专利名称：镉积累减少的转基因植物的制作方法
镉积累减少的转基因植物本发明涉及用于减少植物，特别是烟草中镉积累的工具(means)和方法。大量耕地中存在浓度逐渐升高的镉。这一方面是由于某些土壤中天然的高金属水 平，而另一方面是由于肥料(由于用于制造肥料其的磷盐岩中存在镉)的应用，污水处理站 淤泥的扩散，使用城市污水灌溉田地，以及浮质(aerosol)的沉降造成的。由于作为肥料 使用的无镉磷酸盐矿被耗尽，在不远的将来，农田中的镉浓度还会持续显著地提高。结果， 在植物，主要是供食用的那些植物中存在的镉含量越来越频繁地超过由不同国家规定的标 准，或联合国粮农组织推荐的标准。举例而言，绿色沙拉、土豆、胡椒、小麦，特别是烟草的情 况正是如此。关于烟草，已知这种植物在叶中积累高水平的镉，文献中报道烟草中的镉浓度 为 0. 5-5ppm。镉是属于元素周期表中IIB族的金属元素。由于其化学毒性，吸入或摄取高水平 的镉将造成人和动物的严重健康风险(包括对呼吸系统、肾脏或肝脏的损伤，以及癌症)。因此，需要能够在包含高镉浓度的土壤中生长，并且能够具有低的这一有害金属 含量的植物。尽管可以依照不同的策略降低植物中的镉浓度，生产转基因植物也可有助于 获得此类植物。Lee等人提出了生产抗性增强且镉吸收减少的植物的方法(2003， PlantPhysiol. 133 :589-96 ；和国际申请WO 02/081707)。该作者获得了表达大肠杆菌 (Escherichia coli)重金属ZntA蛋白的转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)。此转基 因植物具有显示改进的Pb和Cd抗性，并且与野生型相比，其芽(shoot)具有降低的Pb和 Cd含量。ZntA 是 Pib-型 ATP 酶(P1B_type ATPase)，其通过使例如 Zn2+、Cd2+ 和 Pb2+ 的二价 阳离子主动流出细胞质外，而赋予大肠杆菌对毒性浓度的这些金属离子的抗性(Rensing et al. , 1997, PNAS,94 14326-14331 ；Rensing et al. , 1998, J Biol Chem. ,273 32614-32617 ；Dutta et al.，2007，Biochemistry, 46 :3692_3703)。Pib-ATP酶是利用ATP水解放能反应释放的能量，使例如Zn2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Cu+ 和Ag+的软金属阳离子跨膜转移的转运蛋白(Inesi，1985，Annu RevPhysiol. ,47 :573_601 ； Axelsen and Palmgren，2001，Plant Physiol.，126 :696_706 ；及综述 ArgUello et al., 2007，BioMetals，20 233-248)。有时也将它们称作HMA (重金属ATP酶)，或者称作CPx-型 ATP酶。Pib-ATP酶发现于原核生物和真核生物，包括古细菌、细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳 动物中。它们都包含标志性的DKTGT氨基酸序列。基于对底物阳离子的选择性和系统发育 分析，将Pib-ATP酶分成两个主要的不同亚类(族)(Rensing et al.，1999，J Bacteriol.， 181 =5891-5897) Cu+ 族 Pib-ATP 酶参与 Cu+ 和 Ag+ 的转运，而 Zn2+ 族 Pib-ATP 酶转运 Zn2+ 和其 他重金属，例如 Co2+、Cd2+和 Pb2+(Axelsen and Palmgren，2001，如上)。不同亚类的 Pib-ATP 酶在其跨膜域中具有不同的保守氨基酸基序。举例而言，基于选择转运的阳离子，它们的第 六跨膜域包含(C，S，T)P(C，H)基序(Solioz and Vulpe, 1996, Trends Biochem Sci. ,21 237-241 ；Rensing et al.，1998，如上；Williams et al.，2000，Biochim Biophys Acta.， 1465 104-126 ；Dutta et al.，2007，如上)。
