专利名称：：用于产生酵母提取物的方法
技术领域：
：本发明涉及使用外源蛋白酶产生酵母提取物的方法。
背景技术：
：酵母提取物用途广泛，例如，用于食品工业中的调味，用于微生物发酵培养基中，和用作保健食品。酵母提取物的产生在文献中有描述，参见例如Kelly,M.(1982)YeastExtract(于IndustrialEnzymology,Godfrey,T.编)或Chae，H.J.等(2001)，BioresourceTechnology76，253-258。酵母提取物通常通过如下方法制备，通过对细胞进行酸水解或机械或化学破坏来分解酵母，继而用内源酶自溶，从而将酵母的大分子结构(特别是蛋白质)降解成极大量(maximumamount)的可溶性物质。可以添加内源酶，包括蛋白酶如木瓜蛋白酶，以增进酵母自身酶的效果。在酶水解之后，将酵母提取物与细胞碎片分离，并且可以进行巴氏灭菌和浓缩。浊度是酵母提取物的一个质量量度。低浊度使浓缩和分离更容易。因此，对产生低浊度酵母提取物的方法存在期望。根据本发明可应用的蛋白酶在先前已有描述。例如，源自拟诺卡氏菌属菌种(Nocardiopsissp.)NRRL18262的蛋白酶在WO88/03947(其中将该菌抹称作拟诺卡氏菌属菌种菌抹IOR)和WO01/58276中公开。其它可用于本发明的相关蛋白酶在WO88/03947、WO04/111220、WO04/111222、WO04/111223、WO05/123911和WO04/072279中公开。
发明内容本发明人已经鉴定了可用于以高产率制备浊度非常低的酵母提取物的蛋白酶。当与等量酶蛋白进行比较时，这些蛋白酶比本领域使用的其它蛋白酶更有效，这使酵母提取物的制造者获得更经济的产品。此外，当使用本发明的蛋白酶制备酵母提取物时，总干固体的蛋白质含量高，这反映了高纯度。因此，本发明涉及用于产生酵母提取物的方法，其包括a)向包含蛋白质的酵母添加蛋白酶，所述蛋白酶与SEQIDNO:1具有至少50%同一性；和b)3温育从而使蛋白质水解。发明详述蛋白酶术语蛋白酶(protease)用于本文是水解肽4建的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶也称为，例如，肽酶、蛋白水解酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶(proteolyticenzyme)。用于本发明的蛋白酶是在多肽链内部作用的内切型(endo-type)蛋白酶(内肽酶)。对用于本发明的蛋白酶的来源不进行限制。因此，术语蛋白酶不仅包括天然或野生型蛋白酶，还包括任何显示蛋白酶活性的蛋白酶的突变体(mutant)、变体(variant)、片段等，以及合成的蛋白酶，诸如改组的蛋白酶(shuffledprotease),和共有蛋白酶(consensusprotease)。这些遗传工^呈〈'l"饰的蛋白酶可以如本领域通常所知的来制备，例如通过定点诱变(site-directedmutagenesis)，通过PCR(使用含有期望的突变的PCR片段作为PCR反应中的引物之一)，或通过随机诱变来制备。共有蛋白的制备在例如EP897985中描述。蛋白酶变体的实例(如本文中使用的)是已缺失、插入或用其它氨基酸取代了一个或多个氨基酸的蛋白酶。用于本发明的蛋白酶的实例是(i)WO01/58276中公开的源自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶，所述蛋白酶的序列示于本文件的SEQIDNO:1;(ii)与(i)的蛋白酶具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或至少95%氨基酸同一性的蛋白酶；(iii)(i)或(ii)的蛋白酶显示蛋白酶活性的突变体、变体或片段。就本发明而言，两个氨基酸序列的比对可以通过使用EMBOSS程序包(http:〃emboss.org)版本2.8.0的Needle程序来测定。Needle程序执行Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.MoLBiol.48,443-453中描述的全局比对算法(globalalignmentalgorithm)。使用的取代矩阵是BLOSUM62,缺口产生罚分(gapopeningpenalty)是10，并且击夹口延伸罚分(gapextensionpenalty)是0.5。两个氨基酸序列之间的同一性程度这样计算，用两个序列的比对中的精确匹配数除以两个序列中最短序列的长度。结杲表示为百分比同一性。当两个序列在重叠的相同位置具有相同的氨基酸残基时，出现精确匹配。序列的长度为序列中的氨基酸残基数(例如SEQIDNO:1的长度是188)。