用于蛋白质生产的最优化的宿主细胞的制作方法

专利名称：用于蛋白质生产的最优化的宿主细胞的制作方法
用于蛋白质生产的最优化的宿主细胞 相关申请的交叉引用本申请要求2006年11月30日提交的美国临时申请号60/872， 281 的优先权的权益。该申请的内容通过引用将其全部并入本文。发明背景[OOOl]选择生产高水平重组蛋白质的细胞系是生物技术中最大的 挑战之一。用于蛋白质生产的细胞宿主群体常常表现为遗传学上异质 的细胞，它们具有不同的生长属性及其他属性。甚至当这些宿主群体 是来源于一个个体细胞的群体时，对此细胞进行培养久而久之会导致 产生这样的细胞群体，其中个体细胞以一种或多种累积的遗传差异为 特征。为了生产蛋白质，将编码目的蛋白质的一种或多种遗传序列引 入细胞中。引入了遗传序列的群体中的每个细胞可以吸收不同拷贝数 的遗传序列，而这些序列中的任何一条又可以整合入此细胞基因组中 不同位置。结果产生了细胞的很大的多样性，其中每个细胞具有生产 目的蛋白质的不同潜力。为了生产蛋白质，有可能使用全部或部分引 入了遗传序列的宿主细胞，或者也有可能测试细胞的克隆群体、或由 这个群体中分离的单个细胞衍生而来的细胞系，以鉴别具有最佳蛋白 质生产及其他特征的细胞，其他特征如对蛋白质生产有利的某种生长 或增殖特征。由于细胞巨大的多样性，难以从有成千上万个细胞的群 体中鉴定并分离出具有增加的生产目的RNA(例如，编码目的蛋白的 一个RNA)能力的单个细胞。有限稀释是鉴定用于蛋白质生产的细胞 系的一种普通方法，其中将几百和如果通过机器人技术自动化则数千 个单个分离的细胞进行培养，以产生克隆群体，然后评估克隆群体的 蛋白质生产能力。然而，由于细胞在蛋白质生产和其他特征(如生长 或增殖速率)二者上的巨大多样性，测试如此相对小数目的细胞对于效(ineffective)的方法。流式细胞仪或细 胞分选具有分析及分离单个细胞的能力，能对更巨大数目的个体细胞 进行测试，是另一种有助于选择这种稀有细胞的方法。然而，流式细 胞技术中用到的很多测量个体细胞中RNA或蛋白质生产的标准方法常 常需要杀死正被测量的细胞，或者不能在单个细胞中测量蛋白质生产。 此外，这些现在应用的方法不能够评估细胞的增殖速率。因此，需要 有方法用于鉴定、分离及培养具有增加的RNA或蛋白质生产速率的细 胞的高通量方法，其中还根据最优化的生长及增殖属性选择细胞。
现有增加细胞中蛋白质生产的方法还聚焦在最优化培养基 配方上。例如，增加或减少生长培养基的多种成分如糖、盐、氨基酸、 维生素等。例如，参见Chu和RoMnson， Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12(2): 180_7; Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 (1) : 52-7; Dempsey等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 (1) : 175-8;及Sauer等人，Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5; 67 ( 5 ): 585-97。这些努力聚焦在异质细胞群体上。也有可能产生可 靠地生产高水平蛋白质的克隆细胞群体，并为此克隆群体最优化培养 基。
此外，表达高水平目的RM的细胞可以将其很多能量花费 在蛋白质生产中并且因此生长速率降低(Gu等人，Cytotechnology. 1992: 9 ( 1-3 ): 237-45和Kromenaker等人，Biotechnol Prog. 1994 May-Jun; 10 ( 3 ): 299-307 )。具体而言，当使用非克隆细胞群体时， 生长速率降低会导致蛋白质生产降低的细胞过度生长。选择在不同或 最优化的培养基条件下具有最佳生长谱和增殖谱的细胞的方法还有助 于建立用于最优化的生产蛋白质的细胞群体。发明概迷
本发明涉及分离表达增加水平的目的RNA或蛋白质的细胞 的方法。本发明还涉及分离具有改变的细胞增殖速率的细胞，例如具 有增加或降低的细胞增殖速率的细胞的方法。还提供了分离具有改变8的细胞增殖速率(例如，增加或降低的细胞增殖速率)的细胞的方法，其中所述细胞还表达增加水平的目的RNA或蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供了分离具有增加的细胞增 殖速率的细胞的方法。该方法包括以下步骤将细胞群体与用于监测 细胞增殖速率的焚光试剂接触，以及分离显示出一定水平的荧光试剂 的荧光的细胞，所述一定水平的荧光试剂的荧光与细胞增殖的增加有 关。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于分离具有增加的 细胞增殖速率的细胞的方法，其中所述细胞也表达高水平的目的RNA。 该方法包括以下步骤将细胞群体与荧光发生探针接触，该荧光发生 探针在与目的RNA杂交时发出荧光；将该群体与用于监测细胞增殖速 率的荧光试剂接触；以及分离显示出增加的荧光发生探针的荧光和一 定水平的荧光试剂的荧光的细胞，所述一定水平的荧光试剂的荧光与 细胞增殖的增加有关。检测荧光发生探针的荧光可以与检测用于监测 细胞增殖速率的试剂的荧光同时测定。备选地，检测荧光发生探针的测定。用于监测细胞增殖速率的荧光试剂可以发出与荧光发生探针相 同或不同波长的荧光。根据本发明的方法分离到的细胞可以进一步培 养从而产生细胞培养物或细胞系。在特定实施方案中，以上方法进一 步包括测量细胞培养物密度的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供了产生具有增加的细胞 密度的细胞培养物的方法，其中细胞培养物中的细胞表达增加水平的 目的RNA。该方法包括以下步骤将细胞群体与荧光发生探针接触， 该荧光发生探针在与目的RNA杂交时发出荧光；从显示出增加的焚光 发生探针的荧光的群体中分离细胞；培养所述分离的细胞以产生第一 细胞培养物；重复上述步骤从而分离第二细胞培养物；测量第一和第 二细胞培养物的密度；以及鉴定具有增加或更高的细胞密度的细胞培 养物，其中所述细胞培养物中的细胞表达增加的高水平目的RNA。
在特定实施方案中，本发明还提供了分离具有二相生长谱(biphasic growth profile )的细胞的方法，其中所述细胞在生长镨 第一部分中具有增加的增殖速率，并且其中所述细胞在生长谱第二部 分中具有降低的增殖速率。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤 将细胞群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触，以及分离在生 长谱第一部分中显示出改变的荧光试剂的荧光且在生长谱第二部分中 显示出未改变或降低的焚光试剂的荧光的细胞。
在特定的其他实施方案中，本发明提供了分离具有二相生 长谱的细胞的方法，其中所述细胞在生长谱第一部分中具有增加的增 殖速率，并且其中所述细胞在生长谱第二部分中具有降低的增殖速率， 并且其中所述细胞在生长谱第二部分中表达的目的RM水平等于或高 于在生长谱第一部分表达的目的RNA水平。在其他的实施方案中，本 发明提供了分离具有二相生长谱的细胞的方法，其中所述细胞在生长 谱第一部分中具有增加的增殖速率，并且其中所述细胞在生长谱第二 部分有着降低的增殖速率，并且其中细胞在生长谱第二部分中表达的 目的RNA水平低于在生长谱第一部分表达的目的RNA水平。在一个实 施方案中，该方法包括以下步骤将细胞群体与荧光发生探针接触， 该荧光发生探针在与所述目的RNA杂交时发出荧光；将所述群体与用 于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触，其中所述试剂发出与焚光发生 探针不同波长的荧光；以及分离在生长镨第一部分中显示出改变的荧 光试剂的荧光，在生长语第二部分中显示出未改变或降低的荧光试剂 的荧光强度变化，而且在生长谱第二部分中显示出增加的荧光发生探 针的荧光的细胞。在另一个实施方案中，该方法包括以下步骤将细 胞群体与荧光发生探针接触，该荧光发生探针在与所述的目的RNA杂 交时发出荧光；将所述群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触， 其中所述试剂发出与荧光发生探针不同波长的荧光；以及分离在生长 谦第一部分中显示出改变的荧光试剂的荧光，在生长i普第二部分中显示出增加的荧光试剂的荧光，而且在生长谱第二部分中显示出增加的 荧光发生探针的荧光的细胞。