在拟南芥中，HMA2和HMA4蛋白(分别为AtHMA2和AtHMA4)是与Zn27Co2+/Cd27 Pb2+亚类聚类在一起的Pib-型ATP酶。AtHMA2和AtHMA4在植物(in planta)中位于质膜， 并参与这些二价阳离子向植物地上部分的转运(Hussain et al.，2004，Plant Cell. ,16 1327-39 ；Verret et al. ,2004, FEBS Lett.，576 :306_312)。锌是植物需要的必要微量元 素，而钴、镉和铅则具有毒性作用。可分别通过GenBank数据库的登录号GI112229675和 GI112229637获得AtHMA2和AtHMA4的氨基酸序列；本文中复制AtHMA4氨基酸序列，称为 SEQ ID No. 1。这些蛋白在其第六跨膜域中包含保守的CPC基序(下文中也称作C1PC2)，并 且在其第六和第七跨膜域之间的可溶性环中包含DKTGT基序(Argilello et al.，2007，如 上)。在AtHMA4中，第一个半胱氨酸残基(C1)位于氨基酸序列的第357位(Mills et al.， 2003，Plant J. ,35 164-76) Mills等人的文章(2003，如上)显示AtHMA4在酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中的表达降低了酵母对Cd的敏感性，并且赋予酵母对此金 属离子的抗性。在Mills等人2005年公开的第二篇文章(FEBS Letters, 579 783-791)中 显示在酿酒酵母中表达CPC基序的第一个半胱氨酸(C1) (357C)被甘氨酸取代的AtHMA4突变 体(AtHMA4-C357G)没有赋予酵母对Cd和Zn的抗性，即与表达野生型AtHMA4的那些酵母 相比，表达AtHMA4-C357G的酵母对高水平的Cd和Zn更为敏感。现已获得过表达AtHMA4的转基因拟南芥(Verret et al.，如上和国际申请WO 2005/090583)。与Lee等人(如上)获得的表达ZntA (与Zn2+亚类聚类的大肠杆菌Pib-型 ATP酶)转基因拟南芥相反，Verret等人获得的转基因拟南芥显示其芽的Zn和Cd含量比 野生型提高。由以上描述可见，依照Pib-型ATP酶的原核生物或植物起源，在转基因植物中表达 或过表达与Zn2+亚类聚类的Pib-型ATP酶能导致不同的表型。在导致获得本发明的研究框架内，本发明的发明人意想不到地发现表达AtHMA4 变体(AtHMA4-C357S)(其中第六跨膜域中保守(^^2基序的第一个半胱氨酸(C1)残基被丝 氨酸取代)的酿酒酵母表现降低的Cd转运能力，但Zn外流几乎与野生型酵母相同。随后， 本发明的发明人证明了表达AtHMA4-C357S变体的转基因拟南芥对镉的摄取低于野生型， 并且有利的是其生理Zn2+微量元素的稳态并没有改变。因此，在第一方面，本发明提供了减少镉在植物地上部分中积累的方法，其特征在 于所述方法包括在所述植物中表达在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的 Zn2VCo2VCd2VPb2+亚类植物Pib-型ATP酶的变体，所述变体具有突变，该突变由选自丝氨 酸、丙氨酸、组氨酸和苏氨酸组成的组的任何氨基酸取代C1残基组成，其中优选该突变由丝 氨酸取RC1残基组成。术语“地上部分”包括，但不限于芽、叶、茎、花、果实和种子，优选叶和种子。可通过本领域熟知的方法测定所述Pib-型ATP酶在植物中质膜的定位。举例而 言，可引用Hussain et al.，2004和/或Verret et al.，2004 (如上)中描述的方法。简 要而言，通过水两相分配使植物的总质膜分成部分(fraction)，并通过以Pib-型ATP酶特 异性抗体为探针的蛋白质凝胶斑点分析表征所述部分。为了验证所述Pib-型ATP酶在质膜 的定位，可将其编码序列与例如绿色荧光蛋白(GFP)的标记酶融合在一个读码框中，并在 转基因植物或原生质体内的组成型启动子的控制下表达(瞬时表达)。可通过共焦显微镜 观察Pib-型ATP酶-标记酶在细胞中的亚细胞定位。
