专利名称：Thermoanaerobacter mathranii菌株bg1的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的嗜热菌，其属于r力ei7Poa/ aero6a"er/Z7s^rs/7j7。
背景技术：
生产发酵产物(例如乙醇和乳酸)的工业正面临生产过程从可相 对容易转化但昂贵的淀粉类材料的发酵向复杂但便宜的木质纤维素生 物材料(lignocellulosic biomass)(例如木材和农业作物的残漆， 如禾秆)的发酵的转变的挑战。与含有均一的且易于水解的聚合物的 淀粉不同，木质纤维素生物材料含有纤维素(25-53%)，半纤维素 (20-35%)，多酚木质素(10-25%)和其他可提取的组分。通常，利 用木质纤维素生物材料的第一步是预处理步骤，以使木质纤维素材料 的组分分级且增加其表面积。最常用的预处理方法是酸水解法，其中 使木质纤维素材料遭受酸(例如硫酸)并由此糖聚合物纤维素和半纤 维素部分或完全水解为其组成成分糖单体。另一种类型的木质纤维素 水解是蒸汽爆石皮法(steam explosion)，该方法包括通过蒸汽注入将 木质纤维素材料加热至190-230°C。第三种方法是湿氧化法(wet oxidation),其中在150-185。C用氧气处理材料。预处理之后可以进
行酶促水解以一使糖单体完全释放。该预处理步骤导致纤维素水解成葡 萄糖而半纤维素转变成戊糖(木糖和阿拉伯糖)以及己糖(葡萄糖)，
半乳糖和甘露糖。因此，与淀粉不同，木质纤维素生物材料的水解导 致除己糖外戊糖的释放。这意味着有用的发酵生物必须能够将己糖和 戊糖都转化成期望的发酵产物(例如乙醇)。
用于例如乙醇发酵的传统微生物，酿酒酵母(^cc力araro迈/c" cereWs/ae)和运动发酵单胞菌(Z7历0迈o/7as迈o6i7/s),不能4戈i射 戊糖(例如木糖和阿拉伯糖)，因此需要进一步的代谢工程改造以提 高对木质纤维素底物的效能。革兰氏阳性嗜热菌具有优于常规乙醇生产菌林的独特优点。其主要优点是它们广泛的底物特异性和乙醇的天
然高产量。此外，在高温(55-70。C )进行乙醇发酵具有优于中温发酵 的许多优点。嗜热发酵的一个优点是连续培养中污染的问题小，因为 仅有少数的微生物能够在如此高的温度下在未解毒(un-detoxified) 的木质纤维素水解产物中生长。
目前，取决于预处理方法，通常必须将纤维素酶和半纤维素酶加 入到预处理的木质纤维素水解产物中以释放糖单体。这些酶显著增加 了发酵产物的生产成本。但是，许多嗜热革兰氏阳性菌抹拥有大量相 关酶，且如果使用嗜热革兰氏阳性菌林，那么补充的添加物可以变得 更便宜。在高温下发酵还具有高生产率和底物转化以及便于产物回收 的其他优点。
木质纤维素水解产物包含抑制剂，例如糠醛，酚和羧酸，其可以 潜在地抑制发酵生物。因此，该生物还必须对这些抑制剂耐受。水解 产物的抑制作用可以通过在发酵之前应用解毒过程来减少。但是，加 入该额外步骤显著增加了发酵产物的总成本，故应优选地避免加入该 步骤。例如，已评估，柳木水解产物的过石灰化(overliming)增加 了用大肠杆菌(^sc力er/cA/a 生产乙醇的成本22% ( Von Sivers
等人，1994 )。因此，由于解毒过程的高成本，优选的是，该微生物
能够从未解毒的半纤维素或综纤维素水解产物生产发酵产物以使之可 在工业的基于木质纤维素的发酵过程中使用。
如果潜在的微生物能够在高浓度的木质纤维素水解产物(即具有 高干物质含量的木质纤维素水解产物)上生长，那么这也是特别有利 的。当该微生物用于生产醇(例如生产乙醇)时，这一点特别重要， 因为蒸馏成本随着醇浓度的降低而增加。
US 6， 555，350描述了 r力e/7Z7oa/7aero6acfer菌株，其能够将戊糖 转化成乙醇。但是，该菌抹有相当数量的乳酸盐副产物，且仅在干物 质浓度低于6% wt/wt的的木质纤维素水解产物中测试过。
Larsen等人，1997描述了 7^er/z oa/7aei"o^2"e/"迈"力i"a/ //菌林 A3，其仅能够在干物质浓度为6%的麦秆水解产物(60g/l补充木糖的
7麦秆干重)中生长，且已报道其不能在半乳糖上生长。
因此，本发明的一个目标是提供一种微生物，其能够克服上文提 及的障碍，特别是乙醇生产的障碍。
发明概述
因此，本发明涉及选自BG1 ( DSMZ登录号18280 )的 r力e/7z oa/7aero6ac^er迈a^^ra/7//细菌菌林及其突变体。本发明基于纟田 菌菌林BG1的分离，所述细菌菌林BG1能够在非常高干物质浓度的木 质纤维素水解产物上生长并产生发酵产物。此外，BG1具有广泛的底 物特异性，且能够利用戊糖(例如木糖和阿拉伯糖)和己糖。该菌林 还具有嗜热的优点且因此能够在高温下生长，导致高生产率和底物转 化率，污染的低风险和便于产物回收。
本发明进一步涉及通过在合适的条件下培养根据本发明的菌抹来 生产发酵产物的方法。
发明详述
^口上戶斤述，本发明f步及选自 BG1 的 7^e77Z7oa/zaero6acfer 加Mra/7//细菌菌林及其突变体。
本发明基于分离的细菌菌林BG1，其已按照Budapest Treaty条 款于 2006年5 月 17 日在DSMZ ( Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany )进行了 4呆藏，DSMZ登录号为18280。
从下文来看显然的是，本发明的优选细菌已进行了保藏。因此本 发明的其他细菌可以通过诱变保藏的细菌并选择具有增强特征的期望 的突变体来获得。期望的特征包括增加的可利用的糖的范围，提高的 生长速率，生产更高量的发酵产物(例如乙醇)的能力等等。用于诱 变细菌和选择期望的突变体的方法在Functional analysis of Bacter ial genes: A pract ical Manual(由W. Schumann, S. D. Ehrlich & N. Ogasawara编辑，2001 )中有所描述。
基础菌株(base strain) BG1能够在非常高干物质浓度的木质纤 维素水解产物上生长并产生发酵产物。在本申请上下文中术语"木质
8纤维素水解产物"意指木质纤维素生物材料，其已经历预处理步骤并 由此木质纤维素材料已至少部分地分散为纤维素，半纤维素和木质素 从而增加了材料的表面积。木质纤维素材料一般可来源于植物材料， 例如禾秆，干草，庭园垃圾，碎木块，果皮和种皮。
最常用的的预处理方法是酸水解法，其中使木质纤维素材料遭受 酸(例如硫酸)并由此糖聚合物纤维素和半纤维素部分或完全水解为 其组成成分糖单体。另一种类型的木质纤维素水解是蒸汽爆破法，该
方法包括通过蒸汽注入将木质纤维素材料加热至190-230°C。第三种 方法是湿氧化法，其中在150-185。C用氧气处理材料。预处理之后可 以进行酶促水解以使糖单体完全释放。该预处理步骤导致纤维素水解 成葡萄糖而半纤维素转变成戊糖(木糖和阿拉伯糖)以及己糖(葡萄 糖)，半乳糖和甘露糖。在某些实施方案中，预处理步骤可用导致纤 维素和半纤维素进一步水解的处理进行补充。这类附加的水解处理的
目的是使纤维素和/或半纤维素起源的酸水解、湿氧化或蒸汽爆破期间 产生的寡糖和可能的多糖水解以形成可发酵的糖(例如葡萄糖，木糖 和可能的其他单糖)。这类进一步的处理可以是化学的或酶促的。化 学水解通常通过在100-150'C范围内的温度下用酸处理(例如用含水 硫酸处理)来实现。酶促水解通常通过用一种或多种适当的糖酶(例 如纤维素酶，葡糖苷酶和半纤维素酶，包括木聚糖酶)处理来进行。
令人惊讶地发现，根据本发明的细菌菌抹能够在含有经水解的、 具有至少10% wt/wt (例如至少15% wt/wt，包括至少20% wt/wt，甚 至高达25% wt/wt)干物质含量(或者如本文也使用的"总固体"， TS)的木质纤维素生物材料物质的培养基中生长。如之前提及的，这 具有重大的优点，即在发酵过程前不需要稀释水解产物，且因此可能 获得更高浓度的发酵产物(例如乙醇)，从而可以降低随后回收发酵 产物的成本。例如，用于乙醇蒸馏的成本随着醇浓度的降低而增加。
