专利名称：：具有经修饰的用于在昆虫细胞中产生aav的aav-rep78翻译起始密码子的载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及昆虫细胞中腺伴随病毒的生产，以及病毒Rep蛋白表达和稳定性提高的腺伴随病毒，所述提高增加了昆虫细胞中腺伴随病毒载体的产量。
背景技术：
：腺伴随病毒(AAV)被认为是用于人类基因治疗的最有前景的病毒载体之一。AAV具有有效感染人类分裂及非分裂细胞的能力，AAV病毒基因组整合进宿主细胞基因组的一个单染色体位点，而且最重要的是，即使很多人带有AAV，但其跟任何疾病都无关。由于这些优点，人们正在血友病B、恶性黑素瘤、嚢性纤维化和其他疾病的基因治疗临床试验中对重组腺伴随病毒(rAAV)进行评价。所有支持AAV体外复制的宿主细胞都源自哺乳动物细胞类型。因此，用于基因治疗的rAAV至今主要是在哺乳动物细胞系上生产的，例如293细胞、C0S细胞、HeLa细胞、KB细胞和其他哺乳动物细胞系(参见如US6，156，303、US5，387，484、US5，741，683、US5，691，176、US5，688，676、US20020081721、WO00/47757、WO00/24916和WO96/17947)。rAAV载体通常在这种哺乳动物培养系统中的生产是通过提供含有侧翼带有AAV复制原点(末端反向重复序列即ITR)的治疗基因的DNA质粒，AAV复制蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的基因，以及病毒粒子或结构蛋白VP1、VP2和VP3的基因。另外，还提供一种含有腺病毒早期基因(E2A、E40RF6、VARNA)的质粒以加强AAV基因的表达和提高载体的产量(参见如Grimmetal.，1998，Hum.GeneTher.2745-2760)。然而，在大多数这些哺乳动物细胞培养系统中，每个细胞产生的AAV颗粒的数量的数量级为104个颗粒(在Clark,2002，KidneyInt.^i(Supp1.1):9-15中有所综述)。对于临床研究，可能需要1015个以上的rAAV颗粒。为了产生此数量的rAAV颗粒，需要转染和培养大约1()H个培养的人类293细胞，相当于5000个175cm2培养瓶的细胞，这意味着要转染多至10"个293细胞。因此，使用哺乳动物细胞培养系统进行大规模rAAV生产以获得临床试验的材料已被证明是非常麻烦的，商业,的生产甚至是不可行的。另外总存在一种危险，即在哺乳动物细胞培养中生产的用于临床的载体会被哺乳动物宿主细胞中存在的不想要的(或许是致病的)材料所污染。为了克服这些哺乳动物生产系统中的问题，最近开发了一种使用昆虫细胞的AAV生产系统(Urabeetal.,2002，Hum.GeneTher.U:19351943;US20030148506和US20040197895)。对昆虫细胞中的AAV生产，必须做一些修饰以获得正确比例的AAV衣壳蛋白(VP1、VP2和VP3)，其依靠两种剪接受体位点的轮换使用和VP2起始密码子ACG的次优使用，该密码子不能被昆虫细胞准确地复制。为了在昆虫细胞中模拟衣壳蛋白的正确比例，Urabe等人(2002，见上文)使用了一个转录为单个多顺反子信使的构建体，该多顺反子信使不需要剪接即可表达所有三种VP蛋白，并且其中最上游的起始密码子被替换为次优起始密码子ACG。在同时待决的申请(PCT/NL2005/050018)中，本发明人通过在昆虫细胞中进一步优化AAV衣壳蛋白的比例，还进一步提高了杆状病毒产生的rAAV载体的感染力。对于Urabe等人(2002，见上文)首先开发的AAV昆虫细胞表达系统中AAVR印蛋白的表达，使用了含有两个独立Rep表达单元(一个用于Rep78，一个用于R印52)的重组杆状病毒构建体，每个单元都在单独的昆虫细胞启动子(分别为AIEl和PolH启动子)的控制之下。在这一系统中，因为已知在哺乳动物细胞中，与Rep52相比，R印78的表达丰度较低会有利于较高的载体产量(Lietal.，1997，JVirol.U:5236-43;Grimmetal.，1998,见上文)，因此选择比PolH启动子弱;f艮多的启动子AIEl启动子用于驱动Rep78表达。然而更近地，Kohlbrenner等人(2005，Mol.TherH:1217-25)报告了Urabe等人使用的表达所述两种R印蛋白的杆状病毒构建体具有内在的不稳定性。通过在Urabe的原始载体中切开所述两种Rep基因的回文取向(palindromicorientation),并设计两个单独的杆状病毒载体表达Rep52和Rep78,Kohlbrenner等人(2005，见上文)提高了所述载体的传代稳定性。然而，尽管两个独立的杆状病毒Rep构建体可在昆虫细胞中恒定地表达R印52和Rep78至少五代，但是rAAV载体的产量与Urabe等人(2002，见上文)设计的原始杆状病毒R印构建体相比要低5-10倍。因此仍然需要克服在昆虫细胞中大规模(商业化)生产AAV载体的上述严重限制。因此提供在昆虫细胞中稳定和高产(大规模)地生产AAV载体的手段和方法是本发明的一个目标
发明内容定义本文使用的术语"可操作地连接"是指多核苷酸(或多肽)元件功能关系的连接。当使得一个核酸与另一个核#列有功能关系时，它就被"可操作地连接"。例如，如杲转录调控序列影响编码序列的转录，则它可操作地连接至所述编码序列。可操作地连接意味着相连接的DM序列通常是相邻的，并且在必须连接两个蛋白编码区时是相邻的且在阅读框中。"表达控制序列"是指调控与其可操作地连接的核苷酸序列表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调控核苷酸序列的转录和/或翻译时，则所ii^达控制序列"可操作地连接"至所述核苷^列。因此，表达控制序列可包括启动子、增强子、内核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、蛋白编码基因前面的起始密码子、内含子剪接信号和终止密码子。术语"表达控制序列"旨在至少包括被设计以影响表达的序列，也可包括其他的有用元件。例如，前导序列和融合伴随序列是表达控制序列。该术语也可包括从序列中除去框内或框外不想要的可能的起始密码子的核酸序列设计。它也可包括除去不想要的可能的剪接位点的核酸序列设计。它包括指导添加polyA尾的序列或多腺苷酸化序列(pA)，polyA尾为mRNA3'末端的一串腺嘌呤残基，即被称为polyA序列的序列。它还可被设计用来增强mRNA稳定性。已知昆虫细胞中影响转录和翻^HI定性的表达控制序列例如启动子，以及实现翻译的序列例如Kozak序列。表达控制序列具有调节与其可操作地连接的核苷酸序列从而得到更低或更高的表达水平的性质。本文使用的术语"启动子"或"转录调控序列"是指起到控制一个或多个编码序列转录的功能的核酸片段，它位于编码序列转录起始位点转录方向的上游，其结构特征在于存在依赖DNA的RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和任何其他DM序列，包括但不限于转录因子结合位点、抑制子和激活子蛋白结合位点和本领域技术人员已知的直接或间接调控启动子7转录量的任何其他核苷酸序列。"构成型"启动子是在绝大多数生理和发育条件下在绝大多数组织中有活性的启动子。"诱导型"启动子是受生理或发育调控例如通过使用化学诱导物调控的启动子。"组织特异型，，启动子只在特定类型的组织或细胞中有活性。术语"基本上相同"、"基4^目同"、"基本上相似"和"基本相似"是指两个肽或两个核苷酸序列在最优比对例如通过使用默认参数的程序GAP或BESTFIT比对时，至少共有一定百分比的序列同一性(在本文其他地方定义的)。GAP使用Needleman和Wunsch总体比对算法来对两个序列的全长进行比对，使匹配数目最大并使空位数目最小。通常，GAP使用的默认参数为空位形成罚分=50(核普酸)/8(蛋白)，空位延长罚分=3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸，使用的默认分数矩阵是nwsgapdna;对于蛋白，使用的默认分数矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)。当然，当认为RM序列与DNA序列基^目似或具有一定程度的序列同一性时，DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。序列比对和序列同一性百分比得分可使用计算机程序确定，例如GCGWisconsinPackage10.3版，可从AccelrysInc.,9685ScrantonRoad，SanDiego，CA92121-3752，USA获得；或开i文源码软件Emboss的Windows版(目前版本为2.7.1-07)。