专利名称：大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法
技术领域：
本发明属于鱼魏毒检测技术，是涉及用环介导等尉广增(loop-mediated isoth薩al amplification, LAMP)反应检测大菱鲆红体病虫!B病毒的一种^f生物学方^~~大菱鲆红体病虫I^病毒环介导等温 扩增检测方法。 背景狱大穀平红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus， TRBIV)矿泛存在于鱼苗、成鱼以及 饲料和辭I7乂体中的一种新的鱼^IJI^病毒，近年彩彌敲我国#81大穀平中 31流行，导致患病大 菱鲆大量死亡，给我国水产辭Mkit成了巨大的经济损失。因此开发新的技术十规、准确、灵敏ife^测 TRBIV，加强苗种和鱼##疫以及# 1*体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国大 穀平水产銜鹏勺纖捲卖魏具有輕意义。目前，有关大^S平红体病虹彩病毒检测方法的ffiilX不多，史成银等(2004) ffiil组织病理学方法 和电子显微纟鼓现t腿了大穀平虫I^病毒，陈松林等(2004)禾,接种培养牙鲆胚胎细胞的方法脅离和 鉴定到该病毒。在这些方法中，传统的组织満理学方法只戯寸患病大穀种勺组织减理状劍故出初步判断，并不會^i:接检测到大穀平红体病虫i^病毒的存在；电子显微镜技术虽然可以直接观察至'J病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；AI接种培养细胞的方法检测精衝氏、检测过，對毛费时间更长。±3^￡种 方法均不能鹏、简便、准确地检测大穀聘工体病鮮彌毒。史成银等(2007)开发出大穀转工体病虹 彩病毒PCR检测法，该方法克月艮了Jdi3中方法的缺点，在实验室劍牛下实现了)(状穀平红体病^^病 毒的相对十魏、7侮角检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、？鋤交顿斜a成像系统，这大大限 制了 PCR检测方法在7i/^中的推广应用。环介导等显扩增技术是2000年由Notomi等发明的。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特 异弓卿并利用一种具有链置换活性的DNA聚合騰在一定^Jt下对核Mffl1f^显扩增。M几年已开始 应用于生物致病病原的检测。此前，已有自LAMP技;^t测鱼l^lB病毒附随，Caipang等(2004) 开发了真鲷虫10病毒(RSIV)的LAMP检测技术。大^I平红体病虫IB病毒和真鲷虫I^病毒虽同属虫I^ 病毒科，iiM于不同的病毒种，其基因组间存在駄的差异，所以已J隨的真鲷虫If;病毒LAMP检测技 术并不适用于大^t平红体病虹彩病毒的检测。目前，尚未见利用LAMP技术检测大^I平红体病虫I^病毒 的鹏。发明内容本发明的目的是衝共一种大菱鲆红体病虫I^病毒环介导等显扩增检测方法，以实现戯^C穀转工体 病虫I^病毒进行十规、特异、灵敏、简便的现场检测，划艮已有技术的不足。本发明具体包括两4^分1、掛共两对用于检则大菱S转工体病虹彩病毒的LAMP引物序列，即长 度分别为45bp、 46bp、 18bp和18bp的驟核苷鹏列，依次命名为F1P、 BIP、 F3和B3; 2、 Jif共一 种人徵转工体病虫II多病毒的LAMP检测方法'即首先从待检测样品中制备反蹈對反，并配制LAMP反 应体系，然后舰LAMP反应禾Mm对反应t對腿行扩增，顧根据反应混刽勿显示的颜fe^1t测结魏 行判断，如果显恭絶则标该样品的大魏红体病虫IB病毒樹则结果为阳性。Jl^两对LAMP引物序列(FIP、 BIP、 F3和B3)分别与大^I平红体病虫I^病毒的主要衣壳蛋白基 因上相应位置+雜^^列相同躯补，其驟核苷M^列如下 FIP: 5，-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3,BIP: 5，-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3，F3: 5'"GTCACACCCGCAGACAAT-3， B3: 5，-ACCTCGGACAGGGGATTG-3，。