根据本发明的细菌菌林是厌氧性嗜热细菌，它能够在高温(甚至 在70。C或以上)下生长。该菌林能够在高温下操作的这一事实在将木 质纤维素物质转化成发酵产物的过程中是非常重要的。当在高温下进
9行时，碳水化合物转化成例如乙醇的速率快得多。例如，在嗜热杆菌
中乙醇生产率比常规酵母发酵过程(其在30。C下操作)快高达10倍。 因此，对于给定体积的生产率，需要更小的生产设备(production plant),从而减少了设备工程费用(plant construction costs)。 如之前还提及的，在高温下，受其他微生物污染的风险减少，导致更 少的停工期(downtime),提高的设备生产率和更低的用于给料 (feedstock)灭菌的能量需求。高操作温度还可便于随后回收得到的 发酵产物。
许多发酵产物是颇有价值的商品，其可用于多个技术领域，包括 食品工业和化学工业。目前，渐增的全球能量需求已导致对作为能源
的化石燃料的替代物的渐增的关注，并且来源于植物材料的乙醇(生 物乙醇)作为源自石油的液态烃类产物的潜在的替代物或补充物得到 特别的关注。
乳酸(其是另一种发酵产物)作为抗衰老化学制品广泛用于化妆 品工业，且食品工业在多种食品原料中使用乳酸作为酸度调节剂。最 近，乳酸还因为其在生物可降解聚酯中的潜在应用吸引了大量的关注。
根据本发明的菌林具有能够产生许多不同发酵产物(包括酸，醇， 酮和氢)的潜力。在一个实施方案中，醇选自乙醇，丁醇，丙醇，甲 醇，丙二醇和丁二醇。在另一个实施方案中，酸是乳酸，丙酸盐 (proprionate)，乙酸盐，琥珀酸盐，丁酸盐或甲酸盐，且酮是丙酮。
如上文所提及的，BG1是从水岛温泉分离的野生型菌林，它具有 数个非常有利的、转化木质纤维素生物材料物质所需的特征。因此， 这个基础菌林拥有用于将戊糖和己糖转化成各种发酵产物(例如乳酸 和乙醇)的所有遗传机制。
从以下实施例中将显然的是，完整16S rDM序列(SEQ ID NO: 14) 的研究表明菌林BG1与 r力,譜aer由"er迈"力環/i菌株A3 (Larsen等人；1997 )密切相关。这使BG1位于梭状芽孢杆菌 (Clostridia)的第V蔟(cluster V)。虽然这些菌林密切相关，但 是它们对半纤维素水解产物的耐受性差别很大。A3只能在高达40。/o的麦秆水解产物(60 g/1补充木糖的麦秆干重的，即干物质浓度为6% wt/wt)中生长，而BG1能够在高干物质浓度(高达至少25%)、没有 添加糖或酶的情况下生长并从未稀释的水解产物中产生乙醇。此外， 据报道菌林A3不能在半乳糖上生长(Larsen等人，1997 )，而BG1 用半乳糖作为唯一碳源生长良好且主要产生乙醇。因此，根据本发明 的菌林能够在作为唯一碳源的半乳糖上生长。
如在附随的实施例中所显示的，在pH-7和7(TC下在木糖基本培 养基(minimal medium)中BG1生长的前几个小时，等摩尔量地产生 乙醇和乙酸盐。然后当培养物进入指数生长期后期时，特定的乙醇产 量显著超过了乙酸盐的产量。发酵后pH值没有变化，因此预期这种作 用不是由pH值引起的。同样地，已显示用纯氢代替顶部空间的N2/C02 或添加乙酸盐不影响发酵，因此在指数生长期后期向乙醇形成的转移 的机制仍然不明。
实施例还阐明，培养基的pH值对BG1的产物谱有重大的影响。在 pH 6.5以上，乙醇的产量占优势，且几乎不产生乳酸盐。在pH 6. 0 以下，在损失乙醇的情况下乳酸产量增加，且在pH5. 0，没有观察到 生长。在密切相关的嗜热菌7^迈画a,^s"er w/ege"/中也观察 到pH值对乳酸盐产量的相同影响。发现粗细胞提取物含有果糖-l，6-二磷酸(FDP)激活的乳酸脱氬酶(LDH) 。 FDP的亲和力依赖于胞外 pH值。在pH6. 2观察到最大激活，在pH8.2没有观察到激活(Cook， 2000 )。由于这一作用在r力er边。s/2aero6flCer4勿种中是共有的，因jt匕 在BG1中它也很可能是导致因素(Lamed和Zeikus, 1980; Carreira 等人，1982; Bryant， 1991)。
以下实施例还阐明添加乙醇对BG1的生长速率和代谢物分布的影 响。低乙醇耐受性是嗜热菌的商业化应用的主要障碍，因此选择乙醇 抗性菌林是很重要的。但是，热硫化氢热厌氧杆菌( ^ ei7Z7o/ /drosw〃wric咖)的乙醇抗性突变体，39EA,能够在45。C高 达8%( w/v )的乙醇浓度和在68°C高达3. 3%的乙醇浓度下生长(Lovitt 等人，1984 )， 而产乙醇热厌氧杆菌(7y e/7Z7oa/Lsero6a"er
iie^ a"o"c^)的突变体，39E-H8，在60。C展示8°/。的乙醇耐受性 (Burdette等人，2002 )。与其他嗜热厌氧菌林相比，BG1在70。C对 乙醇非常耐受(Herrero和Gomez， 1980; Larsen等人,1997; Lovitt 等人，1988; Wiegel和Ljungdahl， 1981; Rani等人，1996 )。在未 经改变的培养物(unadapted culture)中，在2. 8%的外源乙醇的情 况下，生长速率仍然是未加乙醇时的速率的27%。
已报道产乙醇热厌氧杆菌E39利用伯醇脱氢酶消耗外源添加的乙 醇(Burdette等人，2002 )。甚至在乙醇耐受性突变体E39-H8 (其没 有(或有减少的)伯醇脱氢酶活性)中也是这种情况。相反地，发现 BG1甚至在高浓度的外源乙醇的情况下产生乙醇。当加入乙醇时，在 BG1中发现乳酸盐产量增加。对于生产乙醇的微生物而言，在高乙醇 浓度下的乙醇产量是很关键的。
与淀粉类或纤维素底物(其几乎完全分解为葡萄糖)不同，木质 纤维素生物材料含有数种不同的糖单体，包括己糖和戊糖。如果要在 连续过程中将这些转化为发酵产物(例如乙醇)，那么需要同时吸收 并代谢所有的糖。已证明共发酵在许多传统的生产乙醇的微生物中存 在问题。酿酒酵母和运动发酵单胞菌已就葡萄糖和木糖的共发酵成功 地进行了工程改造，但是与阿拉伯糖的共发酵似乎更困难(Dien等人， 2000; Lawford和Rousseau, 2002; Ho等人，1998 )。在革兰氏阳性 细菌(其中碳代谢在分子水平上进行了研究)中，显示葡萄糖通过分 解代谢物阻遏抑制编码负责木糖初始代谢的酶的xyUB操纵子的转录 (Hueck和Hillen， 1995 )。相反地，产乙醇热厌氧杆菌的xy 1AB操
纵子的转录不受葡萄糖的阻遏，且可以看到葡萄糖和木糖的同时降解 (Erbeznik等人，1998 )。如在实施例中所显示的，BG1同时降解葡 萄糖，木糖，阿拉伯糖和半乳糖的糖混合物以及葡萄糖，木糖，半乳 糖和甘露糖的混合物。
木质纤维素生物材料的水解导致微生物抑制剂的释放(Klinke等
人，2004 ),因此水解产物的洗涤可能增加BG1的乙醇生产率。但是， 在实施例中展示的实验中，洗涤显著降低BG1的乙醇生产率。这一作
12用很可能是由于洗掉了易于发酵的戊聚糖，从而减少了初始糖浓度而 引起的。在一个关于预处理的山杨木的类似研究中，显示洗涤有效地
移除了抑制剂，但也导致显著的可利用的戊聚糖的75%的损失 (Saddler和Chan, 1984 )。水解产物中抑制剂的存在似乎不是BG1 发酵的主要障碍，而且BG1在浓缩的未解毒的木质纤维素水解产物中 似乎具有优于传统的生产乙醇的微生物的重大优点。