或者，相似度或同一性百分比可通过检索数据库例如FASTA、BLAST等获得。本发明的编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列也可按照它们分别与核苷酸序列SEQIDN0.10在温和或优选地在严格杂交条件下的杂交能力来定义。本文定义的严格杂交条件是使具有至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75个核苷酸或100个核苷酸，并且最优选约200个或更多核苷酸的核酸序列在约651C的温度下和在含约1M盐的溶液,优选6xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中杂交；并且，在65匸下和含约0.1M或更少的盐的溶液，优选O.2xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中漂洗。优选地，杂交过夜进行，即进行至少10小时，并优选地进行至少1小时的漂洗，其中至少换2次漂洗液。这些条件通常使具有约90。/。或更高序列同一性的序列特异性地杂交。本文定义的温和条件是使至少有约50个核苷酸，优选约200个或更多核苷酸的核酸序列在约45C的温度下和含约1M盐的溶液，优选6xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中杂交；并且，在室温下和含约1M盐的溶液，优选6xSSC溶液或任何其他含有相当的离子强度的溶液中漂洗。优选地，杂交过夜进行，即进行至少10小时，并优选地进行至少1小时的漂洗，其中至少换2次漂洗液。这些条件通常使具有最高至50%序列同一性的序列特异性地杂交。本领域技术人员能够修改这些杂交条件，以特异性地识别同一性在50%和90%之间的序列。具体实施例方式本发明涉及动物细小病毒、特别是依赖病毒如感染性人类或猿AAV及其组分(如动物细小病毒基因组)用作在哺乳动物细胞中导入和/或表达核酸的载体的用途。具体而言，本发明涉及这种细小病毒载体在昆虫细胞中产生时其产量的提高。细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可被分为两个亚科感染脊推动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒并包括依赖病毒属。正如可从其属名推断的，依赖病毒的成员很特殊，因为它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱瘆病毒共感染以在细胞培养中生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(如血清型1和4)的AAV，和感染其他温血动物的相关病毒(例如，牛、狗、马和羊腺伴随病毒)。关于细小病毒和细小病毒科的其他成员的更多信息在KennethI.Berns,"Parvoviridae:TheVirusesandTheirImplication,"FieldsVirology(3dEd.1996)第69章中有描述。为方便起见，本文将借助AAV进一步例证和描述本发明。然而应理解本发明不限于AAV，而是可同样地应用于其他细小病毒。所有已知的AAV血清型的基因组排列都非常相似。AAV的基因组是长度小于约5000核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。末端反向重复序列(ITR)位于非结构复制蛋白(Rep)和结构蛋白(VP)的独特编码核苷酸序列的侧翼。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端的145个nt是自身互补的并且具有可形成一个能量稳定的形成T形发夹的分子内双链的结构。这些发夹结构作为细胞DM聚合酶复合体的引物，具有病毒DM复制原点的功能。wtAAV感染哺乳动物细胞后，R印基因(即Rep78和Rep52)分别通过P5启动子和P19启动子表达，并且两个R印蛋白都在病毒基因组复制中起作用。R印ORF的剪接事件实际导致了四个R印蛋白(即Rep78、R印68、Rep52和Rep40)的表达。然而，已显示哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接mRNA对AAV载体生产U够的。昆虫细胞中的Rep78和R印52蛋白对AAV载体生产也是足够的。本文中的"重组细小病毒或AAV载体"(或"rAVV载体")是指含有一个或多个侧翼有细小病毒或AAV的末端反向重复序列(ITR)的目的多核苷^列、目的基因或"转基因"的载体。当这种rAAV载体在表达AAVrep和cap基因产物(即AAVRep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中存在时，它们可被复制并装配到感染性病毒颗粒中。当rAAV载体被整合到更大的核酸构建体(例如，染色体或另一用于克隆或转染的载体如质粒或杆状病毒)中时，那么rAAV载体通常被称为"前栽体"，它在存在AAV装配功能和必要辅助功能的情况下可通过复制和壳体化被"挽救"。本发明的第一方面涉及含有开放阅读框的核苷酸序列，所述开放阅读框含有编码动物细小病毒R印蛋白的核苷酸序列，其中细小病毒Rep78蛋白的翻译起始密码子是次优起始密码子。次优起始密码子优选地是实现部分外显子跳跃的起始密码子。本文中的部分外显子跳跃被理解为指至少部分核糖体不在Rep78蛋白的次优起始密码子而在一个更下游的起始密码子起始翻译，其中优选地更下游的起始密码子是R印52蛋白的起始密码子。次优起始密码子优选地在核苷酸序列在昆虫细胞中表达时实现部分外显子跳跃。优选地，使用杆状病毒表达，次优起始密码子在昆虫细胞中实现部分外显子跳跃，从而优选在感染后约20-40小时，更优选在约30-40小时，在昆虫细胞中产生的R印78和R印52的摩尔比范围为1:10到10:1、1:5到5:1或1:3到3:1。R印78和Rep52的摩尔比可通过实施例1.1,3所述的蛋白质印迹测定，优选地使用识别Rep78和Rep52两者的共有表位的单克隆抗体，或使用实施例1.1.3所描述的抗体。本文使用的术语"次优起始密码子"不仅指三核苷^始密码子自身，还指它的背景。因此，次优起始密码子可由在次优背景例如非Kozak背景中的"最优"ATG密码子组成。然而，更优选三核苷^始密码子自身是次优(即不是ATG)的次优起始密码子。本文中的次优被理解为指所述密码子与在同样背景中的正常ATG密码子相比，在翻译起始中的效率较低。10优选地，次优密码子的效率比同样背景下的正常ATG密码子的效率低90%、80%、60%、40%或20%。技术人员清楚比较翻译起始的相对效率的方法。优选的次优起始密码子可从ACG、TTG、CTG和GTG中选择。更优选为ACG。编码动物细小病毒R印蛋白的核苷酸序列，在本文中被理解为编码非结构Rep蛋白例如Rep78和R印52的核苷^列，所述非结构Rep蛋白对于在昆虫细胞中生产细小病毒栽体而言是必需的且很充足。动物细小病毒核苷酸序列优选地来自依赖病毒，更优选地来自人类或猿腺伴随病毒(AAV),最优选地来自通常感染人类(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类(如血清型1和4)的AAV。编码动物细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列的一个实例在SEQIDNo.10中给出，它描绘了AAV血清型2的序列基因组中编码R印蛋白的一部分。R印78编码序列包括核苷酸11-1876，R印52编码序列包括核苷酸683-1876。应理解R印78和Rep52蛋白的精确分子量，以及翻译起始密码子的精确位置，可能随细小病毒的不同而有所不同。然而，技术人员懂得如何识别AAV-2以外的其他细小病毒核苷^列的相应位置。因而，编码动物细小病毒Rep蛋白的核苷^列也可是定义为如下的核苷酸序列a)编码具有性质如下的多肽的核普酸序列所述多肽含有与氨基^f列SEQIDNO.11具有至少50%、60%、70%、80%、88%、89%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的#^酸序列；b)与SEQIDNO.10的11-1876位核苷酸序列具有至少50%、60%、70%、80%、81%、82%、85%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷^列；c)其互补链与(a)或(b)的核酸分子序列杂交的核苷酸序列；d)由于遗传密码的筒并性，与(c)的核酸分子序列不同的核苷酸序列。优选地，编码对在昆虫细胞中生产细小病毒载体而言是必需的且很充足的动物细小病毒R印蛋白的核苷^列。