扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体突变基因的制作方法

专利名称：：扩张性心肌病病人M₂-乙酰胆碱能受体突变基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程技术，更具体地说，是涉及扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体(CHRM2)突变基因及其检测的方法。
背景技术：
：扩张性心肌病(DCM)是一种病因不明的慢性心肌病，其临床症状是全心无明显诱因的扩大，主要为左心室的扩大，累及心功能，表现为心脏功能的明显下降，最终导致心力衰竭。由于病因不清楚，所以无特效的治疗方法，临床上治疗该病的方法是按常规方法用3—受体阻断剂、利尿剂、洋地黄、ACEI(血管紧张素转化酶抑制剂)等药物对症治疗，但疗效不甚理想，病人的死亡率达50%以上。目前普遍认为扩张性心肌病可能的病因有三个方面家族性的遗传因子、病毒性心肌炎和其他细胞毒素侵染和免疫学异常。对于扩张性心肌病来说，必需要有病人中的20-30%为家族性的DCM时才能确定为遗传病，而另外两种病因又不能解释大部分患者。近IO年来对DCM的研究结果表明，抗CHRM2自身免疫抗体参与了DCM的致病过程。例如瑞典研究者发现在DCM病人的血清中含有抗CHRM2的自身抗体，而日本的研究者认为抗CHRM2和Pl—肾上腺素受体的自身抗体对DCM是特异的，而对其他的心脏疾病不特异(FuMLX等ClinImmunolImm廳pathol,1994,72:15-20;MatsuiS等Autoimmunity,1995,Vol21:85-88)。这些都说明抗CHRM2的自身抗体与DCM有关。自身抗体的产生及功能的研究目前正是热点，其功能的研究已经表明，自身抗体具有"拟乙酰胆碱能"样作用，可以使体外培养的豚鼠心肌细胞的跳动频率下降和CAMP的产生减少，它的靶点是细胞外第二环表位肽段。已有报导兔抗人CHRM2的细胞外第二环的抗体具有刺激性的电生理效应，它可降低豚鼠心肌细胞L型Ca^电流(Nascimento,JHM.等AmJPhysiolCellPhysiol2001,281:cl251-1258)，抗CHRM2的自身抗体通过降低心肌细胞L型C^+电流而抑制心肌的收縮力，从而参与了DCM的致病过程。但该自身抗体产生的原因尚不清楚。根据抗体与抗原免疫特异结合的原理，可以推测，该自身抗体的存在可能是由于其受体抗原CHRM2基因的突变而引起抗原组分改变的结果。但到目前为止，尚未有关于CHRM2基因突变与抗CHRM2自身抗体的产生、以及与DCM之间关系的报道。因此，有必要建立一种分离、检测扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的方法，检测扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的突变位点并分离该突变其因，进一步了解CHRM2基因的突变与抗CHRM2自身抗体的产生、以及与DCM之间关系，为制备用于诊断DCM的试剂盒和基因芯片提供必要的依据，也可为提供更好的诊断、治疗和预防DCM的方案、筛选和开发新的治疗和预防药物奠定基础。
发明内容针对目前DCM的研究尚未涉及CHRM2基因突变的现状，本发明者建立了一种检测CHRM2突变基因的方法,并对大量DCM病人的血样进行了筛查，结果检测到两种类型的突变位点位于nt588-nt866的CHRM2突变基因，并测得DCM病人血清的抗CHRM2自身抗体阳性率为55.8%，CHRM2基因发生突变的DCM病人血清的抗CHRM2自身抗体阳性率为100%，同时还测得该阳性血清在体外可降低豚鼠单个心肌细胞L型Ca2+电流的峰强度及密度;而健康人对照组的CHRM2基因均未发生突变，其血清的抗CHRM2自身抗体阳性率仅为9.7%，从而说明CHRM2基因的突变所引起抗原组分改变，可能是产生具有上述功能的自身抗体的原因之一。