在以下实施例中证实，在有利的实施方案中基础菌林BG1可以进 行改良以获得具有改良特征的BG1的突变体和衍生物。因此，在一个 实施方案中，提供了根据本发明的细菌菌林，其是BG1的变异体或突 变体，其中已插入，缺失或基本灭活了一个或多个基因。可利用本领 域公知的合适的基因操作工具和遗传工程方法(例如基因克隆系统， 同源重组和在 Sambrook & Russell "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(第三版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述的技术)插入，缺失或基本灭活基因。
特别地，本发明人惊讶地发现，可通过灭活编码乳酸脱氢酶(LDH) (EC 1.1.1.27)的基因来显著提高BG1的乙醇生产能力。因此发现， 当在葡萄糖上生长时，乙醇产量从野生型BG1中约51-56%的理论最高 产量增加至乳酸脱氢酶缺陷菌抹BG1L1中约84-91%的产量。
因此，预期根据本发明的菌林是BG1的改良形式，其中已灭活编 码乳酸脱氢酶(LDH)的基因(EC 1.1.1.27)(通过缺失所述基因来 实现)，或其中已通过在基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸 基本灭活该基因。
在一个实施方案中，提供了乳酸脱氢酶缺陷突变体菌林BG1L1， 其已按照Budapest Treaty条款于2006年5月17日在DSMZ( Deutsche SammlungvonMikroorganismenundZellkulturen GmbH， Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany)进行了保藏, DSMZ登录号为18283。
如上文所提及，乳酸(或乳酸盐)广泛用于例如食品工业中，因 此是颇有价值的发酵产物。本发明人发现，与野生型相比，野生型菌
13林BG1可以通过灭活编码丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶(pyruvate ferredoxin oxidoreductase )的基因(EC 1.2.7.1)来进行改良以 产生增加量的乳酸盐。因此发现，野生型BGl的代谢可以从乙醇的生 产完全转移至乳酸盐的生产。因此，本发明的一个目标是提供来源于 BGl的菌抹，其中編码丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶的基因(EC 1.2. 7.1)已被下调或基本灭活，例如通过在该基因中突变，缺失或插
入一个或多个氨基酸。更具体地，提供了具有增加的乳酸盐生产特征 的BG1的4汙生物，其命名为BG1PF1，且已按照Budapest Treaty条款 于2006年5月17日在應Z( Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany)进行了保藏，DSMZ登录号为18282。
氢广泛用于石油和化学工业，i.a.用于处理化石燃料，用于加氢 烷基化，氢化脱硫作用和氢化裂解，并且它用于脂肪和油的氢化(在 例如人造黄油的项目中发现)，以及用于生产曱醇。另外，氢可以用 作能源，可以在例如内燃机中燃烧。
乙酸是颇有价值的产物，其在工业中广泛使用，主要用于生产乙 酸乙烯单体，酯产物，醋，且用作溶剂。乙酸的全球需求量为大约6. 5 百万吨/年。
本发明人已构建了改良的BGl突变体菌林，其比野生型菌林BGl 能够生产更多的氢和乙酸(以乙酸盐的形式)。这通过下调BGl的编 码氢化酶的HydABCD基因来实现。
因此，根据本发明，提供了 BGl的突变体菌林或衍生物，其中编 码氢化酶或氢化酶亚基的基因已被下调或基本灭活。这些基因的灭活 可以通过在基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸来实现。更具 体地，编码氢化酶或氢化酶亚基的基因选自[Fe]-氢化酶和[NiFe]-氬 化酶(EC 1. 6. 5. 3， EC 1. 12. 7. 2, EC 1. 12. 99, 6 ),例如NuoE， NuoF, NuoG， EchB, EchC, EchD， EchE和EchF。
因此，在一个实施方案中，提供了根据本发明的菌林，其具有改 良的氢和乙酸生产能力，命名为BG1H1。BG1H1已按照Budapest Treaty条款于2006年5月 17日在DSMZ (Deutsche Sammliing von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH， Mascheroder Weg lb， 38124 Braunschweig, Germany )进行了保藏，DSMZ登录号为18281。
进一步预期，在某些实施方案中，在BG1或其突变体中下调或基 本灭活编码乙酸激酶(EC 2. 7. 2. 1 )和/或磷酸乙酰转移酶(EC 2. 3. 1. 8 ) 可能是有益的。灭活可以通过在所述基因中突变，缺失或插入一个或 多个氨基酸来实现。
如上文所提及的，BG1拥有遗传机制，使得它能够将己糖和戊糖 转化成大量的期望的发酵产物，包括乙醇。但是，对于某些实施方案 而言，可能希望将一个或多个额外的基因插入到根据本发明的菌林。 因此，为了提高特定发酵产物的产量，将一个或多个编码多糖酶的基 因插入到根据本发明的菌林可能是有益的。因此，在特定的实施方案 中，提供了根据本发明的菌林，其中一个或多个基因编码多糖酶，所 述多糖酶选自纤维素酶(例如EC 3. 2.1.4);卩-葡聚糖酶，包括葡 聚糖-1，3 p-葡糖苷酶(外切-l， 3 葡聚糖酶，例如EC3. 2. 1.58), 1，4-P-纤维二糖水解酶(例如EC 3.2.1.91)和内切-l， 3(4)-P-葡 聚糖酶(例如EC 3.2.1.6);木聚糖酶，包括内切-l, 4-P -木聚糖酶 (例如EC 3. 2丄8 )和木聚糖1， 4- P -木糖苷酶(例如EC 3. 2. 1. 37 ); 果胶酶(例如EC 3.2.1.15) ; a-葡糖苷酸酶，oc-L-阿拉伯呋喃糖 苷酶(例如EC 3.2.1.55)，乙酰酯酶(例如EC 3. 1. ，乙酰木
聚糖酯酶(acetylxylanesterase)(例如EC 3.1.1.72) ， oc淀粉 酶(例如EC 3. 2. 1. 1 ) , P -淀粉酶(例如EC 3. 2. 1. 2 ),葡糖淀粉 酶(例如EC3. 2. 1.3)，支链淀粉酶(例如EC3.2. 1.41) ， 葡聚 糖酶(例如EC 3.2.1.73)，半纤维素酶，阿拉伯糖苷酶，甘露聚糖 酶，包括甘露聚糖内切-l，4-p-甘露糖苷酶(例如EC 3. 2. 1.78)和 甘露聚糖内切-l，6-a-甘露糖苷酶(例如EC3. 2. 1.101)，果胶水解 酶，多聚半乳糖醛酸酶(例如EC 3.2.1.15)，聚半乳糖醛酸外切酶 (例如EC 3.2.1.67)和果胶酸裂合酶(例如EC 4.2.2.10)。
取决于期望的发酵产物，预期在某些实施方案中，插入编码丙酮酸脱羧酶的异源基因(例如EC 4. 1.1.1)或插入编码醇脱氬酶的异源 基因(例如EC 1. 1. 1. 1, EC 1. 1. 1. 2， EC 1. 1. 1. 71或EC 1. 1. 99. 8 )
或上调已存在的编码醇脱氢酶的基因是有益的。
根据本发明，还提供了生产发酵产物的方法，其包括在合适的条 件下培养根据本发明的菌株。
根据本发明的菌林是严格厌氧性微生物，因此优选的是通过在严 格厌氧性条件下进行的发酵过程来生产发酵产物。此外，根据本发明 的菌林是嗜热微生物，因此，当在约40-95iC的范围内，例如约50-90 'C的范围内，包括约60-85'C的范围内，例如约65-75'C的范围内的温 度下进行操作时，该过程可以最优地进行。
对于某些发酵产物的生产而言，选择特定的发酵过程(例如分批 发酵过程，包括补料分批过程或连续发酵过程)将是有益的。
