专利名称：：半滑舌鳎雌性特异分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于水产生物
技术领域：
中的鱼类分子标记和遗传性别鉴定技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。技术背景我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雄性比雌性生长快约40%以上，而牙鲆和半滑舌鳎等海水鱼类，雌性个体比雄性个体生长快40%-100%，因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。半滑舌鳎(Qv朋g/oMw化m"/aev^)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。尽管近2年来，半滑舌鳎人工育苗技术获得突破，年产半滑舌鳎苗种近百万尾，不过，研究表明半滑舌鳎雌性个体和雄性个体在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体大2-3倍(黄海水产研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性个体生长过慢，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定半滑舌鳎的遗传性别，严重影响了半滑舌鳎雌核发育和性别控制研究的进行。有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实验室的Deviin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲給鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaYl)大约2.6kb,另一个(CgaY2)458bp,这是首次从鯰鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到IO个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(ftn'Y425、ftn'Y382、feiY227)和一个X染色体连锁(ft]iX420)的AFLP标记。目前的研究还只是在某些鱼类找到少数雄性性别相关的分子标记，但还没有找到鱼类雌性性别特异的分子标记。而有关半滑舌鳎性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。
发明内容本发明的目的，是为了筛选出半滑舌鳎雌性特异分子标记，获得性别特异分子标记的序列，并在半滑舌鳎遗传性别鉴定中进行应用，为半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究提供分子标记和技术方法。本发明的技术方案如下研究一种半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选方法，包括半滑舌鳎基因组DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析，雌性特异分子标记的筛选，其特征是一、半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选，包括1、半滑舌鳎基因组DNA的提取；2、基因组DNA的AFLP分析；3、雌性特异分子标记的筛选；二、半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列，包括1、半滑舌鳎雌性特异分子标记的回收；2、雌性特异分子标记的克隆；3、雌性特异分子标记的序列；三、半滑舌鳎雌性特异分子标记的应用；包括该标记应用于无损伤鉴别半滑舌鳎的遗传性别，具体方法是采集待测半滑舌鳎鱼基因组DNA,根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，其引物序列分别为CseF136Nl(5，-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)禾口CseF136Cl(5，隱AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5,-CACAGCCAGGATGAGGAT-3')和CseF464Cl(5'隱TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3，)；CseF783Nl(5，-AGATTCAAGCATGACGGT-3，)禾口CseF783Cl(5'-GATTTTGGACAGAGGAGC-3，)；采用其中任意1对雌性特异引物进行PCR扩增，就可以对半滑舌鳎鱼进行遗传性别鉴定；当使用CseF136Nl和CseF136Cl引物时，从半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条84-94bp的特异DNA片^:的为遗传上的雌性个体；当^吏用CseF464Nl和CseF464Cl引物时，/人半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条306-316bp的特异DNA片段的为遗传上的雌性个体；当使用CseF783Nl和CseF83Cl引物时，从半滑舌鳎个体基因组MA中扩增出一条248-258bp的特异DNA片段的为遗传上的雌性个体。