因此，本发明的一个目的是提供扩张性心肌病病人CHRM2突变基因中发生突变的部分编码区序列；本发明的另一个目的是提供一种检扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的突变位点的方法。本发明的目的通过以下方案实现为了分离CHRM2突变基因中发生突变的编码区部分序列，和检测其突变位点，本发明的检测方法包括以下步骤(1)通过免疫分析，确定检测扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体突变基因突变位点的候选序列；(2)根据步骤(1)确定的候选序列设计引物，从扩张性心肌病病人的血样提取DNA作为模板，通过PCR反应扩增该序列的DNA片段；(3)用单链构象多态性SSCP法筛选由步骤(2)所得的PCR产物中碱基突变阳性的PCR扩增片段；.(4)定位克隆由步骤(3)筛选出的碱基突变阳性的PCR扩增片段，并测定其核苷酸序列；(5)将测得的序列与GeneBank中正常的人CHRM2基因中相应的序列比较，确定该核酸分子的突变位点，从而确定CHRM2突变基因的突变位点。其中步骤(1)进一步包括以下步骤(a)合成人CHRM2细胞外第二环E2区的表位肽段，该肽段以半胱氨酸为末端，包括位于CHRM2蛋白的第168—192位氨基酸残基；(b)用步骤(a)合成的肽段作为抗原，从扩张性心肌病病人组和健康人对照组的血清中筛选抗CHRM2自身抗体阳性的血清；(c)检测由步骤(b)筛选的扩张性心肌病患者的抗CHRM2自身抗体阳性血清的抗CHRM2自身抗体滴度。根据以上检测方法，可以获得(1)扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体突变基因,其中编码区的第588-866位核苷酸序列，其第722位核苷酸的碱基由C突变为G，从而导致第176位半胱氨酸变为色氨酸，该核苷酸序列如SEQIDNO:4所示。(2)含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQIDNO:4的重组质粒。(3)扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体突变基因，其中编码区的第588-866位核苷酸序列，其第663位核苷酸的碱基由C突变为T，第624位核苷酸的碱基由A突变为G，从而导致第157位的脯氨酸变为丝氨酸，以及第144位的异亮氨酸变为缬氨酸，该核苷酸序列如SEQIDNO:5所示。(4)含有权利要求2所述的核苷酸序列SEQIDNO:5的重组质粒。已知CHRM2属于G蛋白偶联受体家族，CHRM2细胞外第二环相应于第168—192位氨基酸的区域对G蛋白偶联的受体的配体结合是至关重要的，其中的EDXE氨基酸片段(172—175)是抗原组分(抗原决定部位)，根据已知的研究结果，抗CHRM2的自身抗体与DCM有关，DCM病人的CHRM2基因有可能在该区域附近发生突变。因此，本发明通过免疫分析，测定与CHRM2突变基因的表达产物免疫特异性结合的抗CHRM2自身抗体的存在及其滴度，来确定检测CHRM2突变基因的突变位点的候选区域。首先，根据已知的人CHRM2细胞外第二环E2区(参见图1)肽段的氨基酸序列，体外合成CHRM2蛋白的第168—192位氨基酸残基的肽段，其氨基酸序列为序列表中的SEQIDNO:l。然后用此合成的肽段作为抗原，在体外通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，从DCM病人组和健康人对照组的血清样品中筛选抗CHRM2自身抗体阳性的血清，DCM患者中抗CHRM2自身抗体的阳性率为55.8%(29/52)，而对照仅为9.7%(4/41)(P<0.01);DCM病人的抗CHRM2自身抗体的平均滴度为1:128，而健康人对照组为1:24(P<0.01)。从统计学上分析，该结果具有显著性，说明DCM病人体内抗CHRM2自身抗体的产生与该肽段的组成改变相关，其CHRM2基因有可能发生突变，而突变位点有可能发生在编码上述肽段的编码区。