专利名称：用电导或电化学活跃标签实时定量分析与监察核酸扩增的方法与系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测和定量分析核酸及与核酸偶联的分子的新颖及非显 而易见的方法，所述方法包括以核酸或与核酸偶联的分子的聚合酶连锁反应(PCR) 作实时电化学检测方法检测，其中在所述PCR辅助的扩增步骤中，电化学或电导标签 会连接到目标核酸.
背景技术：
核酸分析在病原休及遗传病检测中起重要作用。近年，它的实用性可在不同 类型的应用中反映出来，如即时诊断、环境及食物监察、生物武器检测。在众多DNA 分析技术中，实时聚合酶连锁反应已成为高速测试和准确定量的关键技术。
多种根据实时聚合酶链锁反应(RT-PCR)及利用荧光键联结指示器如SYBR Greenl、水解探针、杂交探针的测试已被开发，同时应用于DNA扩增及PCR扩增子检 测当中。尽管被广泛接受，它们的用途多数被限制于临床及研究实验室的装配中。 要提升这项技术在即时检验(POCT)中的应用，其困难在于DNA扩增子检测需要庞大而 复杂的光学系统。同时，以手提式仪器来进行DNA分析的目标亦很难达到，因为所述 仪器需要利用庞大和笨重的视光检测系统为基础。一个对于这种用途更合适的替代， 尤其对POCT特别适合的替代是一个以检测电化学信号为基础的系统。
以前曾经进行过很多关于电化学DNA感应器的研究，其中有些是将焦点集中于检测PC財广增子。亦曾经发展过含有与电化学信号标签连接的DNA微型芯片，而该微 型芯片与电化学检测系统相联合使用在识别post-PCR产品上。与荧光基底RT-PCR方 法相比，先有技术如上述后者的post-PCR杂交基底平台需要较长的实验时间和配备 较窄的动态范围。
因此，本领域需要发展一个准确、能重复、及安全的检测和定量分析在样本 中的核酸方法，而该方法也可在小规模仪器中进行。
图l显示了一幅根据本发明的一个实施例而构建的使用氧化还原(red-ox)探 针固相方法的示意图。
图2A提供了一幅根据本发明的同一实施例而显示了在不同PCR循环数目中二 茂铁的微分脉冲信号。
图2B显示了一幅在经过25-循环PCR后，有(正极，虚线)或没有(负极，实 线)目标模板的氧化铟锡(ITO)的电极微分脉冲伏安扫描。
图3是一幅根据本发明的一个实施例而构建的使用了肽-核酸(PNA)为探针的
本发明方法的概图。
图4是一幅显示了根据本发明一个实施例中而构建的(A)以硅和玻璃为基片的 布图；(B)进行PCR之前，经寡核酸俘获探针修改的ITO电极的最初状态；和(C)在PCR 最后阶段的最后已延长的俘获探针示意图。
图5是一幅根据本发明的同一实施例而构建的IT0电极而没有配备模板的微分
脉冲伏安扫描。芯片在乙醇胺中培养时间不同(a)l小时；(b)2小时；(C)3小时；
和(d)4小时。电化学测定的进行条件为100mV/s脉冲幅度和25mV/s扫描速度。背景信 号在30-循环PCR的结尾获取。
图6A显示了一幅根据本发明的同一实施例而构成，在不同电极扫描策略中， 在一电极微分脉冲伏安扫描中的最大电流信号相对于PCR循环数目的变化图。(a) 单一扫描含模板(3X106c叩ies/mL); (b) ■多数扫描含模板(3X 106cx)Pies/mL); (c) ▲单一扫描缺模板。
图6B显示了一幅根据本发明的一个实施例而构成，在不同Vent聚合酶浓度中，
7含DNA模板(3 X 103copieS/mL)的电流信号逆PCR循环数目图表。(a) ■ 0. 32units/mL; (b) * 0. 24units/raL;and(c) ▲ 0. 04unUs/uL.
图6C显示了一幅在从10宝1(^DNA copies/mL的一系例稀释中，荧光信号(SYBR Green assay)相对于PCR循环数目的变化图。
(a) 10bcopy/mL; (b) 10ocopy/mL; (c) l01copy/mL; (d) 10'!copy/mL; (e) 102copy/mL; (f) 阴性对比。
图7A显示了一幅根据本发明的同一实施例而构成，从10S至1(/DNA copies/mL 的一系例稀释中最大电流信号相对于PCR循环数目的变化图。(a)来3X102;(b) X 3X10:i;(c) ▲ 3X101， (d) ■ 3X105;(e) 3X106。图7B是一幅根据本发明的 同一实施例而构成的阀值设定于O. lnA的标准曲线图。
图8显示了一幅根据本发明的一个实施例而构成的在30-循环PCR之后的最大 电流信号相对于探针浓度的变化图。在探针固定步骤中，探针浓度为10nM至100mM， 而最初模板浓度为3X 106copies/mL。
发明内容
基于上述背景，本发明目的是提供检测和定量在一个样本中的核酸或与核酸 偶联的分子的方法和系统。
因此，本发明在一方面提供一个经形成由聚合酶连锁反应(PCR)产生的多核 酸，以电化学或电学技术监测或定量分析多核酸的数量的实时固相的方法，，所述
方法包括以下步骤
接触一样本，其中所述样本包含靶核酸， 一与固体表面结合的探针其包含了 一第一引物，而该第一引物的其中一个序列与靶核酸其中一端的最少一部分互补， 一在溶液中的第二引物，而该第二引物的其中一个序列与靶核酸互补链的相对一端 的最少一部分互补，和电化学或具有导电能力的标记物，而该标记物被设计成可以 与由链聚合反应产生的多核酸合并，而在上述合并的同时，如有电压降，能产生信 号改变；
在能有效地进行PCR扩大的情况下加入聚合酶连锁反应酶；
在样本上施加电压，并对由合并于固体表面结合探针的被标签的标记物所产生的电信号进行实时检测或测量；和
定量分析在样本中核酸和多核酸的数量，而多核酸数量是由将信号相对时间 的变化与多核酸的形成联系起来而产生的数量。
本发明在另一方面提供一个实时液相方法利用电化学或电学技术来监测或定 量分析由聚合酶连锁反应(PCR)产生的多核酸而成的核酸的数量，该方法包括以下 步骤
接触一样本，其中所述样本包含靶核酸， 一探针带有中性电荷或正电荷，而 该探针与靶核酸的最少一部分互补，而当该探针杂交于靶核酸时，该探针只会被吸 引到电极表面，和电化学或具有导电能力的被标签标记物，而该标记物是有效地与 探针连接，而在杂交之后，当该标记物与靶核酸合并时，如有电压降，能产生强度 改变；
对样本施加电压和对由被标签标记物合并于靶核酸后产生的电学信号进行实 时检测或量度；和
定量分析在样本中核酸和多核酸的数量，而多核酸数量是由信号相对时间的 变化与多核酸的形成联系起来而产生的数量。