在另一个实施方案中，该方法包括以下 步骤将细胞群体与荧光发生探针接触，该荧光发生探针在与所述的目的RNA杂交时发出荧光；将群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试 剂接触，其中所述试剂发出与荧光发生探针不同波长的荧光；以及分 离在生长傳第一部分中显示出改变的荧光试剂的荧光，在生长谱第二 部分中显示出未改变或降低的荧光试剂的荧光，而且在生长谱第二部 分中显示出降低的荧光发生探针的荧光的细胞。在一个实施方案中， 检测荧光发生探针的荧光可以与检测用于监测在生长谱第二部分中细 胞增殖速率的试剂的荧光同时测定。备选地，检测荧光发生探针的荧 光与检查用于监测细胞增殖速率的试剂的荧光在分开的步骤中测定。 在另一个实施方案中，用于监测细胞增殖速率的荧光试剂发出与荧光 发生探针相同波长的焚光。根据本发明的方法分离的细胞可以进一步 经培养从而产生细胞培养物或细胞系。在特定实施方案中，以上方法 进一步包括测量细胞培养物密度的步骤。
本文描述的任一方法可以进一步包括将本发明的细胞与监 测凋亡或预凋亡标记物的试剂接触。在一个实施方案中，本文描述的 方法进一步包括将具有增加的增殖速率或增加的RNA或蛋白生产的细 胞与监测凋亡或预凋亡标记物的试剂接触的步骤。例如，可以将显示 出增加的荧光信号探针的荧光及改变的监测细胞增殖速率试剂的荧光 的细胞与监测凋亡或预凋亡标记物的试剂接触。显示出凋亡或预凋亡 标记物的细胞会不被选择。[OOll]可以使用本发明的方法检测的RNA包括内源或异质的RNA， 其中包括但不限于编码蛋白的信使RNA、反义RNA分子、结构RM (structure RNA)、核糖体RNA、 h禮A和snRNA。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法用于检测mRNA， 此mRNA编码免疫球蛋白重链，免疫球蛋白轻链，单链Fv，抗体的片 断如Fab、 Fab，或(Fab， ) 2，或免疫球蛋白的抗原结合片段。
在本发明的特定实施方案中，荧光的检测是通过荧光显微 镜、焚光细胞计数、流式细胞分选技术或荧光平板读取器来测定。检 测荧光可以在单个样本中检测，或者一次性在多个样本中检测，如在 高通量的测定中检测。
本发明的特定实施方案中，用于监测细胞增殖速率的荧光 试剂选自羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯、SNARF-1羧酸、醋酸 琥询酯、PKH26、 HoechstCPAl、 CyquantGR和NF染料、MTT以及CTT。
在特定实施方案中，本发明的方法用于分离和/或培养哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、；微生物细胞、藻类细胞或真菌细胞。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、HEK293细胞、Per. C6细胞。在特定实施 方案中，CHO细胞是CH0K1细胞、CH0K1SV细胞、CHO-S细胞或DG44 细胞。在另一个实施方案中，所述细菌细胞是BL21细胞。在另一个实 施方案中，所述真菌细胞选自金孢霉属(C力7xyo^oWM7)细胞、曲 霉属(A/7er^77/M)细胞、木霉属(7>/cAof/eivz/a)细胞、网柄菌属 (Z /c0^^e7/wz7)细胞、念珠菌属(Cs/K/2't/a )细胞、酵母属 (5^cc力aro迈/ces)细胞、裂歹直酵母属(ScA/zosaccAaro/z^ces)细月包 和青霉属(户e/7/c/77/咖)细胞。在另一个实施方案中，所述昆虫细胞 是SF9细胞或SF21细胞。发明详述定义
术语"邻近的"用于探针的上下文中时，指一种接近的条 件从而允许相互作用彼此功能性地相互作用。例如，接近的条件允许 荧光基团被淬灭剂部分淬灭或部分地淬灭。允许目前所知荧光基团和 淬灭剂相互作用的距离为大约20-100A。
术语"生物质"指两个或多存活细胞组成的群体。存活细 胞可以在任何体积的培养基中。
术语"凸出区域"指没有配对的一个核苷酸或修饰的核苷 酸的单链区域。凸出的核苷酸的邻侧是相互互补的区域。
术语"哑铃结构"指具有两个通过每个茎干区域伸出的臂 的末端相连的茎环结构的核酸或修饰的核酸的链。所述连接可能是修 饰或无修饰的非互补区域或者磷酸二酯键。
术语"相互作用对，，指两个化学基团，它们在相互邻近时功能性地相作用，而在不相互邻近时产生与无信号或由相互作用化学 基团产生的背景信号相比可检测的信号，或者产生与相互作用化学基团产生的信号不同的信号。相互作用对包括但不限于荧光基团和淬 灭剂，化学发光标记和淬灭剂或加合物(adduct ),染料二聚体和FRET 供体及受体，或者它们的组合。信号探针可以包含一个以上相互作用 对。例如，波长移动信号探针具有都与淬灭剂相互作用的第一荧光基 团和第二荧光基团，且这两个荧光基团是FRET供体和受体对。
术语"环区域，，指一个以上的未配对核苷酸或修饰的核苷 酸的单链区域。所述环还可以处于具有彼此相互互补或部分互补的一 个或多个核苷酸的两个区域之间。例如，环的上游区域与环下游区域 互补或部分互补。
术语"信号探针"指如下探针，其包含与靶核酸序列互补 的序列和至少相互互补区域，并进一步包含至少一个相互作用对。当 信号探针未结合其靶序列时，相互作用对的各部分相互邻近，以至于 不能产生或产生很少或不同的信号。当信号探针结合其靶序列时，相 互作用对的各部分不再相互邻近，并产生了可检测的信号或不同于探 针未结合状态所产生信号的信号。在一个实施方案中，信号探针是荧 光发生探针，它包含荧光基团和淬灭剂部分，当与靶序列杂交时产生 荧光的改变。相互作用对的各部分可以连接到信号探针的末端或可以 连接到核酸序列之内。可以被内部地并入到信号探针序列上的部分的 实例包括但不局限于淬灭剂dabcyl dT、 BHQ2 dT和BHQ1 dT，以及 荧光基团荧光素dT、 Alexa dT和Tamra dT。
术语"错配区域"指核酸分子或修饰的核酸分子中的双链 区域，其中的碱基或修饰的碱基没有形成Watson-Crick碱基配对。错 配区域的邻侧是两个碱基配对的区域。双链区域可以是非氢键合的或 氩键的以形成Hoogst 6sn械基对等,或两种情况都有。
术语"相互互补区域"指核酸分子或修饰的核酸分子中的 Watson—Crick;^l酉己对区^。
术语"非互补区域"指核酸分子或修饰的核酸分子中的非13Watson-Crick碱基配对区域。例如，非互补区域可以设计成具有凸出 的核普酸、单链环、5，或3，末端的突出核苷酸或错配区域。
术语"茎千区域"指核酸分子或修饰的核酸分子中至少含 有两个非Watson-Crick碱基配对的区域。例如，茎干区域可以设计成 具有通过非互补区域连接的一个以上相互互补区域，或形成连续的相 互互^卜区域。
术语"茎环结构"指核酸分子或修饰的核酸分子具有单链 环序列，其两侧是一对5，和3，寡核苷酸或修饰的寡核苷酸臂。5' 和3，臂形成茎千区域。
术语"三臂交叉结构"指核苷酸或修饰的核苷酸的链，其 具有通过茎千区域的臂连接的茎千区域、第一茎环区域和第二茎环区 域的构象。第一茎环区域在第二茎环区域的5，端。这三个区域可以 通过非互补区域、磷酸二酯键或修饰的磷酸二酯键或它们的组合相连。
除非另外定义，否则所有本文所用的所有技术和科学术语 的意思都与本领域技术人员普通理解的意思相同。如果有沖突，以本 说明书包括定义为准。另外，除非另外有上下文需要，否则单数的术 语包括了复数形式，复数的术语包括了单数形式。 一般的，本文描述 的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、发 育生物学、细胞生物学有关的命名法和技术是本领域熟知并普遍使用 的。
贯穿于本说明书和实施方案中的，词语"包含"或其变体 如"包括，，或"含有"可以理解为表示包括一个所述的组成体或一 组组成体但不排除任何其他的组成体或一组组成体。
本文提到的所有发表物和其他参考文献都通过引用将其 全部并入。尽管本文引用了大量文档，但此引用不构成承认任一文档 形成本领域普通一般知识的一部分。2、 发明方法