以下对本发明的技术方案作更进一步阐述一、半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选，包括1、半滑舌鳎基因组DNA的提取；2、基因组DNA的AFLP分析；3、雌性特异分子标记的筛选其中，1、半滑舌鳎基因组DNA的提取血液基因组DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液，在冰上静置后离心去除上层血浆，加4-6倍体积蒸馏水溶解血细胞沉淀，摇勾，静置，再离心，去上清；加4-6倍体积STE缓冲液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE緩沖液，消化过夜，直至沉淀物溶解为组织液；添加等体积饱和酚，抽^是一次；用与上述STE緩冲液体积相同的饱和酚氯仿异戊醇(25:24:l)混合液抽提一次；然后用与上述STE緩冲液体积相同的氯仿异戊醇(24:l)抽提一次；最后用2-3倍体积的无水乙醇沉淀簡A。于-20。C;^置20-30分钟后于12000rpm离心，去上清，收集DNA沉淀，经70。/。乙醇洗:条和自然干火喿后，用TE(lOmMTris-HCl，pH8.0，10mMEDTA)缓冲液溶解，将DNA保存在-20。C备用。鳍条基因组DNA的提取采集半滑舌鳎鳍条，采取高盐法提取基因组DNA。首先将固定于纯酒精中的鳍条置于1.5ml离心管中，剪碎后加入400fi1TENS裂解液和IOpl蛋白酶K(10mg/ml)，然后于55。C消化。消化完全后，加入140)!l饱和氯化钠，混匀，12000rpm/min4'C离心30min。耳又上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀，然后将絮状沉淀挑出后用70%的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE(10mMTris-HCl，pH8.G,10mMEDTA)溶解DNA为组织液；2、基因组DNA的AFLP分析基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA才莫板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。所述的对DNA模板进行酶切，其方法是先用商业来源的EcoRI/Msel酶混合物(LifeTechnologies/>司)(1.2511/^1)消讦t80-llOng才莫+反DNA4-6小时，用1°/。琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于7(TC孵育15分钟灭活限制性内切酶。所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.(^l接头混合物和0.5^1T4DNA连接酶，2(TC孵育12-20小时。所述的预扩增，其方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3，末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增。所述的选择性扩增其方法是将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板。用荧光标记的MseI引物和5coRI引物进行选4奪性PCR扩增，这两种引物3，末端带有三个选择性碱基。向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94。C变性3分钟后立即置于冰上待用。总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94。C变性后用6.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。所述的电泳分析，其方法是将变性好的扩增产物用5.5-6.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件电压1500V,功率40W，电流40mA,温度45。C,时间3.5小时。然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析。3、雌性特异分子标记的筛选采用商业来源的64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国LifeTechnologies公司)对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出2个引物组合产生了3条雌性特异的DNA标记，这些片段在雄性个体基因组掘A中不存在。其中商品名为M-CAA和E-ACT的引物组合扩增出一条雌性特异的DNA片段，长度为781-791bp,将此片段命名为CseF783;商品名为M-CTG和E-AGC的引物组合扩增出2条雌性特异DNA片段，一条为460-468bp，将此片段命名为CseF464;另一条为130-136bp的雌性特异DNA片段，将此片段命名为CseF136。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异顧A分子标记。二、半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列分析主要包括如下步骤1)半滑舌鳎雌性特异分子标记的回收；2)雌性特异分子标记的克隆；3)雌性特异分子标记的序列分析其中，1)、雌性特异AFLP片段的回收选取能扩增出130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特异AFLP标记的2个引物组合M-CTG和E-AGC以及M-CAA和E-ACT，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片分别切下含有130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。2)、AFLP片段的克隆将回收的上述3个雌性特异AFLP标记，克隆到商业上获得的pMD18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。