禾鹏战的LAMP引物，根据以下步骤即可进行TRBIV病毒的检测，具体包括以下四个歩骤(1) 制备待检样品的LAMP反应t對及取0.5克样品，采用天根生化禾射i有限公司组织基因组DNA 提取试剂盒(TlANamp Genomic DNA Kit)进^T^且织DAN的提取和纯化，制备LAMP反应的DNA模 板；(2) 酉己制LAMP反应体系^mii制备的DNAt對及l ^L，加入到如下反应体系中引物FIP和 BIP各1.6pM，引物F3禾口B3各0,2mM， dNTP1.4Mm， MgCl28mM， Betaine 1M， Tris-HC120mM， KC110mM， MgSO42mM,(NH4)2SO410mM， TritonX-100 0.1%， 聚合酶8U，加A^义蒸zK使 反应体系的总体禾,吸剖25^L，上述的dNTP为dTTP、 dATP、 dGTP和dCTP的混合物，其质量比 为l:l:l:l;(3) 按照如下反应禾M 进行LAMP反应63。C保温60併中，然后80。C保温5併中； 〔4)判断LAMP检测结果:LAMP ffi结束后，在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinder 2 pL，然后用目朗青观察被测样品的LAMP反应产物，如果显恭絶则*^该样品的大^1平红体病虫10病毒检测 结果为附性，如果显示橙黄色则S^该样品的大穀平红体病虫I^病毒检测结果为附性。 本发明所麟的TOBIV检测方法具有如下优点(1) 灵每娘高。对TRBIV的检测极限可低至101个拷贝，对TRBIV检测的灵敏比普通PCR方法 高10倍以上。(2) 特异性强。所用的特异引物根据TRBIV主要衣壳蛋白基因中6个不同区i或设计，特异ttM 常规PCR。(3) 检测时间短。2-3个小时便可获得检测结果，比现有最賊走的PCR检测法节省3-5个小时。(4) 仪驟求宽松。不需要普通PCR所用的PCR仪、凑超交电泳和成像系统，只要一个7K浴锅或金 属浴就能完鹏测反应。(5) 操作简单、结果明显。fi^检测过程H邻及复杂仪器或设备，稍具針生物学基础的人员即可 完 作；检测结果清晰明显，直接用鹏青观察就可以判断。(6) 对人和环境安全。检测过程中不4顿有毒试剂，对人和环境都非常安全。(7) 低 。
LAMP检测总鹏大大低于现有SJt1介的PCR检测方法。总之，该方法具有比普通PCR衞则方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，可以割饮菱鲆红体病 虫I^病毒的电子显微镜、细胞培养和PCR检测法。下面M实施例详细U^本发明的技术内容。为了teTRBIV的LAMP检测方法，首先要选择TOB1V所具有的特异核昔lgff列，然后进行LAMP 弓嫩的设计和合成。史成银等(2007)研究表明TRBIV的主要衣壳蛋白基因(GenBank注册号为 AY590687)与其ft^I^病毒不同，可以作为TOBIV的特征核苷 列，用于TRBIV的鉴定和检测。在 确定主要衣壳蛋白基因作为TRBIV检测的特异核苷 列之后，就可以根据该基因的核苷S^列设计 LAMP扩增的引物。LAMP引物的设计首选软件PrimerExplore 4.0 (http:〃primerexplorer加 /elamp4.0.0/index.html)，也可以j顿常用的弓l物设计软件(如Primer Primier 5.0或Omiga2.0)按照LAMP 引物的设计要 行弓嫩设计。禾佣软件PrimerExplore 4.0在线设计的TRBIV主要衣壳蛋白基因的 LAMP引物如下FIP: 5，-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTnTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3， BIP: 5'-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3， F3: 5'-GTCACACCCGCAGACAAT陽3， B3: 5'-ACCTCGGACAGGGGATTG-3'。按照，弓胸序列进行LAMP弓l物的合成(可由商业的DNA合成公司合成，如上海生物工程公司)。合成制备TRBIV主要衣壳蛋白基因的LAMP扩增弓卿之后，就可以进行TRBIV的LAMP检测了。 其LAMP检测方、 跑括反应丰對反的制备、LAMP反应体系、LAMP反应禾im和扩增结果的判断。LAMP检测反iS^用的DAN t對反可以用常规的组织核,取方法制备，也可用商品化的组织DAN 提取试剂盒制备。本发明中采用天根生化科技有限公司(TIANGEN)组织基因组DNA提取试剂盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)进行样品DAN的提取和纯化，制备LAMP反应DNA模板的详细操作 歩S聚参见该试剂盒的J顿说明书。制备LAMP反应DNA丰對及后，即可进行顶BIV的LAMP反应检测，为此，首先要配制出具有最 佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP反应中的引物、dNTTP和Betaine (甜菊减)的 浓度均做了优化，它们的最佳浓度分别是弓嫩FIP和B1P各1.6 pM，弓胸F3和B3各0.2 一，四禾中dNTP 各1.4mM， BetainelM。