步详细情况，参见例如Suresh等，MethodsinEnzymology,121:210(1986)。(vii)异源结合抗体异源结合抗体也包含在本发明的范围内。异源结合抗体由两个共价连接的抗体组成。这种抗体已经被提出例如用于将免疫系统的细胞靶定有害细胞(美国专利No.4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO91/00360;WO92/00373;和EP03089)。异源结合抗体可以使用任何便利的交联方法来制备。适合的交联剂以及大量的交联技术在本
技术领域：
中是众所周知的，并公开在美国专利No.4,676,980中。本发明的多核苷酸和多肽可用于基因投送介质中。基因投送介质可以是病毒或非病毒来源的(总的来说参见Jolly,CancerGeneTherapy1:51-64(1994);Kimura,HumanGeneTherapy5:845-852(1994);Connelly,HumanGeneTherapy1:185-193(1995);和Kaplitt,NatureGenetics6:148-153(1994))。用于投送含有本发明治疗药剂的编码序列的基因治疗介质，可以局部或全身性施用。这些构建体可以利用病毒或非病毒载体途径。这样的编码序列的表达可以使用内源的哺乳动物或异源的启动子来诱导。编码序列的表达可以是组成性的或被调控。优选的用于基因治疗的介质包括反转录病毒和腺病毒载体。腺病毒载体的代表性例子包括在下列文献中描述的那些Berkner，Biotechniques6:616-627(Biotechniques);Rosenfeld等，Science252:431-434(1991);WO93/19191;Kolls等，P.N.A.S.215-219(1994);Kass國Bisler等，P.N.A.S.90:11498-11502(1993);Guzman等，Circulation88:2838-2848(1993);Guzman等，Cir.Res.73:1202-1207(1993);Zabner等，Cell75:207-216(1993);Li等，Hum.GeneTher.4:403-409(1993);Cailaud等，Eur.J.Neurosci.5:1287-1291(1993);Vincent等，Nat.Genet.5:130-134(1993);Jaffe等，Nat.Genet.1:372-378(1992);禾BLevrero等，Gene101:195-202(1992)。在本发明中可以使用的示例性的腺病毒基因治疗载体也包括在WO94/12649、WO93/03769、WO93/19191、WO94/28938、WO95/11984禾BWO95/00655中描述的那些。也可以使用在Curiel，Hum.GeneTher.3:147-154(1992)中描述的施用与杀死的腺病毒连接的DNA。可以使用其它的基因投送介质和方法；包括只与杀死的腺病毒连接或未连接的聚阳离子浓縮DNA，例如Curiel,Hum.GeneTher.3:147-154(1992);配体连接的DNA，例如参见Wu,J.Biol.Chem.264:16985-16987(1989);真核细胞投送介质细胞，例如参见1994年5月9日提交的美国系列号No.08/240,030和美国系列号Nu.08/404,796;光聚合水凝胶材料的沉积；在美国专利No.5,149,655中描述的手持式基因转移微粒枪；美国专利No.5,206,152和WO92/11033中描述的电离辐射；核酸电荷中和或与细胞膜融合。其它方法描述在Philip,Mol.CellBiol.14:2411-2418(1994)和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.91:1581-1585(1994)中。也可以使用裸DNA。示例性的裸DNA导入方法被描述在WO90/11092和美国专利No.5,580,859中。使用生物可降解的乳胶珠可以提高摄取效率。在珠子启动胞吞作用后，DNA包被的乳胶珠被有效地运输到细胞内。通过处理珠子以增加疏水性并从而促进内体的破坏和将DNA释放到细胞质中，可以进一步改进该方法。可以用作基因投送介质的脂质体描述在美国专利No.5,422,120、PCT专利公布号No.WO95/13796、WO94/23697和WO91/14445，以及EPNo.0524968中。其它适于使用的非病毒投送包括机械投送系统，例如在Woffendin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(24):11581-11585(1994)中描述的方法。此外，编码序列及其表达产物可以通过光聚合水凝胶材料的沉积来投送。其它可用于投送编码序列的常规基因投送方法包括例如使用美国专利No.5,149,655中描述的手持式基因转移微粒枪；使用美国专利No.5,206,152和PCT专利公布No.WO92/11033中描述的激活转化基因的电离辐射。目标抗体或抗体片段可以直接或间接地与有效部分连接，例如放射性核素、毒素、化疗药剂、药物前体、细胞生长抑制剂(cytostaticagents)、酶等。在优选实施方案中，抗体或片段与治疗性或诊断性放射性标记直接连接或通过使用螯合剂进行连接。适合的放射性标记的例子是众所周知的，包括9、125I、131I、mI、1Q5Rh、153Sm、67Cu、67Ga、可以与抗体连接的适当药物的例子包括氨甲蝶呤、阿霉素和淋巴因子例如干扰素、白介素等。可以被连接的适当毒素包括蓖麻毒素、霍乱毒素和白喉毒素。在优选实施方案中，目标抗体与治疗性放射性标记连接，并用于放射性免疫治疗。反义寡核苷酸在某些情况下，可能希望调节或降低前列腺细胞表达的蛋白的量。因此，在本发明的另一方面，可以制备反义寡核苷酸，并利用包括施用一种或多种反义寡核苷酸的方法来降低本发明的前列腺抗原的细胞表达水平。反义寡核苷酸的涵义是指寡核苷酸，其所具有的核苷酸序列通过碱基配对与参与耙表达的特定互补核酸序列相互作用，从而降低基因的表达。优选，参与基因表达的特定核酸序列是编码该基因的基因组DNA分子或mRNA分子。该基因组DNA分子可以包含基因的调控区，或成熟基因的编码序列。因此，术语与核苷酸序列互补在关于反义寡核苷酸及其方法的背景下，是指与该序列充分互补，因此允许在细胞中、即在生理条件下与该序列杂交。反义寡核苷酸优选包含含有大约8到大约100个核苷酸的序列，更优选反义寡核苷酸含有大约15到大约30个核苷酸。反义寡核苷酸也可以含有各种修饰，以赋予对核酸水解降解的抗性，例如修饰的核苷间连键(lineages)[Uhlmann禾卩Peyman,ChemicalReviews90:543-548(1990);Schneider和Banner,TetrahedronLett.31:335,(1990)，将它们引为参考]、5,958,773以及其中公开的专利中描述的修46饰的核酸碱基、和/或糖等。本