3)、序列分析选取阳性克隆，采用ABI3730序列分析仪进行雌性特异DNA片段的序列分析，获得半滑舌鳎3个雌性特异分子标记的序列分别为CseF783ATTTb-ASAMTb丁GAG0AAcTA^cAAAGcTcAGG丁KAccJAGGTccTTAAccATGcGTcAGATGccAGGTcGTGAGATGAcGTcGGAAGTGGcGAAAcTTTcTGAccGAAAATGGAccTTcGGAGTAAGAGAcGATGATAAAAGcTGTcGAAGAGTATAcAGTTGGAAAcAGccTTGcAGTGGAGGAGAGGGGGAGAccAGTGGcAGAcGAAcTAGGccAGcTATcTGAAGAcccGGcTTGGcGTGTTTTAcAGAAccAcGcccAAGTTcGGTcccccTTcTGTTcTGTcGAAGGAAcAAGTccATcTTGTTGcTAGTAccGAGcGTGAcGAccAAAccAAccccGccccGTTTcGTAAcccGTGcGTTGTccTGcTAccAATAAcAATAAATAAAcAATGGTAcccTcTGGGcTTGGAGGAcGAcGTTGGTATTAcAATAcAAcAATcAAATAAGAGAcAGTGGGGAGccAccTAcATccGAGGAcGATAAAGGcTAccAcGcccAGGAGTGAAAAAGcccAGccAAcATAcccTTGTGAAAccTTATccGAccGGAccccAcTcCT)G€rcATccTTTTAcccccATGTTcAcc、hAGSGTA爪GwGGATMcTATAAGGGAATcATc^GcbAAVGcKAII-CseF464<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>结果表明这3个雌性特异标记的长度分别为134bp、468bp及791bp。利用DNAMANVersion4.0软件对5个不同个体的同一个标记的多个克隆子的序列进行比对，结果表明它们均为同一个序列。另外，对这3个标记的序列进行两两比对，发现并无同源性，表明它们为3个不同的序列。最后，利用BLASTn软件在GenBank数据库中对这3个标记进行同源性搜索，结果表明并无同源序列存在，说明这3个序列为半滑舌鳎的新序列。三、半滑舌鳎雌性特异分子标记的应用即该标记应用于无损伤鉴别半滑舌鳎的遗传性别，具体方法是采集待测半滑舌鳎鱼基因组顧A,根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，其引物序列分别为CseF136Nl(5'-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136Cl(5'-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT陽3，)禾BCseF464Cl(5，-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3,);CseF783Nl(5'-AGATTCAAGCATGACGGT-3，)和CseF783Cl(5，-GATTTTGGACAGAGGAGC國3，)；采用其中任意1对雌性特异引物进行PCR扩增，就可以对半滑舌鳎鱼进行遗传性别鉴定；当使用CseF136Nl和CseF136Cl引物时，从半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条84-94bp的特异顧A片段的为遗传上的雌性个体；当使用CseF464N1和CseF464C1引物时，从半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条306-316bp的特异謹A片段的为遗传上的雌性个体；当使用CseF783Nl和CseF783Cl引物时，,人半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条248-258bp的特异DNA片段的为遗传上的雌性个体。具体步骤是1、基因组DNA的提取；2、遗传性别鉴定PCR方法的建立(1).基因组DNA的提取釆集半滑舌鳎鱼苗或鳍条，采取高盐法提取基因组DNA。首先将固定于纯酒精中的鱼苗或鱼鳍条置于l.5ml离心管中，剪碎后加入400ju1TENS裂解液(lOmMTris-HC1，pH7.5，400nMNaCl，lOOmMEDTA,0.6%SDS10mMTris-HC1，PH7.5,400juMNaCl，100mMEDTA，0.6%SDS)和10lil蛋白酶K(10mg/ml)，然后至于55。C消化。消化完全后，加入140pl饱和氯化钠，混勻，12000rpm/min4。C离心30min。耳又上清加入两倍体积预冷的无7JC乙醇沉淀，然后将絮状沉淀挑出后用7oy。的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE(10mMTris—HCl，pH8.0，lOmMEDTA)〉容解DNA。(2)遗传性别鉴定PCR方法的建立根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异DNA标记的序列，分别设计3对特异引物，其引物序列分别为CseF136Nl(5'誦AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136Cl(5，-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT-3，)和CseF464Cl(5，-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3，)；CseF783Nl(5，隱AGATTCAAGCATGACGGT-3，)和CseF783Cl(5，-GATTTTGGACAGAGGAGC隱3，)；PCR反应体系为DNA模板100ng;上下游引物浓度均为0.4^M;dNTP浓度为0.2mM;lxPCRbuffer;MgCb浓度为1.5mM;7b《DNA聚合酶0.75unit;补充灭菌双蒸水至终体积为25^1。