最终确定的反应体系为引物FIP和BIP各1.6^M，弓|物F3禾Q B3各0.2 ^M， dNTP 1.4mM， MgCI2 8 mM， Betaine (甜熟减)1 M， Tris-HCl 20 mM， KCI 10mM， MgS04 2 mM, 4 10mM， TritonX-1000.1%，待检样品DNA模板1 )iL， &f DNA聚合酶8U。按照i:^体系要求配制反 应混合物，混匀后，到无菌Eppendorf管中(规格为200pL)，然后加入双蒸7W吏各Eppendorf管中反 应体系的总^iRiifi」25 ^L。在反应禾辨中，扩徵鹏过高(如65。C) ^il低(如60。C)均不利于LAMP反应获得衝封戈果， 本发明J^共的弓鹏和細本发明确定的反应体系时，其扩i獸鹏为62 °d 。C，最佳的鹏ag为63°C。 另夕卜，反应时间对反应产物量也繊大影响，在反应时间少于45併中时，无7叙见测到反应产物，为保证 LAMP反应产^S够的产物便于观测，本发明中反应时间确定为1个小时。扩增反应结束时应在80 。C 保温5 6H中以灭活DNA聚合酶。所以，謝亍LAMP检测时，需将iiS含有反应体系的Eppendorf管放 A7K浴锅或金属浴中，63 。C保温1个小时，然后80 。C保温5 ^H中。LAMP反应结束后，即可在反应产物中加入核麟料謝亍检测结果的判断，本发明中〗顿的核麟 料为厦门百维信生物科技有限公司商品化生产的GeneFinder，。在反应产物中加入100倍稀释的 GeneFinder 2-，用卿青观察所测i對羊品的LAMP反应产物，如果显/i^絶贝'J悉亍该样品的大穀平红体病虫i^病毒检测结果为附性，如果显示橙黄色则标该样品的大穀移工体病虫:iB病毒检测结果为阴性。实施例1用LAMP方法检测鱼体内的TRBIV首先按照本发明^f共的LAMP弓嫩序列合鹏于TRBIV检测的LAMP弓,FIP、 BIP、 F3和B3 。 然后根据以下步3，行TTRBIV病毒的检测。(1) 制^t寺1t样品的LAMP反j3Ztlfc取待检鱼的脾脏组织0.5克，翻天根生化禾^1有限公司组织基因组DNA提取试剂盒(TTANamp Genomic DNAKit)进《3且织DNA的提取和纯化，制备LAMP反应的DNA丰鎌，具4權取和纯化步骤参见该试剂盒的操作说明书。(2) 配制LAMP反应体系!UO^制备的DNAt對及l(iL，加入到如下反应体系中-弓胸FIP和BIP各1.6pM，引物F3和B3 各0.2,， dNTP1.4mM， MgCl28mM， Betaine (甜熟咸)1 M， Tris-HCl 20 mM， KC110mM， MgS04 2mH(NH02SO410mM， TritonX-100 0.1%， 聚合酶8U;加入双蒸TK使反应体系的总体积龙到25)iL。(3) 按照如下反i^Mff进行LAMP反应 63 。C保温60併中，然后80 。C保温5併中。(4) 判断LAMP检测结果反应结束后，在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinder 2 ^，然后用目郞青观察被测样品的LAMP 反i^物，如果显示纟絶则恭示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表 示该样品的大穀转工体病虫I^病毒樹则结果为阴性。禾,J^方法已经完成了取自山东、辽宁、河北的36份大穀平样品的樹则，检测结果显示，凡^^2TRBIV的PCR检测方法确定为阳性的样品，LAMP检测方法均能检测到TRBIV的被；而其中两伤资 TRBIV的PCR检测方法确定为阴性的样品，用LAMP检测方法却检测出TRBIV的存在，后舰PCR 检测方法的循环数增加到40，从这两份样品中又检测到了 TTRBIV，这说明PCR检测方法可能会出现漏 检的情况，这也反映出该LAMP检测方法比PCR检测方法具有更高的灵每娘和可靠性。实施例2用于TRBIV检测的LAMP方法禾口 PCR方法的灵每娘测定及比较用TRBIV主要衣壳蛋白基因(MCP)特异的PCR弓l物(MCP-sense:5'-CACCATGTCTGCAATCTTA-GGT-3'和MCP-anti-sense primer: 5'-TTACAGGATAGGGAAGCCTGC-3')扩增TRBIV主要衣壳蛋白基因 的錄序列，并构建到载体pDEST32中，获得含有TRBIV MCP基因錄的质粒pDEST32-MCP，然后 测定质粒浓度并作10倍的梯度稀释。