根据本发明，该方法可用于大范围的发酵产物(包括酸，醇，酮 和氢)的生产。因此，根据本发明可生产发酵产物，例如乙醇，丁醇， 丙醇，甲醇，丙二醇，丁二醇，乳酸，丙酸盐，乙酸盐，琥珀酸盐， 丁酸盐，甲酸盐和丙酮。
在以下非限制性实施例和附图中进 一 步描述本发明。
附图简述
图1:基于16S rDNA序列分析的显示菌林BGl在相关嗜热梭状芽 孢杆菌中的位置的系统树。T.是r力er迈os/ aero6a"er物种，Tm.是 7y er迈0麵er幽"e/7亂线条(bar)表示2%的核普酸取代。
图2:来自BG1的24小时分批发酵的产物分布。▲:木糖(mM ), △:乳酸盐(raM) , □:乙酸盐(mM) , :乙醇(mM)， :氢(raM), ■:细胞密度(OD578)。
图3:温度对用5 g/1木糖分批厌氧性生长的菌林BG1的特定生 长速率的影响。3次独立测量的标准偏差用棒表示。
图4:来自不同pH值下的BG1分批发酵的产物形成。△:乳酸盐 (raM) , □:乙酸盐(inM) ， 乙醇(mM)。
图5:在BA培养基(在该培养基中添加了 5 g/1的木糖和各种浓
16度的乙醇)上生长的菌林BG1的分批发酵。消耗每g木糖的mM产物中 的产物产量作为培养基中初始乙醇浓度的函数进行展示。乙酸盐， 厶乳酸盐，乙醇。
图6:用混合糖作为碳源的分批发酵中的BG1糖消耗。2种不同糖 混合物的实验(每个实验一式两份)的糖浓度作为接种菌林BG1后的 时间的函数进行展示。■:葡萄糖，▲:木糖， :阿拉伯糖，x: 半乳糖，□:甘露糖。
图7:在不同浓度的葡萄糖下分批生长的BGl(空心符号)和BG1L1 (实心符号)。A:乙醇(正方形)，乳酸盐(圆形)和乙酸盐(三角 形)作为乙醇浓度的函数。B: A中所示实验的碳回收。
图8:在不同浓度的木糖下分批生长的BG1 (空心符号)和BG1L1 (实心符号)。A:乙醇(正方形)，乳酸盐(圆形)和乙酸盐(三角 形)作为乙醇浓度的函数。B: A中所示实验的碳回收。
图9:在不同浓度的外源添加的乙醇下分批生长的BG1(空心符号) 和BG1L1 (实心符号)。A:乙醇(正方形)，乳酸盐(圆形)和乙酸 盐(三角形)作为乙醇浓度的函数。B: A中所示实验的碳回收。
图10:表中缩写HRT:水压保持时间(hydraulic retention time) , Glu:葡萄糖，Xyl:木糖，Ace:乙酸盐，CGlu:消耗的葡萄 糖，CXyl:消耗的木糖，CS:总消耗的糖，YAce/TS:乙酸盐产量(g/g 初始糖)，YEtOH/TS:乙醇产量(g/g初始糖)，YEtOH/TS:经乙醇 蒸发校正的初始糖的乙醇产量，QEtOH:单位体积的乙醇生产率 (columetic ethanol productivity), CR: 碳回收。
图11:各种麦秆水解产物的悬浮液的流入的糖浓度。未稀释的麦 秆水解产物(23。/。DM; 77g/l可溶性糖；57g/l葡萄糖和20g/l木糖)。
图12:在70。C下在FBR中用BG1L1从各种麦秆水解产物悬浮液中
荻得的产物产量。
图13:在70匸下来自具有固定化的嗜热厌氧性细菌BG1L1的连续 流化床反应器(continuous fluidized bed reactor)的各种酸7片解 的玉米茎水解产物悬浮液的流入的糖浓度(A)和糖转化(B)。
17图l七在7(TC下来自具有固定化的嗜热厌氧性细菌BG1L1的连续 流化床反应器的各种酸水解的玉米茎水解产物悬浮液的流出的产物浓 度(乙酸盐和乙醇)和流入的乙酸盐浓度。
图15:在70。C下来自具有固定化的嗜热厌氧性细菌BG1L1的连续 流化床反应器的各种酸水解的玉米茎水解产物悬浮液的乙醇产量和碳 回收。
图16:在70'C下来自具有固定化的嗜热厌氧性细菌BG1L1的连续 流化床反应器的各种湿爆破的麦秆水解产物悬浮液的乙醇和乙酸盐产 量。
图17:用于缺失7762bp区域的构建体，该区域含有丙酮酸-4失氧 还蛋白氧化还原酶亚基编码基因，来自BG1的染色体。up: BG11丙酮 酸-铁氧还蛋白氧化还原酶的上游区域。down: BG1丙酮酸-铁氧还蛋 白氧化还原酶的下游区域。HTK:编码高热稳定性卡那霉素抗性表达盒 的基因。
图18:在7(TC下用5个独立的BG1PF克隆进行分批发酵后的终产 物分布。
图19:用于将反义表达盒导入BG1的染色体中的构建体。up: BG1 乳酸脱氢酶的上游区域。down:乳酸脱氢酶基因的下游区域。HTK:编 码高热稳定性卡那霉素抗性表达盒的基因，prom:启动子，ter:终止 子。来自hydA的335bp片段以反义方向克隆入启动子和终止子之间的 克隆位点。
图20:从在葡萄糖或木糖上生长的BG1， BG1L1和BG1H1分离的 总RNA的RNA印迹分析。RNA分离自指数生长的细胞。上图使用针 对hydA反义的探针。下图针对hyd mRNA的hydA部分的探针。RM
分子量标记带示于右侧。
图21:分批生长的BG1 (空心和实心正方形)，BGILI(三角形)
和BG1H1 (空心和实心圆形)的生长，木糖消耗，乙酸盐产量，乳酸
盐产量，乙醇产量和氢产量。
18实施例 材料和方法
在下文实施例中应用下列材料和方法。 菌林和生长条件
从70'C的冰岛温泉中厌氧性地分离菌林BG1。除非另有说明，如 (Larsen等人，1997 )中所述，在70。C下，在具有2g/1酵母提取物 的基本培养基(BA)中厌氧性地培养所有菌抹。对于固态培养基，使用 含有BA培养基(具有llg/1植物凝胶(phytagel)和额外的3. 8g/l MgCh 6H20)的转管(Huangate RE， 1969; Bryant MP， 1972)。为了 进行克隆，使用大肠杆菌ToplO ( Invitrogen, USA ) 。 ToplO在37。C 下在LB培养基(当需要时，补充lOOjug/ml氨爷青霉素和25Mg/ml 卡那霉素)(Ausubel等人，1997 )中进行常规培养。
连续反应器
制备用于连续培养的发酵培养基，并用如上所述的相同无机物， 痕量金属和酵母提取物进行补充。调整培养基的初始pH值为7. 4-7. 7， 并在120。C高压灭菌30分钟。为确保厌氧性条件，用&/(:02(4: 1) 的混合物沖洗培养基45分钟，最后将Na2S注射入瓶子，使其终浓度 为0. 25g/l。
反应器为带水套的玻璃柱，其内径为4.2厘米，高为20厘米。反 应器的工作体积为200ml。流入物从反应器底部进入，并通过蠕动泵 (Model 503S-10rpm， Watson Marlow， Falmouth, UK)控制供料。 利用同一螺动果(Model 503—50rpm， Watson Marlow， Falmouth, UK) 实现循环流动，且循环程度为确保反应器中向上流的速率为lra/h。除 非另有说明，通过添加NaOH(l-2M)来维持pH值为7.0。反应器装载 有75ml载体材料(carrier material )，且最后在120。C下对整个反 应器系统(包括管道系统和循环贮液器)高压灭菌30分钟。液体样品 从位于反应器顶部且在反应器出口附近的取样口取出。在70'C下通过 外部加热和玻璃套中的热水循环来进行实验。
实验期间，只要达到稳定状态，就改变HRT或糖浓度。稳定状态条件的标准是所有参数必须保持不变，持续至少5倍停留时间。不同 稳定状态下的反应器效能通过测量糖和终末发酵产物浓度进行监控。 实验期间，利用无菌的注射器和针从流入物和流出物中取出样品，并 将样品储存于-2 (TC直至用于分析。利用排出的气体样品确定二氧化碳 和氢的含量。
对污染的检测