技术领域：
已知的广泛应用于反义技术的反义分子的任何修饰或改变都包含在本发明的范围内。这样的修饰包括制备含有磷的键，公开在美国专利5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5，625，050禾CI5,958,773中。本发明的反义化合物可以包含修饰的碱基。本发明的反义寡核苷酸也可以通过将寡核苷酸化学连接到一个或多个部分或结合物上来进行修饰，以增加反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入。这样的部分或结合物包括脂类例如胆固醇、胆酸、硫醚、脂肪链、磷脂、多胺、聚乙二醇(PEG)、棕榈酰基部分，以及公开在例如美国专利5，514，758、5,565,552、5,567,810、5，574，142、5，585,481、5，587，371、5,597,696和5,958,773中的其它部分或结合物。嵌合的反义寡核苷酸也在本发明的范围内，可以从本发明的寡核苷酸使用例如美国专利5,013,830、5,149,797、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,652,355、5,700,922和5,958,773中描述的方法来制备。.在反义
技术领域：
中，需要某种程度的常规实验来选择具体靶的最适反义分子。为了有效，优选反义分子靶定耙RNA分子的可接近的或暴露的部分。尽管在某些情况下可以获得关于耙mRNA分子结构的信息，但当前使用反义进行抑制的方法是通过实验。在治疗和对照细胞中可以通过mRNA的反转录和分析cDNA水平，来常规测量细胞中的mRNA水平。生物学效应可以通过本
技术领域：
已知的测量细胞生长或生存力进行常规测定。通过分析方法测量反义活性的特异性和分析cDNA水平，是本
技术领域：
认可的证实反义结果的方法。已经建议，应该将来自治疗和对照细胞的RNA进行反转录，并分析得到的cDNA群体。[Branch,A.D.,T.I.B.S.23:45-50(1998)]。本发明的治疗或药物组合物可以以本
技术领域：
已知的任何适合的途径给药，包括例如静脉内、皮下、肌内、经皮、鞘内或脑内。可以通过注射快速给药，或通过缓慢输注或施用缓释制剂给药一段时间。此外，目标前列腺肿瘤蛋白也可以与提供适宜的药物或药效动力学性质的药剂相连接或结合。例如，可以将蛋白与本
技术领域：
中任何已知的促进穿透或跨血脑屏障运输的物质、例如针对转铁蛋白受体的抗体相连，并通过静脉内注射来给药(参见例如Friden等，Science259:373-377(1993)，在此引为参考)。此外，目标蛋白A或蛋白B可以与聚合物例如聚乙二醇牢固连接，以获得所需的溶解性、稳定性、半衰期方面的性质，以及其它药物学上有利的性质。[参见例如Davis等，EnzymeEng.4:169-73(1978);Buruham，Am.J.Hosp.Pharm.51:210-218(1994)，在此引为参考]。组合物通常以药物制剂的形式使用。这些制剂以药物
技术领域：
熟知的方式制备。参见例如《Remington药物学》(第18版)(RemingtonPharmaceuticalScience,18thEd.,MerckPublishingCo.EasternPA，(1990))。一种优选的制剂利用生理盐水溶液介质，但是可以想到其它的可药用载体例如生理浓度的其它无毒盐、5%葡萄糖水溶液、无菌水等也可以使用。可能还希望在组合物中存在有适合的缓冲液。如果需要，这样的溶液可以被冷冻干燥并储存在无菌安瓿管中，以备加入注射用无菌水还原。主要溶剂可以是水性的或也可以是非水性的。目标前列腺肿瘤抗原、其片段或变异体，也可以掺入到固体或半固体生物相容性基质中，它可以被植入到需要治疗的组织中。载体也可以含有其它的可药用赋形剂，用于修饰或维持制剂的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速度或气味。同样地，载体还可以含有其它用于修饰或维持释放或吸收或穿透血脑屏障的可药用赋形剂。这些赋形剂是通常和习惯上用于配制药剂的赋形剂，这些药剂用于以单位药剂形式或多剂形式肠胃外给药、或通过连续或定期直接输注到脑脊液中。根据药剂制剂的药代动力学参数和采用的给药途径，药剂的给药可以重复进行。也考虑到了含有目标抗体或核酸拮抗剂的某些制剂将会口服给药。这样的制剂优选与适合的载体包囊并配制成固体剂型。适合的载体、赋形剂和稀释剂的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯垸酮、纤维素、明胶、糖浆、甲基纤维素、甲基-和丙基-羟基苯甲酸酯、滑石、镁、硬脂酸盐、水、矿物油等。制剂还可以包含润滑剂、增湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或调味剂。组合物可以被配制成通过采用本
技术领域：
熟知的步骤给患者用药后，提供活性成分的快速、持续或延迟的释放。制剂还可以包含减少蛋白水解降解和促进吸收的物质，例如表面活性剂。具体剂量按照患者的大致体重或体表面积或占用的身体空间的体积计算。剂量也将根据所选的具体给药途径计算。确定治疗最适剂量所需的计算的进一步细化，通常由本
技术领域：
的普通专业人员完成。本
技术领域：
