核酸探针以及检测疟原虫寄生虫的方法

专利名称：：核酸探针以及检测疟原虫寄生虫的方法核酸探4十以及检测痗原虫寄生虫的方法发明的
背景技术：
：疟原虫是一种寄生性原生动物属。已知^皮这种属感染会形成疟疾。在寄生虫的生命周期中始终存在着两个宿主蚊子带菌者以及脊一,动物宿主。至少有十个种类会感染人类，包4舌恶性痴原虫(P.falciparum)，间日痴原虫(P.vivax),三日痴原虫(P.malariae),以及卵形痴原虫(P.ovale)。症疾是一种传染性疾病，其普遍存在于热带地区以及亚热带地区。痴疾对于男人、女人以及儿童的生存而言象4正着一种威胁。它每年感染3000万至5000万人，并且导致每年1百万至3百万人的死亡，这些大部分都发生在撒哈拉以南的非洲地区的儿童中。疟疾是最常见的传染性疾病中的一种，并且是一种极大的公共卫生问题。上述疾病是由疾原虫属的原生动物寄生虫引发的。上述疾病中最严重的类型是由恶性疾原虫(Plasmodiumfalciparum)以及间曰痴原虫(Plasmodiumvivax)所引发的，但是其4也相关的种类(卵形痴原虫(Plasmodiumovale)以及三日症原虫(Plasmodiummalariae))同才羊能够感染人类。确定了上述的感染性种类能够帮助确定所述患者的治疗方案。it断疾疾的优选并且最可靠的方法是对血力莫进^于显樣H竟才企验，因为上述四种主要的寄生虫种类中的每一种都具有不同的特性。传统使用到的是两类血膜。薄膜类似于常规的血膜，并且能够进行种类的识别，因为在这种方法中所述寄生虫的外观能得以最好的保存。厚膜使得显樣丈镜操作人员能够筛选出更大量的血液，并且其敏感性比上述薄膜的敏感性高出大约十一倍，因此在所述厚膜上识别低水平的感染更加容易，但是所述寄生虫的外观则被扭曲的多，并且因此在区别不同的种类上存在更大的困难。从上述厚膜中，有经验的显微镜操作人员能够检测到的寄生虫的水平(或者寄生虫血症)下至寸氐至红血^求的0.0000001%。然而，显孩"竟i貪断可能存在困难，因为所有四个种类的早期营养体("环形体")看起来相同并且一艮本不可能基于单个的环形体来i貪断其种类；种类的识别始终要以几种营养体为基础来进^f亍的。在无法利用显樣"竟方法的情况下，利用抗原^r测i式-验，该方法^又需要一滴血液。OptiMAL-IT(TCSBioSciences,白金汉君卩，英格兰)将可靠的一企测到下至0.01%寄生虫血症水平的恶性症原虫(falciparum)以及下至0.1%水平的非恶性症原虫。Paracheck画P产(OrchardBiomedicalSystems,印度)^M企测到下至0.002%水平的寄生虫血症，但其不能够区分恶性症原虫痴疾以及非恶性痴原虫症疾。也可以利用聚合酶链式反应对寄生虫的核酸进4于一企测。这项纟支术比显孩"竟方法更加准确。然而，这项4支术昂贵并且需要专门的实—验室。并且，寄生虫血症的水平并不必然与所述疾病的#呈度相互关耳关，特别是在当所述寄生虫能够粘附于血管壁的情况时。在一些临床实验室以及快速实时;险测中可以利用的分子方法是有限的，例如，QT-NASBA(基于聚合酶链式反应的实时定量核酸序列依赖性扩增)，但其目前需要进行改进。因此，为了在上述领域检测低水平的寄生虫血症，需要研制敏感的、低科:技的诊断工具。我们所需要的是能够快速并且准确的检测到并辨别出引起症疾的各种痴原虫种类的i式剂以及方法。发明概述本发明涉及能够在例如杂交检测中检测到并且辨别出不同种类的疟原虫寄生虫的核酸纟笨针。因此，在第一个方面，本发明的特征在于利用核酸片段作为探针，用于在杂交检测中检测疟原虫。本发明还包4舌能够辨别出恶性疟原虫(P.falciparum),间日痴原虫(P.vivax)，三日痴原虫(Rmalariae)以及卵形痴原虫(P.ovale)的#1针(DNA,RNA以及PNA)。在本发明的内容中，所述术语"辨别"(或者类似的术语)指的是所述探针对于来自于一种种类的核酸(例如，RNA,DNA，rRNA[核if唐体RNA]或者rDNA[核糖体DNA])的结合比其他三个种类的结合更加顺利。在第二个方面，本发明的特征在于一种核酸片,殳，所述的核酸片段含有一种序列，所述的序列选自，一种或者多种探针指定的PG飄sl,PGe腦2，MalFl，MaiF2,Mai1.8F,Mai1.8R,PV1,PV2,PFl，PF2,PF3,PF4，PF5，PM1，POl中的4尤选至少5个、更加优选至少10个或者最优选至少15个连续的核苷酸或者全部序列，或者是这些序列的部分或者完整长度的互补序列。在第三个方面，本发明的特征在于一种核酸片l殳，所述的核酸片段含有一种序列，所述的序列选自一种或者多种^:针指定的序歹'j1(SEQIDNO:1)至序歹'J15(SEQIDNO:15)中的至少5个、优选至少10个、更加优选至少13个或者最优选至少15个连续的核苷酸或者全部序列，或者是这些序列的部分或者完整长度的互补序列。在最后一种方面，本发明的特征在于在样本中4全测疟原虫的存在的方法。