从反应器中取出lml样品，用来自A&A Biotech (波兰)的DNA 纯化试剂盒纯化染色体DNA。用Pfu聚合酶(MBI Fermentas， Germany) 和退火至细菌rDNA的引物B-all 27F ( SEQ ID NO: 1; GAG TTT GAT CCT GGC TCA G)和B-all 1492R (SEQ ID NO: 2; ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT)进行PCR反应。片段用来自Qiagen的Qiaex II试剂盒进行纯化， 用PNK (MBI Fermentas )进行处理，并克隆入用CIAP ( MBI Fermentas ) 处理的pBluescript SK+ ( Stratagene ),然后转4t入大肠杆菌ToplO (Invitrogen)。挑选50个克隆，并用B-all 27F和B-all 1492R 引物扩增插入物。获得的片段用和#6oI限制性酶(MBI Fermentas)消化，并在3%的琼脂糖凝胶上进行电泳。仅得到一个消 化模式。将2个片段送去测序(MWG Biotech, Germany)，并鉴定为 A10。还使用分别退火至乳酸脱氢酶的上游和下游区域的引物ldhcwl 和ldhccw2进行PCR反应。另外，使用与用于B-all引物的条件相同 的反应条件。获得的片段(如上)进行克隆，并利用限制性片段长度 多态性分析26个片段。这再次仅导致一个模式。对2片段进行了测序。
分析方法
如所述，菌林在无抗生素的BA培养基中分批生长24-48小时。在 65。C下用4mM硫酸作为洗脱液，利用有机酸分析柱(Aminex HPX-87H column (Bio-Rad))在Hewlett Packard系列1100 HPLC上针对葡 萄糖，木糖，乙酸盐，乳酸盐和乙醇对培养物上清液进行分析。
酶和试剂
除非另有说明，酶由MBI Fermentas (Germany)供应且根据供应 商的建议进行使用。PCR反应用1单位1单位的Taq聚合酶和Pfu
20聚合酶的混合物进行。化学制剂是分子级的，且购自Sigma-Aldrich Sweden AB。
16S rRNA分析
收获200jul BG1过夜培养物，在最高效果下用微波处理2分钟， 用作PCR模板。通过PCR利用引物B1 (GAG TTT GAT CCT GGC TCA G) (SEQ ID NO: 3 )和B2 ( ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT ) ( SEQ ID NO: 4 ) 扩增1500bp的16S rDNA。平末端PCR片段用多核苷酸激酶进行处理， 并克隆入用5toal消化且用CIP (牛小肠磷酸酶)处理的pBluescript SK+栽体(Stratagene)。利用J7"I， 和#// 6I限制性酶通过限
制性酶片段分析法分析来自所得DNA文库的24个克隆。将6个片段送 到MWG-Biotech (Germany)进行测序。利用VectorNTi进行比对且利 用MEGAS程序(Kumar等人，2001 )画出比对树。
分析技术
在65。C下用4mM疏酸作为洗脱液，利用有机酸分析柱(Aminex HPX-87H column (Bio-Rad Laboratories, CA USA))在HPLC上针 对纤维二糖，葡萄糖，木糖，乙酸盐，乳酸盐和乙醇对培养物上清液 进行分析。用具有火焰离子化检测的气相色谱验证乙醇和乙酸盐的测 量。在80。C下用7K作为洗脱液，利用Phe画enex，顧Monosaccharide (00H- 0130-K0)柱在HPLC上测量混合的糖。甘露糖和阿拉伯糖不能利 用这一设备进行区分，因此在单独的培养物中进行检测。利用GC82 气相色语(MikroLab Aarhus， Denmark)测量氛。
ldh敲除盒的构建
最终的敲除构建体，p3CH含有1) BG1的1-ldh基因的上游DNA 片段， 利用引物 ldhuplF (SEQ ID NO: 5; 5'-TTCCATATCTGTAAGTCCCGCTAAAG )和 ldhup2R ( SEQ ID NO: 6; 5'-ATTAATACAATAGTTTTGACAAATCC)进行扩增；2)从质粒pUC18HTK (Hoseki等人，1999 )扩增的编码高热稳定性卡那霉素抗性的基因； 3) BG1的l-ldh基因的下游DNA片段,利用引物ldhdown3F ( SEQ ID NO: 7; -ATATAAAAAGTCACAGTGTGAA )和ldhdo簡4R (SEQ ID NO: 8;
215'-CACCTATTTTGCACTTTTTTTC)进行扩增。质粒p3CH进行线性化并电 穿孔入BG1。
氢化酶反义构建体的构建
将含有氢化酶A反义盒的DNA片段SEQ ID NO: 9插入p3CH。 pfor敲除盒的构建
最终的敲除构建体，pPF含有1 ) BG1的l-ldh基因的上游DNA片 段， 利用 引物 pforuplF ( SEQ ID NO: 10; 5'-GAGGATTTAAGAAGGGGAGTTGG )和pforup2R (SEQ ID NO: 11; 5、 ATTTCATCTCCCCCTGGATAAAG )进行扩增；2 )从质粒pUC18HTK ( Hoseki 等人，1999 )扩增的编码高热稳定性卡那霉素抗性的基因；3) BG1的 l-ldh基因的下游DNA片段，利用引物pfordown3F ( SEQ ID NO: 12; 5'-CGAGAGCTGATTCCCACGAAGA)和pford醒4R (SEQ ID NO: 13; 5,-CA GACTACTACAACTGGATCTAGC)进行扩增。质粒p3PF进行线性化并电穿孔 入BGl。
BG1的电穿孔
除了电穿孔外，所有操作都在厌氧性条件下进行。为制备感受态 细胞，用新鲜的BGl的ON培养物接种150ml BA (用2g/l酵母提取物 和5g/l木糖改进)至OD578为0. 1并在70C下温育。当0D"8-0. 5 时，在水上冷冻细胞并进行收获(3500rpm, 35分钟，4'C ),然后重 悬于10ml冷的EP緩沖液(0. 3M蔗糖，10%甘油，3. 20mM Na2S, pH7， 用无菌N2气体冲洗)中。重复洗涤，最终将团块重悬于4ml无Na2S的 EP-緩冲液中。将细胞以等分试样储存于-8(TC。将O. 2ml感受态细胞 转移至含有2ug线性化的质粒DNA的电穿孔试管(0. l厘米电极间距) 中，并遭受25juF, 500欧姆和2. 0kV的脉沖。将细胞转移至含有10ml BA培养基(具有2g/1酵母提取物)的无氧血清瓶。经电穿孔的细胞 允许在70。C下恢复16小时。然后将它们10倍稀释入含有35jug/ml 卡那霉素的BA培养基中。24小时后，重复转移入含有卡那霉素的培 养基的步骤，且使培养物在70。C下生长"小时。利用Himgate技术 (Bryant MP， 1972; Hungate RE， 1969 )将0. 5ml培养物转移至具有35 u g/ml卡那霉素的转管。在70。C下温育2天后，挑选菌落(colony) 并接种入无抗生素的BA培养基中。从4个单独的重組克隆和wt BGl 中纯化染色体DNA。利用分别仅退火至ldh基因的上游和下游的引物 ldhcwl和ldhccw2从染色体DNA扩增2. lkb的片段。这些片段用限制 性酶消化进行分析并进行测序。使用内部的卜ldh引物的PCR反应仅 得到wt BGl用作模板时的产物。 RNA印迹分析
利用A&A Biotechnology (Poland)的Total RNA试齐'J盒如供应 商所推荐从50ml的指数生长的77 eivz7oa/7aero^c^er细胞纯化RNA。 5 jug总RNA在含有80mM硫氰酸胍的1%琼脂糖凝胶(mRNA印迹)或5% 变性丙烯酰胺凝胶(反义印迹)上电泳。利用TurboBlotter系统 (Scleicher & Schuell Bioscience GmbH, Germany)如所推荐进行 印迹分析。利用Ambion， Inc. (TX， USA)的UUrahyb溶液进行杂交， 并根据标准方法(Ausubel等人，1997 )进行洗涤。利用带标记的cc -P"CTP从pSKPhydD (由在反义构建体中使用的相同的hydD片段(但 没有启动子和终止子序列)插入pBluescript SK+ (Invitrogen)的 MCS而得)转录正义和反义探针。
