专利名称：一种体外扩增自然杀伤细胞的方法
技术领域：
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增人或 动物外周血自然杀伤细胞的方法。
背景技术：
自然杀伤细胞(natural killer cells, NK细胞)是一类不依赖于抗原刺 激，能够自发地溶解多种肿瘤细胞和被病毒感染细胞的一类淋巴细胞，其细胞 表面的标志分子是CD3—， CD56+。 NK细胞存在于外周血和脾脏中，在外周血中占 淋巴细胞的15%-20% 。 NK细胞具有抗肿瘤、抗感染和免疫调节等作用，是机体 免疫监视的第一道防线，对机体抵抗肿瘤和感染具有重要作用。研究NK细胞迅 速扩增的方法，是临床免疫学实践应用十分重要的课题。由于外周血中NK细胞 含量不高，要获得大量高纯度的NK细胞是困难的。虽然已有的技术通过免疫磁 珠或流式细胞术分选能够获得高纯度的NK细胞，但要获得一定的数量则需要大 量的血液和抗体，这无疑会增加获得NK细胞的成本；现有的方法通过使用IL-2 等淋巴因子能够在体外诱导NK细胞增殖，产生淋巴因子激活的杀伤细胞
(lymphokine activated killer cells, LAK细胞)，但这种方法也会同时扩增 其他的淋巴细胞，LAK细胞中自然杀伤细胞的比例仍处于较低的水平。经广泛査 阅国内外专利文献和各种出版物，迄今为止，均未见有实用、高效的体外大量 优势扩增NK细胞方法的发明和报道。因此发明一种实用、高效、快速体外大量 优势扩增人外周血NK细胞的方法，用于对自然杀伤细胞的免疫功能机制的实验 研究，以及用于临床提高人、动物免疫调节力，抵抗肿瘤、抗感染是非常重要 的；对于攻克人类长期渴望解决的恶性肿瘤疾病的难题是十分有价值的。
发明内容
本发明目的在于提供一种实用有效的体外大量扩增自然杀伤细胞(NK细 胞)的方法。
本发明体外扩增NK细胞的方法，包括以下步骤(1) 从人、动物外周血分离单个核细胞；
(2) 单个核细胞悬浮在含5% 15%自体血清的RPMI 1640培养液中，经有 效浓度为1 4 mmol/L的甲基-P -环糊精(M P CD)预处理36 60小时；
(3) 加入重组人白细胞介素2，在含5%新生牛血清与5%自体血清的RPMI 1640培养液中扩增培养10天以上。
单个核细胞采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心方法分离获得。 MP CD的最佳有效浓度为2 3 mmol/L。 重组人白细胞介素2有效浓度为20 50 U/ml。
在RPMI1640中添加25 mmol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 jig/ml链 霉素、50 U/ml青霉素。
单个核细胞在含有10%自体血清的RPMI 1640培养液中，经甲基-环糊 精预处理48小时；再加重组人白细胞介素2。
将上述处理的细胞在体外扩增10 13天。
狐细胞的比例检测采用流式细胞术，CD37CD56+的细胞即为NK细胞，NK细 胞扩增的绝对值通过计数扩增细胞总数结合流式细胞术检测NK细胞比例计算获 得。
本发明体外优势扩增NK细胞的方法，要点在于采用最佳的MPCD浓度预 处理单个核细胞。
脂筏(Lipid rafts)是指细胞膜上富含胆固醇和鞘酯的微区，浓集有GPI-连接的蛋白以及参与信号转导的信号分子，如LCK、 LAT、 Ras和G蛋白等。淋 巴细胞激活过程的早期，细胞膜上出现脂筏聚集或形成功能性脂筏，也是抗原 递呈细胞与T细胞相互接触时形成免疫突触的平台。在研究脂筏功能的实验中 通常用高浓度(10 15 nimol/L)的MeCD预处理细胞，可去除细胞膜胆固醇，以 干扰脂筏形成。本发明研究证明低浓度和高浓度的MP CD对细胞胆固醇的影响 明显不同。当细胞培养中有血清存在时，低浓度MgCD可作为胆固醇的穿梭载 体，加速游离胆固醇在细胞和脂蛋白之间的交换。我们发现用低浓度的 M3CD(l 4mmol/L)预处理人外周血单个核细胞能够明显地促进NK(CD37CD56+) 细胞的增殖，从而发明了体外大量优势扩增NK细胞的有效的方法。