因此本发明选取CHRM2基因编码区的588-866位核苷酸序列(相应于第132-224位氨基酸残基)作为候选的筛查序列，其中的第696-768位核苷酸片段相应于第168-192位氨基酸序列。根据候选筛査序列设计引物，正向引物为序列表中的'SEQIDNO:2，反向引物为SEQIDNO:3，从DCM病人和健康人(对照)的血样中分离白细胞，提取DNA作为模板进行PCR扩增，所得276bp的PCR扩增产物(图2)随后用于检测其突变位点。已知单链核酸的二级结构根据其一级结构的不同而异，PCR产物变性后产生二条单链，如果扩增的片段内含有单个或多个碱基的置换、插入或缺失，由此引起的一级结构的变化，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率就会有所不同。根据该区别可以检测出甚至单个碱基的改变。因此，本发明利用SSCP(单链构象多态性)，通过非变性凝胶电泳检测单个碱基对的变化，根据异常条带的出现(图3)，从PCR扩增产物中筛选出发生突变的片段，采用PCR产物克隆试剂盒(pGEM-T7VectorSystem,美国Promaga公司产品)按产品说明书进一步进行定位克隆、测序并与正常人的CHRM2基因相应序列(GenbankNT007680核苷酸588-866)比较。临床数据表明，DCM有明显的家族遗传性，本发明利用上述方法，通过对一个18位成员的中国DCM家族(此家族有4个患者)，和67位散发DCM病人的CHRM2基因突变位点进行检测，分离并检测出两种类型与DCM有关的CHRM2突变基因中发生突变的编码区部分序列。其中之一是该基因编码区的第722位核苷酸的碱基由C突变为G，从而导致第176位的半胱氨酸突变为色氨酸(图5A)，该序列设定为SEQIDNO:4。DCM家族中的4位DCM患者和2位无临床表现的成员，以及5位散发的DCM患者的CHRM2突变基因属于这种类型的突变。另一种是从其他DCM散发病人分离出的CHRM2突变基因中发生突变的编码区部分序列，该基因编码区的第663位核苷酸的碱基由C突变为T(图5B)，从而导致第157位的脯氨酸变为丝氨酸，以及第624位核苷酸的碱基由A突变为G(图5C)，从而使第144位的异亮氨酸变为缬氨酸，该序列设定为SEQIDNO:5。DCM家族中其他成员和对照者的CHRM2基因的相应序列未发生变异。根据本发明的上述检测结果，DCM病人中的一部分，其CHRM2基因在588-866位核苷酸区域内发生了碱基置换的突变，尤其是家族性的DCM病人，CHRM2基因突变的发生率为100%，而且该家族成员中还有二位未发病成员的CHRM2基因也发生了突变。与此同时，本发明还测定了CHRM2基因发生突变的DCM病人血清中的抗CHRM2自身抗体，其阳性率为100%。此外，本发明还使用全细胞膜片钳技术测定了CHRM2基因发生突变的DCM病人血清中的抗CHRM2自身抗体阳性血清在体外对豚鼠单个心肌细胞L型C^+电流的峰强度及密度的影响，并进一步与CHRM2的激动剂碳酰胆碱、0—肾上腺素的兴奋剂异丙肾上腺素、和CHRM2的阻滞剂阿托品，以及作为对照的CHRM2自身抗体阴性血清(健康人对照)对豚鼠单个心肌细胞L型C^+电流的峰强度及密度的影响比较。结果表明，该自身抗体减少了心肌细胞L型C^+电流，而且可以使异丙肾上腺素激动所増大的L型C^+电流减小，而CHRM2的阻滞剂阿托品可以阻断此作用；由此证明了抗CHRM2自身抗体的该作用类似于CHRM2的激动剂碳酰胆碱，在DCM病人体内，它通过减少心肌细胞L型Ca^电流而降低其收縮力，从而参与DCM病人的致病机制。根据本发明的检测方法和检测结果可知，中国DCM病人中部分病人的CHRM2基因发生了碱基置换的突变，其中DCM家族中发病者CHRM2基因突变的阳性率为100%，二名无临床表现的成员其CHRM2基因也发生了突变，而DCM家族中其他成员和46位对照者的CHRM2基因均未发生突变。DCM病人中，血清的抗CHRM2自身抗体阳性率为55.8%，健康人为9.7%(P<0.01)，而CHRM2基因发生突变的DCM病人的阳性率为100%。