本发明的更优选的核苷酸序列包括含有SEQ.IDNO:7的9核苷^f列或与SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列的表达控制序列，所ii^达调控序列位于编码细小病毒Rep78蛋白的核苷酸序列的起始密码子的上游，与SEQ.IDNO:7的核苷酸序列基本一致且可帮助增加细小病毒R印78蛋白表达的序列是例如与SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列具有至少60%、70%、80°/。或90%同一性的序列。正如本领域技术人员非常理解在昆虫细胞中可被识别的推定剪接位点的消除一样，本领域的技术人员还非常理解，其他细小病毒的R印蛋白编码序列中除了R印78和Rep52翻译起始位点之外的可能的餘溪的翻译起始位点的消除。为野生型细小病毒序列在昆虫细胞中正确表达的多种修饰可通过应用熟知的遗传工程技术达成，如SambrookandRussell(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork中所描述的。本领域的技术人员了解能够增加R印蛋白产量的多种Rep蛋白编码区的各种进一步修饰。这些修饰都在本发明的范围之内。在另一方面，本发明涉及含有编码上迷细小病毒R印蛋白的核苷i^列的核酸构建体。优选地，在该构建体中，编码细小病毒Rep蛋白的核普酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。这些表达控制序列至少包括在昆虫细胞中有活性的启动子。本领域技术人员已知的在昆虫宿主细胞中表达外源基因的技术可用于实施本发明。昆虫细胞中分子工程和多肽表达的方法学在文献中有所描述，如SummersandSmith.1986.AManualofMethodsforBaculovirusVectorsandInsectCultureProcedures,TexasAgriculturalExperimentalStationBull.No.7555，CollegeStation,Tex.;Luckow,1991.Prokopetal.,CloningandExpressionofHeterologousGenesinInsectCellswithBaculovirusVectors'RecombinantDMTechnologyandApplications,97—152;King:LA.andR.D.Possee，1992,Thebaculovirusexpressionsystem,ChapmanandHall,UnitedKingdom;O'Reilly,D.R.,L.K.Miller,V.A.Luckow，1992，BaculovirusExpressionVectors:ALaboratoryManual,NewYork;W.H.FreemanandRichardson,C.D.，1995，BaculovirusExpressionProtocols,MethodsinMolecularBiology,volume39;US4，745，051;US2003148506和W003/074714。对本发明编码细小病毒Rep蛋白的核苷^列的转录特别合适的启动子为例如多角体启动子。然而，本领域也已知其他在昆虫细胞中有活性的启动子，例如，p10、p35、IE-1或厶IE-1启动子，以及上面文献中描述的其他启动子。12优选地，用于在昆虫细胞中表达细小病毒R印蛋白的核酸构建体是昆虫细胞相容的载体。"昆虫细胞相容的载体"或"载体"的含义是能够多产地转化或转染昆虫或昆虫细胞的核酸分子。示例性生物学载体包括质粒、线性核酸分子和重组病毒。只要是昆虫细胞相容的，任何栽体都可被使用。所述载体可能整合进昆虫细胞基因组，但所述载体在昆虫细胞中的存在并不需要是永久的，瞬间游离栽体也包括在内。所述载体可以用已知的任何方法例如细胞化学处理、电穿孔或感染来导入。在一个优选的实施方案中，所述载体是杆状病毒、病毒载体或质粒。在一个更优选的实施方案中，所述栽体是杆状病毒，即所述构建体是杆状病毒载体。杆状病毒载体及它们的使用方法在上面引用的昆虫细胞分子工程学的参考文献中有所描述。本发明的另一方面涉及含有不超过一种类型核苷酸序列的昆虫细胞，所述核苷酸序列含有编码细小病毒R印蛋白的单个开放阅读框。优选地，所述单个开放阅读框编码一种或多种细小病毒Rep蛋白，更优选地，所述开放阅读框编码所有细小病毒Rep蛋白，最优选地，所述开放阅读框编码全长R印78蛋白，优选地，至少R印52和R印78在昆虫细胞中都可由此开放阅读框表达。本文中可理解的是，所述昆虫细胞可含有单一类型核苷酸序列一个以上的拷贝，例如在多拷贝游离载体中的单一类型核苷^列一个以上的拷贝，但是这些拷贝基本是同一个核酸分子的多个拷贝，或至少是编码同一个Rep氨基酸序列的核酸分子，例如只是由于遗传密码简并性而相互不同的核酸分子。只存在单一类型编码细小病毒Rep蛋白的核酸分子避免了可能存在于含有Rep序列的不同类型载体中的同源序列之间的重组，所述重组会产生影响昆虫细胞中细小病毒的生产水平(的稳定性)的缺陷型R印表ii^J建体。优选地，在昆虫细胞中，含有编码一种或多种细小病毒R印蛋白的单个开放阅读框的核苷酸序列是核酸构建体的一部接。更优选的昆虫细胞含有作为"第一"核苷酸序列的如上定:的编码细小病毒R印蛋白的核苷酸序列，优选为带有如上定义的次优起始密码子的编码序列，或如上定义的核酸构建体；或所述昆虫细胞含有作为"第一"核酸构建体的如上定义的含有这类核苷酸序列的核酸构建体。任何可复制重组细小病毒(rAVV)载体并可以在培养物中培养的昆虫细胞都可按照本发明使用。例如，所用细胞系可来自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、果錄细胞系，或坟子细胞系，例如白故伊蚊(Aedesalbopictu)衍生细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自易被杆状病毒感染的昆虫种类的细胞，包括例如Se301、SelZD2109、SeUCRl、Sf9、Sf900+、Sf21、BTI-TN-5Bl-4、MG-1、Tn368、HzAml、Ha2302、Hz2E5、HighFive(Invitrogen，CA，USA)和ej^re5SF+(US6,103,526;ProteinSciencesCorp.,CT，USA)。本发明优选的昆虫细胞，除了上述"第一"核苷酸序列或核酸构建体，还含有a)含有至少一个细小病毒末端反向重复(ITR)核苷酸序列的笫二核苷酸序列；和b)含有与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接的细小病毒Cap蛋白编码序列的第三核苷酸序列。在本发明的上下文中，"至少一个细小病毒ITR核苷酸序列"被理解为指回文序列，含有大部分互补、对称排列的也被称为"A"、"B"和"C"区的序列。ITR作为复制原点，即一个在复制中有"顺式"作用的位点，亦即作为反式作用复制蛋白例如R印78(或Rep68)的识别位点，所述反式作用复制蛋白识别回文结构和回文结构内部的特异序列。ITR序列对称性的一个例外是ITR的"D"区。它是独特的(在一个ITR内部无互补序列)。单链DNA的切口出现在A区和D区的痴^处。它是新DNA合成起始的区域。D区一般位于回文结构的一侧并为核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的细小病毒一般有两个ITR序列。然而，可以设计一个ITR使结合位点位于A区的两条链上，并且D区对称分布，在回文结构的每側各一个。随后，在双链环形DNA模板(如质粒)上，Rep78或Rep68辅助的核酸复制在两个方向上进行，并且单个ITR即可满足环形载体上的细小病毒复制。因此，一个ITR核苷酸序列可用于本发明的上下文中。然而，优选地,使用两个或另一偶数个规则的ITR。最优选地，使用两个ITR序列。一个优选的细小病毒ITR是AAVITR。由于安全原因，可能需要构建在初始导入细胞后不能再繁殖的重组细小病毒(rAAV)载体。这种限制不想要的载体在受者中的繁殖的安全机制可通过使用如US2003148506所述的带有嵌合ITR的rAAV提供。14在生产重组细小病毒(rAAV)栽体的昆虫细胞中使用的核酸构建体的数量在本发明中没有限制。例如，l个、2个、3个、4个、5个或更多个独立的构建体可用于按照本发明的方法在昆虫细胞中生产rAAV。如果使用了5个构建体，则一个构建体编码AAVVP1,另一个构建体编码AAVVP2，又一个构建体编码AAVVP3,再一个构建体编码如上定义的Rep蛋白，最后一个构建体含有至少一个AAVITR。如果使用不到5个构建体，则这些构建体可含有至少一个AAVITR以及VP1、VP2、VP3和Rep蛋白编码序列的各种组合。优选地，使用两个或三个构建体，更优选地使用如上所述的两个构建体。