在这个方法中，将样本与一种核酸片段进行接触，所述的核酸片,殳含有一种序列，所述的序列选自，PGenusl,10PGe謂2，MalFl,MaiF2,Mai1.8F,Mai1.8R,PV1,PV2,PF1,PF2,PF3,PF4，PF5，PM1或者POl中的^尤选至少5个、至少10个、更加伊二选至少13个或者最优选至少15个连续的4t苦酸或者全部序列，探针选自或者是上述序列(或者上述序列的任意组合)的部分或者完整长度的互补序列；上述的4妄触是在允述样本中的疾原虫核酸发生结合的所述核酸片段进行4企测，用来指示所述样本中痴原虫的存在。对本发明所述的能够对上述列出症原虫种类的存在。在本发明的此方面的一个实施方式中，所述的核酸片段含有一种序列，所述的序列选自揮:针PGenusl中的^尤选至少5个、更加^尤选至少IO个或者最伊C选至少15个连续的一亥苷酸或者全部序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。在本发明的一种方面的第二个实施方式中，所述的核酸片賴二含有一种序列，所述的序列选自探针PGenus2中的优选至少5个、更加伊C选至少IO个或者最伊匸选至少15个连续的核苦g臾或者全部序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。在本发明的一种方面的第三个实施方式中，所述的核酸片賴二含有一种序列，所述的序列选自探针MalFl中的优选至少5个、更加伊。选至少IO个或者最伊C选至少15个或者全部序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。在本发明的一种方面的另外一种实施方式中，所述的核酸片段含有一种序列，所述的序列选自探针MalF2中的优选至少5个、更加伊C选至少10个或者最^尤选至少15个一亥苦酸或者全部序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。在本发明的一种方面的另外一种实施方式中，所述的一亥酸片段含有一种序列，所述的序列选自探针Mal1.8F中的优选至少5个、更加〗尤选至少IO个或者最伊C选至少15个^t苷g吏或者全部序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。在本发明的一种方面的另外一种实施方式中，所述的核酸片段含有一种序列，所述的序列选自探针Mal1.8R中的优选至少5个、更加伊C选至少IO个或者最Y尤选至少15个斗亥苷酸或者全部序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。探针PGe腦l，PGe簡2，MalFl,MalF2，Mai1.8F以及Mal1.8R的优点在于，由于它们能够4企测到受试的全部三个种类的症原虫，并且因此不局限于才企测单一的痴原虫种类。本发明的其他特;f正以及优点将通过下述对于其的详细i兌明以及后附的4又利要求中体现出来。在具体的方面，本发明预期了一种检测才羊本中疟原虫的存在的方法，所述方法包括如下步骤将所述样本与一种纟笨针进行接触，所述4笨针用于在杂交4企测中4企测疰原虫，其中所述的^果针能够辨别痞原虫的种类，在允"i午所述4笨4十与痴原虫核§交发生杂交的条件下进行接触；并且对与所述样本中的所述疟原虫核酸发生结合的所述揮:针进4亍才企测，用来指示所述样本中症原虫的存在。在前述的实施方式中，所述的核酸片^殳包4舌一种序列，所述的序歹'J选自4笨4十PV1，PV2,PF1，PF3，PF4，PF5,PM1或者POl中的至少5个连续的核苦酸序列，或者是上述序列的完整长度的互^卜序列。在其他的方面，本发明预期了一种检测才羊本中疾原虫的存在的方法，所述方法包4舌如下步眾《将所述样本与一种核酸片4殳进行接触，所述的核酸片,殳包括一种序列，所述的序列选自由PGe画l,PGe画2，MalFl,MalF2，Mai1.8F,Mai1.8R,PV1,PV2，PF1，PF2,PF3,PF4，PF5，PM1以及POl所纟且成的纟且中的^笨针中的至少5个连续的核苦酸序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列，在允许所述核酸片,殳与疟原虫核酸发生杂交的条件下进行接触；并且对与所述样本中的所述疟原虫核酸发生结合的所述核酸片,殳进4亍;险测，用来指示所述才羊本中症原虫的存在。在前述的实施方式中，所述的核酸片革殳包4舌一种序列，所述的序歹'J选自由PGenusl,PGenus2，MalFl,MalF2，Mai1.8F,Mai1.8R,PV1，PV2,PF1,PF2,PF3,PF4,PF5,PM1以及POl所组成的组中的4果针中的完整长度的序列、至少15个连续的核苦酸、至少IO个连续的核苷酸、至少5个连续的核苷酸，或者是上述序列的完整长度的互补序列。本发明还预期了一种核酸片段，所述的核酸片,殳包括一种序歹寸，戶斤述的序歹'J选自由PGenusl，PGenus2,MalFl以及MalF2，Mai1.8F,Mai1.8R,PV1,PV2，PF1,PF2，PF3,PF4,PF5,PM1，POl所组成的组中的探针中的至少5个连续的核香酸，或者是上述序列的完整长度的互补序列。本发明还预期了一种核酸片段，所述的核酸片段包括一种序歹寸，戶斤述的序歹'J选自由PGenusl，PGenus2，MalFl以及MalF2，Mall见Mal1.8R,PV1,PV2，PF1,PF2,PF3,PF4,PF5,pmi，poi所组成的组中的揮:针中的至少io个连续的核香酸，或者是上述序列的完整长度的互补序列。