说明CHRM2基因的突变与抗CHRM2自身抗体的产生有更直接的关系。由此可推论CHRM2基因的突变引起其表达产物CHRM2抗原组分的改变，从而产生与该抗原组分特异结合的抗CHRM2自身抗体。因此，本发明与现有技术相比有以下优点本发明利用其检测扩张性心肌病病人CHRM2突变基因的方法，首次获得了扩张性心肌病病人CHRM2突变基因，并将其与抗CHRM2自身抗体、DCM联系起来，进一步说明了三者之间的关系，表明CHRM2基因的突变是DCM的病因之一，尤其是DCM的遗传病因之一。为进一步研究DCM的病因奠定了必要的基础。该突变基因可以作为探针制成试剂盒、或制作基因芯片，用于体外检测生物样品中CHRM2突变基因的存在，尤其是通过对DCM家族成员样本的体外检测，可以为制定新的诊断、预防、治疗DCM的方案，筛选和开发新的药物提供依据。图1是表示CHRM2的结构及其生物学特征的示意图。图中E2为CHRM2细胞外第二环，相应于氨基酸残基168-192。图2是CHRM2基因编码区第588—866位核苷酸片段的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。图中第1泳道是pBR322/Hinf分子量标志，第2、3、4泳道是PCR产物。图3是检测CHRM2基因编码区第588—866位核苷酸片段的PCR扩增产物单链构象多态性(SSCP)的非变性凝胶电泳图。图中第l、2泳道是碱基突变阳性的PCR扩增产物，箭头所指为异常条带；第3、4泳道为碱基未发生突变的PCR扩增产物；第5泳道是健康人(对照)血样的PCR扩增产物。图4是T-载体克隆CHRM2基因编码区第588—866位核苷酸片段的PCR扩增产物的示意图。图5是正常CHRM2基因和CHRM2突变基因部分序列的测序图谱。I为碱基发生突变的位点，图5A为第722位核苷酸突变;图5B为第663位核苷酸突变;图5C为第624位核苷酸突变。图6是遗传性DCM家族图。图中口代表男性；O代表女性；/表示己死亡的个体；黑色图标表示感染的个体；/为先证者。图7是在不同条件下的豚鼠心肌细胞L型C^+的电流曲线。其中抗CHRM2自身抗体阳性血清取自CHRM2基因发生突变的DCM病人。图中Al、Cl、Dl:对照；A2:加入抗CHRM2自身抗体阴性血清；Bl、C2、D2:加入ei—肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素；B2:加入Pi—肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素后，再加入抗CHRM2自身抗体阴性血清；C3:加入CHRM2的激动剂碳酰胆碱；D3:加入抗CHRM2自身抗体阳性血清；C4:加入碳酰胆碱后再加入CHRM2的阻滞剂阿托品；D4:加入自身抗体阳性血清后再加入阿托品。具体实施方式以下通过三个实施例，结合附图对本发明作进一步说明。实施例一DCM病人CHRM2自身抗体阳性血清的筛选1.抗原肽的合成由北京SBSGenatech有限公司采用Merrifield的固相法(FuMLX等，ClinImmunolImmunopathol,72:15-20(1994))合成相应于人乙酰胆能碱受体CHRM2的细胞外第二环氨基酸序列的肽段(氨基酸残基第168一192位)，然后用HPLC分析法在VydacC-18柱上分析该合成肽段的纯度，并用自动氨基酸分析仪(Beckmaninstruments,Inc,PaloAlto,CA)分析其氨基酸序列。该序列设定为SEQIDNO:l，其末端为半胱氨酸V-R画T-V-E-D-G-C-Y-I-Q-F-F陽S-N-A-A-V-T誦F-G-T-A-I-C;2.样本的选择从在医院就医的病人中选出52位DCM病人，其中33位女性，19位男性。入选的标准为出现CHF(充血性心力衰竭，纽约心脏协会功能分级II一IV)症状1年以上。所有的病人呈现出心脏结构和功能的改变，在超声心动图中，左心室射血分数为45%以下。患有肥大性心肌病、糖尿病、自身免疫性疾病和某些感染疾病的病人除外。收集血清之前，所有病人停用P—肾上腺素受体拮抗剂和ACEI。