如果使用两个构建体，则优选地，所述昆虫细胞含有(a)如上定义的用于Rep蛋白表达的第一核酸构建体，该构建体还含有如上面(b)所定义的第三核苷酸序列(含有与至少一个用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接的细小病毒Cap蛋白编码序列，另见下文)；和(c)含有如上面(a)定义的第二核苷酸序列的笫二核酸构建体(含有至少一个细小病毒/AAVITR核苷酸序列)。如果使用三个构建体，优选地，配置与使用两种构建体时相同，除了使用分别的构建体表达衣壳蛋白和表达Rep蛋白。每种构建体中的序列相互之间可为任意次序。例如，如果一个构建体含有ITR和一个含有编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的0RF，则VPORF可以位于该构建体上，从而使得ITR序列之间的DM复制时，VPORF被复制或不被复制。再例如，Rep编码序列和/或含有编码VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可按任何次序位于构建体上。应理解，同样地，所述第二、第三和其他核酸构建体优选地是昆虫细胞相容的栽体，优选为如上所述的杆状病毒载体。或者，在本发明的昆虫细胞中，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和笫四核苷酸序列以及任选的其他核苷酸序列中的一个或多个可稳定地整合到昆虫细胞的基因组中。本领域的技术人员了解如何将核苷酸序列稳定地导入昆虫基因组中，以及如何识别在基因组中有这种核苷酸序列的细胞。可通过例如使用含有与昆虫基因组的区域高度同源的核苷M列的载体来帮助整合到基因组中。将核苷^f列引入基因组的另一种方法是使用特殊序列，如转座子。本发明中，含有细小病毒衣壳(Cap)蛋白编码序列的第三核苷酸序列在本文中被理解为含有编码三种细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3中的每一种的序列。含有衣壳蛋白编码序列的第三核苷酸序列可以多种形式存在，例如可使用分别针对衣壳蛋白VP1、VP2和VP3中的每一种的编码序列，其中每个编码序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。然而，更优选地，第三核苷酸序列含有编码所有三种动物细小病毒(AAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的单个开放阅读框，其中衣壳蛋白VP1翻译的起始密码子是非ATG的次优起始密码子，例如如Urabeetal.(2002，见上文)所述。VP1衣壳蛋白的次优起始密码子可以是上文定义的Rep78蛋白的次优起始密码子。更优选的衣壳蛋白VP1的次优起始密码子可选自ACG、TTG、CTG和GTG,其中CTG和GTG是最优选的。优选的用于衣壳蛋白表达的第三核苷酸序列还包括表达控制序列，它含有SEQ.IDN0:7的9核苷酸序列或与SEQ.IDN0:7基本同源的核苷酸序列，位于编码衣壳蛋白VP1的核苷酸序列的起始密码子的上游。与SEQ.IDNO:7的核苷酸序列基本同一且有助于提高VP1表达的序列为例如与SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列具有至少60%、70%、80%或90°/。同一性的序列。更优选的用于表达衣壳蛋白的第三核苷,列还更优选地包含对编码衣壳蛋白VP1的核苷酸序列的选自12位核苷酸的C、21位核苷酸的A和24位核苷酸的C(l位是翻译起始密码子的第一个核苷酸；参见SEQIDNO.1)的至少一个修饰。正如本领域的技术人员非常理解在昆虫细胞中可被识别的推定剪接位点的消除一样，本领域的技术人员还非常理解翻译其他血清型VP1的可能的發溪的翻译起始密码子的消除。技术人员了解对VP编码区的多种其他修饰，这些修饰能够增加VP和病毒粒子的产量或产生其他所需效果，例如改变向性或减少病毒粒子的抗原性。这些修饰都在本发明的范围之内。优选地，本发明编码细小病毒衣壳蛋白的核苷^f列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接，所&达控制序列至少包括一个在昆虫细胞中有活性的启动子。这类控制序列和用于在昆虫宿主细胞中表达细小病毒衣壳蛋白的其他技术和材料(如载体)已经在上面Rep蛋白部分描述过。在本发明的一个优选的实施方案中，存在于本发明昆虫细胞中的第二核苷酸序列，即含有至少一个细小病毒(AAV)ITR的序列，还含有至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列，其中优选地，所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列整合到在昆虫细胞中产生的重組细小病毒(rAAV)载体的基因组中。优选地，所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列是用于在哺乳动物细胞中表达的序列。优选地，第二核苷酸序列含有两个细小病毒(AAV)ITR核苷酸序列，且其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列位于两个细小病毒(AAV)ITR核香酸序列之间。优选地，如果编码目的基因产物的核苷酸序列(用于在哺乳动物细胞中表达)位于两个规则ITR之间或位于经改造的具有两个D区的一个ITR的任一侧时，那么它会整合到在昆虫细胞中产生的重组细小病毒(rAAV)载体中。因此本文上面定义的第二核苷酸序列可含有一个编码至少一个在哺乳动物细胞中表达的"目的基因产物"的核苷酸序列，其位置使其可整合到在昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体中。任何核苷酸序列都可被整合，以随后在用根据本发明产生的重組细小病毒(rAAV)载体转染的哺乳动物细胞中表达。可编码例如一个蛋白的核苷酸序列可表达出RNAi试剂，即能够进行RNA干扰的RNA分子，例如shRNA(短发夹RNA)或siRNA(短干扰RM)。"siRNA"指小干扰RM，它是对哺乳动物细胞无毒的短双链RNA(Elbashiretal.，2001，Nature494-98;Caplenetal.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9742-47)。在一个优选的实施方案中，第二核苷酸序列可含有两个核苷酸序列，且每一个都编码一个在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物。编码目的基因产物的两个核苷^列的每一个的位置都可使其可被整合到在昆虫细胞中复制的重组细小病毒(rAAV)载体中。在哺乳动物细胞中表达的目的产物可以是治疗用基因产物。治疗用基因产物可以是多肽或MA分子(siRNA)或其他基因产物，所迷其他基因产物在靶细胞中表达时可提供想要的治疗效果，例如消除不想要的活性，如除去感染的细胞或补足基因缺陷(如导致酶活缺失的缺陷)。治疗用多肽基因产物的实例包括CFTR、IX因子、脂蛋白脂肪酶(LPL,优选为LPLS447X;参见W001/00220)、栽脂蛋白Al、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT)、视网膜色素变性GTP酶调节因子相互作用蛋白(RP-GRIP)和细胞因子或白细胞介素例如IL-IO。另外或此外，作为第二基因产物，本文上面定义的第二核苷酸序列可含有编码用作标记蛋白的多肽的核苷酸序列，以测定细胞转化和表达。用于此目的的合适的标记蛋白为例如荧光蛋白GFP和选择性标记基因HSV胸苷激酶(用于HAT培养基上的选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(用于对潮霉素B的选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(用于对G418的选择)和二氳叶酸还原酶(DHFR)(用于对曱氨蝶呤的选择)、CD20(低亲和性神经生长因子基因)。获得这些标记基因的来源和其使用方法见SambrookandRussel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdedition)，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork。另外，本文上面定义的第二核苷酸序列可含有编码可用作故障保险机制的多肽的核苷酸序列，在认为必要时，所述多肽使得可以用由本发明的重组细小病毒(rAAV)载体转导的细胞来治愈受试者。这种通常被称为自杀基因的核苷i^列编码能够将前药转变为有毒物质的蛋白，所述有毒物质能够杀死所述蛋白在其中表达的转基因细胞。