本发明还预期了一种核酸片段，所述的核酸片段包括选自由PG飄sl，PGe腦2，MalFl以及MalF2，Mal1.8F,Mal1.8R,13PV1,PV2,PF1，PF2,PF3,PF4,PF5,PM1，POl戶斤纟且成的组中的探针的完整序列，或者是上述序列的完整长度的互补序列。在具体的方面，本发明预期了一种筛选核酸揮:针的方法，所述的核酸纟笨针能够辨别出下述种类恶性疟原虫(P.falciparum)，间日痴原虫(P.vivax),三日痴原虫(P.malariae)以及卵形疟原虫(P.ovale),上述方法包括制备一种核酸片4殳或者多肽核酸PNA,4吏其对应于或者互补于一种序列，所述的序列具有来自于恶性症原虫(P.falciparum),间日症原虫(P.vivax)，三日症原虫(P.malariae)，以及卵形症原虫(P.ovale)的核S吏中的至少5个核苦酸；对比所述#1针在杂交才企测中#r测一种或者多种上述症原虫种类的能力；并且选"t奪那个或者那些能够;险测到一种、两个或者三个痴原虫种类而不是4企测到全部四个疟原虫种类的#果4十。本发明还预期了一种才企测并且区分存在于一种才羊本中的恶性症原虫(P.falciparum)，间日症原虫(P.vivax),三日症原虫(P.malariae)，以及卵形症原虫(P.ovale)的方法，戶斤述方法包括提供i)来自于被怀疑患有症疾的宿主的样本以及ii)包括核酸的揮:4十，其中所述的核酸适于用来片企测并且区分恶性痴原虫(P.falciparum),间日疾原虫(P.vivax),三日疰原虫(P.malariae)，以及卵形症原虫(P.ovale);在适于4吏所述4笨4十与目才示发生杂交的条件下，将所述样本与所述探针进4亍接触；并且确定在所述样本中恶'f生疾原虫(P.falciparum)，间日症原虫(P.vivax)，三日疾原虫(P.malariae)，以及卵形症原虫(P.ovale)是否存在。在一种实施方式中，所述的方法予贞期到用于冲企测恶性疾原虫(P.falciparum)的4笨4十选自具有PFl,PF2,PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少5个连续的核苷酸的核酸序列。在另外一种实施方式中，所述的方法预期到所述的纟果4f"选自具有PFl，PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少10个连续的核香酸的核酸序列。在另夕l、一种实施方式中，所述的方法预期到戶斤述的才笨4十选自具有PF1，PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列。在一种实施方式中，所述的方法预期到用于4企测间日疟原虫(P.vivax)的揮:针选自具有PV1或者PV2中的一种或者多种中的至少5个连续的核香酸的核酸序列。在另外一种实施方式中，所述的方法预期到所述的纟笨针选自具有PV1或者PV2中的一种或者多种中的至少10个连续的核苷酸的核酸序列。在另外一种实施方式中，所述的方法预期到所述的纟果针选自具有PV1或者PV2中的一种或者多种中的至少15个连续的冲亥香酉吏的核l臾序列。在一种实施方式中，所述的方法予贞期到用于才企测三日疰原虫(P.malariae)的4笨针选自具有PM1中的至少5个连续的核苷酸以及PF1，PF2，PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少5个连续的冲亥苷酸的核S臾序列，并且其中如果具有PM1中的至少5个连续的核苷酸的挥:4十;险测呈阳性，并且具有PFl,PF2，PF3，PF4或者PF5中的至少5个连续的核香酸的揮:4^险测呈阴性，则样本中的三日症原虫(p.malariae)为阳性。在另外一种实施方式中，所述的方法予贞期到所述的4笨4十选自具有PF1，PF2，PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少10个连续的核普酸以及具有PM1中的至少IO个连续的核苷酸的核S臾序列。在另外一种实施方式中，所述的方法预期到所述的纟罙4十选自具有PF1，PF2,PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少15个连续的核苦酸以及具有PM1中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列。在一种实施方式中，所述的方法预期到用于才企测卵形痴原虫(P.ovale)的探针选自具有POl中的至少5个连续的核普酸以及PF1,PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少5个连续的核苷酸的核酸序列，并且其中如果具有POl中的至少5个连续的核苷酸的#1针4企测呈阳性，并且具有PF1，PF2,PF3，PF4或者PF5中的至少5个连续的核苷酸的^l笨针^r测呈阴性，则才羊本中的卵形疾原虫(p.ovale)为阳性。