对照组为41位健康的血液提供者，对照组的年龄和性别与DCM病人相配。其临床症状、ECG和超声心动图检査都正常，且不服用药物。3.样本血清的酶联免度吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验将上述病人组和对照组采集的血样在一2(TC下储存备用。取50iU溶于100mMNa2CO3(pHll)的肽溶液(5ug/ml)涂布在NUNC微量滴定板上，4T过夜。用PBS—T使孔饱和，PBS—T是在磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS，pH7.3-7.4)中添加了0.2%(v/v)Tween—20(Sigma，USA)和0.01%(v/v)硫柳汞(Sigma，USA)的溶液。将20p1按1:201:160稀释的血清加入涂布了肽溶液的微量滴定板中，4'C下放置过夜。用PBS—T将孔洗涤三次后，使其与亲和纯化的生物素化兔抗IgG(H+L)抗体(用PMT按1:500稀释)反应1小时。PMT是添加了胎牛血清的PBS—T液，浓度10%。洗涤三次后，使平板与链霉抗生物素—过氧化物酶(JachsonLaboratories,PA，USA)的PMT溶液(2nl/ml)反应1小时。然后用PBS洗涤三次，并加入底物2.5mMH202—2mMABTS(Sigma，s，Louis,MO.USA)。30分钟后在微量板读数器中读出405nm下的光密度(O.D)(KeelingPJ等，BrHeartJ73:417-421(1995))。4.结果抗CHRM2自身抗体阳性血清的分析数据如表1所示。表lDCM和NC(对照)抗M2受体的自身抗体比较<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表中的数据以平均值土SD表示。阳性定义为阳性/阴性(p/n-样本0D—空白OD/阴性对照OD—空白OD)比>2.1。由以上数据可知，DCM病人的抗CHRM2自身抗体阳性率为55.8%(29/52)，而对照为9.7。^(4/41)(pO.Ol)。这些结果表明，在中国的DCM病人体内不仅存在抗CHRM2的自身抗体，而且其抗体的几何平均滴度在蛋白水平上明显高于对照，说明DCM病人体内抗CHRM2自身抗体的产生与其相应的抗原肽的组成改变相关。实施例二DCM病人CHRM2基因突变位点的检测1.检测样本的选择按实施例一同样的标准选择67位散发DCM病人(其中包括38位女性和29位男性)，和一个18位成员的中国山西省DCM家族(其中有4个DCM患者)作为被检对象，并选择46位年龄和性别与DCM病人相配的健康供血者，作为对照组。2、PCR扩增根据已知的编码人CHRM2细胞外第二环的第588-866位核苷酸的序列设计以下引物正向引物为5'-AGTCAAGCGGACCACAAAAATGGC-3'该序列设定为SEQIDNO:2反向弓l物为5'-GGCTCCTTCTTGTCCTTCTTTATCC-3'该序歹U设定为SEQIDNO:3参照文献(GrimbergJ,NawoschikS,BelluscioL,.等NucleicAcidsRes.l989(17),8390)所述的方法，从待测样本的血液中分离白细胞，用酚-氯仿抽提和乙醇沉淀法提取DNA用作模板。通过PCR反应，扩增相应于CHRM2基因编码区位于588—866核苷酸序列的DNA片段，PCR反应条件为25ulPCR反应总体积中含有DNA模板0.5ul引物0.7dNTP0.5u11(^缓冲液+^^2+2.5u1Tag聚合酶0.2uldH2020.6ul反应混合物在95。C变性5min后，94。C变性lmin，51。C退火lmin，7(TC延伸lmin，共进行30个循环，然后在72°C延伸10min后，4'C保存。PRC产物的2%琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，图中泳道1为pBR322/Hinfl分子量标志，第2、3、4泳道为PCR产物，其片段为276bp。