本发明的另一方面提供了一微型芯片，包括一电化学或电导电极，和一固体 支撑物设计成可以接收一含有核酸的分子，其中该微型芯片设计成可以使用在如上 描述的固相或液相方法。该电极包含一表面，而该表面包含一固体支撑物；在一更 优选实施例中，该固休支撑物包括玻璃，而最少一电极的表面，被组成图案和被结 合到该微型芯片中，是由氧化铟锡，金，或铂组成。
在另一优选实施例中，该微型芯片还包括一温度传感器和一微加热器，而该 温度传感器和微加热器被结合到该微型芯片中。
本发明在另一方面还提供了一用来量度电化学或电导信号的装置，包括本发 明的微型芯片。在一个优选实施例中，该装置是一便携式装置和/或一微装置。 在另一方面，本发明提供了一电化学信号检测装备，包括本发明的PCR引物和微型芯 片；在一个更优选的实施例中，该装备还包括除了引物和其类似物的PCR试剂。
本发明具有很多优点。例如，在PCR反应中，因对核酸扩增的生成物进行的检 测和/或定量分析是实时进行，而本发明的方法与系统是耐热的，所以对PCR反应有
9很小影响。此外，这个方法即使没有洗掉未反应的分-了这额外步骤，依然是准确、 能重复、及安全的，，尤其在所述反应中使用了可溶解和未与标签合并的分子和标 记物。
另外，因为这方法可以使用在小规模即时检验装置中，它可以被结合到便携 式仪器用来对DNA进行即时检验分析。这对医学诊断工业以及在不同应用中的环境监
测给予一个很有意义的贡献。
当与以光学基底装置相比，本发明提供了一种可大大减低成本开支的技术； 特别地，本方法可以应用在微小装置，如便携式PCR分析器，而这种装置在现有的市 场上是不能找到的。再者，虽然目标核酸分析物所需的开始浓度是较光学基底方法 为高，但本发明的电化学基底实时PCR方法的敏感度高，在开始时只需要3个PCR循环。
具体实施例方式
本发明起于发明人希望对现有技术有所改善，以及希望可以避免使用在现今 技术中所需的笨重又昂贵的仪器。本发明针对存在于现今应用的工业标准光学方法 的固有缺憾，如PCR方法，同时本发明是对利用连接于固体底物的电化学标签来进行 实时检测的改进。
在研究过程中，发明人发明了一个比较简单、便宜、和优良的用来检测和定 量核酸的装置和方法。发明人知道在众多可供选择的方法中， 一个以电化学/电学信 号为基础的检测系统对于PCR反应条件来说是最适合的。此外，将这检测方法与加上 合适的电化学或电导指示器、扩增子或探针的PCR反应联系，，而该电化学标签可结 合到已扩增的核酸的时候，这个组合会成为一个用来检测和定量分析如核酸或与核 酸偶联的分子的目标大分子的优良方法。这个方法与现有技术相比，所需成本较少， 而且比较简单和准确。
定义
如本说明书和权利要求书所用，"样本"是指组织或由个人抽取出来液体的样 本，包括但不限于，例如，皮肤，血浆，血清，脊髓液，淋巴液，滑液，尿，眼泪， 血细胞，器官，肿瘤，以及体外细胞培养物组分的样本(包括但不限于由在细胞培养基生长的细胞所产生的条件培养基，重组细胞和细胞成分)。
"核酸"，"多核酸"和"寡核酸"是指被检测的引物、探针、低聚物片段，低聚 物控制物和未被标签的阻滞低聚物，同时也属于多聚脱氧核酸(含有2-脱氧-D-核 糖)，多聚核糖核酸(包含D-核糖)，以及任何其它种类的多核酸，而该多核酸是嘌呤 或嘧啶，或经修改是的喂呤或嘧啶基的N苷。本说明书和权利要求书没有意图去分辨 "核酸"， 〃多核酸"和"寡核酸"的长度，而这些术语是可交换使用的。这些术语只涉 及属于一级结构的分子。所以，这些术语包括双键和单键脱氧核糖核酸(DNA)，与及 双键和单键核糖核酸(RNA)。寡核酸是一个相对于一指定核酸序列的一个区域，包 含约莫最少6个核酸，优选地包含约莫最少10-12个核酸，及更优选地包含约莫最少 15-20个核酸的序列。 〃相等于〃是指与指定核酸序列相同或互补。
寡核酸不需要按自然规律从仟何现有或自然序列衍生出来，但可以是由任何 方法产生，包括化学合成，DNA复制，反转录或其任何结合的方法。"寡核酸"或"核 酸〃是指染色体组的DNA或RNA，互补脱氧核糖核酸(cDNA)，半合成的或依靠合成起源 的多核酸，而其起源或操作方法(l)不是与全部或一部分的多核酸联合的而是在自 然中联合;和/或(2)是和多核酸链接，除了是在自然中链接;和(3)不是在自然中找 到。
"肽核酸(PNA)"是指一人工制造，含有与脱氧核糖核酸或单键核糖核酸 (RNA)相似的结构的化合物，其中PNA的主链含有重复的和由肽键链接的N-(2-氨 基乙基)甘氨酸单位，为此不同类型嘌呤与嘧啶也可以用亚甲基羰基键链接于该主 链。基于这结构的PNA是不带电的。
"引物"可以是指多过一个引物和不论是在自然界出现的如一纯化限制性酶切 或是合成出来的寡核酸，所述合成出来的寡核酸可成为沿互补链合成的开始点，而 该合成是在与一核酸链互补的引物延伸产品合成的情况下被催化。上述的情况包括 在一适合的缓冲剂内(缓冲剂包括为辅助因素的取代基，或能改变pH、离子强度、 等)，在一适合的温度下，有四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸盐和一聚合反应产生 诱导物如脱氧核糖核酸聚合酶或逆转录酶存在。优选地，为了在扩增过程中获得最 大效率，引物是单键。
如本说明书和权利要求书所用，"靶核酸"，"靶序列"或"靶核酸序列〃是指
11寡核酸的其中一部分，该部分是将被扩增、被检测或以上两者都是。耙序列是在两 引物序列之间被用于扩增反应。
"探针"是指已被标签的寡核酸，而所述寡核酸由于和在探针中的最少一序列 与在靶区域的一序列的互补，与包含在靶核酸中的一序列形成一双螺旋结构，。特 别在固相方法中，当所有探针都已连在电极表面之上，其余在电极表面上的残留活 性部位可能被"封锁"以限制未连接或未反应的已标签标记物结合到电极表面。 如本说明书和权利要求书所用，"标签"是指任何可以用作提供可检测(优选地是可 计量的)信号，和可连接到核酸或蛋白的原子或分子。
"相邻的"是指相对于在模板核酸的互补链上的探针的引物位置。引物和探针 可被1至约莫20个核酸分隔，更优选地，约莫1至10个核酸，或可直接地彼此毗连， 或应用在独立于聚合反应的工序的检测。此外，如本申请中所教导的用于PCR扩增和 检测方法中，"相邻"可以是将被扩增的序列的任何位置。
如本说明书和权利要求书所用，"有效地连接"，"结合"或"连结"，在 广义上是指分子间或分子和底物表面间的缔合和包括，除了别的以外，在它们之间 直接或间接的(共价的或电价的)连接。为方便描述，"结合"普遍是指分子和固体 表面之间的缔合，其中"连结"普遍是指两个分子之间的缔合。"有效地连接"包 括所有种类的键合，不论是电价的或共价的，分子与分子或分子与表面。"具有电 化学或电导标签的标记物"，如在这里所使用，是指与电化学或电导分子连结的标 记物。