在另外一种实施方式中，戶斤述的方法子贞其月到戶斤述的4笨4十选自具有PF1,PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少10个连续的冲亥苷酉菱以及具有POl中的至少10个连续的核香酸的核酸序列。在另外一种实施方式中，所述的方法预期到所述的^t果针选自具有PF1，PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少15个连续的核苷酸以及具有POl中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列。在前述的任意一种实施方式中，所使用到的探针可以是本发明所/>开的完整的核苷酸序列或者是该序列的互补链，也可以是所述纟笨4十中的5个、10个或者15个连续的核苷酸的互补序列。具体实施例方式本发明的特^正在于用于在例如杂交才全测中才企测痴原虫寄生虫(例3口，恶生疾原虫(P.falciparum),间日疾原、虫(P.vivax)，三日症原虫(P.malariae),以及卵形症原虫(P.ovale))的核酸探针。本发明所述的探针可以被用于在生物样本中检测症原虫的存在的方法中。在这类方法中，在杂交才全测中将本发明所述的4笨针与一种生物样本(例如，全血，脑脊液(CSF)或者组织样本)进4亍4妄触，并且对与所述才羊本中的所述核酸发生结合的所述4果4十进行4企测，用来指示所述样本中疟原虫的存在。本发明中所包括的揮:4十可以通过下述方法进4于识别A(1)制备核酸片段或者多肽核酸，PNA(即，探针)，使其对应于或者互补于一种序列，所述的序列具有来自于恶性痴原虫(P.falciparum)的核酸中的至少10个核苦酸；并且(2)对个种类相比，与恶性痴原虫(P.falciparum)更顺利的进4亍杂交的探针被包括在本发明之内。B(1)制备核酸片段或者多肽核酸(PNA)(即，探针)，j吏其对应于或者互补于一种序列，所述的序列具有来自于间曰痴原虫(P.vivax)的核酸中的至少IO个核苷酸；并且(2)对比所述探针在杂交;f企测中检测所有痴原虫种类的能力。与其他三个种类相比，与间日疾原虫(P.vivax)更顺利的进4亍杂交的#1针#1包4舌在本发明之内。C(1)制备核酸片段或者多肽核酸(PNA)(即，探针)，^吏其对应于或者互补于一种序列，所述的序列具有来自于三曰症原虫(P.malariae)的核酸中的至少10个核香酸；并且(2)对比所述探针在杂交才企测中检测所有症原虫种类的能力。与其他三个种类相比，与三日疾原虫(P.malariae)更顺利的进4亍杂交的探针被包括在本发明之内。D(1)制备核酸片段或者多肽核酸(PNA)(即，探针)，4吏其对应于或者互补于一种序列，所述的序列具有来自于卵形痴原虫(P.ovale)的核酸中的至少10个核苦酸；并且(2)只于比所述探针在杂交;^企测中^r测所有症原虫种类的能力。与其他三个种类相比，与卵形疾原虫(P.ovale)更顺利的进行杂交的探针被包括在本发明之内。恶寸生疾原虫(P.falciparum)，间日症原虫(P.vivax),三日痴原虫(P.malariae),以及卵形症原虫(P.ovale)冲亥酉臾可以通过来自于被感染的个体的生物样本(例如全血，骨髓，脑脊液(CFS))而获得，其中利用本领域标准的核酸分离方法获得。恶性疟原虫(P.falciparum)(以及间日症原虫(P,vivax),三日痴原虫(P.malariae)和卵形症原虫(Rovale))还可以通过i咅养获4寻。例如，DNA编码的痴原虫核#唐体RNA可以通过对DNA进4亍的聚合酶链式反应(PCR)扩增来获得，其中所述的DNA是从被感染患者的全血样本中制备得到的，利用这里所描述的以及本领域已知的方法和引物。可以选4奪4壬意的痴原虫序列(例3。，编石马58、5.8S、18S或者28S核^f唐体RNA的序列)作为候选序列用于进4于#笨4十的识别。优选的序列是那些与非人类疟原虫或者其他原生动物寄生虫中的类似序列存在差异的序列，所述的其他原生动物寄生虫像是例如巴贝西虫(Babesia)或者牛泰勒原虫(Thileria),所述的差异是由系统发育比4交来确定的。本发明所述的核酸探针具有至少10个核苦酸的长度并且可以含有脱氧核^f唐核苦酸(DNA纟果针)，核糖核香酸(RNA探针)，肽核酸(PNA探针)或者上述物质的组合或者1奮饰。所述的採3十可以是单《连的或者是双《连的，并且可以通过本领域的各种标准方法中的任4可一种进4亍制备。例如，所述的^笨针可以通过下述方法来制备化学合成，载体(例如，含有与所述探针相应的序列的质粒)的限制性内切核酸酶消化反应，聚合酶链式反应(PCR)扩增，或者含有与所述探针相应的序列的载体的体外專争录(参见，例如，Ausubel等人于1994年的CurrentProtocolsinMolecularBiology《观J戈分子生物学实马全指南》，Greene出版社，纽约N.Y.，在此引入作为参考)。所述的探针可以在合成的过禾呈中或者合成之后进4亍标i己。例如，可以在合成的过程中向所述探针中插入含有例如放射性同位素(例如，p32,S35，或者H3)、生物素或者;也高辛配基的一皮才示i己的4亥苷酸。