3.SSCP法筛选碱基突变阳性的PCR产物用SSCP银染法(Hayashi,K，1991.PCR-SSCP:AsimpleandsensitivemethodfordetectionofmutationsingenomicDNA.PCRMethodsAppl.l:34-38)筛选碱基突变阳性的PCR扩增产物。将DCM病人组和对照组的PCR产物进行SSCP电泳，其步骤如以下所述。(1)按以下组分制备8%聚丙烯酰胺凝胶，(总体积34ml):20%的丙烯酰胺/双丙烯酰胺(49:1)13.6ml5xTBE3.4ml20%APS34ulTEMED34nl犯2017ml(2)将制备的凝胶在160V下预电泳lh;(3)然后将PCR产物在98T下变性10min后，按下述条件进行电泳、固定、染色单链PCR扩增产物6ml+变性剂6m1—电泳10—12小时后，固定15分钟，染色4分钟并显色。图3为PCR产物的SSCP非变性凝胶电泳图，电泳出现两种不同的SSCP模式，模式I(第3泳道对照；第4、5泳道DCM病人，碱基未发生突变)的DNA序列与GeneBank中的完全相同，而模式II(第l、2泳道DCM病人，碱基突变阳性，箭头所指为异常条带)的DNA序列则发生了变化。4.PCR产物的克隆经过SSCP电泳检测，挑选碱基突变阳性的PCR扩增产物，采用PCR产物克隆试剂盒(pGEM-T7VectorSystem,美国Promaga公司产品)按产品说明书和J.Sambrook等的分子克隆实验室指南，第二版中所述方法进行定位克隆。(1)连接碱基突变阳性的PCR扩增产物7ul(1.377ug或1.89"g)PGEM-T71u110x缓冲液lul连接酶lyl连接反应温度、时间室温、l小时(2)细菌转化100ulDH5a感受态细胞加入10ml转化管中，加入5u1连接反应液，温和混合后在冰上放置30分钟，然后在42。C(水浴)静置2分钟，再加入900"1LB(无抗菌素)，37。C下振摇45分钟(100-150rpm)。取160u1细菌转化液在含有氨苄青霉素/IPTG/X-gal的LB平板培养基上培养，挑选白色克隆，用BstZI进行酶切、鉴定，选出插入了碱基突变阳性的PCR扩增片段的阳性质粒进一步用于序列分析，检测突变位点。用同样方法克隆健康人对照组相应的PCR产物，构建含有CHRM2对照基因编码区588—866位核苷酸片段的PCR产物的重组对照质粒。图4是T-载体克隆CHRM2基因编码区588_866位核苷酸片段的PCR扩增产物的示意图。图中l是pGEM-T7载体，2是碱基突变阳性的PCR扩增产物或对照PCR扩增产物，3是含有CHRM2突变基因或对照基因编码区第588_866位核苷酸片段的PCR产物的重组质粒。黑色图标表示插入片段。5.CHRM2基因部分编码区序列的测定用反向通用引物测定由上述4中筛选出的阳性质粒和对照质粒中276bp的DNA插入片段的序列，其结果如图5所示。将CHRM2突变基因和对照基因的nt588-nt866与正常CHRM2基因(GenbankNT007680)的nt588-nt866的序列比较，发现对照质粒的插入序列与正常基因的完全一致，而阳性质粒的插入序列有两种类型的突变，其中一种是DCM家族的4个DCM患者(图6的II:1、III:1、III:3、III:7)和2个12岁以下的未发病的成员(图6的IV:1和IV:2)，以及5位DCM散发病人的CHRM2基因中的第722位核苷酸的碱基C突变为G，从而导致第176位的半胱氨酸变为色氨酸(图5A)，其nt588-nt866的序列为SEQIDNO:4;另一种类型是在其他DCM散发病人的CHRM2基因中，第663位核苷酸的碱基C突变为T，从而导致第156位脯氨酸变为丝氨酸(图5B)，以及第624位核苷酸的碱基A突变为G，导致第144位的异亮氨酸变为缬氨酸(图5C)，其nt588-nt866的序列为SEQIDNO:5。DCM家族的未发病成员和对照组成员的CHRM2基因未发生突变。实施例三CHRM2基因突变的DCM病人抗CHRM2自身抗对豚鼠心肌细胞L型(^2+电流峰强度和密度的影响1.