这种自杀基因的合适的实例包括例如大肠杆菌(Aco/Z)胞嘧咬脱氨酶基因或单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘带状疱渗病毒的胸苷激酶基因之一，在这些实例中，更昔洛韦可用作杀死受试者中转基因细胞的前药(参见例如Clairetal.，1987，Antimicrob.AgentsChemother.H:844-849)。在另一个实施方案中，一个目的基因产物可以是AAV蛋白。特别是R印蛋白，如Rep78或R印68,或其功能片段。编码Rep78和/或Rep68的核苷酸序列，如果存在于本发明重组细小病毒(rAAV)载体的基因组中并在被所述载体转导的哺乳动物细胞中表达，则可使重组细小病毒(rAAV)载体整合到经转导的哺乳动物细胞的基因组中。Rep78和/或Rep68在rAAV转导或感染的哺乳动物细胞中的表达，可通过允许经所述重组细小病毒(rAAV)载体引入细胞的其他目的基因产物长期或永久地表达，而有利于所述载体的某些应用。在本发明的重组细小病毒(rAAV)载体中，至少一个编码在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物的核苷酸序列，优选地与至少一个哺乳动物细胞相容的表达控制序列例如启动子可操作地连接。本领域已知许多这类启动子(见SambrookandRussel，2001，见上文)。可使用在许多种细胞中广a达的构成型启动子，例如CMV启动子。然而，更优选的启动子是诱导型的、组织特异的、细胞种类特异的或细胞周期特异的。例如，对于肝脏特异性表达，启动子可选自ocl-抗胰蛋白酶启动子、曱状腺激素结合球蛋白启动子、白蛋白启动子、LPS(甲状腺素结合球蛋白)启动子、HCR-ApoCII杂交启动子、HCR-hAAT杂交启动子和栽脂蛋白E启动子。其18他实例包括用于肿瘤选择性一一特别是神经细胞肿瘤选择性一一表达的E2F启动子(Parretal.，1997，Nat.Med.3:1145-9)或用于在单核血细胞中4吏用的IL-2启动子(Hagenbaughetal.，1997，JExpMed;185:2101-10)。AAV能感染多种哺乳动物细胞。参见如Tratschinetal.(1985，Mol.CellBiol.互3251-3260)和GrimmetaL(1999，Hum.GeneTher.n:2445-2450)。然而，人类滑膜成纤维细胞的AAV转导明显比类似的鼠细胞更有效(Jenningsetal.，ArthritisRes，3:1，2001)，且AAV的细胞营养机能在各血清型中不同。参见如Davidsonetal.(2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,^:3428-3432)，该文献讨论了AAV2、AAV4和AAV5在哺乳动物CNS细胞向性和转导效率方面的不同。可用于本发明以在昆虫细胞中生产重组AAV载体的AAV序列可源自任何AAV血清型的基因组。通常，MV血清型具有在M酸和核酸水平上有明显的同源性的基因组序列，提供一系列相同的遗传功能，产生在生理和功能上基本等价、并通过几乎相同的机制进行复制和装配的病毒粒子。对于各种AAV血清型的基因组序列和基因组相似度的综述，参见如GenBank登陆号U89790;GenBank登陆号J01901;GenBank登陆号AF043303;GenBank登陆号AF085716;Chlorinietal.(1997,J.Vir.71:6823-33);Srivastavaetal.(1983，J.Vir.45:555-64);Chlorinietal.(1999，J.Vir.73:1309-1319);Rutledgeetal.(1998，J.Vir.72:309-319)和Wuetal.(2000，J.Vir.74:8635-47)。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本发明上下文中的AAV核苷酸序列的优选来源。优选地，用于本发明上下文中的AAVITR序列源自AAV1、AAV2和/或AAV4。同样，R印(Rep78和Rep52)编码序列优选地源自AAV1、AAV2和/或AAV4。然而，用于本发明上下文的编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的序列可选自已知的42种血清型的任何血清型，更优选地选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9或通过例如衣壳改组(capsidshuffling)技术和AAV衣壳文库获得的新开发的AAV样颗粒。AAVR印和ITR序列在大多数血清型中是特别保守的。各种AAV血清型的R印78蛋白有例如超过89。yd的同一性，并且AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV6之间在基因组水平的总核苷酸序列的同一性为约82%(Bantel-Schaaletal.，1999，J.Virol.，73(2):939-947)。另外，在哺乳动物细胞中产生AAV颗粒方面，已知许多AAV血清型的Rep序列和ITR与其他血清型的相应序列是有效交叉互补的(即功能可替代的)。US2003148506才艮道了AAVRep和ITR序列与在昆虫细胞中的其他AAVRep和ITR序列是有效交叉互补的。已知AAVVP蛋白决定AAV病毒粒子的细胞营养机能。不同AAV血清型的VP蛋白编码序列的保守性明显比R印蛋白和基因的要低。R印和ITR序列与其他血清型的相应序列交叉互补的能力可^:得产生假型rAAV颗粒，该颗粒包含一种血清型(如AAV3)的衣壳蛋白和另一种AAV血清型(如AAV2)的R印和/或ITR序列。这种假型rAAV颗粒是本发明的一部分。经修饰的"AAV"序列也可用于本发明的上下文中，如用于在昆虫细胞中产生rAAV载体。这种经修饰的序列例如包括与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或MV9至少有约70。/"至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或更高核苷酸和/或#^酸序列同一性(例如具有约75-99%核*酸序列同一性的序列)的序列，ITR、Rep或VP可用于代替野生型AAVITR、Rep或VP序列。尽管在许多方面与其他AAV血清型相似，AAV5与其他人类和猿AAV血清型的不同比其他已知的人类和^jfe清型要大。因此，rAAV5在昆虫细胞中的生产与其他血清型的生产不同。当^f吏用本发明的方法来生产rAAV5时，优选地，一种或多种构建体(总之在超过一种构建体的情况下)含有一个含有AAV5ITR的核苷酸序列、一个含有AAV5Rep编码序列的核苷酸序列(即含有AAV5R印78的核苷酸序列)。这种ITR和Rep序列可根据需要被修饰，以在昆虫细胞中有效生产rAAV5或假型rAAV5载体。例如可修饰Rep序列的起始密码子，可修饰或除去VP剪接位点，和/或可修饰VP1起始密码子和附近核苷酸，从而提高rAAV5载体在昆虫细胞中的生产。因此，本发明另一方面涉及在昆虫细胞中生产重组细小病毒(rAAV)粒子(含有如上定义的重组细小病毒(rAAV)载体)的方法。优选地，所述方法包括以下步骤(a)在产生重组细小病毒(rAAV)载体的条件下培养如本文上面定义的昆虫细胞；并(b)回收所述重组细小病毒(rAAV)载体。在此，应理解以所述方法生产的重组细小病毒(rAAV)载体优选为一种感染性细小病毒或AAV病毒粒子，它含有重组细小病毒(rAAV)载体核酸。本领域熟知培养昆虫细胞的培养条件以及昆虫细胞培养中异源产物的生产，这些例如在上面引用的昆虫细胞分子工程学参考文献中有所描述。优选地，所述方法还包括使用抗AAV抗体(优选固定化抗体)对重组细小病毒(rAAV)载体(或含有所述载体的病毒粒子)进行亲和纯化的步骤。所述抗AAV抗体优选为单克隆抗体。一种特别合适的抗体是一种单链驼科动物(cameloid)抗体或其片段，可例如从骆驼或美洲驼获得(参见如Muyldermans，2001,Biotechnol.74:277-302)。用于AAV亲和纯4匕的抗体优选为一种与rAAV衣壳蛋白上的表位特异结合的抗体，因此优选地，所it^位为在多种AAV血清型的衣壳蛋白上存在的表位。如所述抗体可基于与AAV2衣壳特异性结合产生或选择，但同时它也可与AAV1、AAV3和AAV5衣壳特异性结合。本发明另一方面涉及使用上述核酸构建体和细胞，在上述本发明的方法中生产的rAAV病毒粒子。优选地，所述rAAV病毒粒子在其基因组中包含至少一个编码目的基因产物的核普酸序列，其中所述至少一个核苷,列不是天然AAV核苷酸序列，并且其中在AAVVP1、VP2和VP3衣壳蛋白的比例中，VP1的量为(a)至少为VP2量的100°/。