"二茂铁衍生物"是指含有两个环戊二烯基环与一中央金属原子如铁原子的 对边结合而形成一夹层结构的化合物。
本发明 一般方法
除非特别指明，本发明所使用的技术是指分子生物学中属于本技术范围的常 规技术。这些技术在文献中有充分解释。参考，例如，Sambrook， Frtisch&Maniatis， Molecular Cloning; A Laboratory Manual,Second Edition(1989) -'Oligonucleotide Synthesis (M. _J. Gait， ed. , 1984);禾口Nucleic Acid Hybridization (B. D Hames&S. J.Higgins， eds. ， 1984)。所以在本申请提及的专利、专利中请、和出版物，包括前 述和以下提及的，通过引用将该文献以其全文并入本申请。
在本发明提及的方法中所用试剂可以包装为诊断工具包。诊断工具包包括放 在不同容器内的己标签的标记物和引物。如标记物是未被标签，特定的标签试剂可 能被包括在该工具包内。工具包也可包括其它适于包装和扩增反应所需的试剂和材 料，例如，缓冲剂、dNTPs、禾口/或聚合工具，和检测分析所需的，如酶和固相萃取 剂，以及进行分析的说明。
从他们的研究，发明人发现了一新颖和非显而易见，使用固休支持物的电化 学实时PCR(ERT-PCR)技术，例如硅玻璃微型芯片，同时进行脱氧核糖核酸扩增和检 测的方法。这ERT-PCR芯片工序依赖在液相和/或固相中的寡核酸延伸和电化学量度， 如在PCR试剂和酶存在的情况下的连续或断续的信号。在本发明提及方法的一个优选 实施例中，需要其它参数配合，包括电极表面的钝化作用，和在PCR工序中的电化学 扫描模式。在研究过程中，发明人同时发现，当使用于高模板DNA检测(3X 106c叩ies/mL)， ERT-PCR的热循环开始(大约3-5循环)是较荧光基底方法为少，其 中所述热循环开始是分析信号开始能从背景分辨出来的情况。在发现小心控制固定 探针浓度和聚合酶的能力下，发明人对减低在芯片ERT-PCR中样版的最初浓度作出了 重大改进。在本专利提及ERT-PCR基底方法的其中一个实施列中，优选地使用微型芯 片平台，选择地电极/微型芯片可成为用于DNA接合的固相，而这将会是应用于POCT 的快速DNA检测的工业标准。
因此，本发明涉及一新颖和非显而易见的电化学或电子基底方法用于检测和 定量分析靶分子，包括核酸和/或与核酸连结的分子，包括进行PCR程序以使耙分子 与电化学和/或电导指示器接触，而指示器是在电导电极表面存在的情况下与靶分子 连接起来，由此，在PCR循环过程中靶分子扩增可以用电化学检测技术量度。在本方 法的其中一个优选实施例方法包括实时方法。本发明针对存在于现今光学，如荧光， 基底实施PCR方法的固有缺憾。本发明使用一新颖和非显而易见的策略，该策略基于 氧化还原剂标签指示器、扩增子或探针，如核酸或与核酸连结的分子的化合作用； 例如，上述探针是与肽氨酸连结的肽，而该探针可于存在着能检测到由探针发出的 电化学信号的电极的情况下进行PCR反应。在另一优选实施例中，本发明的方法和仪器适合用于使用固相氧化还原探针，如电极，的情况下进行PCR。这样，以PCR延伸 寡与核酸偶联与固相的方法来捕获探针与氧化还原标记物的电化学检测是可以允 许。在另一优选实施例中，该反应是实时检测。
发明人已发展一新颖和非显而易见的技术主要适合于使用在两种电化学基底 RT-PCR装置或仪器。第一种是适合于桌上使用，可提供优良表现予现有的如Applied Biosystem(ABI)， Stratagene和Roche生产的实时QPCR仪器。除此之外，医院、研究 /测试/教学实验室、食物/药物测试的政府实验室，也需要实时PCR仪器。第二种仪 器是便携式RT-PCR分析仪，这是一种较小型和可手携的装置，可对不同类型如那些 包含病菌及其相类似的核酸样本进行分析。以下是本发明提及的方法和装置的其它 应用，包括临床诊断和科学研究应用。便携式RT-PCR分析仪提供核酸生物感应器用 于不同种类和POCT包括用于遗传疾病分析，病毒定量分析，病原体识别，环境监测， 和药物监测，及其它。
因此，在实施本发明可优选地使用微型芯片平台策略。即是，对结合于扩增 核酸的氧化还原标记物进行的电化学检测可以在便携式芯片基底系统进行，更优选 地是实时进行。这电化学仪器和方法使用简单和小体积，如微小型，的仪器，与体 积庞大和复杂的、需要光学技术的荧光基底系统相比是较可取的。本发明也可应用 于在不同环境下，对生物分析物进行实时检测，如水病菌的。
在本发明的另一方面，发明人首次展示了结合在电极上的寡核酸探针的延伸， 如与已标签的标记物包括被二茂铁标签脱氧尿苷三磷酸(Fc-dUTP)取代的脱氧胸腺 嘧啶三磷酸(dTTP)—起，可用于实时监测DNA扩增。简单地，特定于一PCR靶核酸或 扩增子的寡核酸探针是固定在一电极如氧化铟锡(ITO)电极之上。然后，该电极是在 一传统PCR试管形式下浸入PCR溶液内；接着，靶核酸链因变性作用而开始被分开。 在之后的退火步骤中，所述热变性单链靶核酸或扩增子杂交于与ITO电极结合的探 针。探针由于在固相PCR的聚合酶的增加而令氧化还原剂标记物逐渐积累，而该氧化 还原剂标记物是在与已扩展DNA分子连结的扩增子或耙核酸中捕获，然后延伸至电极 表面上。在多个实验过程中，多个样本是在相同的条件下并行地运行。并入与电极 结合的扩增DNA发出的电化学或电学讯号会扩增如二茂铁信号，是以电化学技术量 度。。
14此外，发明人研究本发明提及的电化学检测方法对电极表面使钝化的影响， 和在PCR扩增中电化学扫描对表现的影响。在微型芯片上进行RT-PCR的能力对于用提 携式装置实施POCT应用最为重要。发明人的方向特别地在微型芯片形式上能减低背 景噪音以及增加电化学信号。
本发明的主要原则是电化学基底RT-PCR方法，包括以下的使用l)在电导电极 表面上的捕获核酸探针的固相延伸；2)当PCR循环数目增加，会有更多电化学或电 导指示器与已扩增的核酸基底结合；3)以微型芯片为平台，电化学和核酸扩增的集 成。
固相延伸方法
技术领域：