抗CHRM2自身抗体阳性血清的制备选择9例CHRM2基因突变的DMC病人和9例健康的供血者，按照实施例一所述的ELISA方法筛选抗CHRM2自身抗体阳性血清，其结果为所有病人的血清均为阳性，健康供血者的血清为阴性。采集的阳性血清(稀释度l:160)作为研究对象保存在一7(TC下备用。2.细胞的分离(1)选用健康成年豚鼠，雌雄不拘，体重250320g，断头处死。(2)在室温20-25"C下，迅速开胸取出心脏放入冰冷的无钙台氏液中，心脏跳动几次排除心腔内血液，转入无钙台氏液，去除心包膜。(3)分辨主动脉，将心脏安置于Langedorff灌流架上，由主动脉逆行灌流心脏[灌流压为70cmH2O(lcmH2O=0.098kPa)，温度37。C]，所有溶液通以95%02+5%C02，灌流滴速为7ml/min，循环液37'C，并确定灌流入心脏的管中无气泡。(4)无钙液灌流心脏5分钟，心脏逐渐停止跳动。(5)改用含O.lmg/mL蛋白酶E,0.5mg/mL去脂肪酸的牛血清白蛋白的低钙液灌液心脏5分钟。至心脏变得柔软，松驰为止。(6)将心脏从灌流装置系统上取下，剪去心房，心室肌切为小块，置于上述含酶溶液中，37。C条件下温孵、搅拌约5分钟。(7)吸取少量细胞悬液在显微镜下观察细胞的多少及形状，细胞纹理，可搅拌三次，用滤膜过滤，取细胞悬液。(8)将细胞悬液用含C^+1.8mM的无钙液台氏液稀释5倍，静置1小时以备使用。3.电生理测定用全细胞膜片钳技术(刘泰撻，心肌电生理学，北京大学出版社，1988)测定了豚鼠心肌细胞在以下不同条件下的L型C^+电流峰强度和密度(1)不加任何试剂(对照)如图7中的A1、Cl、和D1;(2)加入抗CHRM2自身抗体阴性血清，如图7的A2;(3)加入ei—肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素，如图7中的B1、C2禾BD2;(4)加入Pi—肾上腺素的激动剂异丙肾上腺素和抗CHRM2自身抗体阴性血清，如图7的B2;(5)加入CHRM2的激动剂碳酰胆碱，如图7的C3;(6)加入抗CHRM2自身抗体阳性血清，如图7中的D3;(7)加入碳酰胆碱后再加入CHRM2的阻滞剂阿托品；如图7的C4;(8)加入自身抗体阳性血清后再加入阿托品，如图7的D4。4、结果电生理学测定结果如图7和表2所示。表2在不同条件下豚鼠心肌细胞L型C^+电流峰强度和密度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>参照图7和表2，加入自身抗体阴性血清(图7，A2)对细胞L型Ca"电流(图7，Al)无影响；加入e—肾上腺素受体的激动剂异丙肾上腺素，再加入自身抗体阴性血清后(图7，B2)对异丙肾上腺素的刺激作用产生的电流增大(图7，Bl)无影响；加入异丙肾上腺素(图7，C2、图7，D2)，细胞L型Ca^电流的峰强度和密度比对照(图7，Cl、图7，Dl)明显增加；加入CHRM2的激动剂碳酰胆碱(图7，C3)，细胞L型Ca2+电流峰强度和密度比对照(图7，Cl)降低；加入自身抗体阳性血清(图7，D3)，细胞L型Ca2+电流峰强度和密度明显降低；其作用类似于CHRM2的激动剂碳酰胆碱；加入激动剂碳酰胆碱后再加入CHRM2的阻滞剂阿托品(图7，C4)，和加入自身抗体阳性血清后再加入阿托品(图7，D4)，阻断了激动剂碳酰胆碱和自身抗体阳性血清对细胞L型C^+电流的转移。由以上数据可证明，循环的抗CHRM2自身抗体通过降低基础的收縮力，参与DCM病人的病理生理改变，其作用与CHRM2的激动剂碳酰胆碱类似。本发明为进一步研究DCM的病因奠定了必要的基本发明的^^L^，可以作为探针制成试剂盒、或制作細芯:体外=CH腹2突变翻的存在，力其是通过对0^=样本的体外检测，可以为制定新的诊断、预防、治疗DCM的方S，^和开发新的药物提供依据。