、105%、110%、120%、150%、200%或400%;或(b)至少为VP3量的8%、10%、10.5%、11%、12%、15%、20%或40%;或(c)至少为(a)和(b)共同定义的。优选地，使用识别VP1、VP2和VP3中的每一种所共有的表位的抗体来测定VP1、VP2和VP3的量。本领域有多种可对VP1、VP2和/或VP3的相对量进行定量的免疫试赵参见如UsingAntibodies,E.HarlowandD.Lane,1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)。一种可识另3三种衣壳蛋白中的每一种所共有的表位的合适抗体为例如小鼠抗CapBl抗体(可从Progen,Germany购得)。一种本发明的优选的rAAV病毒粒子是在其基因组中含有至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列的病毒粒子，其中所述至少一个核苷酸序列不是天然AAV核苷酸序列，且其中所述AAV病毒粒子含有一种VPl衣壳蛋白，它1位氮基酸为亮氨酸或缬氨酸。一种本发明更优选的AAV病毒粒子具有上面定义的衣壳蛋白比例，并含有一种其1位氨基酸为亮氨酸或缬氨酸的VPl衣壳蛋白。在本文件及其权利要求中，动词"含有"及其各种形式是用其非限制21性的含义表示包括该词之后的项目，但并不排除未专门提到的项目。另外，用"一"或"一个"(不定冠词"a"或"an")提及的要素不排除多个该要素存在的可能性，除非上下文明确要求有一个且只能有一个该要素。因此"一"或"一个"(不定冠词"a"或"an")通常是指"至少一个"。图1:A)野生型AAV基因组中R印表达的组织结构。Rep78和Rep52基因分别由P5和P19启动子表达。Rep68和Rep40(分别为R印78和Rep52的剪接变体)的表达未给出。这两种表达单元都含有ATG起始位点。B)本发明的构建体具有在单一启动子(例如多角体(PolH)启动子)控制下的R印0RF。因为Rep78的起始密码子ATG#:转化为备用ACG起始密码子并被核糖体部分跳过，因此上述单一启动子驱动Rep78和Rep52两者的表达。C)Urabeetal.(2002，见上文)的原始构建体独立地通过两个不同的启动子(分别为AIEl和polH)驱动Rep78和Rep52。图2:从在昆虫细胞中传代5次的重组杆状病毒表达的Rep蛋白的蛋白印迹分析。Urabeetal.，2002i殳计的原始杆状病毒(原始REP/Bac-to-Bac)在5次传代中Rep78/52的表达緩慢下降。插入在杆状病毒骨架PSC中的Urabeetal.,2002设计的Rep78和52表达单元(原始REP/PSC)在昆虫细胞中传代后R印78/52的表达发生了下降。然而，PSC骨架中带有含ACG起始密码子的REP表达单元的杆状病毒(REP-ACG/PSC)在至少5次传代中其Rep78/52的表达是稳定的。Western杂交分析如实施例1.1.3所述进行。图3:表l结果的曲线图。图4:昆虫细胞中各种rAAV构建体稳定性的比较。如上面实施例1所述，在SF+细胞中生产rAAV。对于所有生产而言，含有ITR的杆状病毒和含有衣壳基因的杆状病毒是相同的，世代数与含有Rep基因的杆状病毒的相同。使用了4种不同的含有Rep基因的杆状病毒1)REP-ACG/PSC;2)SLR:Urabeetal.(2002，见上文)的原始构建体；3)Rep52+Rep78(B2B):两种独立的Bac-to-Bac杆状病毒，一种含有Rep78基因，另一种含有Rep52基因；4)R印52+Rep78(PSC):两种独立的ProteinSciences杆状病毒，一种含有R印78基因，另一种含有R印52基因。图5:最高达传代8次的REP-ACG/PSC杆状病毒构建体的稳定性。如上面实施例1所述，在SF+细胞中生产rAAV。图6:传代作用对Urabeetal.(2002，见上文)的原始构建体和本发明的REP-ACG/PSC构建体的对Rep蛋白表达的影响的比较。杆状病毒传代和蛋白印迹的进行如实施例1所述。在rep杆状病毒正常传代的过程中，向SF细胞加入杆状病毒后40小时取样并进行蛋白印迹。实施例实施例1:R印构建体1.1.材料和方法1.1.1杆状病毒质粒构建为从单独的双顺反子信^吏RM表达R印78和R印52,将位于表达载体pFastBacDualSLR(Urabeetal.，2002，见上文)上的Rep78的ATG起始密码子转变为ACG。所用的上游引物是BamHI5'-cgcggatcctgttaagACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTC-3'(SEQIDNO.8)正向引物序列PCR反应中使用的3，-引物位于REP78基因的侧翼并含有Xbal位点(TCTAGA):Xbal5'-AGGCTCTAGATTCGAAAGCGGCCCG-3'(SEQIDNO,9》反向引物序列通过PCR(反应体积50lxPfxAmp.緩沖液，0.3mMdNTP，lmMMgS04,150mM正向引物，150mM反向引物，2x增强溶液，模板50ng23(pFastBacDualSUO，1UPlati画Pfx(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA))，使用以下实验方案来扩增上述引物对之间的序列95X:、5min的1个循环；95X:、15s,55t:、30s，72*C、2min的35个循环；721C、10min的1个循环；4t:齡存)。使用ZeroBluntT0P0PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将PCR产物克隆到PCR-bluntII-TOPO中。再利用限制位点Spel和Xbal将Rep78亚克隆到pFastBacDual(Invitrogen)中。最终将突变的Rep表达盒克隆到(使用限制性酶BstZ171和AvrII)杆状病毒表达构建体(用EcoRV和Xbal切开)pPSCIO(ProteinSciencesCorporation,Meriden，CT，USA)中。Baseclear，Leiden,theNetherlands对所述构建体的序列进行了确i人分析。1.1.2重组杆状病毒生产使用GeneXpressBaculoKIT(ProteinSciencesCorporation)生产源自苜蓿银紋夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒。转染如下进行在一个圆底14ml试管中将200nlGRACE培养基与6ju1Cellfectine(Invitrogen)混合，并在一个Eppendorf管中将200piGRACE培养基与50ji1病毒DM(ProteinSciences)和2pg转移质粒(REP)混合。将E卯endorf管中的容纳物加入上述试管并小心混合。室温培育30分钟之后将1,300piGRACE加入至转染混合物中。用GRACE培养基清洗T25烧瓶中的昆虫细胞，并将转染混合物逐滴加入细胞层。在28X:培育6小时后，小心加入添加有10%FBS的SF900II血清，并将T25烧瓶置于28"C温箱中5天，然后收获重组杆状病毒。1.1.3蛋白印迹分析用杆状病毒-REP感染昆虫细胞(SF+)。在感染细胞后16、40和64小时取样品，通过加入0.IV10xTRIS裂解緩沖液(1.5MNaCl，0.5MTRIS，0.01MMgCl，1%TRITONX-100,pH8.5，过滤灭菌)裂解细胞，在摇床(Innova44，NewBrunswick)中于28tl下培育30分钟。通过与Benzonase在37"C培育30分钟降解游离的MA和RNA。对细胞裂解物进行离心(1，900xg;15min;40。在上清液样品中加入NuPAGELDS样品緩冲液(4x，Invitrogen),然后上样到4-12%的Bis-Tris胶(120V)上。蛋白质在PVDF膜(BioRad)上印膜30分钟，IOV(半干印迹)。Western免疫化学通过用Superblock-PBS封闭緩冲液(PIERCE)封闭膜并随后用小鼠抗Rep(303.9，Progen，Germany;稀释度1:50)和兔抗小鼠-HRP歸0，稀释度1:500)培育来进行。用发光底物(lumi-lightplusWestern-blottingsubstrate)(Roche)通过化学发光染色使Rep蛋白可见。1.2结果将新设计的本发明的R印构建体(REP-ACG/PSC)与1)PSC杆状病毒骨架中和2)Bac-to-Bac杆状病毒骨架中的原始Rep构建体(Urabeetal.，2002)的性能进行对比。所有三种构建体都进行连续传代直至第5代。使用第2、3、4和5代R印构建体以及第2、3、4和5代各代的AAV-LPL和AAV-Cap重组杆状病泰这里使用的AAV-LPL和AAV-Cap重组杆状病毒如下面实施例2中所述)进行AAV1-LPL生产实验。