本发明提及的电学或电化学RT-PCR方法是基于被捕获的探针(在图1以虚线显 示)和被标签的标记物，如Fc-dUTP、 Fc-dATP、 Fc-dGTP或Fc-dCTP，以及其它电导 分子的固相延伸。这方法在图1中显示。在PCR变性作用步骤中(优选温度为约95。 C)， 双链扩增子被变性至单链20(在图1以实线显示)。在退火温度(55。 C)时，除扩增子 20和引物的溶液杂交外，扩增子20也和被固定的延伸探针杂交。此后，探针22延伸 并经聚合酶和Fc-dUTP合并。使用这策略，氧化还原信号逐渐增加，与扩增子的数量 成比例。最显著的特征是在每个PCR循环都能直接地检测扩增子的电化学信号.图2A 显示了在进行不同PCR循环后的ITO电极的微分脉冲伏安扫描。已合并Fc的电化学信 号随PCR循环数目增加。不论是没有模板或只用不特定模板，进行对照实验，以确定 被检测到的电化学信号是源被固定探针的特定延伸。结果显示在图2B。当阴对照实 验进行了25个循环后，获得接近平线的信号。当开始模板数目与现有技术的光学基 底RT-PCR相约时，应注意这EC系统的开始点(即，这点是信号能从底线分别出来)相 对于光学方法(通常是在15至20个循环)较早出现。这特征对POCT的超级快速DNA 识别特别吸引。
此外，本发明在一方面提供一个在一生物样本内的实时固相方法以电化学或 电学方式技术来监测或定量分析，由聚合酶连锁反应产生多核酸而成的核酸的数量， 该方法包括以下步骤
接触一样本，其中所述样本包含了靶核酸， 一与固体表面结合的探针其包含了一第一引物，而该第一引物的其中一个序列与耙核酸其中一端的最少一部分互补， 一在溶液中的第二引物，而该第二引物的其中一个序列与耙核酸互补链的相对一端 的最少一部分互补，和具有电化学活性或导电能力的标记物，而该标记物被设计成 可以与由链聚合反应产生的多核酸合并，而在上述合并的同时，如有电压降，能产 生信号改变；
在能有效地进行PCR扩增的情况下加入聚合酶连锁反应酶；
在样本上施加电压，并对由合并于固体表面结合探针的被标签的标记物所产 生的电信号进行实时检测或测量；和
定量分析在样本中核酸的数量和将信号对于时间的变化与多核酸组成联系起 来而产生的多核酸数量。
在一优选实施例中，所述的第一引物是被固定在固体表面上。在一更优选实 施例中，上述方法可包括在聚合作用前进行改变靶核酸特征的步骤；和优选地，所 述PCR步骤与一热稳定PCR酶进行。
在另一优选实施例中，信号改变可包括电流强度的改变，而这改变是与在样 本中核酸和产生出来的多核酸的浓度成比例。
所述方法可以在进行多过一个PCR扩增循环情况下使用。明显地，在这方法模 式中每一个信号改变都和在每一个PC財广增循环的多核酸产生形成出来的多核酸数 量成比例。在另一优选实施例中，电学信号可利用最少一对在样本中的具有电导性 电极被来检测和/或量度。电极的多个部分也可如上的描述使用。
在一优选实施例中，具有导电性能的电极的表面包括氧化铟锡，金，铂，碳 或有磁性的粒子。
在一更优选实施例中，探针可以结合在具电导性的电极表面。在这类型的方 法中，标签可包括二茂铁和其衍生物，以及其它技术人员可以认识的。
在另一优选实施例中，标记物的例子包括dUTP、 dATP、 dGTP、或dCTP，以及 其它能接受电化学活性标签和适合应用于在因PCR而发生的DNA扩增。 本专利也提供一形态简单的微型芯片，其包括一具电化学活性或具有导电性的电极; 和一设计成可以接收一包含核酸的分子的固体支持物，其中该微型芯片设计成可以 用于如上述的固相延伸方法。核酸可在实验室的环境下加进固体支持物，或已与特
16定探针连合的底物可因需要而购买回来使用。用于连接DNA到固体支持物的实验室技 术，以及适合于用作支持物的物料都是本领域已知的，所以不需在这类详述。固体 支持物物料的例子是玻璃。在另一实施例中，微型芯片包含一电极，而该电极有一 包含固体支持物的表面；换句话说，该电极设计成可以接收DNA。微型芯片本身也可 被合成了用于监测PCR扩增的一温度感应器和一微型发热器，而该温度感应器包含金 属或由金属形成。该温度感应器普遍地是由铂构成或包含铂。但是，其它金属如金 和铜，以及具备表达监测温度功能的材料也是合适的。被提供在装置和/或微型芯片 的其中一个电极，其表面普遍是由ITO构成或包含ITO，但其它金属如金和铂，或其 它导电材料也可被使用。电极或其表面可被装饰和被合成在微型芯片。
在本发明的另一实施例进一步提供一微型芯片，该微型芯片包含一电化学或 具有导电性电极模式的玻璃底物和一结合了温度感应器和微型加热器的硅芯片。在 这实施例中，该硅芯片是设计成可与该玻璃底物结合以在它们中间建立了一微室； 因此，PCR可以在该微室内进行和被监测。
在进一步实施例中，本专利提及的微型芯片可以合并到一用于量度电化学或 电学信号的装置。该装置可以是近似使用于本领域的其它装置或分析仪器的桌上型 装置，或在一新颖和优选的实施例中，该装置可以是便携式；优选地，与其它桌上 型装置比较，它有更縮减的体积。明显地，本技术的优点是能够制造适于实时场合 应用的准确和有效地小型分析仪器和装置。
为了实施本发明的方法和使用本发明的装置/分析仪器,发明人也提供一检测 电化学信号的工具包，包括本发明所提及的PCR引物和一个或多个微型芯片。该工具 包还包括除引物外的PCR试剂。这些工具包可选择性地与该装置或分析仪器一同售 出，而该装置或分析仪器可以是桌上型或便携型。
以肽酸核作基底的方法
在另一方面，本发明提供一以肽核酸(PNA)探针作基底的方法。该方法的优点 在于探针的电学中性，如标签了二茂铁的PNA探针(在某些情况下，探针可能会带有 微量正电荷)，和其快速与选择性结合、耐热性、与PCR的兼容性，以及氧化还原可 逆性。这是在本发明提及的方法中的一个特定形式，其可行原则可以在图3显示出来。在任何PCR的退热步骤中，不带电或带微量正电荷的二茂铁-PNA(Fc-PNA)探针28选 择地与带负电荷的PCR扩增子26和PCR引物结合。在退热步骤的结尾，以及在利用聚 合酶进行引物延伸以产生新扩增子的步骤前，扩增子-PNA杂种27以静电学形式，在 电势控制下，连接到感应器表面24。所以，PNA探针28的二茂铁标签是被带到与电 极表面24很接近的地方以用于电荷转移。电化学信号与在PCR产生的特定扩增子数 目成比例。
特别地，本发明提供第二种实时液相方法以电化学或电学技术来监测或定量 分析由聚合酶连锁反应产生多核酸而成的核酸的数量，该方法包括以下步骤
接触一样本包含靶核酸， 一探针带有中性或正电荷，而该探针与耙核酸其中 一端的最少一部分互补，以及当该探针杂交于靶核酸时，该探针只会被吸引到电极 表面，和具有电化学活性或导电能力的被标签标记物，而该标记物是有效地与探针 连接，以及在杂交之后，当该标记物与靶核酸合并时，如有电压降，能产生强度改 变；在样本上施加电压，并对由合并于固体表面结合探针的被标签的标记物所产生 的电信号进行实时检测或测量；和
定量分析在样本中核酸的数量和将信号对于时间的变化与多核酸组成联系起 来而产生的多核酸数量。