作为可用于本发明的细菌蛋白酶的实例，可提及的是WO88/03947中公开的来自白拟诺卡氏菌(Nocardiopsisalba)(先前为达*〉维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei))NRRL18133的蛋白酶；来自ii^维尔拟诺卡氏菌达+〉维尔亚种(Nocardiopsisdassonvilleisubsp.dassonvillei)DSM43235、白#以诺卡氏菌DSM15647、拟诺卡氏菌属菌种DSM16424的蛋白酶和合成的蛋白酶22，全部四种公开在WO04/111220中；WO04/111222中公开的来自葱绿拟诺卡氏菌(Nocardiopsisprasina)DSM15648的蛋白酶；WO04/111223中^>开的来自葱绿拟诺卡氏菌DSM15649的蛋白酶；来自葱绿拟诺卡氏菌(先前为白拟诺卡氏菌)DSM14010、嗜i威拟诺卡氏菌(Nocardiopsisalkaliphila)DSM44657和卢森坦拟诺卡氏菌(Nocardiopsislucentensis)DSM44048的蛋白酶，全部三种公开于WO05/123911中；来自BrachysporiellagayanaCGMCC0865、绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)、粘帚酶属菌种(Gliocladiumsp.)CBS114001、黑团孢属菌种(Periconiasp.)CBS114002、黑团孢属菌种CBS114000和新月弯孢(Curvularialunata)CBS114003的蛋白酶，全部六种公开在WO04/072279中；以及这些蛋白酶显示蛋白酶活性的突变体、变体或片段。用于本发明的蛋白酶是细菌蛋白酶，术语"细菌的(bacterial)"表明所述蛋白质是衍生自或起源于细菌，或是源自细菌的类似物、片段、变体、突变体或合成蛋白酶。其可在原野生型细菌菌抹中、在另一微生物菌抹中或在植物中产生或表达；即所述术语涵盖野生型、天然存在的蛋白酶的表达，以及重组蛋白酶、遗传工程蛋白酶或合成蛋白酶在任何宿主中的表达。在本发明的方法中，蛋白酶可以是纯化的。术语"純化的"用于本文包括这样的酶蛋白，其基本上不含来自该酶蛋白所来源的生物的组分。术语"纯化的"还包括这样的酶蛋白，其不含来自从中获得该酶蛋白的天然生物的组分，这也称为"基本上纯的(essentiallypure)"酶，并且可以具体涉及天然存在并且未经遗传修饰的酶，所述遗传修饰诸如通过缺失、取代或插入一个或多个氨基酸残基。因此，蛋白酶可以是纯化的，即仅存在少量的其它蛋白质。表述"其它蛋白质"具体而言指其它的酶。术语"纯化的"用于本文还指去除其它组分，特别是作为所述蛋白酶来源的细胞中存在的其它蛋白质，并且最具体而言是其它的酶。蛋白酶可以是"基本上纯的(substantiallypure)",即基本上不含来自在其中产生所述蛋白酶的生物的其它组分，所述生物例如用于重组产生酶的宿主生物。优选地，所述蛋白酶是75。/。(w/w)纯的，更优选至少80%、85%、90%或甚至至少95%纯的。在更优选的实施方案中，所述蛋白酶是至少98%纯的酶蛋白制备物。然而，对于本发明的使用，蛋白酶不需要那么纯。其可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，在这样的情况下可将其称为蛋白酶制备物。本发明的蛋白酶可以与其它酶(例如其它蛋白酶)一起使用。在一个优选的实施方案中，将内切型的蛋白酶，例如源自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶，与外肽酶组合，或与具有外肽酶活性的蛋白酶制备物组合，例如源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的蛋白酶制备物，如W094/25580中所述，诸如Flavourzyme(NovozymesA/S,Denmark)。在一个具体实施方案中，当通过对酪蛋白的水解和后续的TCA可溶性肽与邻苯二曱醛及2-巯基乙醇的反应，然后测量所得复合物在340nm的吸光度时，用于本发明的蛋白酶具有接近中性的pH-活性最优值。术语接近中性的pH活性最优值意指以下的一种或多种情况pH-最优值在pH5.5-11.0，或pH7,0-11.0，或pH6.0-10.0,或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0,或pH8.0-10.0的区间中。在另一具体实施方案中，用于本发明的蛋白酶是热稳定的。术语热稳定意指以下的一种或多种情况当如上所述通过对酪蛋白的水解来测定时，最佳温度是至少50。C、52。C、54。C、56。C、58。C、60。C、62。C、64°C、66°C、68。C或至少70°C。