根据本发明优选的实施方式，所述Pib-型ATP酶来自高等植物，例如拟南芥、烟草 (Iiicotiana)Jjag (Oryza)和杨树(Populus)，且更优选来自与需要进行所述表达的植物 相同的植物物种。在另一个优选的实施方式中，所述Pib-型ATP酶选自拟南芥的HMA4和HMA2、天 蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)的 HMA4 (可由 GenBank 数据库登录号 GI | 46361-990 获得)、叶芽鼠耳芥(Arabidopsis halleri subsp. Gemmifera)的 HMA4 (可由 GenBank 数 据库登录号GII 63056225获得)、水稻的HMA2和HMA3 (可分别由GenBank数据库登录号 GI1125598398 和 GI1125557764 获得)和葡萄(Vitis vinifera)的 HMA (可由 GenBank 数 据库登录号GI1157357491获得)组成的组。根据本发明的另一个具体实施方式
，所述Pib-型ATP酶与SEQ ID NO 1的AtHMA4 蛋白质具有至少50 %，优选至少54 %的序列同一性，并且按照优选度递增的顺序，具有至 少 56%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%和 99%序列同一性，或 者至少70%，优选73%的序列相似性，且按照优选度递增的顺序，具有至少79%、80%、 85 %、90 %、95 %、97 %、98 %和99 %的序列相似性，条件是所述Pib-型ATP酶在第六跨膜域 中包含保守的C1PC2基序。除非另有说明，本文提供的蛋白序列同一性和相似性是在包括蛋白完整序列的比 较窗口上使用默认参数的BLASTP程序计算的。使用计分矩阵BL0SUM62进行相似度计算。任选地，上述定义的取代可与旨在改进这些突变体活性的一种或多种其他突变组
I=I O根据本发明的另一个具体实施方式
，所述变体具有氨基酸序列SEQ IDNO :2。此氨 基酸序列对应于野生型AtHMA4蛋白(SEQ ID NO :1)，其中此蛋白第六跨膜域中保守(^(2基 序中的第一半胱氨酸(C1)残基被上述氨基酸(即丝氨酸、丙氨酸、组氨酸或苏氨酸)取代。根据本发明的另一个实施方式，降低镉在植物中积累的方法还进一步包括抑制所 述植物中在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn27Co27Cd27Pb2+亚类的至 少一种，优选所有内源性(野生型)P1B-型ATP酶。本发明的这一实施方式的方法仅涉及表达所述内源性Pib-型ATP酶的植物。实际 上，植物可能表达一种或多种上以上定义的内源性Pib-型ATP酶。举例而言，拟南芥表达 Pib-型ATP酶的HMA2和HMA4。因此，当此实施方式的方法应用于拟南芥时，此方法包括抑 制 HMA2 禾口 / 或 HMA4。可通过消除、阻断或降低其功能，或者通过有利地抑制或下调其基因的表达来获 得对内源性Pib-型ATP酶的抑制。举例而言，可通过诱变相应基因或其启动子，并选择具有部分或完全丧失Pib-型 ATP酶活性的突变体来获得对内源性Pib-型ATP酶的抑制。例如，根据突变的性质，在编码 序列内的突变能够诱导表达无活性的蛋白；与此相同，在启动子序列内的突变能够诱导所 述内源性Pib-型ATP酶的表达缺失，或使其表达下降。可以通过，例如对内源性Pib-型ATP酶编码序列或启动子或其部分的靶向删除，或 在所述编码序列或所述启动子内靶向插入外源序列来进行诱变。