PCR反应程序为94。C预变性4min，之后94。C50s，退火(温度分别为57，56和52。C)50s，72。C延伸50s，30个循环；再于72。C延伸7min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用D2000marker作参照。CseF136Nl和CseF136Cl引物可以从雌性个体基因组中扩增出一条84-94bp的特异DNA片段，CseF464Nl禾HCseF464Cl引物可以从雌性个体基因组中扩增出一条306-316bp的特异DNA片段，而CseF783Nl和CseF783Cl引物可以从雌性个体基因组中扩增出248-258bp的特异DNA片段，而这些引物从雄性个体基因组中则不能扩增出这样的特异DNA片段。提取30个雌性个体和30个雄性个体的基因组DNA,用上述特异引物进行PCR扩增。如果某个个体产生了这样的特异DNA片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。本发明与已有技术对比其特点是本发明采用分子标记技术，以半滑舌鳎为材料首次筛选到雌性特异DNA分子标记，首次建立了我国养殖鱼类遗传性别鉴定的分子生物学技术。该技术具有准确、灵敏、可靠等优点，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类单性育种具有重要意义和应用价值。图1、半滑舌鳎3个雌性特异顧A标记的核苦酸序列；图2、半滑舌鳎雌性个体和雄性个体遗传性别鉴定结果。具体实施方式图1中，下划线"="表示AFLP引物序列；下划线"一"表示遗传性别鉴定PCR中所用的雌性特异弓I物的序列。图2中，A-1和A-2为采用CseF783Nl和CseF783Cl扩增的结果B-l和B-2为采用CseF464Nl和CseF464Cl扩增的结果；C-l和C-2为采用CseF136Nl和CseF136Cl扩增的结果。$表示雌性个体；(^表示雄性个体。本发明采用现代分子生物学技术，筛选出性别特异的分子标记，建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的分子技术，这对于培育半滑舌鳎全雌苗种，进行全雌苗种养殖，提高半滑舌鳎的养殖产量，提高养殖的经济效益，真正将半滑舌鳎开发为一个被广大养殖户接受的优良养殖品种，推动半滑舌鳎养殖产业的发展及海水鱼类养殖品种的更新换代，具有重要的现实意义和巨大的经济效益。对本发明的技术内容进行详细阐述实施方式举例一、半滑舌鳎雌性特异分子标记，包括1、半滑舌鳎基因组DNA的提取，2、基因组DNA的AFLP分析，3、雌性特异分子标记的筛选。其中，1、半滑舌鳎基因组DNA的提取血液基因组DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液200-400|J,取100-150|il血液于3500rpm离心15分钟，去除上层血浆后，加5倍体积蒸馏水(灭菌)溶解血细胞沉淀，摇匀，静置5-10分钟，再以3500rpm离心15分钟，去上清；力口5倍体积STE(O.lmol/LNaCl,1Ommol/LTris.Cl(pH8.0)，lmmol/LEDTA(pH8.0)),清洗沉淀2次；每次在U000rpm离心78分钟；去上清后加0.5mlSTE,10%SDS25-30^1，蛋白酶-K至终浓度100吗/ml，37。C消化过夜，直至沉淀物溶解为止；添加等体积饱和酚，倒转摇匀IO分钟，12000rpm离心5分钟，吸上层清液入另一1.5ml离心管；加等体积饱和酚氯仿异戊醇(25:24:1),倒转混匀IO分钟后于12000rpm离心5分钟，吸上层清液入另一1.5ml离心管，向上清液中加等体积氯仿异戊醇(24:1),倒转混匀IO分钟，于12000rpm离心5分钟，取上清入另一管；加1/12体积3M醋酸钠，混匀后再加3倍体积的4。C无水乙醇，轻柔振摇；可观察到白色絮状物出现(DNA),于-20。C放置20-30分钟后于12000rpm低温(4°C)离心10分钟，去上清，收集DNA沉淀，加lml70。/。乙醇洗涤，12000ipm低温(4°C)离心10分钟，去上清，重复l次；自然干燥后，用pH8.0TE溶解，保存在-2(TC备用。基因组DNA的浓度应不低于20ng/fxl,基因组DNA的纯度要求0026()/0028()值为1.8左右。鳍条基因组DNA的提取釆集半滑舌鳎鳍条，釆取高盐法提取基因组DNA。首先将固定于纯酒精中的鳍条置于1.5ml离心管中，剪碎后加入400jilTENS裂解液(lOmMTris-HCl,pH7.5,400^iMNaCU00mMEDTA,0.6%SDS10mMTris陽HCl,PH7.5,400fiMNaCl,100mMEDTA,0.6%SDS)和10(il蛋白酶K(10mg/ml)，然后至于55。C消化。消化完全后，加入140(al饱和氯化钠，混匀，12000rpm/min4°C离心30min。取上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀，然后将絮状沉淀挑出后用70。/。的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE(10mMTris-HCl,pH8.0,10mMEDTA)溶解DNA。2、基因组DNA的AFLP分析主要分为如下5步(1)、酶切用l.O(il5caRI/^feel酶混合物(1.25U/^)消化80-110ng模板DNA4-6小时，再用1%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于70。C孵育15分钟灭活限制性内切酶。