专利名称：：一种可诱生细胞免疫应答的真核表达载体及其疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及真核表达载体，具体地说关于一种可诱生细胞免疫应答的真核表达载体及其疫苗。
背景技术：
：DNA疫苗(DMvaccine)又称核酸疫苗、基因疫苗(genevaccine)，是指将编码某种目的抗原蛋白的外源基因插入真核细胞表达质粒，直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。核酸疫苗不仅能刺激机体产生特异性的体液免疫,还能诱导产生特异性的具有细胞毒杀伤性功能的CTL效应(细胞免疫)，并可直接清除带有目的抗原的靶细胞，因此对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病具有广阔的治疗前景。表4立疫苗(epitopevaccine)是用4元原表位制备的疫苗，包括「合成肽疫苗(syntheticpeptidevaccine)、重组表位疫苗(recombinantepitope-basedvaccine)及表位DNA疫苗(epitopeDMvaccine,minigenes/印igenes)，是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenicdeterminant)，它是T细月包抗原受体(Teel1rec印tor,TCR)和B细胞抗原受体(Bcellreceptor,BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细月包表位。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是高度多态性的细胞表面分子，它将多肽片段递呈给T细胞。与MHCI类分子结合的抗原肽为8-12个氨基酸，是来自内源性抗原经蛋白酶降解后的产物。蛋白酶水解片^殳通过抗原加工相关转运体(transporterassociatedwithantigenprocessing,TAP)转运至内质网与新合成的MHCI类分子相结合，MHC肽复合体转移至细胞表面被CD8+细胞毒T淋巴细胞的TCR识别。MHCII类分子结合肽长度变化较大，为9-25个氨基酸，主要由外源蛋白通过溶酶体中的蛋白酶降解而来。在内体溶酶体中与MHCII类分子结合后，MHC肽复合体也转运至细胞表面被C頂T细胞TCR识别。据此可设计出两大类T细胞疫苗，即与相应的MHCI颠HC1I类分子相关的CD8T细胞疫苗和CIMT细月包疫苗。CIM辅助性T细月包(helperTcell,Th)又分为分泌不同细胞因子却又交叉调节的两群，即Thl和Th2。DNA疫苗作为第三代疫苗，与血源疫苗和基因工程疫苗相比，具有以下优点在宿主体内合成所编码的蛋白质，具有与天然抗原相似的构象；能诱导机体产生全面的免疫应答；免疫应答持久；易于制备，化学结构稳定，便于保存和运输；可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；给药途径多样化等，为预防和治疗各种疾病提供了一种重要的思路。但是，由于机体组织对导入质粒有一定程度的破坏，外源基因的转染率较低，导入基因在体内不能也不应自我复制，都限制了核酸疫苗的使用效果。在免疫效果方面，总体而言动物尤其是小动物的试验效果优于人体试验，国内外研究者正谋求以多种方式提高免疫效果，如使用佐剂、改进导入方式、优化表达序列、多抗原表位结合等，使用的剂量也倾向加大。因此，如何增强核酸疫苗的免疫原性成了当前研究的重点。已有的增强DNA疫苗免疫效率的策略主要包括①优化外源基因编码序列核酸疫苗不含病原体的蛋白合成系统，完全依赖于宿主细胞凋控，将外源基因优化为宿主细胞偏好的密码子，可改善目的抗原的合成，进而促进免疫效果。研究表明，选用人体细胞偏好的密码可提高翻译效率，促进蛋白表达，显著提高细胞和体液免疫反应。②细胞因子的免疫佐剂效应细胞因子是体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质类肽性调节因子，在体内能激活和调节免疫活性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。业已发现多种细胞因子具有免疫佐剂作用，可调节免疫应答的强度和方向。Thl细胞主要产生IL-2、IFN-y，在促进细胞免疫、清除细胞内病原体方面具有优势，Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，以促进抗体产生为主，而IL-10又对Thl细胞因子产生明显的抑制作用，从而形成免疫调控网络。