酵母(familySaccharomycetaceae)。在一个特定的实施方案中，酵母是酵母属(Saccharomyces)的酵母，例如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvamm)。在另一实施方案中，酵母是克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母，例如脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)。在另一实施方案中，酵母是念珠菌属(Candida)酵母，例如产朊念珠菌(Candidautilis),也称为串酵母菌(Torulayeast)。应用的酵母可以是任何形式，诸如特别培养在例如糖蜜上的酵母，或废啤酒酵母(spentBrewer'syeast)，或自醇发酵收集的酵母。应用的酵母可以是完整的酵母细胞，或完全或部分^C坏或降解的酵母细胞。酵母提取物酵母提取物在本发明的上下文中与酵母水解产物或酵母自溶产物同义，是来自包含经水解蛋白的酵母的可溶性提取物，其用途广泛，例如用作增味剂(flavourenhancer)。根据本发明，所述酵母提取物是使用用于蛋白质水解的外源蛋白酶产生的。除了添加的蛋白酶之外，酵母本身含有多种降解酶(degradativeenzymes)，包括脂肪酶、核酸酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶和蛋白酶。这些内源酶的最优温度和pH值各不相同，并且它们在本发明的工艺条件下可能或多或少是有活性的。在添力口蛋白酶之前，酵母可以是含7K悬'液(aqueoussuspension)的开^式。酵母悬液的干物质含量可以是5-50%，诸如10-30%。所述酵母悬液的pH和溫度可以适当参考所述蛋白酶的特性来调节。在一个实施方案中，将酵母悬液的pH调节得碱性更强，例如调节至pH5.5-9，优选pH6-8，或更优选pH6-7。pH和温度的调节可以在添加蛋白质之前、同时或之后进行。蛋白酶应该以有效量应用，即足以进行充分蛋白质水解的量。目前预期按一种或多种以下量(剂量范围)施用所述酶0.001-1;0.005-1;0.01-0.5;0.01-0.2;或0.01-0.1——全部这些范围的单位是mg酶蛋白/g酵母干物质。在添加蛋白酶之前或之后，可以破坏酵母细胞，如通过提高温度来进行。任选地，可以添加化学物质，诸如盐或有机溶剂。此过程通常称为质壁分离。质壁分离和由外源蛋白酶引起的蛋白质水解可以同时发生。酵母细胞内容物的自体消化通常称为自溶。这种自体消化可能以不同程度在外源蛋白酶引起的蛋白质水解之前发生或与之同时发生。在一个优选的实施方案中，质壁分离、外源蛋白酶引起的蛋白质水解和特定程度的自体消化同时发生。在另一实施方案中，质壁分离和以酵母自身酶进行的自体消化首先进行，而以添加的蛋白酶进行的水解在单独的澄清步骤(aseparateclarificationstep)中进行。添加蛋白酶之后的温育可以在获得期望程度的蛋白质水解所必需的任何方便的温度和温育时间进行。本发明上下文中的蛋白质水解可以基本上通过添加的蛋白酶进行，或者可以是添加的蛋白酶和酵母的自体消化性内源蛋白酶的作用的组合。即，术语蛋白质水解包括由添加的蛋白酶进行的蛋白质水解，和通常称作自溶的由酵母自身的蛋白酶进行的蛋白质水解。在优选的实施方案中，温育温度是约20°C至约70°C，优选约40。C至约60°C，并且温育时间是约1小时至48小时，优选12至30小时。在温育进程中的任何时刻，可将pH和温度二者任选地调节得更高或更低。将用蛋白酶进行的温育持续到达到期望的结果，其后可以或可以不通过使酶失活来终止，例如通过热处理步骤进行。这种热处理也可以用于对酵母提取物进行巴氏灭菌。蛋白水解处理之后，可以将酵母提取物与细胞碎片分离，例如通过离心并且倾析上清。由此获得的酵母提取物可以通过本领域已知的任何方法浓缩。可以对酵母提耳又物的质量进行表征，例如通过以下参数进行表征蛋白质产率是在酵母提取物中回收的蛋白质占水解之前酵母千物质中的百分比。以下是使用本发明的蛋白酶可以获得的蛋白质产率的实例至少40%,至少50%，或至少60%。水解程度(DH)表示通过所述方法获得的蛋白质水解的程度。在本发明的上下文中，水解程度(DH)由下式定义DH=(切割的肽键数/肽键总数)x100%蛋白质分数(proteinfraction)是蛋白质来源的酵母提取物中干固体所占的分数。以下是使用本发明的蛋白酶可以获得的蛋白质分数的实例至少45%,至少50%，或至少55°/。。酵母提取物的浊度可以通过本领域已知的任何方法测定。其可以作为NTU(比浊法浊度单位(NephelometricTurbidityUnits))测量。以下是使用本发明的蛋白酶可以获得的酵母提取物浊度的实例低于2000NTU，低于1500NTU,低于1000NTU，或低于500NTU。