(2)、连接向上面的酶切反应混合液中加入12.0jal接头混合物和0.5(^1T4DNA连接酶，2(TC孵育12-20小时，保证接头充分连接。(3)、预扩增将连接产物稀释10倍，作为预扩增的模板；预扩增引物是3，末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物。PCR反应条件为92-94。C，30秒；54-56°C，1分钟；70-72°C,1分钟。20个循环后，4。C待用。(4)、选择性扩增将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板。用含酶切位点MseI的引物和含酶切位点EcoRI的引物进行扩增，这两种引物3，末端带有三个选择性碱基。PCR反应分为三步第一步进行l个循环92-94°C,30秒；63-65°C,30秒；70-72°C,1分钟；第二步进行12个循环92-94°C,30秒；65-54°C,30秒；70-72°C,1分钟；第三步进行23个循环——92-94°C,30秒；54-56°C,30秒；70-72°C,1分钟。扩增产物加入适量的上样液，94。C变性3分钟，立即置于冰上。(5)、电泳分析将变性好的扩增产物用5.5-6.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件电压1500V,功率40W，电流40mA,温度45。C,时间3.5小时。总共用了64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP分析，用SAGA软件分析电泳图谱后，筛选出产生特异片段的引物组合2个，这2个引物组合共产生了3条雌性特异的DNA片段。3、雌性特异分子标记的筛选总共用64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国LifeTechnologies公司)对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，这64个引物组合的核苷酸序列见表1。表1:64个AFLP引物组合的核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>通过SAGA软件分析筛选出2个引物组合产生了3条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在其中商品名为M-CAA和E-ACT的引物组合Ml-El扩增出长度为781-791bp的雌性特异DNA片段；商品名为M-CTG和E-AGC的引物组合M2-E2扩增出2条雌性特异DNA片段，一条为460-468bp;另一条为130-136bp。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记。二、半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列它的技术内容包括1)半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异分子标记的序列1)、雌性特异AFLP标记的回收选取能扩增出130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特异分子标记的2个引物组合M-CTG和E-AGC以及M-CAA和E-ACT，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片分别切下含有130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。2)、AFLP标记的克隆将回收的上述3个雌性特异AFLP标记，克隆到商业上获得的pMD18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，釆用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。3)、雌性特异标记的序列选取阳性克隆，釆用ABI3730序列分析仪进行雌性特异DNA片段的序列分析，结果表明这3个雌性特异标记的长度分别为134bp、468bp及791bp(图子的序列进行比对，结果表明它们均为同一个序列。另外，对这3个标记的序列进行两两比对，发现并无同源性，表明它们为3个不同的序列。最后，利用BLASTn软件在GenBank数据库中对这3个标记进行同源性搜索，结果表明并无同源序列存在，说明这3个序列为半滑舌鳎的新序列。三、半滑舌鳎雌性特异分子标记的应用包括1、基因组DNA的提取；2、遗传性别鉴定的PCR方法的建立分述如下1.基因组DNA的提取釆集半滑舌鳎鱼苗或鳍条，采取高盐法提取基因组DNA。首先将固定于纯酒精中的鱼苗或鱼鳍条置于1.5ml离心管中，剪碎后加入400(^1TENS裂解液(10mMTris-HCl,pH7.5,400(^MNaCl,100mMEDTA,0.6%SDS10mMTris-HC1，PH7.5,400pMNaCU00mMEDTA,0.6%SDS)和10fJ蛋白酶K(10mg/ml),然后至于55。C消化。消化完全后，加入140pl饱和氯化钠，混匀，12000rpm/min4。C离心30min。取上清加入两倍体积预冷的无水乙醇沉淀，然后将絮状沉淀挑出后用70%的酒精洗涤两次，待酒精挥发干后，用TE(10mMTris-HCl,pH8.0,10mMEDTA)〉容解DNA。2.