专利名称：体外骨髓间充质干细胞扩增方法
技术领域：
本发明涉及细胞扩增，具体涉及一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法。
背景技术：
我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国。糖尿病足是糖尿病最严 重的并发症之一，以往治疗糖尿病足，服用药物是常用的方法，但是服用药物
常常效果不佳，不能有效的减少截肢率；近年来，干细胞移植治疗糖尿病足初 见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。干细胞研究给糖尿 病足患者带来了新的希望，其中成体骨髓间充质干细胞多向分化潜能最强， 最适合治疗糖尿病足这种包括神经血管在内的混合性病变，但是现有方法所扩 增的细胞常常具有致瘤性和较强的免疫原性，这些因素限制了其临床应用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述缺陷和不足，提供一种安全快速 的体外骨髓间充质干细胞扩增方法。
本发明所述的体外骨髓间充质干细胞扩增方法，包括以下步骤
(1) 取骨髓，Percoll密度梯度离心分离并收集骨髓间充质干细胞；
(2) 将收集的细胞用含15。/。胎牛血清的DMEM培养液重新混悬均匀，再接种、
培养；
(3) 细胞达85% 95%融合时，对其进行消化并收集细胞，用全培养基重 新悬浮细胞按1:2传代培养；
(4) 培养3代17天后，弃去胎牛血清培养基；
(5) 然后用PBS冲洗，再加入含10%血清的培养基，继续培养5天；然后用 胰酶消化，再用血清终止消化即可。
步骤(2)所述的接种、培养优选以下过程按lX10Vml密度接种于直 径为35 cm2的培养皿中，置于37 °C， 5 %C02饱和湿度的C02孵箱中培养。 步骤(5)所述血清为与步骤(1)的骨髓来自同一主体的血清。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1) 本发明的方法具有更高的扩增效率；
(2) 本发明的方法有效地解决了体外培养MSC存在的致瘤性和致敏性的问题。
图1为实施例1扩增后所得的细胞的形状图2是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD34-特征图； 图3是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD44+特征图； 图4是流式检测实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD105+特征图； 图5 MSC扩增曲线图6是对1例实施扩增后所得细胞进行染色体检测结果图；(其中图A是 实验结果图，图B是经过LUCIA自动分析软件分析后得到的染色体排序结果 图)
图7为裸鼠致瘤性检测的对照组结果图； 图8为裸鼠致瘤性检测的实验组结果图。
具体实施例方式
以下提供本发明效果较好的实施例，以助于进一步理解本发明。 实施例1
(1)用装有2ml含500u/ml肝素的生理盐水的20 ml无菌注射器抽取10ml 骨髓.摇匀后注入50ml的无菌离心管中。再用等量含20u/ml肝素的生理盐水液 稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加入等体积的比重为1.077g/ ml的Ficoll人淋巴 细胞分离液上，2000 r/ min ，离心30 min，用毛细吸管首先将最上层脂质吸 出弃掉，再将50X血清约20ml吸出，加入80mlDMEM制成含10X的与骨髓来自同 一主体的血清的培养基共100ml，过滤，冻存于—2(TC下(留最后5天培养时用)， 再将毛细吸管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆之间的乳白色云雾 状白膜层)，沿管壁轻轻吸出全部细胞(剩下的红细胞层和血浆层留用于制备 与骨髓来自同一主体的血清)。然后用DMEM培养液离心洗涤2次，每次1500 r/ min ,离心10min，弃去上清液，收集细胞。(2) 再将收集的细胞用含15W优质胎牛血清的DMEM培养液重新混悬均匀 后，计数细胞数，调整细胞密度。然后按lX10Vml接种于直径为35cm2的培养 皿中，置于37 °C， 5 % C02饱和湿度的C02孵箱中培养。1 d后首次换液，弃 去未贴壁细胞，以后每2天更换培养液1次，
(3) 当细胞达85 % 95 %融合时用0.25 %胰蛋白酶和0.02 %EDTA混合液 37 'C消化25min 。当细胞突起縮回，细胞之间间隙增大，细胞接近圆形时用 胎牛血清终止消化。用吸管反复吹打平皿底壁，使己经消化的细胞脱离平皿底 壁。收取细胞悬液，1000 r/min，离心5min，弃上清后用全培养基重新悬浮细 胞按1:2传代培养。