产量和碳回收
基于以下反应(不包括ATP和NAD(P)+转化)计算理论上的最高 产量和碳回收
1 M葡萄糖—2 M乳酸盐，
1 M葡萄糖—2 M乙酸盐+ 2 M C02,
1 M葡萄糖—2 M乙醇+ 2 M C02
3 M木糖—5 M乳酸盐，
3 M木糖—5 M乙酸盐+ 5 M C02,
3 M木糖—5 M乙醇+ 5 M C02
因此，葡萄糖和木糖的理论最高乙醇产量分别为2和1. 67摩尔/摩尔。
如下计算碳回收
23[3 x (mM产生的乳酸盐+ mM产生的乙酸盐+ raM产生的乙 醇)]/[nx (mM消耗的底物)]x画。
其中，对于木糖而言n为5，对于葡萄糖而言n为6。
实施例1
BG1的16S分析
构建菌祙BG1的1500bp 16S rDNA片段的文库，并用限制性片段 长度多态性分析法对不同序列进行分析。仅发现一个消化模式，并对 6个克隆进行了测序。6个序列是相同的，且在www. ncbi. nlm. nih. gov 上的DNA同源性搜索表明菌林BG1在r力e77Z70fl/2aero6a"er迈aMra/n7 的群组(其现在由菌抹A3和BG1组成)中。BG1的16S rDNA序列作 为SEQ ID NO: 14示于序列表中。除了在菌林A3的GenBank (Benson 等人，2005 )序列中7个未测序的位置外，2个菌林具有相同的16S rDNA 序列。如图1所示，最接近的其他亲缘物是热粪热厌氧菌 (r力eryz70a/2aer06ac^er fAeryzzocopr/ae, 98%同一寸生),乙醜乙基热 厌氧菌 (r力er/woa/7aero6acfer acetoe^^r/yci^ ， 95% ) 和 77 e/"迈oa/2aerc^a"er /^//cw51 ( 95%) 。 BG1与Thermoanaerobacter mathranii菌抹A3 (Larsen等人，1997 )紧密相关。如之前所述，这 使得BG1位于梭状芽孢杆菌的第V簇(Collins等人，19")。虽然
这些菌林紧密相关，但是当提到对半纤维素水解产物的耐受性时，它 们很不相同。A3只能在高达40。/。的麦秆水解产物(60g/l补充木糖的 麦秆干重的)中生长，而BG1可以在未稀释的没有添加糖或酶的水解 产物中生长并产生乙醇。此外，据报道菌林A3不能在半乳糖上生长 (Larsen等人，1997 )，而BG1用半乳糖作为唯一碳源生长良好且主 要产生乙醇(数据未展示)。 实施例2 BG1的发酵产物
用27mM木糖作为唯一碳源，使BG1厌氧性分批生长24小时(图 2)。在发酵的前4个小时，产生几乎等量的乙酸盐和乙醇。在生长的 4和6小时之间，相对于乙酸盐，乙醇的产量增加，而在指数生长期
24后期或在稳定期，几乎完全产生乙醇。在整个实验中，仅产生少量的
乳酸盐。氢产生似乎跟随着乙酸盐的产生，产生大约等摩尔量的这2 种化合物。 实施例3
BG1的温度，pH和乙醇耐受性
如从图3可以看到的，菌抹BG1的最适宜温度为大约70°C，与分 离BG1的温泉的温度相同。发现BG1在pH=5. 0至7. 5的pH范围内生 长。在分批实验中，在培养基的不同pH值下测试产物形成。如图4 所示，在6. 5至7. 5的pH范围内，乙醇生产得到促进，而在更低的 pH下则主要生产乳酸盐。在pH = 6. 5和pH = 7. 5时乙醇的最佳产量 为1. 15 mM乙醇/ mM木糖。在pH5. 5时，乙醇产量为0. 44 niM / mM。 这分别相应于理论最高产量的69%和26%。
对于乙醇生产而言，乙醇耐受性具有显著的重要性。在提高的外 源乙醇浓度下研究产物形成。如图5中所示，在增加的乙醇浓度下， 乙醇产量显著下降。在培养基中0%初始乙醇时，产量为1, 05 mM乙醇 / mM消耗的木糖，而在2. 8%乙醇时，产量为0.31 mM/mM。乙醇产量 的下降主要是因为乳酸盐产量的增加(增加6.4倍)，但乙酸盐产量 液增加了 40%。显然，没有形成其他主要产物，因为在所有浓度下从 乙酸盐，乙醇，乳酸盐产量计算的碳回收在92-99%范围内(数据未展 示)。
实施例4
半纤维素糖的BG1共发酵
对于用于乙醇生产的微生物而言同时吸收并代谢不同糖类是期望 的，但这并不是很普通的性状。在2种不同糖类混合物(各含有4种 不同的半纤维素糖单体)上分批测试BG1，以研究是否可以同时代谢 混合的单体(图6)。甘露糖和阿拉伯糖不能在我们的HPLC设备中进 行区分，因此在单独的混合物中进行测试。如从图6可以看到的，在 生长的6小时和8小时之间观察到所有添加的糖的同时降解。木糖的 降解速率与葡萄糖的降解速率一样，虽然木糖降解的起始稍微有点延迟。半乳糖和阿拉伯糖是最后被降解的，且降解速率均低于葡萄糖和 木糖的速率。观察到甘露糖降解的速率是最快的，但与葡萄糖相比， 其降解的起始也延迟了。
实施例5
BG1L1和BGL2:来自BG1的卜ldh基因的缺失
为了阻止乳酸盐的形成，缺失BG1的L-LDH基因。将纯化的 pKHFr3rev质粒(含有侧翼于ldh的上游和下游区域的热稳定性卡那 霉素抗性基因)线性化并电穿孔入BG1，利用热稳定性卡那霉素抗性 基因挑选阳性重組子。分离数个独立的克隆并通过PCR进行验证。随 后对来自2个克隆的PCR产物进行测序，发现如所预期的，其含有代 替乳酸脱氢酶基因的卡那霉素抗性盒。2个突变体菌林命名为BG1L1 和BG1L2。
在不同浓度的葡萄糖和木糖上生长wt BG1菌林和这2个菌株 BG1L1和BG1L2，以测试它们的乙醇生产效能(图7和8 )。为了简明 起见，仅展示BG1L1，但平行菌抹BG1L2显示出非常类似的结果，甚 至在木糖上具有比BG1L1稍微更高的最高产量。
如从图7和8可以看到的，在突变体中产物分布产生巨大的变化。 利用葡萄糖或木糖作为底物，没有检测剖乳酸盐产生，这证实了乳酸 脱氢酶基因的缺失。还显示，本文所描述的ldh基因是BGl中仅有的 ldh基因或是主要的ldh基因。野生型BG1对增加的底物浓度作出应 答，增加了乳酸盐产量，尤其是当在木糖上生长时。并且看到相应的 较低的乙醇和乙酸盐产量。在更高的糖浓度下，乙酸盐产量不变或更 低，且由于其不能产生乳酸盐，因此看到持续高或渐增的乙醇产量。 在突变体中乙醇产量显著改善在葡萄糖上，与wt菌林中的51-56% 相比，在BG1L1中看到84-91%的理论最高产量。在木糖上，BG1L1和 BGlwt的乙醇产量分别为76-80%和40-63%。碳回收在91和106%之间 (图7B和8B)。 100%以上的回收可能由酵母提取物组分的代谢引起。
图9展示在培养基中渐增的乙醇浓度下，与BG1L相比的BG1的乙 醇产量。wt BG1对培养基中增加的乙醇浓度作出应答，显著增加了乳
26酸盐产量。乙酸盐产量增加大约2倍。当添加2.8% (v/v)的乙醇时， 乙醇产量减少至最高理论产量的仅2(T/。。在BG1L中，没有乳酸盐产生， 且在更高乙醇浓度下乙酸盐产量并不显著增加。结果，在培养基中的 所有乙醇浓度下，乙醇产量均很高。事实上，在添加1.95%乙醇时， 测量到的最高产量为理论最高产量的84%，且在添加2,8%乙醇时，产 量仍为理论最高产量的72%。碳回收在84和99%之间(图9B)。用独 立的克隆BG1L2重复实验，获得类似的结果。 实施例6
利用BG1L1的糖的连续发酵
在70X:下操作的实验室规模的流化床反应器中研究将固定化的 嗜热厌氧性细菌用于连续乙醇发酵的潜能(图10)。用具有10g/l木 糖的补料流检测水压停留时间(HRT)对乙醇产量和生产率的影响。产 物浓度和木糖转化几乎不受逐渐降低的HRT (从8至1小时)的影响。 糖转化高于97. 8%,产生0. 33g乙醇/g初始糖，且乙醇生产率从0. 43 逐渐增加至3. 34 g/l/h。进行第二个实验以研究葡萄糖和木糖的共发 酵。在糖混合物高达54g/l下，2种糖均同时有效地转化成乙醇，糖 利用高于90.6%。在这些糖浓度下，乙醇产量逐渐增加且达到的最高 乙醇浓度为15. 35g/l。乙醇产量为0. 28-0. 40g乙醇/g初始糖。在8 小时的HRT和30g/l糖下获得的最高乙醇生产率为1. 1g/l/h。这一研 究证明，嗜热厌氧性细菌的活性固定化细胞培养是可能的。该反应器 连续运作140天没有污染物，显示良好的长期效能。