以细胞因子作为佐剂，可望提高核酸疫苗的免疫效果。在使用方式上，除可直接使用细胞因子外，还可以细胞因子基因与疫苗质粒共免疫，或构建二者的共表达质粒。③共刺激分子的佐剂效应共刺激分子如B7、ICAM-1、VCAM-1、LFA-3等T细胞激活的第二信号，目前研究较多的是B7-1和B7-2分子。T细胞受体与抗原结合产生T细胞活化的第一信号，而T细胞表面的CD28与抗原递呈细胞表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被充分活化。缺乏B7等共刺激分子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫耐受。④增加CpG免疫刺激序列(ISS)近年来发现一些非曱基化脱氧核苷酸片断(CpGDNA)能增加核酸疫苗的免疫效果，以细胞免疫反应尤为明显，因此称之为免疫刺激序列(ISS)。免疫刺激序列的基本骨架为5，-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3，，主要来源于细菌DNA，合成的相同序列具有相似的免疫增强作用，但是曱基化修饰或改变序列，则免疫刺激作用完全消失。CpG免疫刺激序列增强免疫反应的机理可能是直接诱导B细胞增殖活化并分泌IL-2、IL-6,保护B细胞免受细胞凋亡作用，刺激单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞活化分泌TNF-oc、IL-6、IL-12，刺激T细胞、NK细胞分泌IFN-y。总之，CpG诱导Thl类细胞因子产生，增加特异性IgG2a抗体的产生，增强CTL反应。核酸疫苗可通过多种途径及方式接种到机体内，肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔、粘膜都可以是核酸疫苗的接种部位，合适的接种途径和方式有利于提高蛋白表达水平和减少个体差异对免疫应答效果的影响。肌纤维是已永久地有丝分裂后的细胞，转入的DNA不会因为细胞分裂而4交快地稀释或丟失，可长期稳定表达。所以，肌肉注射成为最常用的DNA疫苗注射方式。不过，肌纤维对DNA的摄取效率低是重要的限制因素，可将局部肌肉组织经物理或化学因素处理(如局部冷敷、注射麻醉剂或蛇毒、心肌毒素等)，产生炎症反应，损伤的肌细胞在增生过程中，可增加质粒摄入，使目的抗原表达量增多。电脉冲技术的作用机制是使细胞膜双层磷脂结构在电场的作用下发生改变，形成瞬间可逆的微孔，于是DNA或其他物质分子得以进入细胞。在体电脉冲(/zF/raelectroporation，又称电穿孑L才支术)正是用上述这种基本原理,使得DNA能够注入到活细胞内以提高其治疗效果。同时，由于电脉冲造成组织的轻纟效损伤产生了局部组织的炎症反应，可增强抗原递呈细胞(APC)功能，从而进一步提高了DNA疫苗的免疫原性，诱导机体产生更强的免疫应答。另夕卜，在体电脉冲技术增强DNA疫苗的免疫效果较常用的基因枪方法更为简单实用，具有一次导入的质粒DNA量大、成本低、易于推广等优点，有可能成为非病毒载体基因治疗接种方法中的一项主导性技术。
发明内容本发明的目的在于(1)提供一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/(32M-IL15真核表达载体；(2)提供一种可增强细胞免疫应答的pcDNA3.1/P2M-IL15真核表达载体构建方法；(3)提供一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗。本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明采用质粒pGL3/CMV-印itope-linker-|32M-TA-SV40-CD80-TA,其中pitope-linker-P2M融合基因以CMV为启动子，BGHPA为转录终止信号；CD80基因以SV40为启动子，SV40PA为转录终止信号。本发明采用质粒pcDNA3.1/P2M-IL15,带有P2微球蛋白基因启动子(P2M),含有BGHPA转录终止信号及氨节青霉素抗性基因。质粒DNA用QiagenPlasmidMaxiKit大量制备、纯化，溶于生理盐水，调整浓度为l|iig/nl。取6-8周龄DBA/2雌性小鼠(购自中科院上海实验动物中心)，分组后腹腔给药麻醉小鼠，然后用无菌微量注射器将10-100ug质粒pGL3/CMV-印itope-linker-P2M-TA-SV40-CD80-TA注射入小鼠后腿股四头肌。