半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法的建立根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，其引物序列分别为CseF136Nl(5'-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136Cl(5'-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3，)；CseF464Nl(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT隱3，)禾口CseF464Cl(5'-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3，)；CseF783Nl(5，-AGATTCAAGCATGACGGT-3，)和CseF783Cl(5，-GATTTTGGACAGAGGAGC-3，)。PCR反应体系为DNA模板100ng;上下游引物浓度均为0.4(iM;dNTP浓度为0.2mM;lxPCRbuffer;MgCl2浓度为1.5mM;Ta《DNA聚合酶0.75unit;补充灭菌双蒸水至终体积为25|il。PCR反应程序为94"预变性4min，之后94。C50s，退火(温度分别为57，56和52。C)50s，72。C延伸50s，30个循环；再于72t:延伸7min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，使用D2000marker作参照。CseF136Nl和CseF136Cl引物可以从雌性个体基因组中扩增出一条84-94bp的特异DNA片段,CseF464Nl和CseF464Cl引物可以从雌性个体基因组中扩增出一条306-316bp的特异DNA片段，而CseF783Nl和CseF783Cl引物可以从雌性个体基因组中扩增出248-258bp的特异DNA片段，而这些引物从雄性个体基因组中则不能扩增出这样的特异DNA片段。提取30个雌性个体和30个雄性个体的基因组DNA，用上述特异引物进行PCR扩增。如果某个个体产生了这样的特异DNA片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。结果表明30个雌性个体都含有这样的雌性特异的DNA片段，而30个雄性个体都不含有这样的DNA片段(图2),由此，建立了半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法，该方法鉴定半滑舌鳎遗传性别的准确率为100%。序列表<110〉中国水产科学研究院黄海水产研究所<120>半滑舌鳎性别特异AFLP标记序列<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>791、468、134<212>DNA<213>半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)<400>1gactgcgtaccaattcactgtctgatgacacaggatacgtctgcacgcagtttagagtgc60tggaccgtagacatgccaactacacttcaaattgtgaatgaggcttccaggtaaaatgca120cagttctttcaaagctggtgaaggctacaataggtttgatcatatgagaagcttgtcgag180aaaatagtagcagagattcaagcatgacggtgacacagagtggggagaggaggtgactgt240tccgaccaatgacattttgtgcggttctggccacagaatgtctattcgacctggacaaaa300ggaagctgttcttgtcttcgctccctggctttgatacaactctgctccaaccaaacacag360cagtgctgagccatgtattctgttgttctactctgagttcactgttgcgtgctcacagaa420tgcaatttgctcctctgtccaaaatctggtcttccctattgtgttataactaaataaata480actaataactcataactaaattataactaatcaacataacattatggttgcagcagtgat540gtgttctgattatgcagtgagccttttacattcaacatcactgaggggtgacatgtagca600cgacacacgaaaaagttgatggttacacctgcaaacacattcgcgtaaaatgaagcactt660attctgtgacacaaagtgttccgtgccacatactaaaatcatggtgtaattatcaggtgc720accattttcctctcctctcacaggc3C3cacatcccacte敏gcc3c吗acttgttect"780caggactcatc791gactgcgtaccaattcagctggcaccttatagcggcagaacagggacgcaaacccaccac60aacaacacagccaggatgaggatcaaagtcagttacaggcggagcgacaacaatgggtct120acaccactgaatgaactcaatactccaaactcccaaacttatetaggtcagcgctgcacc180tctagacttatcccactcttttccctgccatctgattcctttgttgttgtgggtgctgat240gtaacggactgtaactttgccaggtaaccaggtagttgaagtggtgttgcagataaggca300aa昭tagaactectcatascttegccactg肌acc3a昭3ga昭cattgcataaaaattc360tccgttttccaactgacaatgtgatagaccctgaaaaacacaaacaacaacaacaacaac420tgcaa犯acaagtcagagttaaaatatttcagttactcaggactcatc468gactgcgtaccaattcagctaagtaacgacacgaaggggtggagacctagttagtgcctt60ctacccgggcttttgcattagctgtttttctatcacatttcactcggtttttcatcagtt120actcaggactcatc13权利要求1.