用qPCR测定AAV1-LPL的产量，如表l所示。Urabeetal.，2002设计的原始杆状病毒(原始REP/Bac-to-Bac)的AAV产量在5次传代中迅速下降。插入在杆状病毒骨架PSC中的Urabeetal.，2002i殳计的Rep表达单元(原始REP/PSC)导致了在昆虫细胞中传代后也发生了AAV产量的下降。然而，PSC骨架中具有含ACG起始密码子的REP表达单元的杆状病毒(REP-ACG/PSC)的AAV产量在至少5代中稳定。因此，只有用含有REP-ACG构建体的杆状病毒才能在几代(如2-5)中得到可重现的AAV-LPL产量。代数原始REP/PSCvg/mlREP-ACG/PSCvg/ml原始REP/Bac_to-Bacvg/ml25.38E+093.04E+093.62E+1039.57E+094.77E+097.28E+0941.66E+097.81E+097.59E+0857.35E+089.90E+092.03E+08表1:使用几代杆状病毒构建体生产rAAV病毒粒子用编码第2、3、4或5代的LPL载体单元、编码第2、3、4或5代的Rep表达单元和编码第2、3、4或5代的Cap表达单元的三种重组杆状病毒感染Sf9细胞。三天后收获细胞并用qPCR测定AAV产量(每ml载体基因组；vg/ml)。25<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>2002设计的原始杆状病毒(原始REP/Bac-to-Bac)显示显著量的第五代重组杆状病毒的Rep序列有缺失。插入在杆状病毒骨架PSC中的Urabeetal.，2002设计的R印78和52的表达单元(原始REP/PSC)表现出重组杆状病毒非常早且显著的损失。然而，PSC骨架中具有含ACG起始密码子的REP表达单元的杆状病毒(REP-ACG/PSC)(克隆C4和A3)表明在至少5代中为稳定的重组杆状病毒。实施例2:Cap构建体2.1.1杆状病毒质粒构建体为了从单个多顺反子信使RNA表达VP1、VP2和VP3，如Urabeeta1.,2002(见上文)所述，设计了杆状病毒-AAV-Cap构建体。简言之，将VP1的ATG起始密码子突变为ACG。11位上可能的ATG起始密码子被改为ACG。VP1起始密码子下游的剪接受体位点被破坏(21位和24位突变)。突变的Cap表达盒被克隆到带有BamHl/StuI限制位点的杆状病毒表达构建体pFastBacDual(pFBDAAVlVPmll)中。此质粒(pFBDAAVlVPmll)是引入VP1替代起始密码子的起始材料。Urabeetal(2002，见上文H吏用的目的在于引入上述突变的正向引物是BamHI11121245'-cgcggatcctgttaagACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO,1)下面的正向引物用于以pFBDAAVlVPmll(Urabeetal.，2002，见上文)为起始材料制备表，建体5'-cgcggatcctgttaagTTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO,2》5'-cgcggatcctgttaagATTGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQ工DNCU3)5'-cgcggatcctgttaagGTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC-3'(SEQIDNO，4〉5'-cgcggatcctgttaagCTGGCTGCCGACGGTTATCTACCCG&TTGGCTd(SEQIDNO.5)使用上述正向引物的PCR反应中用的反向引物被定位到VP1起始密码子下游约230bp处并含有一个特殊的StuI位点(AGGCCT)。5'-GTCGTAGGCCTTGTCGTGCTCGAGGGCCGC-3'(SEQIDNO,6)用上述正向和反向引物对通过PCR扩增片段。用BamHI和Stul消化PCR产物后，PCR产物被亚克隆到pFBDAAVlvpmll的BamHI/Stul位点，产生多个待测的杆状病毒-AAV-Cap构建体。该DM构建体在Baseclear，Leiden,theNetherlands通过序歹'J分析确认。2.1.2重组杆状病毒的生产用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen)生产了源自苜蓿4艮紋夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒。通过感染每ml2xl06个Sf9细胞来扩增rBac-Cap,moi为O.1。感染后三天，通过离心沉降细胞，回收含有病毒的上清液。。2.1.3重组AAV的生产用Urabeetal.，2002的三种重组杆状病毒生产rAAV批次。然而，对于此研究，一种杆状病毒含有转基因LPLS447X的表达构建体。从该转基因表达的治疗用活性试剂是人类脂蛋白脂肪酶的天然存在的变体，它是一个448个氨基酸的单链。所述LPf变体在蛋白C末端有2个M酸缺失。第二种杆状病毒含有AAV复制基因Rep78和Rep52的表达构建体。第三种杆状病毒含有AAV1衣壳序列，其中VP1的起始密码子要么是ACG，要么是TTG、CTG、GTG。根据Grimmetal.，1998(Noveltoolsforproductionandpurificationofrecombinantadeno-associatedvirusvectors.HumGeneTher.1998Dec10;9(18):2745-60)生产用质粒转染系统产生的哺乳动物-rAAV各批次。2.1.3蛋白印迹分析用杆状病毒-Cap感染昆虫细胞。感染后三天，细胞被离心(3，000g;15min)。用0.22umMillex过滤器过滤上清液。在上清液样品中加入NuPAGELDS样品緩冲液(Invitrogen)，然后上样到4-12°/。的Bis-Tris胶上。在100V下跑胶。蛋白质在IOOV、350mA下于硝酸纤维素膜(BioRad)上印膜l小时。Western免疫化学是通过用1%Marvel脱脂奶粉封闭膜并随后用小鼠抗Cap(Bl，Progen，Germany;稀释度l:50)和兔抗小鼠HRP歸0，稀释度1:100)培育来进行的。用发光底物(lumi-lightplusWestern-blottingsubstrate)(Roche)进行化学发光染色l吏VPl、VP2、VP3可见。2.1.4生化测量用放射性甘油三油酸酯乳液底物如前所述测定人类LPLS447X活性(Nilsson-EhleandScholtz，1976)。用鸡IgY和小鼠5D2抗hLPL抗体进行夹心酶联免疫分析测定人类LPL，x免疫活性物质(Liuetal.，2000)。4吏用商业试剂盒按照厂商说明书(BoehringerMannheim,#450032)测量血浆甘油三酸酯水平。2.2结果2.2.1重组杆状病毒的构建为了在Urabeetal(2002，见上文)i殳计的杆状病毒质粒中引入不同的可替代的用于VPl表达的起始密码子，设计了一系列含有BamHI限制位点的上游引物，并用TTG、ATT、GTG或CTG密码子替代VPl的ACG起始密码子。用这些引物结合含有StuI位点的下游引物进行PCR,得到亚克隆到pFBDVPmll(Bac-Cap)的BamHI/StuI位点的扩增片段。产生的杆状病毒质粒用于通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒。制备的重组杆状病毒感染昆虫细胞以生产AAV衣壳。感染后三天，用蛋白印迹测定不同批次杆状病毒的病毒蛋白表达。从蛋白印迹可清楚地看出，含有VP1的TTG起始密码子的杆状病毒构建体表达此蛋白的水平比以前用ACG起始密码子的构建体要高，用TTG密码子的VP1和VP2之间的比例是1:1,接近于对野生型AAV的报道(未给出)。2.2.2各rAAV批次对培养细胞的感染为了研究源自使用TTG起始密码子的重组杆状病毒的AAV衣壳的感染性，生产了rAAV。同时也通过用质粒转染哺乳动物HEK293细胞生产了一批rAAV。两批rAAV的载体基因组滴度都用qPCR测定。此滴度用于在微滴定板中以增加的moi感染HEK293细胞。感染后两天，在感染细胞的培养基上进行转基因产物(LPLS"7x)的定量测定(LPy定量测定)。该测定表明用杆状病毒生产的rAAV所产生的LPy的量接近于用质粒生产的rAAV所产生的LPL(未给出)。2.2.3小鼠中各rAAV批次的注射杆状病毒生产系统和常规哺乳动物质粒生产系统所生产的各rAAV批次经肌内注射到小鼠中以观察体内LPLS447X蛋白活性和甘油三酸酯饥饿。