的专业人员根据本文公开的靶细胞制剂分析中获得的活性，可以无需过多实验而做出这些计算。与标准的剂量-效应研究相结合，确定了精确的剂量。应该理解，实际施用的组合物量将由执业医生根据相关的情况来确定，包括要治疗的病症、要施用的药剂的选择、患者个体的年龄、体重和反应、患者症状的严重性、以及选择的给药途径。在本发明的一个实施方案中，通过在患者中植入能够产生生物活性形式的蛋白或蛋白前体的载体或细胞，蛋白可被治疗性给药，其中蛋白前体即能够被身体容易地转化成生物活性形式的蛋白的分子。在一种方法中，分泌蛋白的细胞可以被包裹在半透膜中，植入到患者内。细胞可以是正常表达蛋白或其前体的细胞，或者可以将细胞转化以表达蛋白或其前体。优选情，当患者是人类时，细胞是人类来源的、蛋白是人类蛋白。但是，预计上面讨论的蛋白的非人类灵长动物同源物也可以是有效的。目标前列腺蛋白或核酸的检测在许多情况下，希望在患者中测定蛋白或相应mRNA的水平。上面公开的证据表明，在某些疾病例如癌症期间，目标前列腺蛋白可能以不同的水平表达，以其为基础，得出结论，这些蛋白的存在提供了与细胞生长和存活相关的正常生理功能。本发明的内源产生的蛋白也可能在某些疾病状态中扮演重要角色。本文使用的术语"检测"在检测患者中蛋白的存在的环境下，旨在包括在患者中测定蛋白的量或表达一定量蛋白的能力，根据疾病的可能结果估计预后和恢复的前景，在一段时间内监测蛋白水平用作疾病状态的度量，以及监测蛋白水平以确定患者例如前列腺癌患者的优选治疗方案。为了在患者中检测本发明的前列腺蛋白的存在，从患者获取样品。样品可以是组织活检样品或血液、血浆、CSF、尿液等样品。已经发现，在某些癌症中，目标蛋白以高水平表达。用于检测蛋白的样品可以从前列腺组织获取。当评估蛋白的外周水平时，优选的样品是血液、血浆或血清样品。当评估中枢神经系统中的蛋白水平时，优选的样品是从脑脊液或神经组织获得的样品。样品可以通过非侵入性方法获得，例如从组织收集物或培养物获得，或使用直接可用的组织材料(尿液、唾液、粪便、毛发等)。在某些情况下，希望确定患者中或患者的组织或细胞系中基因是否是完整的。完整的基因是指基因中没有变化例如点突变、缺失、插入、染色体断裂、染色体重排等，其中这样的变化可能改变相应蛋白的生产，或改变其生物活性、稳定性等，从而导致疾病过程。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了检测和表征基因中任何变化的方法。该方法包括提供含有基因的寡核苷酸、基因组DNA或其片段或其衍生物。寡核苷酸的衍生物是指衍生的寡核苷酸基本上与它所源自的序列相同，其中衍生的序列与它所源自的序列具有足够的序列互补性，以与基因特异性杂交。衍生的核苷酸序列不是必需实际上从核苷酸序列衍生，而是可以以任何方式产生，包括例如化学合成或DNA复制或反转录或转录。通常，从来自患者的细胞样品分离患者的基因组DNA，并用一种或多种限制性内切酶例如Taql和Alul消化。使用本
技术领域：
熟知的Southern印迹方法，该分析方法确定了患者或患者中特定组织是具有本发明的完整的前列腺基因还是具有基因异常。与基因杂交包括将染色体DNA变性以获得单链DNA;将单链DNA和与基因序列相关的基因探针相接触；以及鉴定杂交的DNA-探针以检测含有至少一部分基因的染色体DNA。本文使用的术语"探针"是指包含多核苷酸的结构，由于探针序列与靶区域中的序列的互补性而与靶序列形成杂合结构。适合用作探针的寡聚物可以含有最少大约8-12个与靶序列互补的连续的核苷酸，并优选最少大约20个。本发明的基因可以是DNA或RNA寡核苷酸，并可以通过本
技术领域：
任何已知的方法来制备，例如剪切、转录或化学合成。探针可以用本
技术领域：
已知的任何可检测标记物进行标记，例如放射活性或荧光标记或酶标志。探针的标记可以通过本
技术领域：
已知的任何技术来完成，例如通过PCR、随机引发、末端标记、切口平移等。本
技术领域：
的专业人员将会认识到，其它不使用标记探针的方法也可用于测定51杂交。可以用于检测杂交的方法的例子包括Southern印迹、荧光原位杂交和使用PCR扩增的单链构象多态性。杂交通常在25。-45。C进行，更优选在32°-40°C，更优选在37°-38°C。杂交需要的时间从大约0.25到大约96小时，更优选从大约1到大约72小时，最优选从大约4到大约24小时。也可以通过使用PCR方法和位于基因侧翼或内部的引物来检测基因异常。PCR方法在本
技术领域：
是众所周知的。简单来说，该方法使用两个寡核苷酸引物来进行，引物能够与位于基因内部的靶序列侧翼的核酸序列杂交并扩增靶序列。本文使用的术语"寡核苷酸引物"是指长度从大约8到大约30个碱基的短链DNA或RNA。上游和下游引物通常长度从大约20个到大约30个碱基对，并与侧翼的区域杂交以复制核苷酸序列。聚合由DNA聚合酶在脱氧核苷三磷酸或核苷酸类似物的存在下催化，以产生双链DNA分子。然后将双链通过任何变性方法分离，包括物理、化学或酶学方法。通常，使用物理变性方法，包括将核酸加热到通常大约80°C到105°C的温度，为时大约1分钟到大约10分钟。该过程被重复所需的循环次数。选择与被扩增的DNA链基本上互补的引物。因此，引物不需要反映模板的准确序列，但是必需具有足够的互补性，以与被扩增的链选择性杂交。PCR扩增后，则将含有基因或其片段的DNA序列直接测序，并通过将序列与本文公开的序列进行比较来分析，以鉴定可能改变活性或表达水平等的变化。在另一个实施方案中，提供了根据分析表达基因的组织来检测本发明的肿瘤蛋白的方法。某些组织例如前列腺组织已经被发现过度表达目标基因。该方法包括将多核苷酸与来自正常表达基因的组织样品的mRNA进行杂交。样品得自怀疑有基因异常的患者。为了检测编码蛋白的mRNA的存在，从患者获得样品。样品可以来自血液或来自组织活检样品。可以对样品进行处理以提取其中包含的核酸。从样品获得的核酸进行凝胶电泳或其它根据大小进行分离的技术。将样品的mRNA与用作探针的DNA序列相接触，以形成杂合双链体。使用上面讨论过的标记探针可以对产生的双链体进行检测。当使用编码蛋白的cDNA或cDNA的衍生物作为探针时，可以使用高严紧性条件以防止假阳性，假阳性是指当实际上不存在完整的和有功能的基因时，基因核苷酸序列的杂交和表观检测。当使用源自基因cDNA的序列时，可以使用较低严紧性的条件，但是由于假阳性的可能性，这将是较不优选的方法。杂交的严紧性由杂交过程和清洗程序期间的许多因素决定，包括温度、离子强度、时间长度和甲酰胺的浓度。这些因素被概述在例如Sambrook等的文献中[Sambrook等，(1989),同上]。为了增加在编码蛋白A或蛋白B的mRNA样品中检测的灵敏度，可以使用反转录/聚合链反应(RT/PCR)技术来扩增从编码前列腺肿瘤抗原的mRNA转录的cDNA。RT/PCR方法在本
技术领域：
中是众所周知的，可以如下进行。通过例如标准的异硫氰酸胍方法分离总细胞RNA，将总RNA反转录。反转录方法包括在RNA模板上使用反转录酶和3'末端引物合成DNA。通常，引物含有寡(dT)序列。然后将这样产生的cDNA使用PCR方法和基因A或基因B特异性引物进行扩增。[Belyavsky等，Nucl.AcidRes.17:2919-2932(1989);Krug和Berger,MethodsinEnzymology,152:316-325,AcademicPress,NY(1987)，在此引为参考]。聚合酶链反应按照上面的描述进行，使用与被扩增的DNA区段的两侧翼区域基本互补的两条寡核苷酸引物。扩增后，则将PCR引物进行电泳，并通过溴化乙锭染色或通过磷成像(phosphoimaging)进行检本发明还提供了在从患者获得的样品中检测蛋白存在的方法。可以使用本