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。用该质粒DNA每隔两周l次共3次免疫，方法同前。第3次免疫后的0-14天用10-100ug质粒pcDNA3.1/B2M-IL15注射入小鼠对侧后腿股四头肌，质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉沖刺激。第3次DNA免疫和加强免疫后的第18天采血，分离其单个核细胞或CD8+T细胞，用于四聚体分析和IFN-yELISPOT分析。检测免疫后细胞免疫功能，采用四聚体分析检测抗原表位特异性CD8+T细胞的数量和比例。IFN-yELISPOT分析4佥测抗原肽特异性、分泌IFN-y的功能性T细胞。本发明技术方案如下一种可i秀生细胞免疫应答的真核表达载体pcDNA3.1/(32M-IL15,它的核苷酸序列如SEQIDNO:3所述。一种可诱生细胞免疫应答的真核表达载体pcDNA3.1/|32M-IL15,它的构建如下(1)克隆人P2微球蛋白基因启动子；(2)克隆人白细胞介素15基因片断；(3)构建pcDNA3.1/p2M-IL15真核表达载体。一种可诱生细胞免疫应答的表位DNA疫苗，该疫苗包括pGL3/CD80-PlA共表达载体和pcDNA3.1/P2M-IL15真核表达载体，其中pGL3/CD80-PlA共表达载体核苷酸序列如SEQIDNO:2所述，首先将pGL3/CD80-PlA共表达载体注射免疫，然后注射pcDNA3.1/P2M-IL15真核表达载体增强其诱发的抗原表位特异性细胞免疫应答。本发明所公开一种可诱生细胞免疫应答的真核表达载体及其疫苗，其优点表现在本发明有利于克服常规表位DNA疫苗免疫原性低的缺陷，可用于肿瘤及病毒持续性感染等的预防和治疗。图1:本发明实施例所用？"35-43表位DNA疫苗pGL3/CMV-PlA-linker-P2M-TA-SV40-CD80-TA(即pGL3/CD80-PlA)质4立载体示意图；图2:本发明所用含人(32微球蛋白基因启动子(|32M)的白细胞介素15(IL-15)真核表达载体pcDNA3.1/P2M-IL15质粒载体示意图；图3A:表位DNA疫苗免疫接种后PlA35-43表位特异性细胞免疫反应，质粒DNA注射免疫诱发表位特异性CD8+-T细胞反应的流式分析结果(单个核细胞)。图3B:表位DNA疫苗免疫接种后PlA35-43表位特异性细胞免疫反应，质粒DNA注射免疫诱发表位特异性CD8+-T细胞反应的流式分析结果(CD8+-T细胞)。图3C:表位DNA疫苗免疫接种后PlA35-"表位特异性细胞免疫反应，脾脏单个核细胞ifn-yelispot分析结果。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例11材一牛和方法1.1材料试剂各种限制性内切酶、74DNA连才妾酶购自BoehringerMannheim公司；PCR试剂购自TaKaRa公司；细胞总RNA抽提试剂TRIZOL、逆转录反应试剂购自InVitrogen/^司；DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA分离纯化试剂盒购自QIAGEN公司；琼脂糖购于Promega公司；酵母提取物，胰蛋白胨购于0X0ID/^司；LamdaDNAHindIIImarker(华美7>司)，lOObpDNAMarker(天为时代乂>司)；单个核细胞分离液Lymphoprep(Axis-ShieldpolAS);MTT(华美公司)；ConA(购于晶美公司)；重组人IL-2购自PeproTechECLtd公司;R-PElabeledPro5MHCPentamerH-2L7LPYLGWLVF，FITC标记大鼠抗小鼠CD8分子单克隆抗体(克隆号KT15)和P1A九肽(LPYLGWLVF)均购自PR0I固UNE7^司；MouseIFN-yELISPOTkit(U-CyTech)。其他试剂均为国产分4斤纯。质粒pGL3/p簡oter(购自Promega公司)；pc醒3.1(购自Invitrogen/>司)。pcDNA3/eb2M本室构建保存。质粒pcDM3.1/eb2M构建方法设计含有表位肽序列、linker;S^vP2M基因5，端的引物(pb2M)，以人DNA为模板，通过PCR方法扩增出融合基因，PCR产物再经酶切与同样酶切的pET-42b(+)质粒(购自Novagen爿^司)连4妾后，形成原核表达质粒pET-OVA-1inker-P2M。