<吏用例如卵白素或者链霉亲和素的二级试剂#r测含有生物素的探针，所述的二级抗体含有一种可^f企测到的标记，例如荧光染料(例如，荧光素或者若丹明)或者酶(例如，石威性^粦酸酶或者-束才艮过氧化物酶)。类似的，含有地高辛配基的探针可以通过使用被标记的抗地高辛配基抗体来4企测。揮:针还可以在合成之后进^f亍标记，通过例如切口平移或者利用T4RNA连接酶，多聚腺苷酸聚合酶，末端转移酶或者T4多核苷酸激酶用标准的方法进行标记(参见，例如Ausubel等人的如上所述的著作)。为了增强所述探针的稳定性，所述的探针还可以含有一皮修饰的核苷酸。例如，可以使用在核糖基团中含有2，-0-烷基基团的核糖核苷酸。所述的探针还可以含有能够促进所述探针在固体支持物上进行捕获的修饰。例如，为了4足进#笨针与一种固体支持物进4亍结合，可以利用末端转移酶在所述4笨针的3'末端加入poly-dA或者poly-deaza-鸟苦尾巴，其中所述的固体支持物是例如由poly-dT或者poly-dC标记的磁性粒子。所述的探针可以在4吏用之前通过标准的方法进4亍纯化，所述的标准方法是例如改性聚丙烯酰胺;疑月交电泳，高岁文液相色i普或者凝月交过滤色"i普(参见，例如，Ausubel等人的如上所述的著作)。本发明所述的探针可以被用于任何标准的杂交检测当中，用以才企测才羊本中疾原虫的存在。例如，可以4吏用的方法有Southern印迹，贫王点印迹，原4立杂交，由生物4专感器或者乂又重4罙4十4企测的实时杂交，夹心杂交才企测(参见，例如，美国专利申i青No.07/826657[王见在是美国专利No.5519127]以及美国专利No.5629156[国际7>开号WO94/10335],上述全部内容在此引入作为参考)。或者，所述的探针可以在聚合酶链式反应检测中作为引物(参见，例如，Ausubel等人的如上所述的著作)。可以利脊液(CSF),骨髓以及例如来自于脾脏的组织样本。利用标准方法(除了在原位杂交的情形中，在该情形中所述细胞是保持完整的)乂人上述才羊本中分离出核酸并且利用在上述列出的4企测中所佳:用的所述#1针进^亍分析。在所述才全测中可以4吏用单个的揮:针或者这些探针的组合。利用这类探针进行的杂交反应的条件(例如，在本发明所述的方法中)落入如下的范围之内，例如，在25。C至42。C下的30-50%的甲酰胺，或者在25-37°C下的异石克氰酸胍(GuSCN)与曱酰胺的混合物。正如"本领域技术人员所知"，对于杂交条件的选择取决于所使用的探针的长度以及核苷酸的成分(conteng)(即，GC以及AT的才目只于量)。因》匕，可以依照这些因素对杂交条件进4亍调整。除此之外，4吏用不同的盐类(例如，与氯4匕钠相7十比的异石克氰酸胍或者盐酸胍)以及改性i式剂(例如，NP-40,十二烷基碌u酸钠)时可能需要调整所述的盐浓度以及所述的温度，这对于本领域技术人员而言是容易确定的。本发明可以4吏用的杂交条件的非限制性例子如下。在Southern印迹分析中，可以使用如下的杂交条件42。C下，存在于2xSSC中的30%-50%的曱酰胺。杂交反应之后，利用标准方法对所述的过滤器进4亍洗涤。例如，在25。C下，在2xSSC至O.lxSSC中进4亍三次15分4中的杂交后洗;条，并且可以利用0.1%的十二烷基硫酸钠(SDS)进行洗涤，用以除去未结合的探针。在RNA印迹杂交中，在室温下利用30%的曱酰胺反应过夜。通过在2xSSC中利用0.1%的十二烷基石克酸钠(SDS)进行三次15分钟的洗涤来除去过量的探针。所述的术i吾"杂交反应"指的是互补核酸的配对。杂交反应以及所述杂交反应的强度(即，在所述核酸之间发生结合的强度)受到下列因素的影响所述核酸之间的互补程度，相关的条件的严格性，所形成的杂交的Tm值，以及在所述核酸中的G-C比例。在单个分子的结构中含有的互补核酸的配对被称为"自体杂交"。已经熟知的是，可以利用众多的等价条件来构成适当的杂交条件；考虑的因素是例如所述探针的长度以及性质(DNA,RNA，石威基组合物)以及所述目标的性质(DNA,RNA,石咸基组合物，存在于溶液中或者是^皮固定的，等等)以及所述盐的浓度以及其他组分(例如，是否存在曱酰胺，石危酸葡聚糖，聚乙二醇)，并20且所述的杂交溶液可以是多种多样的，以形成不同于<旦是等<介于上述列出的条件的低度严格的杂交条件。除此之外，本领域已知在高度严格的条件下促进杂交反应的条件(例如，增加杂交的温度和/或洗涤步骤，在所述杂交溶液中使用曱酰胺，等等)。对于原位杂交而言，可以4吏用如下所述的条件，如美国专利No.6165723以及美国专矛J申i青No.11/494430(在jt匕引入4乍为参考)中所描述的在室温至37。C之间的异碌u氰酸胍(1.5至3.5M，耳又决于所述纟果4十的序列)，或者在室温至37。C之间的甲酰胺与异石克氰酸胍混合物，30分钟至1小时，随后在SSC(2X至0.1X)以及0.1。/。的十二烷基碌L酸钠(SDS)中进4亍洗涤。实施例无需更加详尽的细节，可以相信，本领域技术人员根据本发明的描述，能够将本发明利用到最完善的程度。因此，下面的具体实施方式仅仅被解释为描述性的，并不能以无论何种的形式构成对所述/>开的其余内容的限制。