技术领域：
任何已知的检测蛋白的方法。这些方法包括但不限于免疫扩散、免疫电泳、免疫化学方法、结合物-配体分析、免疫组织化学技术、凝集和补体分析。[BasicandClinicalImmunology,《基础与临床免疫学》，217-262,Sites和Terr主编，Appleton&Lange,Norwalk，CT，(1991)，在此引为参考]。优选的是结合物-配体免疫分析方法，包括将抗体与前列腺肿瘤抗原蛋白的表位进行反应，并竞争性替换本发明的标记的前列腺抗原或其衍生物。本文使用的目标前列腺肿瘤抗原的衍生物旨在包括某些氨基酸已经被缺失或取代或改变成修饰的或不常用氨基酸的多肽，其中衍生物与基因在生物学上等效，并且其中多肽衍生物与针对蛋白产生的抗体交叉反应。交叉反应是指抗体与诱导它形成的抗原之外的其它抗原反应。众多的竞争性和非竞争性蛋白结合免疫分析方法在本
技术领域：
中是公知的。在这些分析方法中使用的抗体可以是未标记的，例如在凝集试验中使用的抗体，或被标记，以用于多种多样的分析方法。可以使用的标记包括放射性核素、酶、荧光剂、化学发光剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、粒子、染料等，用于放射性免疫分析(RIA)、酶法免疫分析例如酶联免疫吸附分析(ELISA)、荧光免疫分析等。本发明的另一方面涉及用于选择、鉴定、筛选、表征或优化生物活性化合物的方法，包括确定候选化合物是否结合、优选选择性结合上面公开的耙分子。这些靶分子包括核酸序列、多肽及其片段，典型为前列腺特异性抗原，更优选为其细胞外部分。结合可以在体外或体内、典型在体外、在基于细胞或无细胞的系统中进行评估。通常，靶分子与候选化合物在任何适合的装置中接触，并测定复合物的形成。靶分子和/或候选化合物可以固定在支持物上。被鉴定或选择的化合物代表了用于治疗癌症疾病、特别是前列腺癌的药物候选物或先导物。在对本发明包括优选实施方案进行了如上描述后，提供下面的实施例以进一步说明本发明。组织来源取得适合的患者样品用于评估研究方案。样品提供有相关的临床参数和患者同意书。对所有样品进行组织学评估，通过病理学诊断证实每个样品中恶性肿瘤的存在和/或不存在。临床数据一般包括患者(patent)史、生理病理学和与前列腺癌生理学相关的参数。获取了10份正常的和IO份恶性肿瘤样品以及可用的临床信息。此外，从正常前列腺和前列腺癌之外的器官获取IO份样品，用于确定表位的组织特异性表达情况。源自正常组织样品的RNA从已知的商业来源获得。获取了另外的患者样品用于细胞毒性T淋巴细胞(CTL)分析。从有相关临床参数和患者同意书的患者抽取血液，分离外周血单核细胞(PBMC)。临床数据一般包括患者史、生理病理学和与前列腺癌生理学相关的参数。从符合研究要求的6个前列腺癌患者收集PBMC。一名患者获得双份样品。DATAS文库的产生根据病理学诊断合并样品(正常对肿瘤)。根据总RNA的当量合并样品，产生IOO吗的总合并RNA样品。DATAS文库的构建按照以前在美国专利No.6，251，590中公开的方法，该专利的公开内容以其全文引为参考。简单来说，从正常的和肿瘤合并样品分离总RNA，然后对于每个合并样品，从总RNA中纯化mRNA。使用生物素化的寡聚(dT)引物进行cDNA的合成。将生物素化的cDNA与相反样品的mRNA杂交，形成cDNA和mRNA之间的异源双链体。例如，合并的正常前列腺样品的生物素化cDNA与前列腺肿瘤的mRNA杂交。同样地，前列腺肿瘤的生物素化cDNA与前列腺正常RNA杂交，产生第二个DATAS文库。使用链亲和素包被的珠子，通过结合cDNA上存在的生物素来姊化每会物田RNAseH消化忌、源双链汰.以降艇SnF)NA百补的RNA。所有与cDNA不同的mRNA序列仍保持完整。然后使用简并引物扩增这些单链RNA片段或"环"，并克隆到pGEM-T或pCRIITOPO载体(公司来源)中，以产生DATAS文库。克隆测序和生物信息学分析；DATAS文库被用于转化大肠杆菌，以便可以使用标准的分子生物学技术分离个体克隆。从这些文库分离到了10,665个个体克隆，并使用自动化的AppliedBiosystems3100测序仪进行测序。获得的核苷酸序列被提交到生物信息学渠道进行分析。因为DATAS文库是使用PCR扩增的DNA制备的，在从文库分离的克隆中存在同样序列的许多拷贝。因此，重要的是降低克隆的冗余性，以鉴定分离到的独特的、不重复序列的数量。从该大组DATAS片段鉴定到了1699个独特的、不冗余的序列，每个DATAS片段用候选基因注解。注解是通过用两种方法将DATAS片段与人类基因组序列比对来进行的1)可公开获得的比对和基因组浏览工具Blat(Kent等，2002);以及2)可商购的基因组比对和浏览工具Prophecy(Doubletwist)。每个DATAS片段序列用与含有DATAS片段的基因组序列交叠的相应基因来注解。基因用ReflS叫登记号或从不同算法例如Genscan、Twinscan或？§61^511++预测的假定基因进行注解。被鉴定的基因或者与DATAS片段的序列匹配(在外显子与片段匹配的情况下)，或者与DATAS片段交叠(在内含子与片段匹配的情况下)，并鉴定了基因的全长序列。这些序列被进一步分析，以检测所有可能的跨膜蛋白。膜蛋白通过使用不同的公开可用的算法来预测。例如TMHMM(CBS)被用于鉴定候选基因的氨基酸序列内存在的跨膜结构域。DATAS片段被定位于序列内，以试图确定剪接事件是否影响了细胞内或细胞外结构域。将与序列相关的基因进行分级，以便对治疗靶的成功鉴定最大化。单克隆抗体靶的选择用于抗体治疗物开发的最高优先级基因具有下列特征基因是已知的膜蛋白，基因的功能已知，并且DATAS片段对应到蛋白的细胞外结构域上的内含子，这表明DATAS片段将存在于细胞外，并对于单克隆抗体的治疗性干预是可用的。根据生物信息学分析，对与单克隆抗体治疗物开发有关的克隆按优先顺序进行了排序。CTL表位的鉴定在CTL筛选分析中包含的最高优先级的DATAS片段是含有新的序列信息的片段，例如含有新的外显子或外显子延伸的片段。优选的DATAS片段克隆与癌症的起始或进展有关，并编码细胞质蛋白。