还可以通过随机的化学或 物理诱变，随后筛选在编码所述内源性Pib-型ATP酶基因内的突变体来进行。用于高通量 诱变和筛选的方法在本领域内是已知的。例如，可以引用Hussain et al.，2004(如上)中描述的方法，其中将T-DNA插入到来自拟南芥的hma2和hma4等位基因中，并使突变体在含 高浓度Zn的培养基上生长(这些突变体是Zn缺陷型的)。有利地，可通过沉默相应的基因获得所述内源性Pib-型ATP酶的抑制。用于在植 物中沉默基因的方法在本领域中是已知的。例如，可通过反义抑制或共抑制进行。还可使 用靶向所述内源性Pib-型ATP酶mRNA的核酶。在优选的方法中，通过靶向待沉默的所述内源性Pib-型ATP酶编码基因的RNA干 扰(RNAi)的方式诱导转录后基因沉默。在本领域中可获得用于递送RNAi的各种方法和 DNA 构建体(综述参见Watson et al. ,2005, FEBSLetters, 579 5982-5987)。本发明还提供了如上文定义的Pib-型ATP酶蛋白变体。本发明还提供了用于实施所述表达的工具(means)。本发明还提供了编码如上文定义的Pib-型ATP酶蛋白变体的多核苷酸。可通过 DNA重组技术和/或化学DNA合成的已知方法获得本发明的多核苷酸。这些方法还可以在 天然存在的编码如上文定义的Pib-型ATP酶蛋白变体的核苷酸序列中引入所需的取代。
本发明还提供了重组表达盒，其包含在转录启动子控制下编码如上文定义的 Pib-型ATP酶变体的多核苷酸，由转录启动子控制以允许在宿主细胞中调控所述多核苷酸。在优选的实施方式中，所述转录启动子是在植物细胞中发挥功能的任何启动子， 即能够在植物细胞中指导编码如上文定义的Pib-型ATP酶的多核苷酸的转录。特别地，可 根据希望进行表达的器官或组织，或表达的类型(即组成型或诱导型)来选择更为适合的 启动子。本领域中可获得大量适合在植物，特别是在烟草中进行基因表达的启动子。例如， 可从植物(例如拟南芥和烟草)、植物病毒或细菌，例如土壤杆菌(Agrobacterium)获得。 其包括组成型启动子，即在大多数组织和细胞中以及大多数环境条件下都具有活性的启动 子，或仅在或主要在某些组织(例如叶)或某些细胞类型中具有活性的组织或细胞特异性 启动子，以及通过物理或化学刺激激活的诱导型启动子。还包括所述内源性Pib-型ATP酶 的启动子，其来自与需要进行所述表达的植物相同的植物物种。启动子序列也可重复两次 或更多次(例如串联重复)。常用的组成型启动子的非限制性实例为公知的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动 子和胭脂碱合酶(Nos)启动子，木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(Verdaguer et al.， 1996，Plant Mol. Biol. ,31 :1129_39)，用于转基因单子叶植物的质粒pActl_F4中包含的 后接水稻肌动蛋白内含子的水稻肌动蛋白(1或2)启动子(RAP-RAI) (McElroy et al., 1991, Mol. Gen. Genet.，231 (1) :150_160)。表达盒通常还包括转录终止子，例如35S转录终止子或Nos终止子(D印icker et al.，1982，J. Mol. Appl. Genet.，1 :561_73)。还可包括其他调控序列，例如转录增强序列。可将本发明的重组表达盒插入到允许对宿主细胞基因组进行遗传转化的适合的 载体中。因此，本发明还涉及包含上述定义的表达盒的重组载体，其中所述表达盒的启动 子优选为在植物细胞中发挥功能的启动子。本发明还提供了包含上文定义的重组表达盒或重组载体的宿主细胞。本发明的宿主细胞为原核细胞或真核细胞，优选植物细胞，且更优选烟草细胞。在另一方面，本发明提供了生产镉积累减少的转基因植物的方法。所述方法包括以下步骤a)提供包含上文定义的重组表达盒或重组载体的植物细胞，并且任选地抑制所述 植物细胞中如上文定义的内源性Pib-型ATP酶，和b)由步骤a)中获得的植物细胞再生表达如上述定义的Pib-型ATP酶变体的转基 因植物。