影响细胞群体中总RNA和蛋白质生产的两个培养参数包括(i)细胞特定的生产速率，和(n)用于RNA和/或蛋白质生产 的细胞群体的生长特征。本发明的方法和组合物最优化了这些参数中 一个或两个。第三个影响细胞群体中蛋白质生产的变量是细胞增殖速 率。例如，具有增加的增殖速率的细胞比具有降低的增殖速率的细胞 可能在更短的时间内达到生产蛋白质的细胞的一定生物量。因此，在 一个给定时间段内生产的蛋白质量就最大化了。在一些情况下，细胞 可以降低细胞增殖以将能量输出转移到蛋白质生产上。因此，在另一 个实施方案中，本发明提供了分离具有降低的增殖速率的细胞的方法， 其中所述细胞也表达增加水平的编码目的蛋白质的RNA。
本发明的方法基于荧光发生信号探针和可以用于增殖标记 物的试剂在存活的细胞中产生可检测的信号的能力，而无需固定或裂 解细胞。在活细胞中，荧光发生信号探针在与靶标RM序列杂交时产 生可检测的信号，且当RNA是蛋白质编码RNA时与细胞产生的相应蛋 白质的量相关。本发明中所使用的信号探针和增殖标记物产生的信号 检测出来应当比所测试细胞群体中产生的平均水平(例如背景焚光)更高或者不同。因此，平均的细胞一点都不产生荧光是不必要。在一 个实施方案中，本发明提供了分离细胞或产生细胞系的方法，所述细 胞或细胞系具有增加的目的RNA或蛋白质的生产。例如，本发明的方 法可用于分离细胞或产生细胞系，所述细胞或细胞系具有相对于所测 试细胞群体中目的RM或蛋白质的生产增加的目的RM或蛋白质的生 产。正如本文所使用的，对照细胞与本发明的分离的细胞相同，但是 它没有用本文描述的发明中任何方法就增加或降低的RNA或蛋白质生 产而选择，或没有就改变的细胞增殖速率而选择。
如本文所描述，使用可用作增殖标记物的信号探针和试剂 使得能够鉴定就增加的目的RNA(如编码蛋白质的RNA )的生产最佳化 的细胞。不像需要固定或裂解细胞来分析细胞内成分的试剂，信号探 针和增殖标记物的荧光能用于分析活细胞中胞内RNA和蛋白质水平。 这个特征使得能够分离和繁殖具有增加的目的RNA生产的细胞。在一个实施方案中，在用包含编码目的RNA的基因的DNA构建体将编码目 的蛋白质的遗传序列引入细胞(如，转染)后，将识别目的RNA的荧 光发生信号探针引入细胞。这个步骤可以在用选择标记物进行任选的 筛选后进行，如，若被转染的DNA构建体也编码药物抗性则可以进行 药物选择。转录了所述基因的细胞发荧光。
在另一个实施方案中，细胞与增殖标记物如CFSE接触。在 用CFSE染色之后，可以随时间监测细胞分裂，或者可以让细胞在定量 增殖标记物的信号之前的一段时间内进行分裂。可以使细胞在定量增 殖标记物的信号之前增殖短于1小时到1天，1到5天，3到10天，5 到15天，l到2周，1.5到4周或者至多IO周。在一个实施方案中， 分离具有增加的细胞增殖速率的细胞。分离这些细胞可以基于，例如， 增殖标记物的降低的荧光信号。具有不同增殖速率的细胞依据增殖标 记物的不同信号水平被分离。在另一个实施方案中，分离具有降低的 细胞增殖速率的细胞，其中所述细胞表达增加水平的目的RNA或蛋白 质。细胞可以同时或在不同的时间暴露于增殖标记物和信号探针。如 果是在不同的时间，细胞可以在暴露于信号探针接触之前或者之后暴 露于增殖标记物。细胞可以在不同时间暴露于增殖标记物和信号探针 接触但同时进行分析，例如细胞可以在一个时间暴露于增殖标记物而 在相应于几次细胞分裂所需要的时间长度(基于平均细胞加倍时间) 之后的第二个时间暴露于信号探针。
可以用检测荧光的任何已知方法分离在CFSE染色或信号 探针杂交时产生多种水平的荧光的细胞。例如，可以用流式细胞分选 技术分离在CFSE染色或信号探针杂交时产生荧光的细胞。分离的细胞 可以随后用于产生表达高水平目的RNA以及还具有增加或降低的增殖 速率的细胞系。
本发明的方法和组合物还可以用于分离具有一个以上目的 RNA生产增加的细胞，甚至不需要在选择性药物和试剂存在下维持细 胞。细胞可以被转染或者用另外的方式引入两种或多种DNA或RNA构 建体。所述两种或多种DNA或RNA构建体可以同时或顺序地转染入细胞。第一目的RNA的信号探针可以产生与其他目的RNA的信号探针相 同或不同的信号。例如，它们可以具有相同或不同的荧光基团。可以 通过同时或顺序重复这些步骤来提供表达两种以上RNA的细胞或细胞 系。DNA或RNA构建体任选地包含一种或多种药物或选择性试剂标记 物。在转染及任选的药物选择后，将针对每种目的RM的信号探针引 入细胞。在一个实施方案中，细胞随后由流式细胞分选技术分选，于 是分离出表达所述两种或多种目的RNA或蛋白质的任意组合的细胞。
在特定实施方案中，使用多轮次本文描述的方法从而得到 具有两种或多种目的RNA或蛋白质的表达增加的细胞。例如，用一种 或多种编码目的RNA或蛋白质的RNA或DNA构建体转染细胞且根据本 文描述的方法对其分离。接着用一种或多种编码目的RNA或蛋白质的 RNA或DNA构建体对分离的细胞进行进一步轮次的转染。这个方法用 于例如产生具有增加的蛋白质复合体、相同或相关生物学途径中的 RNA或蛋白质、在彼此的上游或下游作用的RNA或蛋白质、对彼此具 有调控、激活或抑制功能的RNA或蛋白质、在功能或活性上相互依赖 的RNA或蛋白质、或共享同源性(例如序列、结构或功能同源性) 的RNA或蛋白质的表达增加的细胞。例如，这个方法可以用于产生具 有免疫球蛋白蛋白质(如IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM)的重链和轻链 或其抗原结合片段的表达增加的细胞系。免疫球蛋白蛋白质可以是完 全人的、人化的或嵌合的免疫球蛋白蛋白质。f为、庠^才炎f时勿應燴崖遽毕#勿^敏#才法
在一个实施方案中，本发明提供了从具有比群体中细胞平 均生长增加的细胞增殖速率的细胞群体中分离细胞或产生细胞系的方 法。在另一个实施方案中，本发明提供了从具有比群体中细胞平均生 长降低的细胞增殖速率的细胞群体中分离细胞或产生细胞系的方法。 所述细胞任选地还表达增加水平的目的RNA或蛋白质。从起始群体中 分离的细胞的增殖速率与起始群体中细胞的平均增殖速率相比增加或 降低了至少1.3倍。在其他实施方案中，来源于从起始群体中分离的 细胞的细胞的增殖速率与起始群体中细胞的平均增殖速率相比增加或17降低了至少1.5倍、至少2. 0倍、至少2.5倍、至少3. 0倍、至少5 倍或至少10倍。在一个实施方案中，可以通过最优化培养基配方(如 优化营养物质的浓度，如糖类、盐类、氨基酸、维生素等)而改变(如 增加或降低)细胞增殖速率。在另一个实施方案中，通过遗传学或代 谢工程而改变细胞增殖速率。例如，可通过表达、过表达或改变影响 细胞增殖速率的基因或蛋白质的表达而改变增殖速率。例如见Mazur 等人，Biotechnol Prog. 1998; 14: 705-713，其全部内容并入本文 作为参考。在一个实施方案中，通过表达、过表达或改变负责细胞周 期、细胞分裂或DNA复制的基因或蛋白质的表达而改变细胞增殖速率， 所述基因或蛋白质例如编码细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶、 细胞周期依赖性磷酸酶、细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂、细胞周 期转录因子、DNA聚合酶、组蛋白和参与DNA复制起始的蛋白质的基 因。被遗传学或代谢方式工程改造的特定基因或蛋白质依赖于本发明 使用的生物体且能由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，通过 表达一种或多种MYC基因如c-MYC而改变细胞增殖速率。例如见 Ifandi等人，Biotechnol Prog. 2005; 21: 671-677，其全部内容并 入本文作为参考。