从文库载体中通过PCR扩增了192个选择的DATAS片段，并定向克隆到真核表达载体中交错的开始位点起始密码子的下游。这种构造使得DATAS片段在所有的开放阅读框架中表达，这是需要的，因为正确的阅读框架并不总是非常表观的。进行质粒制备，将含有选择的DATAS片段克隆的表达载体重新布置在96孔板中，然后将其用于在玻璃载玻片上点样，用于以前在国际专利申请No.PTC/US2005/032392中公开的CTL分析中，该专利的公开内容以其全文引为参考。将含有DATAS表达载体的所需微阵列位置的设计文件上传到高分辨率扫描仪中。将含有DATAS片段的表达载体与明胶和脂质体转染试剂(lipofectamine)混合，然后以与上传到高分辨率微阵列扫描仪中的设计文件相匹配的样式点样双份。下面的阳性对照、阴性对照和实57验样品在阵列上点样。a)没有插入片段的载体(阴性对照)b)编码增强的绿色荧光蛋白的载体(EGFP)c)含有DATAS片段插入的载体d)含有流感NP的编码cDNA的载体(阳性对照)然后将点样阵列用表达I类HLA(例如HLA-A2)的粘附性293T细胞覆盖并培养48-72小时，给细胞时间来表达载体编码的转录物。然后通过将来自正常和前列腺癌患者的HLA匹配的CD8+T细胞在培养的反转染的微阵列载玻片上温育4小时，进行CTL反应性分析。在与阵列温育之前，来自正常人和患者的T细胞可能需要在体外扩增到或多或少的程度，以增加响应性T细胞的频率。在整个细胞温育期间，存在着活化的胱天蛋白酶抑制剂一一带有荧光素标签(硫代若丹明)的Z-VAD，用于结合在某些斑点上表达抗原的粘附性细胞被CTL诱导死亡时变得活化的胱天蛋白酶。然后清洗载玻片以除去未结合的荧光Z-VAD，并使用微阵列扫描仪获得微阵列载玻片的双色(绿色和红色)荧光图像。然后通过目测检査扫描的图像确定数据的分析和证实。反转染的成功通过观察EGFP载体对照斑点的绿色荧光来评估。然后调整微阵列扫描仪上的荧光阈值，因为必需建立相关的背景和阳性对照信号的强度。接下来，通过红色荧光信号的存在鉴定其中T细胞具有阳性反应的DATAS斑点。使用斑点的坐标位置，鉴定产生阳性反应的cDNA。表达监测前列腺癌的有效表位耙要求表位的表达限于前列腺组织，或优选限于前列腺肿瘤。对每个按照优先顺序排列的序列的表达情况的评估通过RT-PCR来进行，这种方法在本
技术领域：
中是众所周知的。使用被称为降落PCR(touchdownPCR)的方案，该方案描述在AppliedBiosystems的GeneAmpPCR系统9700的用户手册中。简单来说，针对DATAS片段设计PCR引物，并用于终点RT-PCR分析。每个RT反应包含5jxg总RNA，使用ArchiveRT试剂盒(AppliedBiosystems)在IO(HU体积中进行。将RT反应用水l:50稀释，取4nl稀释的储液用于50|ilPCR反应中，PCR反应由94°C3min—个循环，94°030秒、60°C30秒和72°C45秒5个循环组成，每个循环将退火温度降低0.5度。然后进行94。C30秒、55。C30秒和72。C45秒30个循环。从每个反应取出15^用于分析，并使反应再进行IO个循环。这在30和40个循环时产生用于分析的反应物，并允许在40个循环的反应已经饱和时检测表达的差异。在正常的和肿瘤前列腺总RNA中，以及来自脑、心、肝、肺、肾、结肠、骨髓、肌肉、脾和睾丸的正常样品的总RNA中，测定DATAS片段的表达分布水平。表达分布按照在前列腺肿瘤中的特异性表达和在正常组织包括正常前列腺中发现的低表达进行优先顺序排列。RNA结构的证实DATAS鉴定了在实验样品之间有改变的序列。但是，从分离的DATAS片段序列不能直接确定DATAS片段所代表的连接或边界的准确序列。但是，DATAS片段被用于设计实验，以阐明每个样品中存在的每个转录物的序列。设计引物用于扩增比拟定的DATAS片段序列大的基因区域。然后将这些扩增子克隆并测序，以鉴定所有外显子和内含子的准确连接。这需要部分克隆来自鉴定样品的同种型，以证实同种型的一级结构(序列)。最初用于产生DATAS文库的全部20个样品(IO个正常的和IO个肿瘤样品)用于证实按优先顺序排列的基因的mRNA结构。同种型的全长克隆的分离利用在结构证实过程中产生的信息和DNA片段，完成了含有两种同种型的全长克隆的分离。有几种方法可用于分离全长克隆。当关于编码序列的全序列信息可用时，从序列设计基因特异性引物，并用于从组织样品的总RNA直接扩增编码序列。使用这些基因特异性引物建立起RT-PCR反应。RT反应按照上面的描述进行，使用寡聚dT引发cDNA。通过标准方法产生第二条链，以产生双链cDNA。使用基因特异性引物完成基因的PCR扩增。PCR由94。C30秒、55。C30秒和72°C45秒共30个循环组成。反应产物在1%琼脂糖凝胶上分析，将扩增子连接到制备有A突出端的载体中，用于扩增子克隆。使用ljil连接混合物转化大肠杆菌，以克隆和分离扩增子。一旦纯化后，就将含有扩增子的质粒在ABI3100自动测序仪上测序。当可用的序列信息有限时，利用寡聚物牵拉方法(oligopullingmethod)。简单来说，根据DATAS片段设计基因特异性寡核苷酸。用生物素标记寡核苷酸，并按照Sambrook等(1989)的程序，用于与从正常前列腺组织或前列腺肿瘤组织制备的单链质粒DNA文库杂交。杂交的cDNA通过结合了链亲和素的珠子进行分离，通过加热洗脱。将洗脱的cDNA转变成双链质粒DNA，用于转化大肠杆菌细胞，对最长的cDNA克隆进行DNA测序。结果使用上面描述的方法，鉴定到了23个DNA片段，推测它们对应于前列腺肿瘤组织表达的外显子(新的剪接变异体)，并引发生产性CTL应答。产生阳性结果的序列Id和相应的患者ID被概述在表1中。重复响应者和DATAS片段克隆所代表的剪接事件的类型也列于表1中。这些DNA序列被包含在表2中，对应于具有SEQIDNO:1-23的核酸序列。参考2006年3月的人类基因组汇编，使用BLAT和UCSC基因组浏览器产生了基因组序列的位置。使用预测算法来鉴定可能对应于包含在每个DATAS片段克隆中的抗原性肽的潜在HLA-A2结合肽，该每个DATAS片段克隆刺激在所述的CTL分析中监测到的CTL应答。该分析的结果包含在表3中。针对克隆到表达载体中的片段编码的每个可能框架列出肽。在每个预测的肽表位左边的数字表示该肽的N-末端氨基酸在列于左边的亲本蛋白中的位置。每个肽的右边是从1到30的分值，当数字向30增加时表示以更高亲和力与HLA-A2结合的可能性。