在一优选实施例中，该方法进一步包括通过计算信号强度变化对核酸扩增反 应产品的生产来进行定量分析的步骤，其中任何电流强度信号随时间变化即表示有 核酸扩增反应产品的生产；其中具有电化学活性或导电能力的被标签标记物的强度 变化与在样本中的扩增反应产品的浓度成比例。在一更优选实施例中，该方法可包 括进行多过一次PCR循环；其中在每一个PCR扩增循环中，被检测和/或量度的信号改 变数目与核酸扩增反应产品的生产成比例。在不同时间获得的信号显示了在不同PCR 扩增循环或循环组中的个清楚和可辨别的跳跃。在另一优选实施例中，通过将导电 性电极放在生物样本中来检查或量度电学信号。
如之前描述过的方法和仪器、装置或分析仪器，其中一个导电电极的表面是 由以下金属构成或包含以下金属IT0、金、铂、碳或有磁性的粒子。 在一优选实施例中，适合用于这方法的电化学标签包括一个或多个二茂铁或其二茂 铁衍生物，而该标签也适合负载于PCR标记物之中，如寡核酸或其它包含寡核酸的分子；该包含寡核酸的分子包括肽核酸分子或其它为本领域人员所认识的。其中一个 优选标记物肽核酸(PNA)分子。
在另一优选实施例中，标签了二茂铁的PNA是利用碳二亚胺化学连结技术来生 产出来的，其包括以下步骤
a) .将l-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶解在二甲基甲酰 胺(DMF) /二甲基亚砜(DMS0)溶液中；
b) .将二茂铁羧酸溶解在上述(a)溶液中；
c) .将在其末端连接了氨基组的PNA加进上述(b)溶液中，然后混合过
夜；禾U
d) .利用HPLC技术去纯化生产出来的Fc-DNA。 如前一方法中提及的工具包也可在本专利中使用，而该工具包可包括所有实
施本发明所需的组件，如引物、微型芯片、电极，PCR试剂、和其相同的物品。在使 用工具包之前，工具包可包括已标签的标记物，和其它特定制造的试剂。
发明人成功地显示出在一合成硅-玻璃微型芯片上实施ERT-PCR工序。在本发 明众多可选择的情况中，以下是较重要的会被详尽描述，包括电极表面钝化，电势 扫描对电化学检测平台的影响，定量分析表现，以及酶和探针浓度对信号-背景比例 的影响。根据速度和便携性，本新颖和非显而易见方法是相比于已发展的荧光基底 RT-PCR技术更优越。本发明其中的一实施例提及到在一块微型芯片上装置了多个可 实施电极，而这技术对于实时多任务检测有良好效果。对于将样本准备工序融合在 微小装置的技术上，本发明提供了一个方法和装置设计的大跃进。此外，本方法和 装置也提供了应用于实时核酸分析上的优良技术。
如下例子进一步说明本发明提及的方法和化学物，但不代表作为本发明的限
定。 例子
所有在本说明书提及的化学物是均来自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。除非 另有说明，所有PCR试剂都是购买自Invitrogen(Carlsbad, CA)。
19I) 固相方法
例子l: 固体底物的准备
首先在80° C下将涂了ITO的玻璃(Delta Technologies, Stillwater, MN)浸 入H202/丽40H/H20(1:1:5)溶液5分钟。然后，用水清洗玻璃以及在氮气下千燥。将水 解底物与在95%乙醇中的10%(3-环氧丙氧基丙基)三甲基乙氧基硅烷进行l小时处理。 在硅烷化程序之后，在50° C与真空下干燥该底物。
例子2: 探针与固体底物的连接
在磷酸盐缓冲剂生理盐水(磷酸盐缓冲盐水，100mM NaCl/10mM钠磷酸盐， pH7.0)中，将依照例子l所准备的底物与lmM寡核酸探针培养过夜，而该寡核酸探针 包含序列:5 ， -NH2-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AGG AAA CAG CTA TGA C-3 ， (SEQ. ID NO. l)剩余的探针用磷酸盐缓冲盐水洗掉。用乙醇胺将残留的环氧化物组分阻断30 分钟，之后用磷酸盐缓冲盐水再次冲洗。
例子3: 耙核酸的PCR扩增
PCR主要混合物包含lx ThermoPol反应缓冲剂(20mM Tris-HCl, 10mM (NH4) 2S04， 10raM KC1， 2mM MgS04， 0. l%Triton X-100， pH8. 8) ， 0. 2mM dNTPs (0. 06mM dTTP被 Fc-dUTP取代)，0. 2mM正向引物5' -GTA AAA CGA CGG CCA G-3， (SEQ ID NO. 2) ， 0. 2raM 反向引物5， -AAG GAA ACA GCT ATG AC-3， (SEQ ID NO. 3) ， 0. 02ng/raL M13mpl8模 板(Sigma) ， 0. 5mg/mL牛血清白蛋白，和O. 02units/mL VentR (外切-)DNA聚合酶(New England BioLabs， Ipswich, MA)。
之后，将功能化后的ITO芯片浸入在上述混合物中和进行依据以下条件进行热
循环
在95° C下进行初步变性作用2分钟；
分别在95° C下进行25个循环20秒，在55° C下进行25个循环20秒，以及在72 ° C下进行25个循环10秒。
20例子4: 被二茂铁-dUTP标签标记物的合成
Fc-dUTP主要是根据King et al的指引所合成的(Wlassoff ， W. A. ;King， G. C.， Nucleic Acid Res. 2002， 30， e58)，而在纯化程序中也作出了些微的修改以改善 产量。在若干PCR循环后，将涂了ITO的芯片从PCR试管取出，用水冲洗。
然后，利用Autolab PGSTAT30(Eco Chemie， The Netherlands)，设定脉冲幅 度为100mV和扫描速度为25mV/s的情况下来量度微分脉冲伏安。用铂作为对电极和伪 参比电极。
PCR的热力控制系统包括 一 数据采集卡(PCI-MI0-16E-1 ， National Instruments, Austin, TX)以及一与温度感应器连接的信号调节板(SC-2042-RTD， National Instruments) <>
在LabVIEW软件(National Instruments)中装备一 电子反馈比例积分微分 (PID)控制算法，以控制由 一 电源发出供应给发热器的电压(HP6629A ， Hewlett-Packard, Rockville， MD)。
利用Autolab PGSTAT30恒电位仪/恒流器(Eco Chemie， The Netherlands)来 进行电化学量度，而该仪器是邮eneral Purpose Electrochemical System(GPES) 软件(Eco Cheraie)控制。
例子5: 硅-玻璃微型芯片的制造