本发明的一个实施方案是通过上述方法产生的酵母提取物。实施例1将具有SEQIDNO:1中所示序列的来自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶与Alcalase和无外源蛋白酶的酵母对照相比较来进行评估。在来自酿酒酵母的成块酵母(blockyeast)上测试拟诺卡氏菌属蛋白酶和Alcalase2.4L(NovozymesA/S,Denmark)。将酵母与去离子水混合以达到13.7%的干物质含量，并且在室温(磁力)搅拌60分钟。将酵母混合物加热至55°C，并且将一部分调节至pH6.5。另一部分不调节pH并且用作对照("酵母对照，，的水解产物pH是大约pH5)。向来自调节过pH的部分的样品添加酶。酶的量按照mg酶蛋白/g酵母干物质(YDM)的配制(dose)。取出20ml样品并且称量精确量。不向称为"空白，，的样品加酶。水解在55。C进行22小时。将样品在85。C失活10分钟。失活之后，使用Heraeus的Multifuge3S-R将样品在3500rpm离心10分钟。倾析之后称量提取物的量。通过称量(在105。C干燥之后)测量提取物中的干固体。通过燃烧法在LecoFP-528上测定了提取物中氮的量。蛋白质的量按照氮的量的6.25倍计算。游离氨基氮使用OPA(邻苯二醛)法测定。基于上述测量进行以下计算%提取物产率=(离心之后的提取物g数)/(离心之前的酵母混合物g数)*100%蛋白质产率=(离心之后的提取物g数*提取物中的蛋白质含量(content))/(离心之前的酵母混合物g数*酵母混合物的蛋白质含量)*100。/。蛋白质/DS=(离心之后的提取物g数4是取物中的蛋白质含量)/(提取物中的干固体g数"100水解程度=(切割的肽键数/肽键总数)*100=(h/htot)*100其中h表示为meqv丝氨酸NH2的函数h=(丝氨酸NH2-0.4)/1;并且htot=7.8。丝氨酸NH2相对于含100mg/L的丝氨酸标准品通过测量340nm的吸光度测量。提取物的浊度作为NTU(比浊法浊度单位)通过HACH2100AN浊度计使用USEPA滤光片测量。针对FormazinTurbidityStandard4000NTU(可从HACHCompany,USA获得)进行校准。较高的NTU是较高浊度的量度。结果在下表中给出(EP二酶蛋白，YDM=酵母干物质)9<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>来自拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262的蛋白酶在低剂量水平(0.022-0.044mgEP/gYDM)产生了非常高的蛋白质产率。在相同的剂量范围，经拟诺卡氏菌属菌种NRRL18262蛋白酶处理的提取物的浊度非常澄清，并且更大部分的干固体来源于蛋白质。权利要求1.一种用于产生酵母提取物的方法，包括a)向包含蛋白质的酵母添加蛋白酶，所述蛋白酶与SEQIDNO1具有至少50％同一性；和b)温育从而使蛋白质水解。2.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶与SEQIDNO:1具有至少60%同一性。3.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶与SEQIDNO:1具有至少80%同一性。4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酵母是酵母属、克鲁维酵母属或念珠菌属酵母。5.权利要求4的方法，其中所述酵母是酿酒酵母或葡萄汁酵母。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述蛋白酶以每克酵母干物质0.005-1mg酶的浓度存在。7.权利要求6的方法，其中所述蛋白酶以每克酵母干物质0.01-0.5mg酶的浓度存在。8.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括将所述酵母悬浮在水溶液中。9.权利要求8的方法，其进一步包括将酵母悬液的pH调节成碱性更强。10.前述权利要求中任一项的方法，其在步骤b)之后进一步包括进行离心以获得沉淀和上清。11.权利要求10的方法，其中在所述上清中回收水解的蛋白质。12.通过前述权利要求中任一项的方法产生的酵母提取物。全文摘要本发明涉及使用外源蛋白酶产生酵母提取物的方法。文档编号C12N1/06GK101558148SQ200780046547公开日2009年10月14日申请日期2007年12月20日优先权日2006年12月22日发明者利斯贝思·卡卢姆申请人:诺维信公司