探针PGe画l，PGe腦2，MalFl,MaiF2,Mai1.8F,Mai1.8R在恶性痴原虫(P.falciparum),间日痴原虫(P.vivax)，卵形痴原虫(P.ovale)以及三日症原虫(P.malariae)才羊本中的杂交斑点印迹的分析数据在表1中有所表示。在这些试—验中，在每个斑点中4吏用大约0.1樣t克的质粒，所述的质粒中含有编码各自的18SrRNA亚基的核苷酸序列。在如上所述的杂交条件下，将所述斑点与i也高辛配基标记的纟罙针进4于杂交。在利用RNA的情况中，对RNA进行合成并且在硝酸纤维素月莫上利用存在于6xSSC中的0.1微克的RNA形成斑点。在室温下在曱酰胺中与所述的地高辛配基标记的探针(dig-labeledprobes)进行杂交过夜。这种方法被用来在不同的生物体以及探针中对杂交信号进行比较。能够与所有种类的痴原虫的所有类型的18rDNA进4亍杂交的4果4十是PGenusl,PGenus2,MalFl,MalF2，Mai1.8F以及Mal1.8R。^笨4十PGenusl，PGenus2以及Mal1.8R能够与所有种类的痴原虫的18SrRNA发生杂交。痞原虫种类18SrRNA特异性揮:4十本发明所述的疟原虫种类特异性探针包括探针PGenusl,PGenus2，MalFl,MalF2，Mal1.8F以及Mal1.8R,其具有下述序列PGenus15'-TCTCGCTTGCGCGAATACTCG-3'(序歹'Jl)PGe画25，-CCAAAGACTTTGATTTCTCAT-3'(序歹'J2)Malfl5，-CAGATACCGTCGTAATCTTA-3，(序歹'J3)Malf25，-CGAAAGTTAAGGGAGTGAAGAC-3，(序歹'J4)Mal1.8F5，-atgtagaaactgcgaacggc-3，(序歹寸5)Mal1.8R5，國cagcacaatctgatgaatcatgc-3，(序歹'J6)疾原虫种类18SrRNA特异性4笨4十本发明所述的疟原虫种类特异性探针包括探针PV1，其具有选白由PV1,PV2，PV3，PF1，PF2，PF3,PF4,PF5，PF6,PF7,PF8,PM1，POl所组成的组中的揮:4十或者是它们的完整长度的互4卜序列中的序列。间日症原虫(P.vivax)特异性揮:4十PV15，一TCTAAGAATAAACTCCGAAGAGAAAATTCTTATTTT-3，(序列7)PV25，-TACACACTCAAGAAATGAATCAAGAGTGC-3，(序歹")恶性痴原虫(P.falciparum)特异性4笨4十PF15，—GCAATCTAAAAGTCACCTCGAAAGATGACTT-3，(序列9)PF25'-CCTAACAAATACTTATCCAAAGATAAAAATCAAGGA_3'(序列10)PF35，—ATTTTTAACACTTTCATCCAACACCTAGTCG-3，(序列11)PF45'-TTACAAAACCAAAAATTGGCCTTGCATTGTTATTT_3'(序列12)PF55，—TCCAATTGTTACTCTGGGAAGG_3，(序歹'J13)三日症原虫(P.malariae)4争异性4果4十PM15'—GAAACACTCATATATAAGAATGTCTC-3，(序歹'J14)卵形痴原虫(P.ovale)特异性探针PO15'—AATTTCCCCGAAAGGAATTTTC—3，(序歹'J15)表1<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注意除MalFl、MalF2以及Mai1.8F之外的其他所有探针也均与rRNA发生杂交。在本发明的一种实施例中，样本被进行检测是否有疟原虫的存在，并且利用本发明所述的纟笨针对;险测到的疟原虫的种类进4亍区分。利用探针对样本进行检测，其中所述的探针具有探针PV1和/或PV2、探针PFl,PF2,PF3，PF4和/或PF5、探针PM1以及探针POl中的至少5个、10个或者15个连续的核香酸，或者具有上述完整的探针或者是它们的互补序歹'J。探针PV1和/或PV2检测呈阳性的样本一皮确定为被间日症原虫(P.vivax)所感染。探针PF1，PF2，PF3,PF4和/或PF5-险测呈阳性的才羊本^皮确定为被恶性疾原虫(P.falciparum)所感染。探针PM1冲企测呈阳性但#14十PF1,PF2,PF3,PF4牙口/或PF54全观'J不呈卩曰斗生的才羊本一皮石角定为^皮三日症原虫(P.malariae)所感染。探针POIJ企测呈阳性^f旦^14十PF1,PF2，PF3,PF4和/或PF54企测不呈阳性的才羊本4皮确定为^皮卵形痴原虫(P.ovale)所感染。通过以上的描述，本领域技术人员可以容易的确定本发明所述的本质特征，并且，在不背离本发明的精神以及范围的情况下，可以对本发明进行各种变化以及》务饰，以4吏其适合于各种用法以及条件。因此，其他的实施方式同样在所述权利要求的范围之内。权利要求1.一种检测样本中疟原虫的存在的方法，所述方法包括如下步骤a)将所述样本与探针进行接触，所述探针用于在杂交检测中检测疟原虫，其中所述的探针能够辨别疟原虫的种类，在允许所述探针与疟原虫核酸发生杂交的条件下进行接触；并且b)对与所述样本中的所述疟原虫核酸发生结合的所述探针进行检测，用来指示所述样本中疟原虫的存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的探针选自由PGe画l,PGe画2，MalFl,MalF2，Mai1.8F,Mal1.8R，PV1,PV2，PF1,PF2,PF3，PF4,PF5，PMl以及POl所组成的纟且或者是它们的完整长度的互#卜序列。