合成硅-玻璃微型芯片包含硅(Si) (400mm厚度)、和有金属图案和微型结构， 涂了ITO的玻璃底物(Delta Technologies, Stillwater, MN)。参考本专利的图4A、 4B和4C。
在Si芯片的前面72a以用薄膜铂(Pt)做成的发热器38和温度感应器36(100nm 厚度)的组成图案。利用蚀刻方法将PCR循环装置和微反应器42(长和阔5mm，深325 U m)放置在Si芯片背面72b，而该蚀刻方法是用感应耦合等离子体-深反应离子蚀刻 技术来进行。在Si芯片背面72b上，用ICP-DRIE技术蚀刻的馈送孔40(500mm半径， 100mm深度)是用作注射和移除PCR溶液。
涂了IT0的玻璃芯片70的中心包括铂薄膜伪参考电极和对电极30(100ntn厚 度)，而该两组电极是被四支IT0基底(100nm厚度)圆形的工作电极34包围，用来进行探针固定和寡核酸探针补获。
利用紫外光(UV)固化的光学胶接剂(Type UV-69， Summers Optical ， Hatfield, PA)来熔封硅72和玻璃芯片70 (硅芯片72是放置在玻璃芯片70的位置32上)。该固 化程序是根据生产商说明书，以及从发明人之前用作多任务检测大肠杆菌和枯草杆 菌的相似报告中获得。参考，Yeung， S. W. ;Lee，T. M. H. ;Cai，H. ;Hsing， I. M. Nucleic Acids Res。 2006， 34， ell8. =
例子6: 探针固定和电极钝化
在进行UV粘合前，被图案化的玻璃底物循序地在一 Alconox溶液(每升水含 8 g Alconox)、异丙醇、和水中(两次)进行超声波处理，而每次超声波处理为 15分钟。之后，经超声波处理的玻璃芯片在氮气下干燥以及在血浆清洁剂(Harrick Plasma, Ithaca, NY)中被处理IO分钟。
将被水解的玻璃底物浸在10%(3-环氧丙氧基丙基)三甲基乙氧基硅烷(溶解在 95%乙醇内)l小时。将被硅烷化底物在5(T C和真空下干燥3小时，然后与硅底物粘 合。在UV粘合后，将寡核酸探针溶液在磷酸盐缓冲盐水(PBS， 100 mM NaC1/10 mM 钠磷酸盐，pH 7. 0)放在微室培养过夜，而该寡核酸探针包含序列5' -NH2-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA AGG AAA CAG CTA TGA C-3' (SEQ。 ID NO. l)多余的探 针用磷酸盐缓冲盐水清洗。除非另有描述，用乙醇胺将残留的环氧化物组分堵塞12 小时。
最后，用经加压灭菌的双去离子水对微室作彻底清洗和并在氮气下干燥。
例子7: 电化学实时PCR方法例子
PCR主要混合物包含lx ThermoPol反应缓冲剂(20 mM Tris-HC1， 10mM (NH4)2S04， 10mMKCl， 2mMMgS04， 0. 1 % Triton X-100, pH 8. 8) ， 0. 2 mM dNTPs (with 0. 06 mM dTTP被Fc-dUTP取代),0. 2 mM正向引物5' - GTA AAA CGA CGG CCA G-3 ， (SEQ ID NO. 2) ， 0. 2 mM反向引物5 ， - AAG GAA ACA GCT ATG AC-3' (SEQ ID NO. 3)， 0. 04ng/mLM13mpl8模板(Sigma), 0. 5 mg/mL牛血清白蛋白，和0.04 units/mL VentR (外切-)DNA聚合酶(New England BioLabs, Ipswich, MA)。根据图4B和4C，该主要混合物被吸移到微室42禾Q，用Bostik' s Blu-Tack封闭注 入孔40。依据以下条件将芯片进行热循环在94° C下进行初步变性作用2分钟；分 别在94° C下进行30个循环20秒，在55° C下进行30个循环20秒，以及在72° C下 进行30个循环10秒。除了利用被图案化的发热器38 (如图4A显示)和温度感应器 36 (如图4A显示)作为芯片上的热控制，微型芯片的PCR热循环也可以利用常规PCR 仪(Eppendorf Mastercycler personal)而获得相似结果(该数据不显示在这说明 书中)。设定脉冲幅度为IOO mV和扫描速度为25mV/s的情况下来量度微分脉冲伏安。
例子8: 结果
图4B和4C显示一幅本专利提及的在硅-玻璃微型芯片上进行电化学实时
PCR(ERT-PCR的示意图)。能够成功地在芯片上实施ERT-PCR，然后用这方法获得在每 个PCR热循环中产生的PCR扩增子的增加数目而累积的电化学信号读数是十分重要 的。
这方法与在￡口口61^0忖@试管中进行的￡1^-PCR工序是不同的。参考，Yeung， S. W. ;Lee， T. M. H, ;Hsing， I. M. J. Am. Chem. Soc. 2006， 128， 13374-13375。这芯片 上ERT-PCR工序包括在密闭微小环境内进行液相和固相寡核酸延伸，和重复的电化电 位扫描，该电化电位扫描是在没用移除溶液和吸附在表面上的杂质的情况下进行。 多个决定性的因素，如感知电极的钝化、用在电化学扫描的策略、酶控制和寡核酸 探针浓度，会对这新实验平台的分析信号有重大影响。这些影响会在以后的段落中 讨论。
电极表面钝化
进行微型芯片ERT-PCR的方法的其中一个重大挑战是去减少,如不是要全部消 除，由液相Fc-dUTP制造出来的背景讯号。图5显示了背景讯号是与乙醇胺堵塞步骤 所用的时间非常有关系。因Fc-dUTP50产生的有特色的氧化还原峰(显示在图4B) ( +0. 57V对铂伪参考电极)在堵塞时间少于3小时下(在图5中的曲线c)是可看到的， 而这结果可能是因Fc-dUTP50在未反应的环氧化物组分中的非特定吸附，禾U/或因 Fc-dUTP50在IT0表面34的自由扩散而产生(显示在图4B)。对于长堵塞时间，即12小时(图5的曲线d)，所得出的底线差不多是平的。这暗示差不多所有的残留环氧 化物组分与乙醇胺反应；因此，Fc-dUTP50在电极表面34的非特定吸附和扩散是已 减到最少。故此，信号对噪音比例是大大的增加；所以， 一较低的检测限是可预见 的。在实施这方法时，用清洗步骤从溶液中移除自由可溶解标记物是不需要的，所 以这方法能做到RT-PCR定量分析。
电极扫描
本说明书提及的方法与荧光基底RT-PCR， ERT-PCR方法是不同的。本方法需要 在热循环过程中或在该过程中间竭的时间中进行电化学扫描，以为了在"实时"设 定中可以用"电化学技术"去监测PCR产品的扩增。在其中一实施例中，四个圆形ITO-基底电极34被图案化到硅-玻璃微型芯片70上。参考图4A。