实施例7
利用BG1L1的蒸汽爆破的麦秆的连续发酵
通过蒸汽爆破、随后进行酶促水解(利用Novozyraes A/S提供的 Celluclast和Novozyme188 )制备蒸汽爆破的麦秆水解产物(SEWS)， 以释放組成成分糖，葡萄糖和木糖。由ELSAM， DK提供SEWS。该水解 产物具有23%的干物质含量(DM),且葡萄糖和木糖分别为"g/l和
30g/i。为避免细菌污染，将sews加热至12rc，持续1分钟。根据
想要的7. 5°/。和15% DM浓度(分别相应于12和43g/l的葡萄糖-木糖
27混合物)，通过添加各自体积的水制备2种SEWS悬浮液(图11 )。 尽管2种SEWS培养基经灭菌且未解毒，菌抹BG1L1也能够有效地共发 酵葡萄糖和木糖，具有0.39-0.4 g/g的相对高的乙醇产量(图12)。 对于2种测试的SEWS悬浮液，葡萄糖均被完全利用(>98%)，而在 15% (DM) SEWS下木糖转化从99%下降至80%，但是，总体糖转化高于 90%。乙酸盐是主要的副产物，且在整个发酵期间维持相对较低 (0.07-0.08 g/g)(图12)。
在所有这些发酵中，如所预期的，仅产生少量的乳酸盐，因为该 菌抹是乳酸脱氬酶缺陷型突变体。
2个实验期间(持续大约140天)，通过从反应器样品中纯化染 色体DNA定期地针对污染检查反应器，未发现其他非BG1L1物种。还 发现乳酸脱氢酶的缺失也是稳定的，如乳酸脱氢酶区域的测序所示。
实施例8
利用BG1L1的酸预处理的玉米茎的连续发酵
由National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO, USA) 提供通过稀硫酸水解制备的玉米茎水解产物(PCS)。该水解产物具有 30% (wt)的总固体(TS)含量，且木糖，葡萄糖和乙酸浓度分别为 67g/l， 15g/l和14g/l。使用浓度为2. 5%-15%TS的玉米茎水解产物。 由于2. 5%和5% TS的水解产物悬浮液中的低总糖浓度，添加额外的 5g/l木糖至这些悬浮液中以防止可能由相对低的糖含量引起的最后 的工艺问题。
利用2. 5-10% TS范围内的PCS水解产物浓度，乙醇产量逐渐增加， 且获得0.41-0. 43g/g范围的相对高且稳定的乙醇产量(图15)。对 于2. 5-7. 5% TS的PCS而言，达到几乎完全的糖利用(高于95%)， 而在10% (TS)下，糖转化降低至大约85% (图16)。在15% TS的PCS 浓度下，糖转化为70%且获得接近0. 35g/g的相对高的乙醇产量。与 其他水解产物浓度相比，15% (TS) PCS下的较低的糖转化(图13)可 能是因为由以下因素的生长和产物抑制引起高浓度的乙酸盐、存在 于水解产物中的其他抑制剂和添加的用于控制pH的碱导致的盐累积(Lynd等人，2001; Palmqvist和Hahn-Hagerdal 2000; Zalvidar 等人.2001 )。但是，15。/。TS的PCS下的低乙醇产量(图15)可能是 由于比预期更高的乙醇蒸发，因为碳回收较低(CR<0. 9)。
乙酸盐产量从大约l增加至3. 5g/1 (图14)。但是，由于补料流 中的高初始乙酸盐浓度(大约l-7g/1)，在流出物中出现相当高浓度 的乙酸盐(接近10g/i)，考虑到乙酸对发酵的抑制作用，这是很显 著的。这些结果清楚地展示该生物体对未解毒的PCS中存在的代谢抑 制剂的高耐受性。 实施例9
BG1PF:菌株BG1的乳酸盐生产突变体
通过将图20中所示的DNA片段插入BG1的染色体制备衍生于BG1 的菌林。将纯化的ppta32K质粒(含有侧翼于pfor的上游和下游区域 的热稳定性卡那霉素抗性基因)线性化并电穿孔入BG1，且利用热稳 定性卡那霉素抗性基因挑选阳性重组子。分离数个独立的克隆并通过 PCR进行验证。随后对来自2个克隆的PCR产物进行测序，发现如所 预期的，其含有代替pfor的卡那霉素抗性盒。
用5g/1木糖作为碳源，使5个独立的BG1PF克隆分批生长2天。 如从图21可以看到的，在代谢中看到完全转变，现在乳酸盐是发酵的 主要产物。
实施例10
BG1H1:通过下调吸氢酶(uptake hydrogenase)构建的具有增加 的氢产量的BG1突变体
氳化酶涉及氩的生产和吸收。在BG1中，发现具有已知氢化酶相 似性的2个序列。 一个(hydA BG1 )在DNA水平上与腾沖嗜热厌氧菌 (r力er迈oa/7sero6a"er te/7gco，/2s/s) hydA基因具有80. 4%的同一 性且在氨基酸水平上与相应的HydA蛋白具有91.8%的同一性。HydA 蛋白是ra. 7e/7^70/^e/ Ws ( 1015 )的胞液MD(H)依赖性唯铁 (Fe-only)氩化酶中的4个亚基之一。该NADH依赖性氢化酶活性受 高氩分压抑制，而醛脱氢酶和醇脱氢酶活性在生长于提高的P (H2)下的r. ^/^cw^e/7s^中更高。类似地，在具有低p(iy的发酵罐培养物 中，乙醇生产几乎被废止。
发现BG1中与氢化酶具有相似性的第二个序列与腾沖嗜热厌氧菌 的echE基因具有73%的同一性，且与腾沖嗜热厌氧菌的Ech氢化酶的 EchE蛋白亚基具有76%的同一性。Ech氢化酶是在腾沖嗜热厌氧菌提 取物的膜部分中发现的一种铁氧还蛋白依赖性[NiFe]氩化酶。2种腾 沖嗜热厌氧菌氢化酶都是主要的氢进化酶。
在r力ei7Z7os/7aero^sc&r BG1中，在高和低p (H2)下主产物都是乙 醇。因此，可能它针对氩和乙醇生产使用了不同的策略。通过将下调 echE和hydA表达的盒导入BG1的染色体来研究下调2种氬化酶的影 响。该盒的基本构建示于图22中。当将该盒导入BG1中时，乳酸脱氢 酶基因被移除，且启动子被激活。这导致分别与含有hydA和echE的 mRNA互补的小转录物的表达。在大部分情况下，由于双链RNA的消化， 这一表达将导致低水平的mRNA。
hydA反义RM的表达和hydA mRNA的相应下调通过RNA印迹进行 验证(图23)。从BG1纯化总RNA,将其转移至膜上，并用分别与hydA 反义RNA和mRNA互补的探针进行探查。已显示用于表达反义RNA的启 动子受葡萄糖抑制，且在木糖存在下被诱导。与此一致，仅当在木糖 上生长时看到反义。野生型BG1菌株和BG1L1菌抹(其中已缺失ldh 但没有插入反义)也显示作为对照。如所预期的，在这些菌林中没有 看到hydA反义RNA。预期来自hydA操纵子的转录物长度约为500b。 当使用针对含有hydA的raRNA的探针时，看到作为大约6000-7000b 迁移的条带。还看到i至2条大约3000-4000b的较小且较强的条带， 特别是当细胞用木糖作为碳源生长时。最小的条带可能是与16SrRNA 的交叉杂交物。相应于3-4000b RM的RNA在强度上变化很大。与葡 萄糖相比，在木糖上生长期间，该种类水平高得多；与野生型相比， 在缺失乳酸脱氢酶的菌林中，该种类的水平也更高。当在葡萄糖上生 长时，该条带的水平在BG1L1和BG1H1中是相等的，而在木糖上生长 期间，在不表达反义的菌林中该条带强得多。这与在上图中显示的反
30义RNA的表达完全一致。
如图24所示，BG1H1比对照菌林产生更多的乙酸盐，更多的氢和 较少的乙醇。这表明BG1的HydABCD氢化酶参与氢吸收，而不是如其 在ra. 7^gco/^ew"所展示的生产。由于NAD (P) H是乙酰辅酶A还 原成乙醛和乙醛还原成乙醇所需要的，因此很可能的是HydABCD氢化 酶利用氢参与这些辅因子的还原。乙酸盐和氢都是颇有价值的产物， 因此如果目标是更高的氢和乙酸盐产量，那么菌林BG1H1是优选的。参考文献