在另一个实施方案中，本发明提供了与来自起始细胞培养 物群体的细胞的细胞培养物的平均细胞密度相比，增加细胞培养物中 的细胞密度的方法。所述细胞任选地还表达增加水平的目的RNA或蛋 白质。细胞培养物的细胞密度与来自起始细胞培养物群体的细胞的细 胞培养物的平均细胞密度相比增加至少1.2倍。在其他实施方案中，比增加了至少1.5倍、至少2. 0倍、至少2. 5倍、至少3. 0倍、至少 5倍或至少10倍。在一个实施方案中，通过最优化培养基配方(如最 优化营养物质的浓度，如糖类、盐类、氨基酸、维生素等)而增加细 胞培养物密度。在另一个实施方案中，通过遗传学或代谢工程的手段 而增加细胞培养物密度。例如，通过表达Bcl-2、 Bcl-t或p21,在 细胞中抑制凋亡。抑制凋亡可以增加细胞培养物的浓度也增加蛋白质生产。例如见Itoh等人,Biotechnology and Bioengineering 2004; 48: 118-122; Chiang等人，Biotechnology and Bioengineering 2005; 91: 779-792;和Jung等人，Biotechnology and Bioengineering 2002; 79: 180-187;其全部内容并入本文作为参考。在特定实施方案中，一 种或多种MYC基因与Bcl-2共表达以增加细胞增殖速率和细胞密度。 例如见Ifandi等人，Biotechnol. Prog. 2005; 21: 671-677，和 Bissonnette等人，Nature. 1992; 359: 552-554，其全部内容并入 本文作为参考。
细胞增殖速率根据本发明的方法中所使用的细胞类型而变 化。例如，细菌细胞在30分钟或更少的时间内可以分裂从而产生两个 存活的子细胞，而哺乳动物细胞每10-24小时才分裂一次，甚至每次 细胞分裂花费超过一天的时间。例如，真核细胞每12-30小时可以分 裂一次。可以由技术工作人员通过在细胞生长周期的增殖期监测群体 中存活细胞的数量来确定细胞的加倍时间。
细胞增殖的增加还依赖于营养条件。在特定实施方案中， 通过最优化培养基配方(例如最优化营养成分的浓度，如糖类、盐 类、氨基酸、维生素等)而增加细胞的增殖速率。例如，见Chu和 Robi画n， Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12 ( 2 ) : 180-7; Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19(1): 52-7; Dempsey 等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 ( 1 ) : 175-8;和Sauer 等人，Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5; 67 ( 5 ) : 585-97，其全部 内容并入本文作为参考。
为提高重组蛋白产量也可以最优化环境条件。例如，将哺 乳动物细胞置于亚生理温度之下可以导致重组蛋白产量的增加。例如， 见Al-Fageeh等人,Biotechnology and Bioengineering 2006; 93: 829-835和Baik等人,Biotechnology and Bioengineering 2006; 93: 361-371,其全部内容并入本文作为参考。
细胞可以用标准方法和仪器来定量。例如，将细胞的一部 分涂布于固体生长培养基以测量群体中菌落形成细胞单位的数量。备选地，可以使用如分光光度计和血球计数器这些仪器。也可以使用用于测量细胞密度的自动化的技术和仪器如Guava ViaCount测定和 Beckman Coulter Vi-CELL自动细胞存活分析仪。
本发明中任一用于分离细胞的方法中，可以培养细胞从而 生产细胞培养物或产生细胞系。
本文描述的任一用于分离具有增加的细胞增殖速率的细胞 或产生具有增加的细胞增殖速率的细胞系的方法还可以包括检测细胞 凋亡或预凋亡标记物的步骤。凋亡和预凋亡标记物包括，例如，DNA 切割、核破碎、染色体浓缩、坏死、细胞膜起泡、聚(ADP-核糖)聚 合酶切割、胱天蛋白酶3激活或其它凋亡相关基因的表达。凋亡或预 凋亡标记物还包括对碘化丙咬或7-AAD的通透性。在一个实施方案中， 本文描述的方法进一步包括以下步骤将具有增加的增殖速率或增加 的RNA或蛋白质生产的细胞与用于监测凋亡或预凋亡标记物的试剂接 触。例如，显示出增加的荧光发生信号探针的荧光和改变的用于监测 细胞增殖速率试剂的荧光的细胞可以与用于监测凋亡或预凋亡标记物 的试剂接触。用于监测凋亡或预凋亡标记物的试剂在本领域中熟知。 用于监测凋亡或预凋亡标记物的焚光试剂的实例包括荧光标记的膜联 蛋白-V和硤化丙淀。^Z^I，加麥產#勿應培#參^才法
在一个实施方案中，本发明提供了用于生产具有更大倾向 于增加细胞密度的细胞培养物的方法。例如，提高有能力生产蛋白质 的存活细胞数量或生物量(例如增加细胞培养物密度)使得提高生 物量生产的蛋白质总量。细胞培养物密度可以提高1到10倍(例如 1.5倍、2倍、3倍、5倍或IO倍)，提高10到100倍(例如15倍、 25倍、50倍或100倍)，提高100到1000倍(例如150倍、250倍、 500倍或1000倍)，或大于1000倍。例如，最终细胞培养物密度可 以在大约1 x 1(T个细胞/ml培养基到1 x 105个细胞/1111培养基范围内， 在lxl()5个细胞/ml培养基到lxl()6个细胞/ml培养基范围内，在1 xl()6个细胞/ml培养基到lxlO'个细胞/ml培养基范围内，在lx107个细胞/ml培养基到lxl()8个细胞/ml培养基范围内，或者甚至大于1 x 108个细胞/ml培养基。细胞培养物密度的增加依赖于营养和环境条 件，还根据本发明中所用的细胞类型而变化。可以培养根据一种或多 种增殖标记物的标记的不同水平而分离的细胞，并且可以测试产生的 群体以鉴定具有更高倾向达到更高细胞密度的细胞。
在特定实施方案中，通过最优化培养基配方(例如最优 化营养成分浓度如糖类、盐类、氨基酸、维生素等)而增加蛋白质生 产细胞的生物量。例如，见Chu和Robi謂n， Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12(2): 180-7; Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 U) : 52-7; Dempsey等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb; 19 (1) : 175-8;和Sauer等人，Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5; 67 ( 5 ): 585-97，其全部内容并入本文作为参考。在另一个实施方案 中，通过阻止蛋白质生产细胞的群体中细胞死亡或凋亡而增加蛋白质 生产细胞的生物量。在其他实施方案中，本发明提供了用于生产具有 增加的细胞密度的细胞培养物的方法，其中细胞培养物中的细胞表达 增加水平的目的RNA。例如，提供了用于生产高浓度的存活且具生产 力的细胞的方法，这些细胞还能迅速增殖。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过遗传学或代谢工 程改变细胞群体的细胞培养物密度的方法。例如，可以通过抑制凋亡 细胞的死亡而增加细胞密度。在一个实施方案中，表达了抗凋亡存活 蛋白质，如bcl-2或bc1-xL。在其他实施方案中，使用了抑制胱天蛋 白酶或表达分子伴侣蛋白质HSP70来增加细胞密度。在其他实施方案 中使用了代谢工程的方法。使用代谢工程来增加细胞密度是通过抑制 新陈代谢有毒副产物如乳酸和氨的积累或通过工程性改进新陈代谢途 径来实现的。例如，丙酮酸羧化酶的表达可以增加葡萄糖向三羧酸循 环中的流动。
本文描述的任一用于生产具有增加的细胞密度的细胞培养 物的方法还可以包括监测细胞的凋亡性细胞死亡的步骤。在一个实施 方案中，本文描述的方法进一步包括了将细胞培养物中的细胞与用于监测凋亡或预凋亡标记物的试剂接触这一步骤。用于监测凋亡或预凋 亡标记物的试剂是本领域熟知的。用于监测凋亡的荧光试剂包括荧光标记的膜联蛋白-v和碘化丙啶。在特定实施方案中，凋亡细胞或倾向凋亡的细胞不被选择。为、岸^才二亩i长-w叙敏的才法