3.才艮据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自探针PV1中的至少5个连续的核苷酸或者是上述揮:针的完整长度的互补序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片,殳包括序列，所述的序列选自4笨针PV2中的至少5个连续的核苷酸或者是上述探针的完整长度的互补序列。5.才艮据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片^殳包括序列，所述的序列选自纟罙针PF1中的至少5个连续的核苦酸或者是上述探针的完整长度的互补序列。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自纟果针PF2中的至少5个连续的核苷酸或者是上述探针的完整长度的互补序列。7.才艮据4又利要求1所述的方法，其中所述的核酸片革殳包括序列，所述的序列选自揮:4十PF3中的至少5个连续的核苷酸或者是上述探针的完整长度的互补序列。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自纟笨针PF4中的至少5个连续的核苷酸或者是上述4笨针的完整长度的互补序列。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自探针PF5中的至少5个连续的核苷酸或者是上述探针的完整长度的互补序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自探针PM1中的至少5个连续的核苷酸或者是上述#笨针的完整长度的互补序列。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自探针POl中的至少5个连续的核苦酸或者是上述纟果针的完整长度的互补序列。12.根据权利要求2所述的方法，其中所述的核酸片段包括序列，所述的序列选自由PGenusl,PGenus2,MalFl，MaiF2,Mal1.8F，Mal1.8R,PV1，PV2，PF1,PF2,PF3,PF4,PF5，PM1以及POl所组成的组中的揮:4十中的至少10个核苷酸或者是这些探针的完整长度的互补序列。13.—种核酸片,殳，所述的核酸片,殳包括序列，所述的序列选自由PG飄sl，PGe應2，MalFl,MalF2，Mai1.8F,Mai1.8R,PV1，PV2,PF1，PF2，PF3,PF4,PF5,PM1,POl所组成的组中的探针中的至少5个核苷酸或者是这些^l笨针的完整长度的互补序列。14.一种核酸片革殳，所述的核酸片革殳包括序列，所述的序列选自由PGe画l,PG函s2,MalFl，MalF2，Mai1.8F,Mal1.8R，PV1,PV2,PF1，PF2，PF3,PF4,PF5，PM1，POl所组成的组中的纟笨针中的至少10个核普酸或者是这些4采针的完整长度的互补序列。15.—种核酸片4殳，所述的核酸片,殳包4舌选自由PGenusl,PGe腦2，MalFl以及MalF2,Mal1.8F，Mal1.8R，PV1，PV2，PF1,PF2，PF3，PF4，PF5,PM1,POl所组成的组中的探针的完整序列或者是这些探针的完整长度的互补序列。16.—种筛选核酸揮:针的方法，所述的核酸纟果4十能够辨别出下述种类恶'I"生痴原虫(P.falciparum),间日疾原虫(P.vivax)，三日疾原虫(P.malariae)以及卵形痴原虫(P.ovale)，上述方法包括a)制备核酸片l殳或者多肽核酸，PNA,-使其对应于或者互补于一种序列，所述的序列具有来自于恶性疾原虫(P.falciparum)，间日疾原、虫(P.vivax),三日症yf、虫(P.malariae)，以及卵形疾原虫(P.ovale)的冲亥酉臾中的至少5个核苷酸；b)对比所述探针在杂交4全测中才企测一种或者多种上述疾原虫种类的能力；并且C)选择那个或者那些能够4企测到一个、两个或者三个症原虫种类而不是片企测到全部四个疟原虫种类的探4十。17.才企测并且区分存在于才羊本中的恶性疟原虫(P.falciparum)，间日症原虫(P.vivax),三日症原虫(P.malariae),以及卵形痴原虫(P.ovale)的方法，所述方法包4舌a)提供i)来自于被怀疑患有疟疾的宿主的样本以及ii)包括核酸的探针，其中所述的核酸适于用来才企测并且区分恶性症原虫(P.falciparum),间日痴原虫(P.vivax)，三日症原虫(P.malariae),以及卵形症原虫(P.ovale);b)在适于使所述探针与目标发生杂交的条件下，将所述样本与所述探针进行接触；并且c)确定在所述才羊本中恶性痴原虫(P.falciparum),间日症原虫(P.vivax),三日疾原虫(P.malariae),以及卵形症原虫(P.ovale)是否存在。