再以质粒pET-0VA-linker-P2M为才莫4反，eb2M(5)与eb2M(3)为引物，通过PCR方法扩增出含有信号肽序列的融合基因sOVA-linker-P2M，将该融合基因的PCR产物经过酶切与同样酶切的pcDNA3.1质粒连4妾后，获得真核表达载体pcDNA3.1/eb2M。引物序列如下pb2M(5):5'CAGCATATGTCCATAATCAACTTTGAAAAACTCGGAGGAGGATCCGGAGGTGGCAGCATCCAGCGTACTCCAAAG3，pb2M(3):5，CAACTCGAGCATGTCTCGATCCCAC3，eb2M(5):5'GATAAGCTTATGTCTCGCTCCGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGCCTGGAGGCTTCCATAATCAACTTTG3，eb2M(3):5，CAACTCGAGCATGTCTCGATCCCAC3，菌抹JM109(大肠杆菌)为本室冻存。动物DBA/2(H-2d)，6-8周龄，雌性。均购于中科院上海实验动物中心，飼养于本校实验动物科学部清洁级动物房。主要仪器低温台式离心机(Sorvall)，低温高速离心机(HITACHI)，紫夕卜分光光度计(Eppendorf),PCR仪(BiometraT3Thermocycler),流式细月包4义(BectonDickinsonFACScalibui),酶标4义(MAX250,MolecularDevices公司),ELISPOT图像自动分析仪Bioreader4000(BIO-SYSGmbH),电脉冲仪CUY21(NEPA/^司)。1.2方法1.2.1人CD80基因真核表达载体的构建通过RT-PCR方法克隆人CD80基因，将PCR扩增产物双酶切后，克隆到pGL3/promoter载体中，替代该载体中原有的荧光素酶基因，ii从而获得在SV40启动子作用下的CD80基因真核表达载体pGL3/C则。1.2.2epitope-1inker-P2M融合基因真核表达载体的构建1.2.2.1pcDNA3.1/P1A真核表达载体的构建通过设计含有P1A基因表位序列(P1A35—43:LPYLGWLVF)的3，端下游引物5'CGGGATCCTCCTCCGAAGACCAGCCACCCTAGATAAGGCAGAGCCTCCAGGCCAGAAAG3，；以及5，端上游引物5，CCCAAGCTTATGTCTCGCTCCGTG3，。上、下游引物的5，端分别加上HindIII和Xbal限制性酶切位点。PCR反应条件于94'C预变性5分钟，共进行30个循环，每个循环条件94。C变性lmin，56。C退火lmin,72。C延伸lmin。以pcDNA3.1/eb2M载体为模板，按以上条件进行PCR反应。然后利用pcDNA3.1/eb2M载体上的HindIII和BamHI酶切位点，双酶切去除原有的0VA表位后，将含有PlA35-43表位序列的PCR产物引入pcDNA3.1/eb2M载体中，测序鉴定正确后，获得表达PlA35—-linker-P2M融合基因的真核表达载体pcDNA3.1/P1A。1.2.2.2epitope-linker-P2M融合基因(如SEQIDNO:1所述)和CD80基因双表达载体的构建通过BglII和Smal双酶切，将pc腿3.1载体上的epitope-linker-P2M融合基因表达框架亚克隆到pGL3/CD80载体中，形成印itope-1inker-p2M融合基因和CD80基因双表达载体pGL3/CD80-P1A(见图1)。pGL3/CD80—P1A如SEQIDNO:2所述。1.2.3人IL-15基因真核表达载体的构建通过RT-PCR方法克隆人IL-15基因，然后双酶切PCR扩增产物，将IL-15基因克隆到pBluescript载体，阳性克隆送上海博亚^>司测序鉴定。将测序正确的IL-15基因再通过BamHI和Notl双酶切，亚克隆到pcDNA3.1/P2M-EGFP载体，获得以02M为启动子的IL-15基因真核表达载体pcDNA3.1/(32M-IL15(见图2)。pcDNA3.1/|32M-IL15如SEQIDNO:3所述。1.2.4质粒的大量制备和纯化才姿质粒纯化试剂盒(QIAGENplasmidmidiprepkit)要求进4亍。简言之，取lml已鉴定正确的菌液加至100mlLB中，振荡培养至对数生长期，6000rpm，4°C离心15分钟，沉淀中加入Pl(含RNaseA)10ml，震荡重悬沉淀后，加入溶液P210ml，轻緩倒置离心管数次，最后加入预冷的溶液P310ml，轻緩倒置离心管数次，冰浴20分钟，13000rpm,4。