在注射后3天、7天和2周^Lik样并测定。在病毒给予之后的3天和7天之间，取自用哺乳动物rAAV注射的小鼠和用杆状病毒-rAAV注射的一只小鼠的血浆都从乳状变为完全澄清。取自一只注射杆状病毒-rAAV的小鼠的血浆仍然相对呈乳状但脂肪水平明显降低。所有处理小鼠的甘油三酸酯的水平分别降低(未给出)。在第14天，在用哺乳动物-AAV和杆状病毒-(TTG)-AAV处理的小鼠中TG水平都降低了96%。病毒给予后两周取得的血浆样品显示出用杆状病毒-AAV和哺乳动物-AAV处理的小鼠的LPLS447X活性接近(未给出)。实施例3:具有经修饰的Rep78起始密码子的rAAV构建体在昆虫细胞中的稳、定性3.1各种rAAV构建体在昆虫细胞中的稳定性的比较如上面实施例l所述，在SF+细胞中生产rAAV。对于所有生产而言，含有ITR的杆状病毒和含有衣壳基因的杆状病毒是相同的，代数与含有R印基因的杆状病毒的相同。使用了4种不同的含有R印基因的杆状病毒:1)REP-ACG/PSC;2)SLR:Urabeetal.(2002，见上文)的原始构建体;3)Rep52+R印78(B2B):两种独立的Bac-to-Bac杆状病毒，一种含有R印78基因，另一种4、有Rep52基因；4)Rep52+Rep78(PSC):两种独立的ProteinSciences杆状病毒，一种^^有Rep78基因，另一种含有Rep52基因。结果如图4所示。在杆状病毒的第5代，使用本发明的REP-ACG/PSC生产的rAAV已经相对原始Rep构建体和分用的Rep构建体提高了10倍以上。3.2最高至第8代杆状病毒构建体的稳定性如上面实施例1所述，在SF+细胞中生产rAAV。对于所有生产而言，含有ITR的杆状病毒和含有衣壳基因的杆状病毒是相同的，代数与REP-ACG/PSC杆状病毒的相同。结果如图5所示。REP-ACG/PSC杆状病毒可保持稳定到至少第8代。REP-ACG/PSC的rAAV生产滴度可保持稳定最高到至少第8代杆状病毒。3.3传代对Rep蛋白表达的影响对Urabeetal.(2002，见上文)的原始构建体与本发明的REP-ACG/PSC构建体的传代数对R印蛋白表达的影响进行了比较。杆状病毒传代和蛋白印迹的进行如实施例1所述。在rep杆状病毒正常传代的过程中，向SF细胞加入杆状病毒后40小时取样并进行蛋白印迹。图6清楚地表明，对于原始Urabe构建体(SLR)而言，较高的世代中的Rep表达与较早的世代中的相比减弱，而对于REP-ACG/PSC构建体而言，较高的世代中的Rep表达与较低的世代中的Rep表达保持一致。3权利要求1.一个含有开放阅读框的核苷酸序列，所述开放阅读框含有编码细小病毒Rep蛋白的核苷酸序列，其中细小病毒Rep78蛋白的翻译起始密码子是可在昆虫细胞中表达时实现部分外显子跳跃的起始密码子。2.根据权利要求l的核苷酸序列，其中所述起始密码子选自ACG、TTG、CTG和GTG。3.根据权利要求1或2的核苷酸序列，其中所述核苦酸序列含有表达控制序列，所^达控制序列含有SEQ.IDNO:7的9核苷酸序列或与SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列，位于编码AAVR印78蛋白的核苷酸序列的起始密码子的上游。4.根据权利要求1-3任一项的核苷酸序列，其中所述细小病毒R印蛋白是腺伴随病毒(AAV)R印蛋白。5.—种含有权利要求1-4任一项的核苷酸序列的核酸构建体，其中所述核苷酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。6.根据权利要求5的核酸构建体，其中所述核苷酸序列与多角体启动子可操作地连接。7.根据权利要求5或6的核酸构建体，其中所述构建体是昆虫细胞相容的载体，优选为杆状病毒载体。8.—种含有不超过一种类型核苷酸序列的昆虫细胞，所述核苷酸序列含有编码一种或多种细小病毒Rep蛋白的单个开放阅读框。9.根据权利要求8的昆虫细胞，其中所述单个开放阅读框编码全长Rep78蛋白。10.根据权利要求8或9的昆虫细胞，其中所述含有编码一种或多种细小病毒R印蛋白的单个开放阅读框的核苷酸序列是一个核酸构建体的一部分，所述核酸构建体中所述核苷酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。11.根据权利要求8-IO任一项的昆虫细胞，其中所迷昆虫细胞含有如权利要求1-4任一项所定义的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列含有编码一种或多种细小病毒Rep蛋白的单个开放阅读框；或含有如权利要求5-7任一项所定义的第一核酸构建体，其中所述核苷酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。12.根据权利要求11的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞还含有a)含有至少一个细小病毒末端反向重复(ITR)核苷酸序列的第二核苷酸序列；和b)含有细小病毒衣壳蛋白编码序列的第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列与用于昆虫细胞表达的表达控制序列可操作地连接。13.根据权利要求12的昆虫细胞，其中所述昆虫细胞含有a)根据权利要求5-7任一项的第一核酸构建体，其中所述第一核酸构建体还含有如权利要求9的(b)所定义的第三核苷酸序列；和b)含有如权利要求9的(a)所定义的笫二核苷酸序列的第二核酸构建体。14.根据权利要求13的昆虫细胞，其中所述第二核酸构建体是昆虫细胞相容的载体，优选为杆状病毒载体。15.根据权利要求12-14任一项的昆虫细胞，其中所述第二核苷*列还含有至少一种编码目的基因产物的核苷酸序列，并且其中所述至少一种编码目的基因产物的核普酸序列被整合到在昆虫细胞中产生的细小病毒载体的基因组中。16.根据权利要求15的昆虫细胞，其中所述第二核苷酸序列含有两个细小病毒ITR核苷酸序列，且其中所述至少一个编码目的基因产物的核苷酸序列位于两个细小病毒ITR核苷酸序列之间。17.根据权利要求12-16任一项的昆虫细胞，其中所述第三核苷^f列含有开放阅读框，所述开放阅读框含有编码细小病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的核苷酸序列，其中所述细小病毒衣壳蛋白VP1的翻译起始密码子选自ACG、TTG、CTG和GTG。18.根据权利要求17的昆虫细胞，其中所述第三核苷酸序列含有表达控制序列，所#达控制序列含有SEQ.IDNO:7的9核苷*列或与SEQ.IDNO:7基本同源的核苷酸序列，位于编码细小病毒VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的起始密码子的上游。19.根据权利要求17或18的昆虫细胞，其中所述笫三核苷酸序列还包含对编码细小病毒衣壳蛋白VP1的核普酸序列的选自12位核苷酸的C、21位核苷酸的A和24位核苷酸的C的至少一个《务饰。20.根据权利要求12-19任一项的昆虫细胞，其中所述第一核苷#列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列中的至少一个被稳定地整合到所述昆虫细胞的基因组中。21.根据权利要求8-20任一项的昆虫细胞，其中所述细小病毒为AAV。22.—种在昆虫细胞中生产重组细小病毒粒子的方法，所述病毒粒子含有如权利要求12、15和16任一项所定义的第二核苷酸序列，所述方法包括如下步骤a)在产生重组细小病毒粒子的条件下培养如权利要求12-21任一项定义的昆虫细胞；并b)回收所述重组细小病毒粒子。23.根据权利要求22的方法，还包括使用抗细小病毒抗体，优选使用固定化抗体，对所述病毒粒子进行亲和纯化的步骤。24.根据权利要求23的方法，其中所述抗细小病毒抗体为单链驼科动物抗体或其片段。25.根据权利要求22-24任一项的方法，其中所述重组细小病毒粒子是重组AAV病毒粒子。全文摘要本发明涉及用于在昆虫细胞中生产重组细小病毒(如腺伴随病毒)载体的核酸构建体，以及含有这种构建体的昆虫细胞，以及用所述细胞生产重组细小病毒粒子的方法。所述昆虫细胞优选地含有编码细小病毒Rep蛋白的第一核苷酸序列，其中细小病毒Rep78蛋白的翻译起始密码子是可在昆虫细胞表达时实现部分外显子跳跃的次优起始密码子。所述昆虫细胞还含有第二核苷酸序列，它含有至少一个细小病毒(AAV)末端反向重复(ITR)核苷酸序列；和第三核苷酸序列，它含有编码细小病毒衣壳蛋白的序列。文档编号C12N5/10GK101506369SQ200780030443公开日2009年8月12日申请日期2007年6月20日优先权日2006年6月21日发明者A·C·贝克,D·J·比斯曼斯,S·J·P·哈斯特,W·T·J·M·C·赫门斯申请人:阿姆斯特丹分子治疗股份有限公司