最理想是可以对每一电极都可以进行多次扫描，例如在每一次PCR循环进行一 次扫描，和在三十次PCR循环中进行三十次扫描，而当中PCR表现是不会受到影响。 但事实上，带电荷的物种如NTPs， Mg2+，和聚合酶的吸附特性可能会因重复的电化学 位扫描而有所改变。该精细的改变可会影响在固体电极表面上进行的核酸延伸。
为了研究电化学扫描的影响，进行了在微型芯片的ERT-PCR工序，其中所有ITO 电极与相同的捕获探针同时被固定。在一微型芯片布置中，每五个循环便对全部四 个ITO电极都进行了进行了多次电化学扫描；而在其它的芯片上，在第O个、第10个、 第20个和第30个热循环时，分别对该四个ITO电极进行了选择性和单次扫描。
相对于荧光基底方法的优点
如从图6A可以看到，电化学信号按循环逐次增加，这表示Fc-dUTP氧化还原标 记物已成功合并在被延伸到探针上。在没有DNA模板的扩增中，较低的背景噪音(图 6A曲线c)表示非特定的电化学干扰已有效地减少。在开始模板浓度为3X 1(Tcopies/mL下，所需"启动"循环的数目是较荧光基底RT-PCR的(通常是15-25个 循环)为少，而该启动是指当在ERT-PCR( 3-5个循环)中的分析信号能从背景信号比 别出来。参考图6A和6C作比较。这暗示ERT-PCR技术需要较少的PCR循环。需要留意 的是，荧光基底方法是已知能检测非常低模板浓度的方法。本策略能减少所需开始
24模板浓度，描述如下。
在大循环数目下，被多次扫描的电极产生的电化学信号的平整增益(图6A曲 线b中，用方形显示的数据点)清楚地指示了相对于被单次扫描动电极(图6A曲线a 中，用圆形显示的数据点)，多次电化学扫描可能对工序有不利影响。其实，在大 循环数目下，相似的信号饱和图表也可在使用荧光基底RT-PCR方法来量度信号时观 察得到。
但是，引致这两种方法的信号饱和的原因是属于完全不同的种类。在荧光基 底方法中，这现象可能是由于限制试剂的损耗而产生；而在本ERT-PCR方法中，虽然 其中的机理仍不是能完全明白，所述现象很大可能是与电化学扫描本身有关。无论 如何，这实验结果强烈暗示了加进更多聚合酶能减低对多重扫描的影响(数据没有 在此显示)。其中一个解释这些结果的可能性是酶和其它物种的不可逆吸附。
虽然多重扫描可会对芯片上ERT-PCR工序做成影响，但这些影响是可用以下方 法避免的在微型芯片上包括更多ITO基底工作电极，和/或在特定的热循环中使用 每一个电极作为单次扫描之用途。这个策略反映出在单次扫描量度中，信号和循环 数目的线性关系(图.6A曲线a)。参考，如图6A。所以，在往后描述的例子中，实 验数据是基于单次扫描电极而得到。实际上，在电极上的被固定探针的密度也可影 响在ERT-PCR工序中的电化学信号，而这些含意会在往后的段落中讨论。
校准图表
在任何RT-PCR技术中，利用靶DNA分子(靶核酸)去评估RT-PCR表现是十分重要 的。本发明提及的ERT-PCR方法中，如显示在图7B的标准曲线是由在现时循环数目图 表中设定阀值为O. lnA，和设定不同最初模板浓度的情况下得到。除了如荧光基底 RT-PCR方法所要求的线性校准图表，电化学校准图表可以从用两线性体制，配合交 叉点为约10'5c叩ies/mL来估计出来。参考，例如图7B。应该注意的是，电化学RT-PCR 方法对比在高模板浓度(〉105COpies/mL)下己发展的荧光基底RT-PCR方法提供更优 良的表现，如以阈值循环数目而言，本方法的表现是较优良。
参考图7A，在模板浓度低于104copies/mL下(曲线a和b)，本电化学方法的 阀值循环数目超过任何荧光基底方法的数目，可能是由于液相引物和用于耙扩增子
25的被固定探针之间的竞争。在低靶拷贝数下，液相引物在退火步骤中有支配倾向。 因此，建立足够PCR产品(多核酸)数量去促进固相引物延伸可能是必要的，但这可 能导致在样本中最初DNA(靶核酸)的含量为低时需要一个大阀值循环数目。
酶和探针浓度对峰值电流信号的影响
如上述讨论，在低模板浓度时，所需的PCR阀值循环数目可能比较大。相对于 荧光基底方法来说，因背景荧光不容易消除，信号对背景的比例便难以增加。另一 方面，酶和探针的浓度可以被用于提高本发明提及到ERT-PCR方法的灵敏度。如图6A 所示，分析信号可因酶浓度的增加而有所增强(背景信号没有增加，数据没有在此 显示)。酶浓度增加八倍会使分析信号增强八倍。更重要的是，当最初模板浓度为3 X 1(fc叩ies/mL，阀值循环数目从25减低至小于5.
另一可改善信号对背景比例的方法可以是在固定步骤中，利用较高的探针浓 度。参考图8。在之前所提及的实验中的固定步骤，探针浓度均为lmM。当该浓度提 高至100mM，分析信号增强了8倍。
II) 液相方法
例子9: 芯片的制造和准备
应用在这液相方法的生物电路芯片是根据上述例子l的方法准备。
例子10: 溶液的准备
PCR主要混合物包含lx ThermoPol反应缓冲剂(20mMTris-HC1， 10mM(NH4)2S04， 10mM KC1， 2mM MgS04， 0, l%Triton X-100, pH8. 8) ， 0. 2mM dNTPs (withO. 06mM dTTP 被Fc-dUTP取代)，0. 2mM正向引物5' -GTA AAA CGA CGG CCA G-3' (SEQ. ID NO. 4)， 0. 2mM反向引物5' -AAG GAA ACA GCT ATG AC-3， (SEQ. ID NO. 5) , 0. 2mM Fc-PNA-探针5， -Fc-TAG AGT CGA CCT GCA GGC ATG C-3' (SEQ. ID NO. 6) ， 0. 04ng/mL M13mpl8 模板(Sigma) ， 0. 5mg/mL牛血清白蛋白，和O. 04units/mL VentR (外切-)DNA聚合酶 (New England BioLabs， Ipswich, MA)。例子ll: 电化学实时PCR
主要混合物被吸移到微室，用Bostik' s Blu-Tack封闭注入孔。依据以下条 件进行热循环在94° C下进行初步变性作用2分钟；在94° C下进行30个循环20秒(变 性作用)；在55° C下进行退火20秒；在25° C下进行量度60秒；以及在72° C下进行 延伸10秒。在量度步骤中，施加正电荷(即，+0. 5V对Pt/Pt参考/对电极20-30秒)， 然后设定脉冲幅度为100mV和扫描速度为25mV/s的情况下来进行微分脉冲伏安量度。 最后，施加负电荷以释放被连接的PC时广增子/引物/探针杂种回到液体内进行延伸。 本发明的优选实施例和例子在此完全描述。尽管本说明书提及个别实施例，本发明 所属领域的技术人员清楚知道本发明可在本发明范围内对其加以修改。因此，本发 明不应被理解为仅限于上述实施例所载。