本发明提出一种用低浓度的MP CD预处理外周血单个核细胞后加白细胞介素2培养优势扩增NK细胞的技术方法，实现了大量体外优势扩增NK细胞，为免疫， 学研究领域的实验研究人员对NK细胞的免疫功能机制的基础研究，以及及临床 应用提供了细胞基础，在抗肿瘤的生物治疗领域中具有重要的应用价值。 本发明体外扩增外周血NK细胞的方法，包括以下三个步骤 第一步从人、动物外周血分离单个核细胞；单个核细胞采用聚蔗糖-泛影 葡胺密度梯度离心方法分离获得。
第二步单个核细胞悬浮在含5°/。 15%自体血清的RPMI 1640培养液中， 经有效浓度为1 4 mmol/L的MP CD预处理36 60小时。过少使用自体血清或 用其他动物血清替代将不能达到理想效果；MP CD最佳有效浓度为2 3 mmol/L; 经MP CD预处理最佳时间为48小时。
第三步加入重组白细胞介素2，在含5。/。新生牛血清与5y。自体血清的RPMI 1640培养液中扩增培养10天以上。加入的重组人白细胞介素2有效浓度为20 50 U/ml;在RPMI1640中添加25 mmol/L HEPES、 2 mraol/L L-谷氨酰胺、50 pg/ml 链霉素、50U/ml青霉素。NK细胞在体外培养扩增时间一般为10 13天，少于 10天，则繁殖倍数低；至少10天以后才可检测到明显的自然杀伤细胞(NK细 胞)比例增加。延长培养时间能够获得更多的NK细胞数量，但是最长也不得高 于15天，高于15天，部分细胞衰老死亡，也会造成NK细胞增殖倍数低和绝对 数量减少。
NK细胞的比例检测采用流式细胞术，表面标志分子CD3—, CD56+的细胞为NK 细胞。NK细胞扩增的绝对值通过计数扩增细胞总数结合流式细胞术检测NK细胞 比例计算获得。
本发明中一般采用20 35岁年轻健康志愿者的外周血单个核细胞。 MeCD预处理48小时后再加rhlL-2。在诱导后的扩增阶段，细胞的分孔视细
胞长势而定， 一般于6 8天进行第一次分孔，随后间隔2 3天分孔，因此，每
次分孔均需补充rhlL-2。后续的培养所用的培养液可添加自体血清，也可用5%新
生牛与5%自体血清的混合成分。
本发明中，MPCD的浓度选择有一定的个体差异， 一般在l 4mmol/L的范
围内。对同一个个体而言，较低的浓度有利于细胞增殖，而较高的浓度则利于
获得更高的NK细胞比例。现代医学研究证明，NK细胞对于提高人、动物免疫调节力，抵抗肿瘤、抗 感染是非常重要的，但较为经济有效，快速大量体外扩增NK细胞，仍然是一个 难题。本发明通过低浓度MPCD预处理外周血单个核细胞后，再加入普通浓度 的白细胞介素2培养扩增一段时间，使NK细胞得以快速大量优势扩增，繁殖倍 数高达392 1752倍，取得了出人意料的效果。这种方法在国内外医学文献和 专利文件中尚未见报道。因此，本发明是在NK细胞研究领域中解决了如何即经 济便利，又能高效优势扩增NK细胞的技术难题的发明，为研究NK细胞的生物 学特性提供了一种获取细胞来源的方法，以及在肿瘤的生物治疗方面有重要的 应用前景。
本发明体外扩增自然杀伤细胞(NK细胞)的方法优点在于l.使用血样少、 试剂成本低；2.操作比较方便；3.扩增倍数高，能够在短期内将NK细胞扩增 392-1752倍；4.本发明方法可用于人和各种动物的NK细胞扩增。
图1不同浓度MeCD处理外周血单个核细胞对扩增细胞中NK细胞比例的 影响(『8);服细胞(CD37CD16+56+细胞)在MP CD处理组明显升高，并随浓度 增加而升高，特别浓度为3 mmol/L和4 mmol/L处理组可达到65%。.