一种半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选方法，包括半滑舌鳎基因组DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析，雌性特异分子标记的筛选，其特征是1)、半滑舌鳎基因组DNA的提取血液基因组DNA的提取抽取半滑舌鳎鱼血液经离心去除上层血浆，溶解血细胞沉淀，去除上清液，清洗沉淀，用含蛋白酶-K的STE缓冲液消化血细胞直至沉淀物溶解为组织液；再依序经饱和酚抽提；饱和酚、氯仿和异戊醇混合液抽提；以及氯仿和异戊醇混合液抽提；无水乙醇沉淀DNA；离心，去除上清液，收集DNA沉淀，经70％乙醇洗涤和自然干燥，用TE缓冲液溶解DNA沉淀，将DNA保存在-20℃备用；鳍条基因组DNA的提取采集半滑舌鳎鱼鳍条，经剪碎后用含蛋白酶-K的TENS裂解液消化，高盐法提取基因组DNA，收集DNA沉淀，经70％乙醇洗涤和自然干燥，用TE缓冲液溶解DNA沉淀，将DNA保存在-20℃备用；2)、基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对DNA模板进行酶切；第二步是将特异接头连接到酶切片段上；第三步是进行预扩增；第四步是进行选择性扩增；第五步是电泳分析；所述的对DNA模板进行酶切的方法是先用EcoRI/MseI酶混合物消化80-110ng模板DNA4-6小时，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶；所述的特异接头连接到酶切片段上的方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μlT4DNA连接酶，20℃孵育12-20小时；所述的预扩增的方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个A或者C的选择性碱基的引物混合物，进行PCR预扩增；所述的选择性扩增的方法是将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的MseI引物和EcoRI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94℃变性3分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；所述的电泳分析的方法是将变性好的扩增产物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；3)、雌性特异分子标记的筛选用从商业公司购买的8个M序列和8个E序列AFLP引物，形成64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，其中2个引物组合产生了3条雌性特异的DNA片段，这些DNA片段在雄性个体基因组中不存在其中，序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’的引物组合M-CAA和E-ACT扩增出1条长度为781-791bp的雌性特异DNA片段；序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCAGC-3’的引物组合M-CTG和E-AGC扩增出2条雌性特异DNA片段，一条为460-468bp，另一条为130-136bp；将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的DNA片段作为雌性特异分子标记。2)、基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤第一步对顧A模板进行酶切；第二步是将特异接头连接到酶切片段上；第三步是进行预扩增；第四步是进行选择性扩增；第五步是电泳分析；所述的对DNA模板进行酶切的方法是先用EcoRI/Msel酶混合物消化80-110ng模板DNA4-6小时，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的顧A溶液置于7(TC孵育15分钟灭活限制性内切酶；所述的特异接头连接到酶切片段上的方法是向上面的酶切反应混合液中加入12.0pl接头混合物和0.5(ilT4DNA连4妻酶，20。C孵育12-20小时；所述的预扩增的方法是将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3，末端带有一个A或者C的选择性碱基的引物混合物，进行PCR预扩增；所述的选择性扩增的方法是将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的Msel引物和5coRI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3，末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94。C变性3分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选^t奪性扩增，获得的PCR产物经94。C变性后用6.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；所述的电泳分析的方法是将变性好的扩增产物用5.5-6.5%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件电压1500V,功率40W，电流40mA,温度45。