本发明提供了用于分离具有二相生长谱的细胞的方法。二 相生长谱的特征是在生长谱第 一部分迅速增殖。这种迅速增殖使得在 一段短的时间段内积累蛋白产生细胞的群体。这个迅速生长阶段随后 是由迅速向慢速增殖甚至不增殖的转变。这个增殖降低或较低的阶段 以蛋白质生产的增加为特征。因此，根据本发明的方法分离的细胞在 其生长镨第一部分具有增加的增殖速率。生长谱的这个部分的特征还 在于增加或降低的蛋白质生产速率。在生长谱第二部分，细胞或多个 细胞具有降低或较低的增殖速率，其中细胞表达与生长谱第一部分的 表达水平相比增加的目的RNA水平。在特定实施方案中，还可以监测 细胞的细胞死亡和凋亡来选择具有最小凋亡或预凋亡标记物存在的细 胞。检测荧光的方法记物一并使用，以鉴别和/或分开在一种或多种波长下显示出 一定水平 或多个水平荧光的细胞。例如，信号探针和增殖标记物的荧光可以用 荧光显微镜、荧光细胞计数、流式细胞分选技术或荧光酶标仪来检测 和/或定量。流式细胞分选技术目前允许每秒分选至多70, OOG个细胞。 可以在不到2分钟内分选5， 000， OOO个细胞。
本文描述的方法还可以与利用荧光报告子检测胞内事件、 状态或组成(如，凋亡、坏死，Ca"离子流动、pH流动、细胞粘附、 细胞分裂和生长或DNA含量)的测定法同时使用。检测胞内事件的荧 光测定法的实例包括，例如荧光染色(如核酸、蛋白质和/或膜的染 色)和用来检测蛋白间相互作用或蛋白与核酸相互作用的测定法。可 以被荧光标记而用于这些测定法的试剂包括但不限于蛋白质(用荧光分子或自发荧光蛋白质标记)；荧光代谢指示剂(如C12刃天青)； 荧光底物或副产物；荧光标记的凝集素；荧光化学制品；笼形荧光化 合物；荧光核酸染料；及荧光多聚体、脂类、氨基酸残基和核苷酸/ 侧(side)类4以物。
本发明的方法可以用适于与本文描述的信号探针和增殖标 记物一起使用的任何细胞。在一个实施方案中，细胞选自哺乳动物细 胞、细菌细胞、植物细胞、微生物细胞、藻类细胞和真菌细胞。在一 些实施方案中，这些细胞是哺乳动物细胞，如人、小鼠、大鼠、山羊、 马、兔、仓鼠或牛细胞。例如，细胞可以来自任何已建立的细胞系， 包括但不限于HeLa、 NSO、 SP2/0、 HEK293T、 Vero、 Caco、 Caco-2、 MDCK、 COS-1、 C0S-7、 K562、 Jurkat、 CH0-K1、 DG44、 C駆1SV、 CHO-S、 Huvec、 CV-1、 HuH-7、 NIH3T3、 HEK293、 293、 A549、 HepG2、 IMR-90、 MCF-7、 U-2 0S、 Per.C6、 SF9、 SF21或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。 在特定实施方案中，细胞为真菌细胞，例如选自如下的细胞金孢霉 属细胞、曲霉属细胞、木霉属细胞、网柄菌属细胞、念珠菌属细胞、 酵母属细胞、裂殖酵母属细胞和青霉属细胞。在特定的其他实施方案 中，细胞为细菌细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或BL21细胞。重遂細种建伴
在一个实施方案中，本发明的方法和组合物用于分离具有 增加的目的RNA (如编码目的蛋白的RNA)生产的细胞。目的RNA可以 从DNA构建体上的基因表达。例如，将被转录为目的RNA的DNA构建 体引入细胞。可以将DNA构建体整合到细胞基因组的不同位置或者可 以留在细胞胞质中。也可以整合到一个或多个特定的基因座。然后， 将转染的细胞与信号探针和/或增殖标记物接触。可以将信号探针和增 殖标记物同时、在一个之后立即加另一个、在完全不同的时间，且以 任何顺序暴露于细胞。在将细胞暴露于信号探针和/或增殖标记物之 后，产生可检测的信号并分离目的细胞。可以用本领域的任何方法分 离和培养细胞，例如，单个或批量分离并涂布细胞。可以通过培养分离的细胞而产生细胞系。
本发明任一方法可以使用选择标记物来进行。尽管药物选 择(或使用任何其他合适的选择标记物的选择)不是必需的步骤，但 只要转染的构建体设计成赋予药物抗性，它可以用来就稳定转染了编 码目的蛋白质的DNA构建体的细胞富集细胞群体。如果使用信号探针 的选择在转染后太早进行， 一些阳性细胞可以只是瞬时而非稳定地转 染。然而，这种情况可以由以下方法减至最小进行足够多的细胞传 代使得从不稳定转染的细胞中稀释或丟失转染的质粒；或根据本文描 述的方法进行多轮次选择。^辦'^《^ 和蛋^ j
转染入本发明的细胞的DNA构建体可以包含转录成编码目 的蛋白质的RNA的序列，该序列有下列不同功能中的一种或多种编 码蛋白质、融合蛋白质、融合到蛋白质上的肽、输出信号、输入信号、 胞内定位信号或其它信号的信使RNA，这些可以融合到蛋白质或肽上。 可以根据本文所描述的方法生产任何蛋白质。可以根据本发明的方法生产的蛋白质的实例包括但不限于肽激素(如胰岛素)、糖蛋白激 素(如促红细胞生成素)、抗生素、细胞因子、酶、疫苗(如HIV疫 苗、HPV疫苗、HBV疫苗)、抗癌治疗剂(如Mucl)和治疗性抗体。 在一个具体的实施方案中，RNA编码免疫球蛋白蛋白质或其抗原结合 片断，如免疫球蛋白重链，免疫球蛋白轻链，单链Fv，抗体片断如Fab、 Fab'或(Fab' ) 2，或免疫球蛋白的抗原结合片段。在一个特别的实 施方案中，RNA编码促红细胞生成素。在另一个特别的实施方案中， RNA编码一种或多种免疫球蛋白蛋白质或其片断，其结合到表皮生 长因子受体(EGFR) 、 HER1或c-ErbB - 1如Erbitux ( cetuximab)。 由本发明的方法及组合物生产的RNA还可以具有一种或多种以下功 能反义RNA、 siRNA、结构RNA、细胞RNA，其中包括但不限于如核 糖体RNA、 tRNA、 hnRNA、 snRNA;随才几RNA、对应于cDNA或EST的RNA; 来自多样性物种的RNA、对应于寡核苷酸的RNA、对应于整个细胞、组 织或生物体cDNA制备物的RNA;对其他核酸、蛋白质、其他细胞成分或药物分子具有一定结合活性的RNA;可以被并入多种大分子复合体 的RNA;影响一定细胞功能的RNA;或者不具有前述功能或活性但仍然 可以被细胞表达的RNA;对应于病毒或外源RNA、连接子RNA或连接一 种或多种RNA的序列的RNA;或，作为标签或以上任何一种或多种未 修饰的诱变的、随机的、换位的序列的组合或重组的RNA。
本发明的DNA构建体可以包含编码目的RNA、可操作地连 接至结构性或条件性启动子的DNA，所述启动子包括但不限于可诱导 的、可抑制的、组织特异的、热休克的、发育的、细胞系特异的、或 暂时的启动子或者以上任何一种或多种未修饰的或诱变的、随机的、 换位的序列的组合或重组。3、信号探针
识别和报告特定核酸序列存在的核酸探针已经用子检测特 定的核酸。例如见美国专利5， 925， 517，其全部内容并入本文作为 参考。 一种类型的探针被设计成具有发卡或茎环形状的结构，具有与 靶序列互补的核苷酸的中央节段，和包含短的相互互补序列的末端。 例如见Tyagi和Kramer, Nature Biotechnology, 14, 303-308( 1996 )， 其全部内容并入本文作为参考。该探针的 一个末端共价结合到荧光基 团上，另一端结合到淬灭部分。在其原始状态，具有杂交的末端，荧 光基团和淬灭剂如此接近以至于相对极少或几乎没有荧光产生。当与 其靶核酸杂交时，所述探针发生构象改变致使荧光基团的荧光产生发 生可检测的变化。这种探针已经用于观察活细胞中的信使RNA (Matsuo， 1998， Biochim.Biophys.Actal379: 178—184 )。类似的探4十 已经用于根据RNA序列的表达来分离活细胞。例如，见美国专利号6， 692， 965，其全部内容并入本文作为参考。
本发明中使用的信号探针被设计成或者与目的RNA的部分 互补或者与其5，或3，非翻译区互补。编码目的RNA的基因可以用标 签序列加标签且探针信号可以被设计成使其识别所述标签序列。标签 序列可以与基因信息的蛋白质编码部分在同框或者与其不同框，这根据是否希望给所生产的蛋白加标签。标签序列可以是与信号探针的序 列全部或部分互补的任何核苷酸序列。蛋白质标签的实例包括但不限