C离心30分钟，上清转移到预先用10mlQC緩沖液平衡好的柱子(QIAGEN-Tip500)上，然后用30ml緩沖液QC洗柱2次，用15ml緩冲液QF洗脱质粒DNA,最后经0.7倍体积的异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤后，用适量TE溶解，260nm测定0D值，鉴定质粒的量和纯度，用适当的限制性内切酶酶切，电泳鉴定。1.2.5质粒DNA注射和电脉沖转移条件将质粒DNA溶于生理盐水中，调整浓度到lug/ul。腹腔给药麻醉小鼠后，用无菌孩吏量注射器将质粒DNA溶液(100ug/0.lml)注射入小鼠后腿股四头肌就。质粒注射后5分钟内，将电核j故置于注射部位两侧，两电极间距约5mm，电极直径O.5cm,进行电脉沖刺激。电击条件为长脉冲方波，电压IOOV，波宽60ms,频率0.75Hz,脉冲次数10次(正反各5次)。1.2.6五聚体分析表位特异性CD8+T细胞1.2.6.1质粒DNA肌肉注射诱导表位特异性T细胞免疫将DBA/2小鼠分为4组，每组3只。第1组注射生理盐水；第2组注射质粒pcDNA3.1;第3、4组注射质粒pGL3/CD80-P1A。分组后腹腔给药麻醉小鼠，然后用无菌微量注射器分别将100ul生理盐水或100ug质粒DNA注射入小鼠后腿股四头肌。质粒注射后5分钟内，将电极放置于注射部位两侧，进行电脉冲刺激。分别用生理盐水或质粒DNA每隔两周l次共3次免疫，方法同前。第3次免疫后的第10天用100ug质粒pcDNA3.1/P2M-IL15分别注射入第1、2、3组小鼠对侧后腿股四头肌，第4组注射生理盐水对照，质粒注射后5分钟内，将电招j文置于注射部位两侧，进行电脉沖刺激。在第一次免疫后第35天处死小鼠，分离脾脏单个核细胞，用于五聚体分析。1.2.6.2五聚体分析具体步骤1.2.6.2.1取5xl()5脾脏单个核细胞，用洗涤緩冲液(含0.1%叠氮钠和0.1%BSA的PBS)洗涤两次，重悬于50ul洗涤液中。1.2.6.2.2加入lOulPE标记的五聚体(H-2Ld/LPYLGWLVF),置于暗处，室温孵育10-15分钟。1.2.6.2.3用洗涤液洗涤一次，重悬于100ul洗涤液中，加入lulFITC标记的抗小鼠CD8抗体，置于暗处，冰上孵育20-30分钟。1.2.6.2.4用洗涤液洗涤2次后，重悬于200ul的固定液(含l%胎牛血清和2.5%曱醛的PBS)中，避光保存或直接用于流式细胞分析。1.2.7ELISPOT分析制备各种肿瘤细胞悬液，同位素(铯137)细胞辐照仪照射后，1x106细胞皮下注射免疫2次，间隔一周。最后一次免疫后10天取脾脏，分离其脾脏单个核细胞。调整单个核细胞浓度为2xl07ml，按照小鼠ifn-yELISP0T试剂盒方法进行ELISP0T分析，步骤筒述如下1.2.7.1将250ul无菌去离子水加入包被抗体瓶中，混合15秒，室温放置5分钟，避免剧烈震荡。取出50ul加入5ml的无菌PBS，混匀。然后加入ELISPOT板，每孔50ul。再每孔加入50ulPBS,盖上板盖，4。C过夜。1.2.7.2取出ELISP0T板，去掉液体，用无菌PBST(含0.01°/。Tween-20的PBS)洗涤5-10次。加入200ul/孔无菌PBS-BSA,37°C，1小时。去掉液体(不用洗板)，加入100ul已准备好的细胞。细胞总数为2xl07孔。每个样品分为两组，一组不加肽作为对照组；另一组加8ug/ml的P1A9肽(LPYLGWLVF)作为刺激组。各设6个复孔。置于37°C，5。/。C()2孵育24小时。1.2.7.3取出ELISPOT板，去除培养细胞。加入冰冻去离子水200ul/孔，将板放置在冰上10分钟。PBST洗板10次。加入生物素标记的检测抗体100ul/孔，37。C，l小时。洗板5-IO次。加入50ul/孔的酶标记抗体(GABA)，37。C孵育l小时。洗板5-10次(最后一次用PBS,避免Tween-20对显色剂的影响)。1.2.7.4取出1.5ml显色剂I和l.5ml显色剂II，4。C暗处混合，加入30u1/孔新鲜配制的显色剂I/II,放置暗处，室温孵育20-30分钟(至显微镜下可以观察到斑点为止)。去除显色液，使用去离子水清洗ELISPOT才反，室温干燥后，于Bioreader4000读^反4义读^反记数。1.2.8统计学处理所有数据均采用未配对资料的f检验进行统计分析。1.2.9结果第1、2、3、4组四聚体和CD8双阳性细胞占整个脾脏单个核细胞比例分别为0.5%、0.61%、2.7%、1.85%(图3A)。以CD8+T细胞作为整体看，第1、2、3、4组四聚体和CD8双阳性细胞的比例分别是2.94%、3.88%、26.75%、12.92%(图3B)。以第3、4免疫方案i秀发的抗原表位特异性CD8+T细胞数量较多，与第1、2组相比具有显著差异(P<0.01)。