由于使用来自植物源的Pib-型ATP酶的变体，本发明方法的优点在于所生产的转 基因植物包含最小含量的外源元件或外源序列，从而使所述变体的表达更加稳定且更加有 效。本发明还包括通过本发明的重组表达盒遗传转化并表达如上文定义的Pib-型ATP 酶变体的植物。优选所述转基因植物可通过本发明的方法获得。在所述转基因植物中，本 发明的重组表达盒包含在整合(即稳定整合)到植物基因组中一个或多个转基因中，从而 能够被传递至后续的植物世代。因此，本发明的转基因植物不仅包括从最初转基因获得的 植物，而且还包括其后代，只要其包含本发明的重组表达盒。有利地，与没有所述转基因的相同品种的植物相比，表达如上文定义的Pib-型ATP 酶变体的本发明转基因植物表现镉吸收减少，特别是在地上部分中。因此，本发明提供了转基因植物或其分离的器官(例如种子、叶、花、根、茎、穗，优 选叶)或其组织，转基因植物或其分离的器官或其组织在其基因组中稳定整合了包含编码 上文定义的Pib-型ATP酶的变体的多核苷酸的重组表达盒。本发明应用于农业经济目标的单子叶或双子叶植物，例如小麦、大麦、玉米、油菜、 水稻、甜菜、菠菜、莴苣、西红柿、烟草，优选烟草。烟草叶天然地积累并浓缩相对高水平的镉，这些镉在燃烧期间挥发，并对接触镉 的吸烟者造成显著的影响。有利地，与野生型烟草或没有上述转基因的烟草相比，来自本发 明转基因植物的烟草叶具有较低的镉含量。因此，另一方面，本发明涉及来自本发明转基因植物的烟草叶在制造烟草产品中 的应用，所述烟草产品包括冒烟产品(smoking product)例如卷烟、雪茄和粗烟丝，以及无 烟产品例如鼻烟、嚼烟(chewing tobacco)或吮烟(suckingtobacco)等。所述产品也包含 在本发明的范围之内。本发明的上述和其他目标和优点更清楚地体现于下文的详述和附图中。然而，应 理解上述详细说明仅为例证，而不是对本发明的限制。
图1 :a)在液体培养基中培养仅pYES-酵母转化体、AtHMA4-酵母转化体和 AtHMA4SPC-酵母转化体，随后测量600nm的光密度(OD)。酵母细胞在存在80 μ M Cd的条 件下于30°C生长48小时。b-d)在与a)相同的条件下进行液体培养。收集细胞，使用IOmM EDTA清洗一次，随后使用去矿物质水清洗两次，以除去吸附在酵母细胞壁上的镉。将沉淀物 干燥、称重并用HNO3矿化，随后通过ICP-AES测定金属含量；在b)和d)中，在存在80 μ MCd 的条件下进行酵母培养；在c)中，在受控的营养溶液(1.5μΜ Zn)中进行酵母培养。图2显示了 Wassilewskija生态型拟南芥(Ws)和过表达AtHMA4(CPC)或 AtHMA4SPC (SPC)的转基因拟南芥的体外根生长测量。幼苗垂直地生长在不含(对照)或含有以下金属的细菌培养琼脂(bactoagar)营养溶液中20μΜ Cd、50yM Zn或200 μ M Zn。 在发芽14天后进行根长度测量。图中表明了 100-150个测量的平均值+/-SD。实施例表达AtHMA4变体形式的转基因酵母和拟南芥的表征1)材料和方法通过定点突变修饰克隆到诱导型酵母载体pYES-GFP (Gravot et al. ,2004, FEBS Lett. ,561 -.22-28.)中的拟南芥HMA4cDNA(可由2005年3月10日版的GenBank数据库登 录号AF412407获得)。使用丝氨酸取代序列中第357位的半胱氨酸残基(克隆pVF472)， 从而获得其中Xaa为氨基酸丝氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO :2 (命名为AtHMA4SPC)。将此构建体分别转化入对Cd和Pb高度敏感的酵母突变株(ycfl) (Li et al.， 1996，J Biol Chem.，271 :6509_6517)和对 Zn 高度敏感的酵母突变株(zrcl) (MacDiarmid et al. ,2003, J Biol Chem.