(4) 培养3代17天后，弃胎牛血清培养基。
(5) 然后用PBS冲洗二次后，加入含10%与骨髓来自同一主体的血清的培 养基，继续培养5天，再用胰酶消化培养瓶中贴壁第4代MSC后，用与骨髓来自 同一主体的血清及时终止消化即可。
实施例2
(1) 观察实施例l扩增后所得细胞的数量和形状图l为实施例l扩增后所 得的细胞的形状图。从图l可以看出，细胞排列呈旋涡状或平行排列，细胞形 态呈长梭形。说明本方法培养的细胞形态符合人骨髓间充质干细胞的形态特 征。
(2) 流式检测实施例l扩增后所得细胞的表面抗原CD105+、 CD44+、 CD34-的特征。图2是流式检测实施例l扩增后所得细胞的表面抗原CD105+特征图；图 3是流式检测实施例l扩增后所得细胞的表面抗原CD44+特征图；图4是流式检测 实施例1扩增后所得细胞的表面抗原CD34-特征图。说明本方法培养的细胞表面 抗原的表达符合人骨髓间充质干细胞的特征。
图5为MSC扩增曲线图，从图5可以看出，本发明的方法可以用约22天的时 间从10ml人的骨髓液中培养出2.0X108以上的间充质干细胞，扩增效率比较 高。
(3) 对5例实施扩增后所得细胞进行染色体检测图6是其中1例扩增后所 得细胞进行染色体检测结果图。其中图A是实验结果图，图B是经过LUCIA自动分析软件分析后得到的染色体排序结果图，结果提示染色体正常；无变异或 缺失。从图6可以看出，扩增后所得的细胞并没发现染色体变异、缺失，同时 仍保持其二倍体的稳定性。
(4) 致瘤性检测将实施例1扩增后所得细胞注入裸鼠体内，4个月后 经病理科活检证实并无肿瘤细胞生成，见图7 8,图7为致瘤性检测的对照 组结果图，图8为致瘤性检测的对照组结果图由图7和图8对比可见。
图6、 7、 8说明扩增后MSC染色体稳定，裸鼠致瘤性试验(一)，此时 的MSC没有向肿瘤细胞分化，形成肿瘤的倾向。注入5位患者自体也证实的这 一结果(最早的患者已经随访l年)。
(5) 致敏性检测将实施例1扩增后所得的细胞用生理盐水通过离心洗 涤3次的细胞悬液，注入2 3个月的成年豚鼠皮下，48h后再注入一次，观 察3天后，注射局部虽然出现中性粒细胞和巨噬细胞聚集，但豚鼠并无明显过 敏反应。说明我们培养的细胞没有明显的致敏性，注入5位患者自体也证实的 这一结果。
将最后生理盐水稀释的细胞悬液送检验科进行细菌、霉菌、真菌、支原体、 衣原体、病毒检测并无以上病原生成。排除了体外培养过程中MSC受到污染的 情况，保证了MSC细胞悬液的无菌状态。
权利要求
1、一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取骨髓，Percoll密度梯度离心分离并收集骨髓间充质干细胞；(2)将收集的细胞用含15％胎牛血清的DMEM培养液重新混悬均匀，再接种、培养；(3)细胞达85％～95％融合时，对其进行消化并收集细胞，用全培养基重新悬浮细胞按1∶2传代培养；(4)培养3代17天后，弃去胎牛血清培养基；(5)然后用PBS冲洗，再加入含10％血清的培养基，继续培养5天；然后用胰酶消化，再用血清终止消化即可。
2、 根据权利要求1所述的一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法，其特征 在于，步骤(2)所述的接种、培养包括以下过程按lX10Vml密度接种于 直径为35 cm2的培养皿中，置于37 。C， 5 %C02饱和湿度的C02孵箱中培养。
3、 根据权利要求l所述的一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法，其特征在 于，步骤(5)所述血清为与步骤(1)的骨髓来自同一主体的血清。
全文摘要
本发明涉及细胞扩增，具体涉及一种体外骨髓间充质干细胞扩增方法。本发明所述的体外骨髓间充质干细胞扩增方法，包括以下步骤(1)取骨髓，然后分离并收集骨髓间充质干细胞；(2)将收集的细胞重新混悬均匀，再接种、培养；(3)细胞达85％～95％融合时，对其进行消化并收集细胞，再传代培养；(4)培养3代16天后，弃去胎牛血清培养基；(5)然后用PBS冲洗，再加入含10％与骨髓来自同一主体的血清的培养基，继续培养3天；然后用胰酶消化，再用血清终止消化即可。与现有技术相比，本发明的方法具有更高的扩增效率；并且有效地解决了体外培养MSC存在的致瘤性和致敏性的问题。
文档编号C12N5/0775GK101412987SQ200810008030
公开日2009年4月22日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日
发明者姜友昭, 张忠辉, 李晓艳, 梁自文, 陆德宾, 兵 陈 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院