C,时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；3)、雌性特异分子标记的筛选用从商业/>司购买的8个M序列和8个E序歹'JAFLP引物，形成64个引物组合对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，其中2个引物组合产生了3条雌性特异的DNA片段，这些DNA片段在雄性个体基因组中不存在其中，序列为5'-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3，和5'-GACTGCGTACCAATTCACT-3，的引物组合M-CAA和E-ACT扩增出1条长度为781-791bp的雌性特异DNA片段；序列为5'-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3，和5'隱GACTGCGTACCAATTCAGC-3，的引物组合M-CTG和E-AGC扩增出2条雌性特异DNA片段，一条为460-468bp,另一条为130-136bp;将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的DNA片段作为雌性特异分子标记。2、一种半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列，其特征在于包括如下三个方面1)雌性特异分子标记的回收；2)雌性特异分子标记的克隆；3)雌性特异分子标记的序列；其中1)、雌性特异分子标记的回收选取能扩增出130-136bp、460-464bp和780-783bp雌性特异分子标记的2个引物组合M-CTG和E-AGC以及M-CAA和E-ACT,进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片分别切下含有130-136bp、460-468bp和781-791bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用；2)、雌性特异分子标记的克隆将回收的雌性特异分子标记，克隆到pMD18-T载体中，采用标准的方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆；3)、雌性特异分子标记的序列选取阳性克隆，用DNA测序仪进行序列分析，获得半滑舌鳎3个雌性特异分子标记的序列分别为CseF783<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>CseF464CseF136AGTTACTCAGGACTCATC3.—种雌性特异分子标记的应用，其特征是该标记应用于无损伤鉴别半滑舌鳎的遗传性别，具体方法是采集待测半滑舌鳎鱼基因组DNA,根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，其引物序列分别为CseF136Nl(5'-AAGTAACGACACGAAGGG-3，)和CseF136C1(5'-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3');CseF464N1(5，-CACAGCCAGGATGAGGAT陽3，)和CseF464C1(5'-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3');CseF783Nl(5'國AGATTCAAGCATGACGGT-3，)禾口CseF783Cl(5'-GATTTTGGACAGAGGAGC-3，)；采用其中任意1对雌性特异引物进行PCR扩增，就可以对半滑舌鳎鱼进行遗传性别鉴定；当使用CseF136Nl和CseF136Cl引物时，从半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条84-94bp的特异DNA片段的为遗传上的雌性个体；当使用CseF464Nl和CseF464Cl引物时，从半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条306-316bp的特异DNA片段的为遗传上的雌性个体；当使用CseF783Nl和CseF783Cl引物时，从半滑舌鳎个体基因组DNA中扩增出一条248-258bp的特异DNA片段的为遗传上的雌性个体。ccAAAccAGGGAcAAGAPwGGAGT「AG斑緣TAcwcGGATcGAcTAccGcGTcAGAcGTcGAAGAGAAAccAcccAGGAcTGAcTTATGAGAcTGAAcAAAAAcGTcAAcAATc全文摘要一种半滑舌鳎雌性特异分子标记及其应用，包括筛选方法，含半滑舌鳎基因组DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析和雌性特异分子标记的筛选；还包括半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列，含雌性特异分子标记的回收，雌性特异分子标记的克隆和雌性特异分子标记的序列；再包括一种雌性特异分子标记的应用，应用于无损伤鉴别半滑舌鳎的遗传性别，即采集待测半滑舌鳎鱼基因组DNA，根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，采用其中任意1对雌性特异引物进行PCR扩增，就可以对半滑舌鳎鱼进行遗传性别鉴定。具有先进、高效、准确、可靠的特点，在半滑舌鳎单性苗种生产中具有重要应用价值，并在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。文档编号C12N15/10GK101270389SQ20081001598公开日2008年9月24日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者静李,沙珍霞,田永胜,邓思平,陈松林,马洪雨申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所