其中第3种免疫方案效果显著优于第4种方案(P<0.01)，即注射质粒pcDNA3.1/|32M-IL15的能增强抗原表位特异性T细胞反应。IFN-yELISPOT分析按照小鼠IFN-yELISPOT试剂盒(购自英国U-CyTech公司)方法进行。结果表明(见图3C)，第1、2、3、4组小鼠脾脏2x105单个核细胞中平均IFN-Y分泌细胞数分别为10、16、73、60。其中第3、4免疫方案IFN-Y分泌细胞数显著多于第1、2免疫方案(P〈0.01),并且注射质粒pcDNA3.1/(32M-IL15的第3免疫方案IFN-y分泌细胞数显著多于未注射质粒pcDNA3.1/P2M-IL15的第4免疫方案(P<0.05)。SEQUENCELISTING<110〉上海交通大学医学院<120>—种可诱生细胞免疫应答的真核表达载体及其疫苗<130>/<160>3<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>411<212>腿<213>智人(Homosapiens)<■〉1atgtctcgctccgtggccttagctgtgctcgcgctactctctctttctggcctggaggct60ctgccttatctagggtggctggtcttcggagg鄉atccgg鄉tggC3gcatccagcgt120ttcaggtttactcacgtcatatggaaagtc333tttCCtg180a^ttgctatgtgtctgggtttcatccatccgscattg犯gttgacttact240gcattcagacttgtctttcagtctttctat300ctcttgtact3C3Ctg犯ttC3CCCCC8Ctagta/tgcctgccgtgtgaac360catgtgactttgtcacagccC犯g3t3gtt卿tgggatc3411〈210〉2<211>6584<212>DNA<213〉智人(Homosapiens)〈400〉2ggtaccgagctcttacgcgtgctagcccgggagctttttgc犯犯gcctaggcctccaaa60aaagcctcctcactacttctggaatagctc卿ggc,ggcggcctcggcctctgcata120aataaaaaaaattagtcagccstggggcggag犯tgggcgg咖tgggcgg3g也gggg180cgggatgggcgga^gtt鄉ggcgggactatggttgctgacta^ttgaga^tgcatgctttg240catacttctgcctgctgggg鄉Ctgggg3ctttccacacctggttgctgact犯ttgsg300atgcatgctttgcateicttctgcctgctgggg鄉ctggggactttccacaccctaactg360ac3cacattccacag犯ttaattcgcgttaaatttttgtt犯3tC3gCtC3tttttt犯C420castaggccgaaatcggcaaaatcccttatgatogggttg480agtgttgttcC3gtttgga3c犯g3gtccaacgtggactccaa_cgtcaaa_540gggcg犯犯accgtctatcagggcgatggccractacgtgaaccatcaccctaatcaagt600tttttggggtcg郷tgccgtaaagcactaaatcggaacccta犯gggagcccccgattt6603g3gcttgacgggg3肌gCCggcg咖gtggcg卿卿gagcg犯agga720gcgggcgctagggcgctggc卿tgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacEicccgcc780gcgctt犯tgcgccgctacagggcgcgtggggataccccctagagccccagctggttctt840tccgcctcaggcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaa900tcctcccccttgctgtcctgCCCC3CCCC3CCCCCC3g33tagaatgacacctactcaga960caatgcgatgcaatttcctcattttattagga卿gacagtggg敏ggcaccttccagg1020gtc卿gasggcacgggggaacaga/tggctggc肌ctaga3ggcacagtc1080g3ggctgatcaacgggcccttgtctcgatcccacttaact114017<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3ggtttttt3犯gcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataagg3tCCgtCg33780ccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggC3tg3Ct3840atcgtcgccgcacttatgactgtcttcttt3tCEttgca^ctcgtsggacaggtgccggca3900gcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagc3960ggtatcagctcactca犯ggcggt犯tacggttatccacagaatcaggggataacgcagg4020aaagaacatgtg3gca^犯gggCC3gg犯Ccgtaaaaaggccgcgttgct4080ggcgtttttccataggctccgcccccctgaCg3gC3tC3Caaaa^tcgacgctcaagtcs4140g鄉tggcgsaacccgacagataccaggcgtttccccctggaagctccct4200cgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttc4260ggg卿cgtggcgctttctcatagctcacgctgteggtatctcagttcggtgt鄉tcgt4320tcgctccaagctgggctgtgtgcax;gaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatc4380cggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagc4440C3Ctggt犯Cg3gCg3ggt3tgt鄉cggtgctaxagagttcttg犯gtg4500gtggcctaactacggctacactagaag犯cagtatttggtatctgcgctctgctg肌gcc4560agttaccttcgg犯犯卿gttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtag4620cggtggtttttttgtttgcaagc3gc3g3ttacgcgcaga4680tcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggascgaaaactcacgttoagggat4740tttggtcatgaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaag4800ttttaaatc3atctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaat4860C3gtg鄉C3cctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccc4920cgtcgtgtagataactacgatacggg鄉gcttaccatctggCCCC3gtgctgcaatgat4980accgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccgg卿5040ggccgagcgc卿3gtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttg5100ccggg卿ctgttCgCC3gtcgc肌cgttgttgccattgc5160tacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttccca5220acgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgc犯aaaagcggttagctccttcgg5280tcctccgatcgttgtC3g犯gt卿ttggccgcagtgttatC8CtC3tggttstggcagc5340actgcataattctcttactgtcatgccatccgt犯gatgcttttctgtgactggtgagta5400ctcaaccaagtcattctgaggcggcgaccgagt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