表1.CTL分析阳性命中々利序列ID阳性命中的忠者工D市泣的阳性命屮No.1EYGRT外显子延伸No.2EYGRT;MSMPB外显子延伸No.3MSMPB外显子延伸No.4P72外显子延伸No.5EYGRT外显子延伸No.6EYGRT外显子延伸No.7P72P72外显子延伸No.8MSMPB外显子延伸No.9EYGRT新的外显子No.10MSMPB新的外显子No.11MSMPB;P72新的外显子NO.12P72新的外显子NO.13MSMPB外显子延伸No.14MSMPB外显子延伸NO.15MSMPB基因组命中NO.16P72P72外显子延伸No.17P72P72基因组命中No.18FRJY5外显子延伸No.19EYGRT新的外显子No.20P72外显子延伸No.21EYGRT外显子延伸No.22P72外显子延伸No.23P72P72基因组命中62表2.DATAS片段的序列信息序列ID:No.1EntrezGene:ID:51016基因组序列chrl4:23,680,141陽23,680,474序列定义14号染色体122号开放阅读框经证实的序列CTACCGGGGGAAGGGTCAAAGAGCGTGCCGAAGCGCTGGAAGGTCGCCCTCAACCAGGTGCCTCCGTTGCAT序列ID:No.2EntrezGeneID:84939基因组序列chrl9:1,327,655■1,328,088序列定义黑素瘤相关抗原(突变的)1经证实的序列GGCTCAGGGGGCACGTTTGCGTTTGGACCTGTCTGCGCGTTCCTCTCCCACTCAGTGTGCTCTGCAGCTG序列ID:No.3EntrezGeneID:95基因组序列chr3:51,996,641■51,996,968序列定义酰化氨基酸水解酶l经证实的序列CCAGGCAGCTGGCGAGGGGGTCACCCTAGAGTTTGCTCAGGAGAATCTCACTCCGTCAC序歹UID:No.4EntrezGeneID:5110基因组序列chr6:150,159,247-150,165,314序列定义蛋白-L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-甲基转移酶(PCMT1)经证实的序列TGTCACCTTTATGCTCCTCAGA序列ID:No.5EntrezGeneID:24142基因组序列chr3:50,309,814-50,311,728序列定义N-乙酰转移酶6经证实的序列GTAAAGGCATGTGGAATCCAGGGGCAGCTTTGGCTGGCACGTCTCACTCAGTCGCCACCTCGGCCTCCCAACA序列ID:No.6EntrezGeneID:7113基因组序列:chr21:41,762,326-41,762,782序列定义跨膜蛋白酶，丝氨酸2经证实的序列GCCGAGGTCTTCCCTAAGGACAGGGAGACTTGTTGAGCTCCCGGCTCCCCTGCACA序列ID:No.7EntrezGeneID:N/A基因组序列chrlO:76，837，410-76,837,825序列定义GenBank人类mRNABC029963经证实的序列CCGATCGGGGAAGTTTGCAGGGCAGGCGGCGGCAAGTTATTGAGCCGCCATCGAATCTCTCTTGC序列ID:No.8EntrezGeneID:11273基因组序列chrl6:28,750,682-28,751,068序列定义类共济失调蛋白2经证实的序列GTAGCAGGGCAGCAGACTTGGGAGAACGCGGGGGATACAT序列ID:No.9EntrezGeneID:5590基因组序列chrl:2，047，301-2,047,449序列定义蛋白激酶C，；经证实的序列GGGCAAAGGATGTTGCCCCTGTCCTGAAGGCTGTCGCCCGATTCCCGTCACGTCTCCTCCCCCCG序列ID:No.10EntrezGeneID:7037基因组序列chr3:197,286,590-197,293,338序列定义转铁蛋白受体(p90，CD71)经证实的序列GTGGCGAGGCGGTTCGGGACGGAGGACGCGCTAGTGTTCTTTGCTCTCC序列ID:No.11EntrezGeneID:64072基因组序列chrlO:73,173,842-73,174,176序列定义类钙粘着蛋白23经证实的序列GACACCCTAGCTGCAAGGGAGGTTAGAAAAAATGAGGGACAAATCAGGCTTCCTTTGGGTGCCCCCG序列ID:No.12EntrezGeneID:65217基因组序列chrlO:56,047,284■56,047,451序列定义智人原钙粘着蛋白15(PCDH15)经证实的序列GTTGAGACCTCGAATTACAGGCATGAGCCACCGTGCCTGGCG序列ID:No.13EntrezGeneID:57194基因组序列chrl5:23,479,621-23,484,596序列定义ATP酶，V类，IOA型经证实的序列GGAGGAGGTCGGCATCACCAGTAACAGGAATCCCTCTCCCTTCTTCTCGTCACCTCCAACGA序列ID:No.14EntrezGeneID:7701基因组序列chr2:219,231,947-219,232,130序列定义锌指蛋白142(克隆pHZ-49)经证实的序列CGGACCAGGACAAAATCATGACGATGCTCCATCCCAAGCCTTCCAAGACCACGCGCCCTCCTCCCTGTC序列ID:No.15EntrezGeneID:N/A基因组序列序列定义GenBank人类mRNAAF116698(内含子命中)经证实的序列CGGCGCACCTGGTACGTGGTGTATGTTCCATTTGTGCTGGCCATTCGGG序列ID:No.16EntrezGeneID:26993基因组序列chrl9:15,372,085-15,372,898序列定义类激酶A(PRKA)锚定蛋白8，AKAP8L经证实的序列:'GGGGAGGCACCCCAGGAAAACTCACCCTTCTCTGGATCCTCCCACTCTGGAGCCCTTCTCCACAGCCTCGCACCC序列ID:No.17EntrezGeneID:N/A基因组序列chr4:171,259,069-171,259,517序列定义基因组命中经证实的序列GCCGCGGGATTGAAACGTTATACAGCGGACCCAGTGAGACAAGAAAGGAGAGGGAGGAGTAAAAAGGACTTTGTCT序列ID:No.18EntrezGeneID:9570基因组序列chrl7:42,371,388-42,371,614序列定义高尔基体SNAP受体复合物成员2经证实的序列GGCCTTAGGGGCACGAGGATGTGAATCGACCTACTACTTAACCATTCTTTCCCTCCCCCGC序列ID:No.19EntrezGeneID:N/A基因组序列chrl3:21,727,184-21,727,549序列定义GenBank人类mRNAAK054845经证实的序列GGGGACAGGCAGAGGTTGCACTGCACTCCAGCCTGGGTGACATCCATAAAAGTGCCTCCCCCCG序列ID:No.20EntrezGeneID:29091基因组序列chrl4:24,351,679-24,351,865序列定义智人突触融合蛋白结合蛋白6(amisyn)(STXBP6)经证实的序列GAGAGATTTCACTGTGCTGCTCCCTCTCCACCTCCCCC序列ID:No.21EntrezGeneID:N/A基因组序列chr6:146,238,220-146,238,476序列定义GenBank人类mRNAAK123820经证实的序列GGCGGCAGGTCTAATCTGGCACACTTGCTAACTTCTAATAAAC序列ID:No.22EntrezGeneID:4343基因组序列chrl:113,044,178-113,044,827序列定义智人莫洛尼氏白血病毒IO，(MOVIO)-ID经证实的序列GTTAGGAGGTAGAGGGGCTGAGCTTGCTCAGACCTTGCAGTCCCA序列ID:No.23EntrezGeneID:N/A基因组序列chrl5:78,115,339-78,115,450序列定义基因组命中经证实的序列AAAATGACAACACTGATTTAGTAGGTCCGCACG表3.HLA-A2结合肽分析<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表3.HLA-A2HLA-A2结合肽分析(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>参考文献Akiyama等，GeneTher,,7:2113—2121,2000.Alcaraz等，CancerRes"55:3998-4002,1994.Allhoff等，WorldJ.Urol"7:12-16,1989.An等,Proc.Amer.Assn.Cane.Res"36:82，1995.An等，Molec.Urol"2:305-309，1998.Antibodies:ALaboratoryManual(《抗体实验室手册》)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1988.Ashley等，J.Exp.Med.,186:1177—1182,1997.Ashton-Richardt,Crit.Rev.Immunol"25:161-82，2005.Babian等，J.Urol"156:432-437,1996.Badalament等，J.Urol"156:1375-1380，1996.Baichwal和Sugden，在GeneTransfer(《基因转移》)中，Kuchedapati主编，PlenumPress,NewYork,pp117-148，1986.Banchereau禾卩Steinman,Nature,392:245-252,1998.Bangharn等，J.Mol.Biol.13:238-252,1965.Barinaga，Science,271:1233，1996.Bedzyk等，J.Biol.Chem.，265:18615,1990.Bell等，"GynecologicalandGenitourinaryTumors"(妇禾斗禾口泌尿生殖肿瘤)，DiagnosticImmunopathology(《诊断免疫病理学》)，Colvin，Bhan和McCluskey主编，第二版，Ch.31,RavenPress,NewYork,pp579-597,1995.Bellus,JMacromol.Sci.PureAppl.Chem.,A31(l):1355陽1376,1994.Benvenisty禾BNeshif，Proc.Nat.AcadSci.USA,83:9551-9555，1986.Berzofsky等，J.ClinicalInvest"11:1515-1525,2004.Bittner等，MethodsinEnzymol，153:516-544，1987.Bonifaz等，J.Exp.Med.，196:1627—1638，2002.Bookstein等，Science,247:712-715,1990a.Bookstein等，Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,87:7762-7767,19卯b.Bova等，CancerRes.,53:3869-3873,1993.Brawn等，TheProstate,28:295-299，1996.Campbell,MonoclonalAntibodyTechnology(《单克隆抗体技术》)，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,(生物4七学和分子生物学实验室技术)，Burden和VonKnippenberg主编，Vol.13:75-83，Elsevier,Amsterdam,1984.Capaldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm，76:425,1977.Carter禾卩Coffey,ProstateCancer:TheSecondTokyoSymposium(《前列腺癌第二届东京研讨会》)，J.P.Karr和H.Yamanak主编，Elsevier,NewYork,pp19-27,1989.Carter和Coffey,Prostate,16:3948,1990.Carter等，Proc.Nat'lAcadSci.USA,87:8751-8755,1990.Carter等，Proc.Nat'lAcadSci.USA，93:749-753，1996.Carter等，J.Urol"157:2206-2209，1997.Cech等，Cell,27:487496,1981.Chang等，Hepatology,14:124A,1991.Chaudhary等，Proc.Nat'lAcad.Sci"87:9491，1990.Chen和Okayama,MoLCellBiol"7:2745-2752,1987.Chen等，Clin.Chem.