/口仃DCM的万案，师选序列表<110>首都医科大学附属北京朝阳医院/北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体突变基因及其检测方法<130>Patentln3.1<160>5<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>25<212>PRT<213>Homosapiens<400>1ValArgThrValGluAspGlyCysTyrlieGinPhePheSerAsnAla151015AlaValThrPheGlyThrAlalieCys2025<210>2<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>2agtcaagcggaccacaaaaatggc24<210>3<211>24<212>DNA<213>Homosapiens<400>3agtcaagcggaccacaaaaatggc24<210>4<211>360<212>DNA<213>Homosapiens<400>4tcatcagctttgacaggtacttctgtgtcacaaaacctctgacctacccagtcaagcgga60ccacaaaaatggcaggtatgatgattgcagctgcctgggtcctctctttcatcctctggg120ctccagccattctcttctggcagttcattgtaggggtgagaactgtggaggatggggagt180ggtacattcagtttttttccaatgctgctgtcacctttggtacggctattgcagccttct240atttgccagtgatcatcatgactgtgctatattggcacatatcccgagccagcaagagca300ggataaagaaggacaagaaggagcctgttgccaaccaagaccccgtttctccaagtctgg360<210>5<211>360<212>DNA<213>Homosapiens<400>5tcatcagctttgacaggtacttctgtgtcacaaaacctcj;gacctacccagtcaagcgga60ccacaaaaatggcaggtatgatggttgcagctgcctgggtcctctctttcatcctctggg120cttcagccattctcttctggcagttcattgtaggggtgag露tgtggaggatggggagt180gctacattcagtttttttccaatgctgctgtcacctttggtacggctattgcagccttct240atttgccagtgatcatcatgactgtgctatattggcacatatcccgagccagcaagagca300ggataaagaaggacaagaaggagcctgttgccaaccaagaccccgtttctccaagtctgg360权利要求1.扩张性心肌病病人M2-乙酰胆碱能受体基因，其中编码区的第588-866位核苷酸序列，其特征在于第663位核苷酸的碱基由C突变为T，第624位核苷酸的碱基由A突变为G，该核苷酸序列如SEQIDNO5的48-326位核苷酸所示，其中所说的第663位核苷酸和624位核苷酸分别相应于SEQIDNO5中的第123位和第84位核苷酸。2.含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQIDNO:5中第48-326位核苷酸的重组质粒。全文摘要本发明涉及扩张性心肌病病人M₂乙酰胆碱能受体突变基因及其检测方法，突变位点及其检测方法详见说明书。本发明将CHRM2基因的突变与抗CHRM2自身抗体、DCM联系起来，进一步说明了三者之间的关系，为进一步研究DCM的病因奠定了必要的基础。该突变基因可以作为探针制成试剂盒、或制作基因芯片，用于体外检测生物样品中CHRM2突变基因的存在，为制定新的诊断、预防、治疗DCM的方案，筛选和开发新的药物提供依据。文档编号C12N15/12GK101215564SQ20081000034公开日2008年7月9日申请日期2003年11月7日优先权日2003年11月7日发明者麟张,岩沈申请人:首都医科大学附属北京朝阳医院;北京诺赛基因组研究中心有限公司