将±^稀释后的质粒用作LAMP反应的徵及分别謝亍扩增，用繊交电泳分析LAMP的反应产物， 结果显示本发明^f共的LAMP检测方法对TRBIV的检测极限为101个拷贝的病毒粒子。同时，将Jt^梯度稀释的质粒用作PCR反应的樹及，禾,大穀平TRBIV主要衣壳蛋白基因特异的 PCR弓l物(MCP-F: 5，-CGTGTTAAGATCCCCTCC-3，和MCP-R: 5，-TCTCGTAAATGAGTGACACC -3，)，按照如下反应，1^>别进行扩增94。C变性4min， 1个循环；94。C变性50s， 58。C退火50s， 72。C延伸lmin， 35个循环； 72。C延伸10min， 1个循环；然后在2X的琼腊糖綱交电泳上分析PCR产物，结果发现，PCR方法对TRBIV的检测柳艮仅仅为 lf个拷贝病毒粒子。可见，本发明所掛共的大穀平红体病虹笼病毒LAMP检测方法比目前用于该病毒检测的PCR方法 灵敏度高10倍。
权利要求
1.一种大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法，其特征在于它的方法包括以下两部分1).提供两对用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、46bp、18bp和18bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为FIP、BIP、F3和B3；上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下FIP5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3’BIP5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’F35’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’B35’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’2).提供一种大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物的颜色显示对检测结果进行判断。
2. 如权利要求书1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测 方法，其特征在于所述的LAMP反应体系引物FIP和BIP各1.6 pM， 弓i物F3和B3各0.21pM，dNTP1.4mM， MgCl2 8 mM, Betaine 1 M，Tris-HCl 20 mM, KC1 lOmM, MgS04 2 mM, (NH4)2S04 10 mM, Triton X-100 0.1% ， 待检样品DNA 1 |iL， 5WDNA聚合酶8U，该反应体系的总体积为25 pL。
3. 如权利要求书1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测 方法，其特征在于所述的LAMP反应程序63 。C保温60分钟，然后80 °C 保温5分钟。
4. 如权利要求书1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测 方法，其特征在于所述的LAMP检测结果判断方法LAMP反应结束后， 在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinderTM 2 |iL，然后在阳光下观察 被测样品LAMP反应产物的颜色，如果是绿色则表示该样品的大菱鲆红体 病虹彩病毒检测结果为阳性，如果是橙黄色则表示该样品的大菱鲆红体病 虹彩病毒检测结果为阴性。
全文摘要
本发明公开一种大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法。该方法包括两对用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测大菱鲆红体病病毒虹彩病毒的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出鱼苗、成鱼及饲料中的大菱鲆红体病虹彩病毒，非常适用于大菱鲆红体病虹彩病毒的流行情况调查。
文档编号C12Q1/70GK101245395SQ20081001515
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月13日 优先权日2008年3月13日
发明者史成银, 宋晓玲, 张庆利, 冰 杨, 倢 黄 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所