，278 15065-15072)中(分别为克隆 pVF4121 和 pVF4136)，以 进行异源试验(heterologous experiments)。通过PCR进行pVF472的插入，以使其用于克隆到带有强异位启动子CaMV35S 的植物载体中(克隆PAP4152和pAP4154)。将载体pAP4154引入到根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)株 AglI 中。通过蘸花转染拟南芥植物(Wassilewskija生态型)(Clough and Bent, 1998, Plant J.，16 :735-743)。在潮霉素上筛选转化体。通过表型表征带有一个构建体插入的 纯合植物的多个独立株系。在对照土壤或包含由AtHMA4转运的各种阳离子的培养基中培 养野生型(Ws)和过表达AtHMA4变体形式(AtHMA4SPC)的植物。种子在受控环境(8h光周 期，在300μπιΟ1 HT2iT1、21°C和70%相对湿度下)中发芽。在发芽14天后测量根长度。使 用T3植物(携带独特T-DNA的纯合植物)进行表型表征。按照Verret et al. 2004, FEBS Lett.，576 :306_312 中的描述获得过表达 AtHMA4 的拟南芥。2)结果2-1)转染的酵母的表征2-1-1)使用空载体(pYES)、编码拟南芥野生型 HMA4 的 cDNA(AtHMA4，SEQ ID NO 1)，或者编码第357位的半胱氨酸被取代为丝氨酸的AtHMA4变体的cDNA (AtHMA4SPC，SEQ ID NO 2)转化野生型酿酒酵母。在存在80 μ M Cd的条件下于30°C进行液体培养，并在48 小时期间监测 600nm 的 0. D.。与 Verret 等人获得结果(2005, FEBS Lett.，579 1515-1522) 一致，观察到用野生型AtHMA4转化的酵母在存在80 μ M Cd的条件下的生长较好。AtHMA4 诱导镉耐受性提高。在由变体形式(AtHMA4SPC)转化时，酵母没有表现出这种提高的耐受 性，并且生长与对照株相同。结果显示于图Ia中。2-1-2)通过Gravot等人(2004，如上)描述的ICP-AES测定酵母中的金属含量。 结果显示于图lb-d中。如此前Verret等人(如上)的描述，发现表达AtHMA4的酵母中的Cd浓度远低于 (60% )对照株中的Cd浓度(图lb)。AtHMA4表达于酵母质膜，并在依赖ATP的Cd/Zn外 流中发挥作用。表达AtHMA4SPC的酵母中的Cd浓度介于其它两个菌株之间(比对照低27. 5% )。 此观察结果可解释为转运和外流Cd的能力较低。
在以下两种生长条件下测量Zn浓度在包含1. 5 μ M Zn的营养溶液中，和在存在 80 μ M Cd的条件下。在这两种条件下，AtHMA4-和AtHMA4SPC-转化酵母中的Zn浓度相同， 且都低于对照酵母(图Ic和图Id)。这些实验显示即使在存在毒性浓度的Cd的条件下，AtHMA4的Zn转运功能也没有 因C357S取代而改变，而Cd转运能力下降。2-2)转染的拟南芥的表征通过测量细菌培养琼脂固体培养基上的根长度来测定植物对AtHMA4或 AtHMA4SPC转运的各种金属的耐受性。在对照条件下，两种表型的根长度相同。结果显示于 图2中。在存在不同浓度的Zn、Co和Pb的条件下，过表达AtHMA4SPC的幼苗的根长度大 于野生型。这些结果与在酵母中获得的结果相符，并且与Verret等人(如上)在过表达天 然形式AtHMA4的植物中的观察结果相符。与过表达天然形式AtHMA4的植物相似，过表达 AtHMA4变体形式(AtHMA4SPC)的植物表现出对这三种金属的耐受性提高。这是由于更重要 的向其芽转运和转移金属的能力。在存在20 μ M Cd的条件下，两种株系(野生型和变体)的根长度相同。镉耐受性 的提高消失，该镉耐受性的提高在过表达AtHMA4的植物中也观察到。此结果与在酵母中获 得的那些结果相符。综上所述，在第六跨膜域中具有C1PC2基序的源自真核生物的Zn27Co27Cd27Pb2+ 亚类的Pib-型ATP酶的变体可能由于对镉的亲和力下降而表现出改变的金属转运特异性， 其中所述变体具有由丝氨酸取代C1残基的突变。然而，对于其他三种转运金属Co、Pb、Zn， 特别是生理性的Zn的转运性质则没有改变。