，41:273-282,1995a.Chen等，Proc.Am.Urol.Assn，153:267A,1995.Chen等，Int.Immunol"15:427-435，2003.Chinault禾口Carbon,"OverlapHybridizationScreening:IsolationandCharacterizationofOverlappingDNAFragmentsSurroundingtheLEU2GeneonYeastChromosomeIII,"(重叠杂交筛选酵母III号染色体上的LEU2基因周围重叠DNA片段的分离和表征)，Gene,5:111-126,1979.Chomczynski禾口Sacchi,Anal.Biochem.，162:156-159，1987.Christensson等，J.Urol"150:100-105，1993.Coffin,Virology(《病毒学》)，Fields等主编，RavenPress,NewYork,pp1437-1500，1990.Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol"150:1，1981.Colvin等，DiagnosticImm漏pathology(《诊断免疫病理学》)，第二版，RavenPress,NewYork,1995Cooner等，J.Urol"143:1146-1154,1990.Couch等，Am.Rev.Resp.Dis.,88:394-403，1963.Coupar等，Gene,68:1-10，1988.Culver等，Science,256:1550-1552,1992.Fci，,0、,楚nor*Q，O■L^t*VW》，L丄丄、,JA乂UAA.Deamer禾口Uster，"LiposomePreparation:MethodsandMechanisms,"(脂质体制备方法和机理)，Liposomes(《脂质体》)，M.Ostro主编，1983.Diamond等，J.Urol"128:729-734，1982.Donahue等，J.Biol.Chem.,269:8604-8609，1994.Dong等，Science,268:884-886,1995.DrugsRD,7:197-201，2006.Dubensky等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA,81:7529-7533,1984.Dumont等，J.Immunol"152:992-1003，1994.Elledge等，CancerRes.54:3752-3757，1994.Esslinger等，Hum.GeneTher.，13:1091—1100,2002.欧洲专利申i青EPONo.320308.Fearon等，Science,247:47-56,1990.Fechheirner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84:8463-8467,1987.Flutter等，CellMol.Immunol"1:22-30,2004.Fong禾卩Engleman,A隱.Rev.Immunol"18:245-273,2000.Fong等，J.Immunol.,167:7150-7156，2001.Forster禾卩Symons，Cell,49:211-220，1987.Fraley等，Proc.Natl.Acad.SciUSA,76:3348-3352,1979.Friedmann，Science,244:1275-1281,1989.79Freifelder，PhysicalBiochemistryApplicationstoBiochemistryandMolecularBiology(《物理生物化学应用于生物化学和分子生物学》)，第二版，Wm.FreemanandCo.，NewYork,N.Y.,1982.Frohman,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(《PCR方案方法与应用指南》)，AcademicPress,NewYork,1990.Gabrilovich等，CellImmunol"170:111-119，1996.Gefter等，SomaticCellGenet"3:231-236,1977.Gerlach等，Nature(London),328:802-805,1987.Ghosh陽Choudhury等，EMBOJ.，6:1733-1739，1987.Gingeras等，PCT申请WO88/10315.Ghosh禾卩Bachhawat，LiverDiseases,TargetedDiagnosisandTherapyUsingSpecificReceptorsandLigands(《肝脏疾病，使用特异性受体和配体的定向诊断和疗法》)，Wu等主编，MarcelDekker，NewYork,pp87-104,1991.Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(《单克隆抗体原理与实践》)，第二版，AcademicPress,Orlando,Fla.，pp60-61,65-66，71-74,1986.Gomez-Foix等，J.Biol.Chem.,267:25129-25134,1992.Gopal，Mol.CellBiol"5:1188-1190,1985.Graham等，J.Gen.Virol"36:59-72，1977.Graham禾口vanderEb，Virology,52:456-467,1973.Graham禾口Prevec,MethodsinMolecularBiology:GeneTransferandExpression(《分子生物学方法基因转移和表达方案7)，E.J.Murray主编，HumanaP腦，Clifton,N丄，pp205-225，1991.Gregoriadis主编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