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权利要求
1、选自BG1的Thermoanaerobac termathranii菌株(DSMZ登录号18280)及其突变体。
2、 权利要求1的菌林，其中所述菌林能够在含有具有至少10% wt/wt的干物质含量的经水解的木质纤维素生物材料物质的培养基中生 长。
3、 权利要求2的菌抹，其中所述干物质含量为至少15% wt/wt。
4、 权利要求2的菌抹，其中所述干物质含量为至少20% wt/wt。
5、 权利要求2的菌抹，其中所述干物质含量为至少25% wt/wt。
6、 权利要求2的菌林，其中所述经水解的木质纤维素生物材料 物质选自庭园垃圾，碎木块，禾秆，'干草，果皮和种皮。
7、 权利要求l的菌林，其能够在70。C或7(TC以上生长。
8、 权利要求1的菌林，其能够在作为唯一碳源的半乳糖上生长。
9、 冲又利要求1的菌林，其能够产生选自酸，醇，酮和氢的发酵产物。
10、 权利要求9的菌林，其中所述醇选自乙醇，丁醇，丙醇，曱 醇，丙二醇和丁二醇。
11、 权利要求9的菌林，其中所述酸选自乳酸，丙酸盐，乙酸盐， 琥珀酸盐，丁酸盐和甲酸盐。
12、 权利要求9的菌林，其中所述酮是丙酮。
13、 权利要求1的菌林，其中已插入，缺失或基本灭活一个或多 个基因。
14、 权利要求1的菌林，其中已下调或基本灭活编码乳酸脱氢酶 (LDH) (EC 1. 1. 1. 27)的基因。
15、 权利要求14的菌林，其中所述编码乳酸脱氢酶(LDH) (EC 1. 1. 1. 27 )的基因已通过缺失所述基因被灭活。
16、 权利要求14的菌株，其中所迷编码乳酸脱氢酶(LDH) (EC 1.1.1.27)的基因已通过在所述基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸基本灭活。
17、 权利要求14的菌林，其是BG1L1 (DSMZ登录号18283 )。
18、 权利要求1的菌林，其中已下调或基本灭活编码丙酮酸-铁氧 还蛋白氧化还原酶(EC 1. 2. 7. 1 )的基因。
19、 权利要求1的菌林，其中编码丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶 (EC 1.2. 7.1)的基因已通过在所述基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸基本灭活。
20、 权利要求18的菌林，其是BG1PF1 (DSMZ登录号18282 )。
21、 权利要求1的菌林，其中已下调或基本灭活编码氢化酶或氢 化酶亚基的基因。
22、 权利要求21的菌林，其中所述编码氩化酶或氢化酶亚基的基 因已通过在所迷基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸基本灭活。
23、 权利要求21的菌株，其中编码氢化酶或氢化酶亚基的基因选 自[Fe]-氢化酶和[NiFe]-氢化酶(EC 1.6.5.3, EC 1.12.7.2， EC 1.12.99.6)，例如NuoE， NuoF， NuoG， EchB， EchC， EchD， EchE和 EchF。
24、 权利要求21的菌抹，其是BG1H1 (DSMZ登录号18281 )。
25、 权利要求1的菌抹，其中编码乙酸激酶(EC 2. 7.2.1)的基 因已通过在所述基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸基本灭活。
26、 权利要求l的菌林，其中编码磷酸乙酰转移酶(EC 2. 3. 1. 8) 的基因已通过在所述基因中突变，缺失或插入一个或多个氨基酸基本灭 活。
27、 权利要求l的菌林，其中已插入一个或多个基因。
28、 权利要求27的菌林，其中已插入一个或多个编码多糖酶的基因。
29、 权利要求28的菌林，其中所述多糖酶选自纤维素酶(例如 EC3. 2. 1.4); p-葡聚糖酶，包括葡聚糖-1,3 P-葡糖苷酶(外切-1， 3 p-葡聚糖酶，EC 3. 2.1.58) ， 1，4-p-纤维二糖水解酶(EC3. 2. 1.91) 和内切-l, 3 (4) - P -葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 6 );木聚糖酶，包括内切-1， 4-P -木聚糖酶(EC 3. 2. 1. 8 )和木聚糖1， 4- |3 -木糖苷酶(EC 3. 2. 1. 37 ); 果胶酶(EC3. 2. 1.15) ; oc-葡糖苷酸酶，oc-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)，乙酰酯酶(EC 3. 1. L-)，乙酰木聚糖酯酶(EC 3. 1. 1. 72 )， oc -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1 ) ， P -淀粉酶(EC3. 2. 1. 2 )，葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)，支链淀粉酶(EC 3.2.1.41) ， p-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)，半纤维素酶，阿拉伯糖苷酶，甘露聚糖酶，包括甘露聚糖 内切-l，4-p-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.78)和甘露聚糖内切-l，6-a-甘 露糖苷酶(EC 3.2.1.101)，果胶水解酶，多聚半乳糖醛酸酶(EC3. 2. 1.15)，聚半乳糖醛酸外切酶(EC 3. 2. 1. 67 )和果胶酸裂合酶(EC4. 2. 2. 10)。
30、 权利要求27的菌林，其中已插入一个或多个编码丙酮酸脱羧 酶(EC 4. 1. 1. 1 )的基因。
31、 权利要求27的菌林，其中已插入一个或多个编码醇脱氢酶 (EC 1.1.1.1, EC 1.1.1.2， EC 1.1.1.71， EC 1.1.99.8)的基因。
32、 权利要求1的菌林，其中已增加一个或多个编码醇脱氢酶的 基因的表达。
33、 一种生产发酵产物的方法，其包括在合适的条件下培养权利 要求1-32中任一项的菌林。
34、 权利要求33的方法，其是在严格厌氧性条件下进行的发酵过程。
35、 权利要求33的方法，其在约40-95。C的范围内，例如约50-90 。C的范围内，包括约60-85。C的范围内，例如约65-75。C的范围内的温度下进行操作。
36、 权利要求34的方法，其中发酵过程是分批发酵过程。
37、 权利要求34的方法，其中发酵过程是连续发酵过程。
38、 权利要求33的方法，其中发酵产物选自酸，醇，酮和氢。
39、 权利要求38的方法，其中所述醇选自乙醇，丁醇，丙醇，甲 醇，丙二醇和丁二醇。
40、 权利要求38的方法，其中所述酸选自乳酸，丙酸盐，乙酸盐，琥珀酸盐，丁酸盐和甲酸盐。
41、权利要求38的方法，其中所述酮是丙酮
全文摘要
属于Thermoanaerobacter mathranii的严格厌氧性嗜热菌及其突变体和衍生物。该细菌特别适合于从木质纤维素生物材料生产发酵产物，例如乙醇，乳酸，乙酸和氢。
文档编号C12N1/20GK101490242SQ200780025893
公开日2009年7月22日 申请日期2007年5月22日 优先权日2006年5月22日
发明者B·K·阿灵, M·J·米克尔森 申请人:比奥咖索尔Ipr有限公司