于c-myc、血凝素及谷胱甘肽-S-转移酶。信号探针包含一个或多个的相互作用对，且可以有不同的 相互作用对。在一个实施方案中，信号探针是荧光发生探针。例如， 见美国专利号6， 692， 965和国际公布WO 2005/079462，其全部内容 并入本文作为参考。在一个实施方案中，荧光发生探针在其未杂交状 态下不发射荧光或发射出背景水平的荧光，但是结合其靶标时就发出 背景水平之上的荧光或发出高于背景水平的荧光。可以使用多重荧光 基团来增加信号或提供不同颜色范围的荧光。可以使用多重淬灭剂在 缺少靶序列时降低或消除信号。淬灭剂的实例包括但不限于DABCYL、 EDAC、铯、溴化二吡啶对二曱苯、铊和金纳米颗粒。荧光基团的实例 包括但不限于磺酰罗丹明101、吖啶、5- (2，-氨乙基)氨基萘-l-磺 酸(EDANS)，德克萨斯红、伊红和Bodipy和Alexa Fluor350、 Alexa Fl雨405、 AlexaFl雨430、 AlexaFl雨488、 Alexa Fl雨500、 Alexa Fluor514、 AlexaFl雨532、 AlexaFl窗546、 Alexa Fluor555、 Alexa Fluor568、 Alexa Fl雨594、 Alexa Fluor610、 Alexa Fluor633、 Alexa Fluor635、 Alexa Fluor647、 Alexa Fluor660、 Alexa Fluor680、 Alexa Fluor700、 Alexa Fluor705、别藻蓝蛋白、氨基香豆素、Bodipy-FL、 Cy2、 Cy3、 Cy3. 5、 Cy5、 Cy5. 5、羧基焚光素(FAM) 、 Cascade Blue、 APC-Cy5、 APC-Cy5. 5、 APC-Cy7、香豆素、ECD( Red613 )、荧光黄(FITC )、 六氯荧光素(HEX)、羟基香豆素、Lissamine罗丹明B、萤光黄、甲 氧基香豆素、俄勒冈绿488、俄勒冈绿514、 Pacific Blue、 PE-Cy7 缀合物、PerC、 PerCP-Cy5.5、 R-藻红蛋白(PE)、罗丹明、罗丹明绿、 罗丹明红-X、四氯荧光素(TET) 、 TRITC、四曱基罗丹明、德克萨斯 红-X、 TRITC、 XRITC和量子点。例如，见Tyagi等人Nature Biotechnology 16:49-53， (1998)及 Dubertret 等人，Nature Biotechnology, 19: 365-370 ( 2001 ),其全部内容并入本文作为参考。本发明还提供了波长移动的信号探针。在一个实施方案中， 探针的一个末端具有至少一个收获荧光基团及一个发射荧光基团，该 探针的邻近末端具有至少一个淬灭剂部分。例如，见Tyagi等人， Nature Biotechnology, 18， 1191-1196 ( 2000 )，其全部内容并入 本文作为参考。在一个实施方案中，收获荧光基团及发射荧光基团在 相同的末端，其中发射荧光基团在远端而淬灭剂部分在与收获荧光基 团相对的一端。发射荧光基团可以通过几个核苷酸的间隔子臂与收获 荧光基团隔开。收获荧光基团在单色光源的波长范围内强烈吸收。在 没有靶标时，探针发出在发射荧光基团的发射范围内的荧光。发射光 谱的移动是由于来自收获荧光基团的吸收的能量通过荧光能量共转移 而转移到发射荧光基团上。这些类型的信号探针可以提供比含有不能 有效从单色光源吸收能量的荧光基团的信号探针更强的信号。在一个 实施方案中，收获荧光基团是荧光黄，且发射荧光基团是6-羧基罗丹 明6G、四甲基罗丹明或德克萨斯红。在另一个实施方案中，探针的一端具有至少一个荧光基团 Fl，且另一个相邻末端具有至少另一个荧光基团F2。选择这两个荧光 基团使得当它们在很接近时发生荧光共振能量转移(FRET)。当探针 未结合其靶序列时，在Fl的吸收波段的激发时，Fl的荧光会被F2淬 灭，并且观察到F2的荧光。当探针结合其靶序列时，FRET减少或消 除，且F1的荧光升高而F2的荧光减少或消失。能监测这个荧光强度 的差异，并可以计算Fl和F2的荧光之间的比值。由于有时候会在荧 光基团-淬灭剂系统中观察到残存的荧光，因此这个系统在定量检测耙 序列时更有优势。见Zhang等人，Angrew. Chem. Int. Ed. 40， 2， pp. 402-405 (2001)，其全部内容并入本文作为参考。FRET供体-受体对的实例包括但不限于分别为香豆素组及6-羧基焚光素组。在一个实施方案中，信号探针包含发光标记及加合物对。 加合物与发光标记的相互作用减少了从标记产生的信号。见Becker 和Nelson,美国专利5, 731， 148，其全部内容并入本文作为参考。
在另一个实施方案中，信号探针包含至少一个染料二聚体。 当探针结合靶序列时，来自染料的信号与来自二聚体构象中染料的信 号不同。
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双链结构本发明提供了包含至少两条分开的核酸链的信号探针或其 他探针，所述核酸链设计成相互退火或形成至少一个相互互补区域。 一条链的至少一个末端与另一条链的一个末端是想邻近的。所述核酸 可以是DNA、 RNA或修饰的DNA或RNA。这两条链可以是形成自我二聚 体的相同的链。所述链也可以是序列上不相同的。
非互补区域。在一个实施方案中，所述两条分开的链设计成与彼此完 全互补。在一个实施方案中，所述两条链形成在每个末端形成4-9、 5-6、 2-10、 10-40、或40 - 400个连续碱基对的相互互补区域。所 述链可以含有5-7、 8-10、 11-15、 16-22、超过30、 3-10、 11-80、 811-200或超过200个核苷酸或修饰的核苷酸。所述两条链可以具有 相同或不同数目的核苷酸。例如， 一条链比另一条更长。在一个实施 方案中， 一条链的5，末端从另一条链偏移(offset)，或者其3，末 端从另一条链偏移，或者两个末端都偏移，其中抵消的部分可以多至 10个、多至20个或多至30个碱基或修饰的碱基。与靶序列杂交的区域可以在一条或两条链的互补区域、非 互补区域或其组合中。多于一 条靶核酸序列可以被相同的信号探针耙 向。所述一个或多个靶标可以在相同或不同的序列上，且它们可以与 被设计与靶标结合的探针的部分准确互补或至少足够的互补。在一个 实施方案中，所述两条链在各自末端形成相互互补区域且乾标补充序 列处于末端相互互补区域以外的区域。在一个实施方案中，具有至少两条分开的链的信号探针是 荧光发生探针。在一个实施方案中， 一条链在一端具有至少一个淬灭 剂部分，且在另一条链邻近的一端具有荧光基团。在一个实施方案中，
28一条链5，和3，末端中每个都具有彼此相同或不同的荧光基团，而且 另一条链5，和3，末端中每个都具有彼此相同或不同的淬灭剂部分。 在一个实施方案中， 一条链的5，末端具有荧光基团而3，末端具有淬 灭剂部分，且另一条链的3，末端具有相同或不同的淬灭剂部分，5， 末端具有相同或不同的荧光基团。 茎环结构在另一个实施方案中，信号探针是核酸或修饰的核酸的链， 其包含至少一个相互互补区域和至少一个非互补区域。在一个实施方 案中，探针形成茎环结构。茎干区域可以是相互互补的或包含相互互 补区域和非互补区域。例如，茎干区域可以有未形成碱基配对的凸出 的核苷酸。茎干区域也可以含有不发生碱基配对的、在5，和3，末端 的突出的核苷酸。当茎千区域完全互补时，茎干区域可以包括3-4、 5-6、 7-8、 9-10、 2-6、 7-10或11-30个碱基对。环区域可以包括10-16、 17-26、 27-36、 37-45、 3-10、 11-25或25-60个核苷酸。在一个实施方案中 茎环区域形成了 4-10、 4或5个连续碱基对。在一个实施方案中，茎环结构包含至少一个拥有两个化学
基团的相互作用对，且一个化学基团是在这条链的每个末端之上的。
在一个实施方案中，信号探针在这条链的每个末端有至少一个荧光基 团和一个淬灭剂部分。在一个实施方案中，茎干区域包含通过非互补区域相连的 两个相互互补区域，与相互作用对邻近的相互互补区域形成5 - 9个碱 基对，且与环区域邻近的相互互补区域形成4 - 5个碱基对。在一个实 施方案中，非互补区域是单链环区域、错配区域或者二者。在另一个 实施方案中，茎干区域包含通过两个非互补区域相连的三个相互互补 区域，与相互作用对邻近的第一相互互补区域形成4-5个碱基对，第 二相互互补区域形成2 - 3个碱基对，而与环区域邻近的第三相互互补 区域形成2-3个碱基对。在茎环结构中，与靼序列互补的区域可以在一个或多个茎干区域或环区域中，或在二者中。茎干中与靶标杂交的区域可以在相 互互补区域、非互补区域或二者中。在一个实施方案中，靶标补充序 列在单链环区域当中的。在一个实施方案中，与相互作用对邻近的茎 干区域之外的区域是靶标补充序列。多于 一种靶核酸序列可以被相同 的探针耙向。所述一种或多种靶标可以在相同或不同序列上，且它们 可以与被设计与靶标结合的探针的部分准确互补或至少足够的互补。茎干长度的增加可以提高信号探针在其关闭构象中的稳定 性，并且因此可以提高可检测信号的信噪比。可以在对细胞仍然安全 的略微提高的温度下将这些探针信号暴露于细胞，之后回到正常温度。 在更高的温度下，信号探针会打开并且如果其靶标存在时结合到其靶 标上。 一旦冷却，未结合到靼标上的信号探针会回复到关闭状态，茎 干稳定性的提高有助于这一点。类似的，其他力量可以用来达到相同 的结果，例如考虑用DMSO使碱基对松散。