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的用于检测恶性疟原、虫(P.falciparum)的4笨4十选自具有PFl,PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少5个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。19.才艮据4又利要求18所述的方法，其中所述的挥:4十选自具有PF1，PF2,PF3，PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少10个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述的探针选自具有PFl,PF2,PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述的用于检测间日疟原、虫(P.vivax)的4果4十选自具有PV1或者PV2中的一种或者多种中的至少5个连续的核香酸的核酸序列，或者是其互^卜序歹'J。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述的探针选自具有PV1或者PV2中的一种或者多种中的至少10个连续的核香酸的核酸序列，或者是其互补序列。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述的探针选自具有PV1或者PV2中的一种或者多种中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。24.根据权利要求17所述的方法，其中所述的用于才企测三日疾原虫(P.malariae)的^笨针选自具有PM1中的至少5个连续的冲亥苦l吏的4tS臾序列，或者是其互^卜序列，以及PF1，PF2,PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少5个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列，并且其中如果PM1探针检观'J呈卩曰性，并且PF1，PF2,PF3，PF4或者PF5探针;险测呈阴性，则样本中的三日痴原虫(P.malariae)为阳性。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述的探针选自PF1,PF2，PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少10个连续的核香酸的核酸序列，或者是其互4卜序列，以及PM1中的至少10个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。26.根据权利要求24所述的方法，其中所述的探针选自PF1,PF2,PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少15个连续的核苦酸的一亥酸序列，或者是其互4卜序列，以及PM1中的至少15个连续的核香酸的核酸序列，或者是其互补序列。27.才艮据权利要求17所述的方法，其中所述的用于才企测卵形痴原虫(P.ovale)的探针选自具有POl中的至少5个连续的核香酸的4亥酉臾序列，或者是其互斗卜序列，以及PFl,PF2,PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少5个连续的核苷酉吏的核酸序列，或者是其互补序列，并且其中如果POl纟笨针才全观'j呈卩曰寸生，并且PFl,PF2,PF3,PF4或者PF5^笨4十冲全观'呈阴性，则才羊本中的卯形症原虫(P.ovale)为阳性。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述的探针选自PF1,PF2，PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少10个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列，以及POl中的至少IO个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。29.根据权利要求27所述的方法，其中所述的探针选自PF1,PF2，PF3,PF4或者PF5中的一种或者多种中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列，以及POl中的至少15个连续的核苷酸的核酸序列，或者是其互补序列。全文摘要本发明涉及新的核酸探针以及检测疟原虫寄生虫的方法，以及检测不同种疟原虫寄生虫的方法，这些不同种的疟原虫寄生虫具有各自不同的选择性。文档编号C12Q1/68GK101541978SQ200780044265公开日2009年9月23日申请日期2007年11月29日优先权日2006年11月30日发明者D·若斯卡,H·威奥特曼,J·S·沙阿,N·哈里斯,O·马克,S·斯谢尔尼-沃德申请人:Id-菲什技术公司