权利要求
用于减少镉在植物地上部分中积累的方法，其特征在于所述方法包括在所述植物中表达在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的植物P1B 型ATP酶的变体，所述变体具有突变，该突变由选自丝氨酸、丙氨酸、组氨酸和苏氨酸组成的组中的任何氨基酸取代C1残基所组成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶来自高等植物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶来自与需要进行所述表达 的植物相同的植物物种。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶选自由来自拟 南芥的HMA4和HMA2、来自天蓝遏蓝菜的HMA4、来自叶芽鼠耳芥的HMA4、来自水稻的HMA2和 HMA3以及来自葡萄的HMA组成的组。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶的变体具有氨基酸序列SEQ ID NO :2。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于所述方法还包括抑制在第六跨膜 域具有C1PC2基序且在植物中位于质膜的Zn27Co27Cd27Pb2+亚类的至少一种内源性Pib-型 ATP 酶。
7.权利要求1-5中任一项定义的Pib-型ATP酶的变体。
8.一种多核苷酸，其特征在于其编码权利要求7所述的Pib-型ATP酶的变体。
9.一种重组表达盒，其特征在于其包含在转录启动子控制下的权利要求8所述的多核 苷酸。
10.一种重组载体，其特征在于其包含权利要求9所述的重组表达盒，其中所述表达盒 的启动子优选为在植物细胞中发挥功能的启动子。
11.一种宿主细胞，其特征在于其包含权利要求9所述的重组表达盒或权利要求10所 述的重组载体。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于其为植物细胞，优选为烟草细胞。
13.用于生产镉积累减少的转基因植物的方法，其特征在于其包括以下步骤a)提供权利要求12所述的植物细胞，并且任选地该植物细胞内的如权利要求6所定义 的内源性Pib-型ATP酶被抑制，和b)由步骤a)中获得的植物细胞再生表达权利要求1-5中任一项所定义的Pib-型ATP 酶的变体的转基因植物。
14.一种转基因植物，其可由权利要求13的方法获得。
15.一种转基因植物或分离的其器官或其组织，其特征在于其包含稳定地整合到其基 因组中的权利要求9所述的重组表达盒。
16.如权利要求14或15所述的转基因植物，其特征在于其为转基因烟草植物。
17.如权利要求15所述的分离的器官，其特征在于其为烟草叶。
18.权利要求17所述的烟草叶在制备烟草产品中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于减少植物中镉积累的方法和工具例如多核苷酸、重复表达盒和重组载体以及表达Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亚类的植物P1B-型ATP酶的变体的转基因植物，所述转基因植物显示在地上部分中的镉积累减少。
文档编号C12N9/14GK101896608SQ200780101868
公开日2010年11月24日 申请日期2007年12月12日 优先权日2007年12月12日
发明者安托万·格拉沃, 帕斯卡利娜·奥鲁瓦, 皮埃尔·里绍, 阿拉因·瓦瓦瑟尔 申请人:原子能与替代能源署