^"f探封W^夢梦谬本发明还提供了化学修饰的信号探针或其他探针。可以修 饰一种或多种糖-磷酸二酯类型的骨架，2， 0H，碱基。磷酸二酯键的 替换物包括但不限于 一OP (OH) (0) 0—， —OP ((TM+) (0) 0—， 一0P (SH) (0) 0—， --OP (SM+) (0) O--， 一NHP (0) 20— —OC (0) 20--， 一OCH2C (0) 2冊一，一0CH2C (0) 20—， 一OP (CH3) (0) 0--， —OP (CH2C6H5) (0)0—， —P(S) (O)O--和--0C(0)2NH—。 M+是无机或有机 阳离子。该骨架还可以是肽核酸，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架 替换。肽核酸在 Hyrup 和 Nielsen, A/0orga"2.c 《#e￡/2'c2'72 s7 C力e/z7/s"/ 4:5-23， 1996， 及Hydig-Hielsen和Godskesen， WO 夕J/"MJ中有描述，其中每篇文献的全部内容都并入本文作为参考。糖结构的2'位包括但不限于H、 0H、 d-G烷氧基 OCH2-CH=CH2、 OCH2-CH=CH-CH3、 0CH2-CH=CH-(CH2) nCH3 (n-0， 1 ... 30)、 闺族元素(F、 Cl、 Br、 1)、 d-C6烷基及0CH3。 d-C4烷氧基及d-G
烷基可以是或可以包括直链、支链或环状的基团。核苷酸的碱基可以是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤或修饰的这些碱基中的任何一个。修饰的碱基包括
但不限于N4-甲基脱氧鸟嘌呤、脱氮杂或氮杂嘌呤和嘧啶。环上的 氮如腺嘌呤的N1、鸟嘌呤的N7、胞嘧啶的N3可以被烷基化。嘧啶碱 基能在5或6位被取代，而噪呤碱基可以在2、 6或8位被取代。例如， 见Cook, W0 93/13121; Sanger, iV/z^/p/es o尸^c7eic Jc/d 5Y藩&re, Springer-Verlag， New York (1984)，其全部内容并入本 文作为参考。常规核苷酸的衍生物是本领域熟知的，并且包括例如具有 不同类型糖的分子。糖的04，位置可以被S或CH2所取代。例如，核 苷酸碱基识别序列可以具有由连接部分连接的环丁基部分，其中环丁 基部分具有与其连接的杂环碱基。例如，见Cook et al.，国际公布 W0 94/19023 (这里其全部内容并入本文作为参考)。
但不限于胆固醇、转导肽(如TAT、渗透素等)。 4、增殖标记物在特定实施方案中，在本发明的方法中使用细胞分裂的荧 光标记物。标记细胞的荧光标记物用于监测细胞分裂，因为标记的细 胞荧光的改变表示细胞已经分裂。可以随时间监测荧光以得到细胞增 殖速率。细胞增殖的增加会关联着用来标记细胞的荧光标记物的增加 或减少。在一个实施方案中，细胞分裂的荧光标记物的荧光减少关联 着细胞增殖的增加。在另一个实施方案中，细胞分裂的荧光标记物的 荧光增加关联着细胞增殖的增加。在一个具体实施方案中，用羧基焚光素二乙酸琥珀酰亚胺 酯(CFSE)标记细胞，此荧光染料可以自发并不可逆地通过与赖氨酸 侧链及其他可及氨基基团的反应结合到细胞蛋白质上。将CFSE染料体 外加到细胞上，并随时间监测荧光；在分析细胞群体的CSFE标记之前 让细胞分裂一段时间。在分裂时，CFSE在子细胞中等量分离使得细胞 中的荧光强度随着每一次连续的继代而减半。CFSE的这个属性使得能 够精确追踪给定细胞的经历的分裂次数(Weston和Parish, JI隱画l Methods. 1990 Oct 4; 133 (1): 87-97; Lyons and Parish, J Immunol Methods. 1994 May 2; 171(1): 131-7; Parish, Immunol Cell Biol. 1999 Dec; 77 (6):499-508; Lyons, J Immunol Methods. 2000 Sep 21; 243 (1-2): 147-54)。用CFSE标记的细胞的荧光强度可以通过 任何适于监测荧光信号的设备检测，例如流式细胞分选仪、荧光细胞 计数仪、荧光显微镜或荧光酶标仪。可用于本发明的其他细胞分裂的荧光标记包括但不限于 CFSE衍生物、羧酸二乙酸琥珀酰亚胺酯染料和它们的衍生物，如俄勒 冈绿488羧酸二乙酸酯的琥珀酰亚胺酯(carboxy-DFFDA SE ) 、 5-(和 -6)-羧基伊红二乙酸琥珀酰亚胺酯(CEDA SE) 、 PKH26、 Hoechst CPA1、 Cyquant GR和NF染料、MTT、 CTT和SNARF-1羧酸，醋酸 盐琥珀酸亚胺基酯。
实施例
实施例1
生产增加水平目的RNA的、具有二相生长傳的细胞 用重组DNA质粒(例如编码结合到表皮生长因子受体的单链Fv 免疫球蛋白片断的质粒)转染细胞。标准转染细胞的方法是已知的。 可以使用市场上有售的试剂或试剂盒(Qiagen， Proraega， Invitrogen， Stratagene )并且遵循制造商的说明书，通过多种方法实现细胞转染。 如果需要，可以通过标准及成功建立的方法，例如通过均质化和进一 步化学处理来分开所述细胞。细胞接着暴露于选择性抗生素以富集将 重组目的基因整合入细胞基因组的细胞，由相同(或不同)的质粒赋 予所述选择性抗生素的抗性。随后细胞用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚 胺酯(CSFE)染色并在低密度下生长一段规定的时间。随后将细胞暴 露于与目的RNA(例如编码了结合到表皮生长因子受体的单链Fv免疫 球蛋白片断的RM)杂交的荧光发生探针。
选择荧光发生探针，使所述探针与目的RNA杂交时其荧光增加。 基于其CFSE荧光丟失得更快以及其荧光发生探针的荧光水平很高(即在低密度下生长迅速却能维持高水平目的基因的RNA表达的细胞)选 择细胞。使分离的细胞生长至充足的数量。
分离的细胞再次用CFSE染色并在高密度下生长。在几天的时间里 周期性进行流式细胞计数。基于以下两个标准分离细胞l)在高密度 细胞培养物中CFSE荧光的丢失速率降低，和2)荧光发生探针的荧光增 加。还用碘化丙啶或膜联蛋白-V对细胞染色以消除凋亡的细胞。最高 密度的细胞培养物依赖于维持荧光发生探针的荧光增加和凋亡的低水 平。在所得细胞培养物上进行流式细胞计数以分离具有二相生长谱、 能够生产高水平目的RNA且能够生长至高密度而凋亡水平低的细胞克 隆。
权利要求
1.分离具有增加的细胞增殖速率的细胞的方法，其包括以下步骤将细胞群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触；以及分离显示出一定水平的荧光试剂的荧光的细胞，所述一定水平的荧光试剂的荧光与细胞增殖的增加有关。
2. 权利要求1的方法，其中使用流式细胞分选技术进行荧光的检测。
3. 分离具有增加的细胞增殖速率的细胞的方法，其中所述细胞还 表达高水平目的RNA，该方法包括以下步骤将细胞群体与荧光发生探针接触，该荧光发生探针在与所述目的 RNA杂交时发出荧光；将所述群体与用于监测细胞增殖速率的焚光试剂接触，其中所述试 剂发出与所述荧光发生探针不同波长的荧光；以及分离显示出增加的荧光发生探针的荧光和一定水平的焚光试剂的 荧光的细胞，所述一定水平的荧光试剂的荧光与细胞增殖的增加有关。
4. 权利要求3的方法，其中检测荧光发生探针的荧光与检测荧光 试剂的荧光同时测定。
5. 权利要求3的方法，其中使用流式细胞分选技术进行荧光的检测。
6. 权利要求3的方法，其中所述用于监测细胞增殖速率的荧光试 剂选自羧基荧光素二乙酸琥珀酸亚胺酯、SNARF-1羧酸或醋酸琥珀酸亚胺酯。