例如，在固相方法的一个替代实施中，探针可包含一固定单位而非一与靶核 酸互补的序列。该固定单位因其序列与第一引物互补而使其与第一引物有效地偶联。 所以，通过与固定单位的相互作用，第一引物与固体表面联合，或结合在固体表面 上。
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权利要求
1. 一个实时固相方法，利用电化学或电学技术来监测或定量分析由聚合酶连锁反应产生的多核酸而成的核酸的数量，其特征在于，所述方法包括接触一样本，其中所述样本包含了靶核酸，一与固体表面结合的探针，所述探针包含了一第一引物，而所述第一引物的其中一个序列与所述靶核酸其中一端的最少一部分互补，一在溶液中的第二引物，而所述第二引物的其中一个序列与所述靶核酸互补链的相对一端的最少一部分互补，以及一电化学或具有导电能力的标记物，而所述标记物被设计成可以与由链聚合反应产生的多核酸合并，而在上述合并的同时，如有电压降，能产生信号改变；在能有效地进行PCR扩增下加入聚合酶连锁反应酶；对所述样本施加电压和对由被标签的标记物产生的电学信号进行实时检测或量度，而所述标记物与结合在固体表面的所述探针合并；和定量分析在样本中所述核酸和所述多核酸的数量，而所述多核酸数量是由将信号相对时间的变化与所述多核酸的形成联系起来而产生的数量。
2. 如权利要求l所述的方法，其中所述第一引物是固定在固体表面。
3. 如权利要求l所述的方法，其中所述方法进一步包括在聚合作用前， 对靶核酸进行变性；和其中聚合酶连锁反应酶包括一热稳定酶。
4. 如权利要求l所述的方法，其中所述信号改变包括电流强度的改变， 而所述电流强度改变是跟在样本中核酸浓度和产生出来的多核酸浓 度成比例。
5. 如权利要求l所述的方法，其中所述方法进一步包括进行多过一个PCR扩增循环；其中每一个信号改变都和在每一个PCR扩增循环中的 多核酸形成成比例。
6. 如权利要求l所述的方法，其中所述电学信号可利用在样本中的具有 电导性电极来检测或量度。
7. 如权利要求6所述的方法，其中至少一个所述具有导电性能的电极的 表面包括氧化铟锡，金，柏，碳或有磁性的粒子。
8. 如权利要求6所述的方法，其中至少一个所述探针是结合在具电导性 的电极表面。
9. 如权利要求l所述的方法，其中所述标签包括二茂铁或二茂铁衍生 物。
10. 如权利要求l所述的方法，其中所述标记物包括dUTP、 dATP、 dGTP、 或dCTP。
11. 一个实时液相方法，利用电化学或电学技术来监测或定量分析由聚 合酶连锁反应产生的多核酸而成的核酸的数量，其特征在于，所述 方法包括接触一样本，其中所述样本包含靶核酸， 一探针带有中性电荷或 正电荷，而所述探针与所述靶核酸的最少一部分互补，而当所述探 针杂交于所述靶核酸时，所述探针只会被吸引到电极表面，以及一 电化学或具有导电能力的被标签标记物，而该标记物是有效地与探 针连接，而当所述标记物杂交于靶核酸时，如有电压降，能产生强 度改变；对所述样本施加电压和对由所述被标签标记物合并于所述耙核酸 后产生的电学信号进行实时检测或量度；和定量分析在所述样本中所述核酸和所述多核酸的数量，而所述多 核酸数量是由将信号相对时间的变化与所述多核酸的形成联系起来而产生的数量。
12. 如权利要求ll所述的方法，其中所述方法进行步包括通过计算信号 强度改变而定量分析核酸扩增反应产品的形成，其中相对时间变化 的任何电流强度信号改变表示核酸扩增反应产品的形成；其中所述 电化学或具有导电能力的被标签标记物的强度改变跟在所述样本中 的扩增反应产品的浓度成比例。
13. 如权利要求ll所述的方法，其中所述方法进一步包括进行多过一个 PCR循环；其中在每一个PCR扩增循环中，检测和/或量度出来的信号 改变跟核酸扩增反应产品的形成成比例。
14. 如权利要求ll所述的方法，其中电学信号是利用在样本中的具有电 导性电极被来检测或量度。
15. 如权利要求14所述的方法，其中至少一个具有导电性能的电极的表 面包括氧化铟锡，金，钼，碳或有磁性的粒子。
16. 如权利要求ll所述的方法，其中所述标签包括二茂铁或二茂铁衍生 物。
17. 如权利要求ll所述的方法，其中所述标记物包括肽核酸。
18. 如权利要求ll所述的方法，其中所述探针包括肽核酸；和所述标签 包括二茂铁或二茂铁衍生物。
19. 一块微型芯片，其特征在于，所述微型芯片包含一电化学或具有导 电性的电极；和一固休支持物设计成接收一包含核酸的分子，其中 所述微型芯片设计成用于如权利要求l或ll所述的方法。
20. 如权利要求19所述的微型芯片，其中所述固体支持物包括玻璃。
21. 如权利要求19所述的微型芯片，其中所述电极的表面包括所述固体 支忖柳。
22. 如权利要求21所述的微型芯片，其中至少一个所述电极的表面包括氧化铟锡，金，或铂，以及被图案化及合成于所述微型芯片。
23. 如权利要求19所述的微型芯片，其中所述微型芯片包括被合成在其 中，用作监测聚合酶连锁反应(PCR)的温度感应器其包含金属；和微 型加热器。
24. 如权利要求23所述的微型芯片，其中所述微型加热器包含铂，金或铜。
25. 如权利要求19所述的微型芯片，其中所述微型芯片进一步包含一玻 璃底物,其中电化学或具有导电性的电极被图案化在所述玻璃底物； 一硅芯片，其中温度感应器和微型加热器被合成在所述硅芯片；其 中所述硅芯片设计成与所述玻璃底物结合以在它们中间建立以微 室，因此聚合酶连锁反应可以在该微室内进行和被监测。
26. —个用作量度电化学或电学信号的装置，其特征在于，所述制造包 含如权利要求19所述的微型芯片。
27. 如权利要求26所述的装置，其中所述装置是一便携装置。
28. —个电化学信号检测工具包，其特征在于，所述工具包包括聚合酶连锁反应引物；和 如权利要求19所述的微型芯片。
29. 如权利要求28所述的工具包，其中所述工具包进一步包括除PCR引物 外的PCR试剂。
全文摘要
一利用电化学或电学技术来监测和检测核酸扩增产品，即在每一个聚合酶连锁反应循环之后，利用具有电化学活性或导电能力的指示器作材料。在核酸扩增过程中，对电极施加电压和量度电学信号，而该电极是适合于定量分析样本核酸产生出来的扩增产品。这技术适合于实时场合的应用，如在遥远的位置检测生物分析物。
文档编号C12Q1/68GK101506380SQ200780029704
公开日2009年8月12日 申请日期2007年8月10日 优先权日2006年8月11日
发明者刑怡铭, 李铭鸿, 杨绍伟 申请人:香港科技大学