7. 权利要求3的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞、 昆虫细胞、植物细胞、微生物细胞、藻类细胞或真菌细胞。
8. 权利要求7的方法，其中所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵 巢(CH0)细胞、NS0细胞、HEK293细胞和Per. C6细胞。
9. 权利要求7的方法，其中所述细菌细胞是BL21细胞。
10. 权利要求7的方法，其中所述真菌细胞选自金孢霉属细胞、 曲霉属细胞、木霉属细胞、网柄菌属细胞、念珠菌属细胞、酵母属细胞、 裂殖酵母属细胞和青霉属细胞。
11. 权利要求7的方法，其中所述昆虫细胞是SF9细胞或SF21细胞。
12. 权利要求3的方法，进一步包括以下步骤将显示出增加的荧预凋亡标记物的试剂接触。
13. 权利要求12的方法，其中所述试剂是膜联蛋白-V或碘化丙啶。
14. 权利要求3的方法，其中所述目的RNA选自编码蛋白的信使 RNA、反义RNA分子、结构RNA、核糖体RNA、 hnRNA和snRNA。
15. 权利要求14的方法，其中所述信使RM编码免疫球蛋白重链， 免疫球蛋白轻链，单链Fv, Fab、 Fab，或(Fab， ) 2抗体片断，或免 疫球蛋白的抗原结合片断。
16. 权利要求3的方法，其中所述目的RNA是内源性RNA。
17. 权利要求3的方法，其中所述目的RNA是外源性RNA。
18. 权利要求3的方法，进一步包括培养所述分离的细胞以产生细 胞培养物的步骤。
19. 权利要求18的方法，进一步包括测量所述细胞培养物的密度 的步骤。
20. 产生具有增加的细胞密度的细胞培养物的方法，其中所述细胞 培养物中的细胞表达高水平的目的RNA，该方法包括以下步骤将细胞群体与焚光发生探针接触，该焚光发生探针在与所述目的 RNA杂交时发出荧光；从显示出增加的荧光发生探针的荧光的群体中分离细胞； 培养所述分离的细胞以产生第一细胞培养物； 重复上述步骤以分离第二细胞培养物； 比较第一和第二细胞培养物的最大达到密度；以及 鉴定具有增加的细胞密度的细胞培养物，其中所述细胞培养物中的细胞表达高水平的目的RNA。
21. 权利要求20的方法，其中使用流式细胞分选技术进行荧光的 检测。
22. 权利要求20的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细 胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物细胞、藻类细胞或真菌细胞。
23. 权利要求22的方法，其中所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠 卵巢(CH0)细胞、NS0细胞、HEK293细胞和Per.C6细胞。
24. 权利要求22的方法，其中所述细菌细胞是BL21细胞。
25. 权利要求22的方法，其中所述真菌细胞选自金孢霉属细胞、 曲霉属细胞、木霉属细胞、网柄菌属细胞、念珠菌属细胞、酵母属细胞、 裂殖酵母属细胞和青霉属细胞。
26. 权利要求22的方法，其中所述昆虫细胞是SF9细胞或SF21细胞。
27. 权利要求20的方法，进一步包括以下步骤将显示出增加的 荧光发生探针的荧光的细胞与用于监测凋亡或预凋亡标记物的试剂接 触。
28. 权利要求27的方法，其中所述试剂是膜联蛋白-V或碘化丙啶。
29. 权利要求20的方法，其中所述目的RNA选自编码蛋白的信 使RNA、反义RNA分子、结构RNA、核糖体RM、 hnRNA和snRNA。
30. 权利要求29的方法，其中所述信使RNA编码免疫球蛋白重链， 免疫球蛋白轻链，单链Fv， Fab、 Fab，或(Fab， ) 2抗体片断，或免 疫球蛋白的抗原结合片断。
31. 权利要求20的方法，其中所述目的RNA是内源性RNA。
32. 权利要求20的方法，其中所述目的RNA是外源性RNA。
33. 分离具有二相生长谱的细胞的方法，其中所述细胞在生长谱第 一部分中具有增加的增殖速率，而在生长谱第二部分中具有降低的增殖 速率，该方法包括以下步骤将第一细胞群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触； 在低细胞密度下培养所述的细胞群体；从在生长语第一部分中显示出改变的荧光试剂的荧光的所迷细胞群体中分离细胞；培养所述分离的细胞以产生第二细胞群体；将所述第二细胞群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触；在高细胞密度下培养所述第二细胞群体；以及分离与在生长镨第一部分中改变的荧光试剂的荧光相比在生长谱 第二部分中显示出未改变或更低速率变化的荧光试剂的荧光的细胞，从而分离具有二相生长i普的细胞，其中所述细胞在生长谱第一部分中具有 增加的增殖速率，并且其中所述细胞在生长谱第二部分中具有降低的增 殖速率。
34. 分离具有二相生长谱的细胞的方法，其中所述细胞在生长谱第 一部分中具有增加的增殖速率，并且其中所述细胞在生长谱第二部分中 具有降低的增殖速率，并且其中所述细胞在生长谱第二部分中表达高水 平的目的RNA，该方法包括以下步骤将细胞群体与荧光发生探针接触，该荧光发生探针在与所述目的 RNA杂交时发出荧光；将所述群体与用于监测细胞增殖速率的荧光试剂接触，其中所述试 剂发出与所述荧光发生探针不同波长的荧光；及分离在生长镨第一部分中显示出改变的荧光试剂的荧光，在生长谗 第二部分中显示出未改变或降低变化的荧光试剂的荧光，而且在生长镨 第二部分中显示出增加的荧光发生探针的荧光的细胞。
35. 权利要求34的方法，其中所述细胞在生长谱第一部分中生长 到增加的密度。
36. 权利要求34的方法，其中在生长镨第二部分期间，检测荧光 发生探针的荧光与检测荧光试剂的焚光同时测定。
37. 权利要求34的方法，其中使用流式细胞分选技术进行荧光的 检测。
38. 权利要求34的方法，其中所述用于监测细胞增殖速率的荧光 试剂选自羧基荧光素二乙酸琥珀酸亚胺酯、SNARF-1羧酸或醋酸琥珀酸亚胺酯
39. 权利要求34的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细 胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物细胞、藻类细胞或真菌细胞。
40. 权利要求39的方法，其中所述哺乳动物细胞选自中国仓鼠 卵巢(CH0)细胞、NS0细胞、HEK293细胞和Per. C6细胞。
41. 权利要求39的方法，其中所述细菌细胞是BL21细胞。
42. 权利要求39的方法，其中所述真菌细胞选自金孢霉属细胞、 曲霉属细胞、木霉属细胞、网柄菌属细胞、念珠菌属细胞、酵母属细胞、 裂殖酵母属细胞和青霉属细胞。
43. 权利要求39的方法，其中所述昆虫细胞是SF9细胞或SF21细胞。
44. 权利要求34的方法，进一步包括以下步骤将显示出增加的亡或预凋亡标记物的试剂接触。
45. 权利要求44的方法，其中所述试剂是膜联蛋白-V或碘化丙啶。
46. 权利要求34的方法，其中所述目的RNA选自编码蛋白的信 使RNA、反义RNA分子、结构RNA、核糖体RNA、 hnRNA和snRNA。
47. 权利要求46的方法，其中所述信使RNA编码免疫球蛋白重链， 免疫球蛋白轻链，单链Fv, Fab、 Fab'或(Fab， ) 2抗体片断，或免 疫球蛋白的抗原结合片断。
48. 权利要求34的方法，其中所述目的RNA是内源性RNA。
49. 权利要求34的方法，其中所述目的RNA是外源性RNA。
50. 权利要求34的方法，进一步包括培养所述分离的细胞以产生 细胞培养物的步骤。
51. 权利要求50的方法，进一步包括测量所述细胞培养物的密度的步骤。
全文摘要
本发明涉及分离表达增加水平的目的RNA或蛋白质的细胞的方法，其中所述细胞显示出改变的生长谱，例如具有增加或减少的增殖速率、增加或减少的调亡速率的细胞，或者具有二相生长谱的细胞。
文档编号C12N5/00GK101611137SQ200780048293
公开日2009年12月23日 申请日期2007年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者D·索库克, K·谢克达 申请人:克罗莫塞尔公司