图2流式细胞术检测MP CD (4 mmol/L)处理单个核细胞培养扩增10天 后淋巴细胞的表型。外周血单个核细胞用MgCD (4 mmol/L)处理48小时后再 加IL-2培养扩增10天，用流式细胞术检测分析扩增的淋巴细胞亚群的比例。左 图显示CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞分别为12%和18. 5% ;右图显示CD37CD16+56+ 细胞占有68.5%。
图3外周血单个核细胞经MP CD (2 mmol/L)处理后培养不同时间后NK 细胞扩增的数量。
具体实施例方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
本实施例包括以下步骤 ' 1.外周血单个核细胞(PBMC)的分离本例选择8例健康成年志愿者(20 35岁)，抽取外周血于肝素抗凝试管中，加等量培养液稀释，置于Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液上，常规密度梯度离心分离获取PBMC，洗涤2次后用含10%自体 血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为2X107ml。
2. M 3 CD的预处理及细胞扩增把PBMC悬液放入24孔培养板中，lml/孔； 加入MPCD (含lCm自体血清的RPMI1640配置)至终浓度0 4 mmol/L。另外设 立LAK细胞对照组(加rhlL-2 1000 U/ml)， 48 h后，分别加入rhlL-2 50 U/ 孔，37°C、 5%(:02温箱中培养。6 8天后分孔扩大培养，并补充含5y。NBS和59() 自体血清的RPMI 1640培养液及rhlL-2 50 U/孔。以后每隔2-3天根据细胞增 殖情况对细胞分孔培养，并补充上述培养液及rhIL-2。定期计数观察细胞增殖 情况；IO天时收集细胞进行细胞亚群。
3. 流式细胞仪分析取上述扩增10天后的细胞，置于流式测定管中，约l X107管。用染色缓冲液(PBS-5%NBS-0. l%NaN3) lml，离心1600 r/min， 5min， 离心后弃上清，使残留细胞悬液S50ul/管。加双荧光标记抗体 CD3-FITC/CD4-PE、 CD3-FITC/CD8-PE、 CD3-FITC/CD16+CD56-PE染色，置4°C30 min后，加染色缓冲液lml/管，离心洗两次；加固定剂(1%PFA-PBS) 400 y 1， 在流式细胞仪(FACSCalibur)上检测，数据文件用CellQuest软件或WinMDI 软件分析。
4. 结果
(1) 不同浓度M P CD处理的PBMC与LAK细胞增殖能力比较 PBMC加不同浓度MPCD (1画1/L 5廳1/L)培养，加rhIL-2 (50U/ml)
维持生长，1 mmol/L 3 mmol/L MPCD处理的PBMC均有明显增殖，4 mmol/L 浓度MP CD处理的PBMC也有增殖，但较前者弱，而4咖ol/L以上浓度MP CD 处理的PBMC均全部裂解死亡。于培养的10天及13天分别计数增殖的各组细胞， 观察增殖情况，结果2mmol/LM后CD浓度组PBMC增殖最快，第10天扩增31. 2 倍，第13天达182. 37倍；3咖ol/L MP CD浓度组与2咖ol/L MP CD浓度组相 似；4 mmol/L MP CD浓度组的PBMC增殖最慢，第10天扩增仅15倍，第13天 仅32倍；作为对照的LAK细胞扩增也只有51. 2倍；其它各组亦有不同倍数的 扩增。
(2) MeCD浓度对扩增细胞亚群的影响PBMC分别加rhIL-2( 1000 U/ml)、 M3CD (1腿ol/L 4 mmol/L)诱导培养扩增10天后收集细胞进行分型，结果 发现CD37CD56+细胞在M 3 CD处理组明显升高，在3 4 mmol/L组可达65%左右，各组均明显高于IL-2组和新鲜PBMC。在各MP CD处理组中，CD3—A:D56+细胞的 百分率随着MP CD浓度的增加而增加，CD3+T细胞则相反。
(3) 2 mmol/L MP CD处理组中CD37CD56+细胞的绝对扩增倍数 在实验的0、 8、 10及13天，用流式细胞术检测CD37CD56+细胞的比例， 同时用苔盼蓝染色计数活细胞的总数。结合二者结果计算出各个体CD37CD56+ 细胞的绝对扩增倍数。如表1所示，在8个个体中，CD37CD56+细胞的基数在5 25X 104。 8天后，各组细胞开始以指数方式扩增。但在8个个体中，扩增的倍 数变化很大，10天时扩增倍数为23 97，而至13天时则达392 1752倍。
权利要求
1.一种体外扩增自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤(1)从人、动物外周血分离单个核细胞；(2)单个核细胞悬浮在含5％～15％自体血清的RPMI 1640培养液中，经有效浓度为1～4mmol/L的甲基-β-环糊精预处理36～60小时；(3)加入重组白细胞介素2，在含5％新生牛血清与5％自体血清的RPMI 1640培养液中扩增培养10天以上。
2. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法单个核细胞采 用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心方法分离获得。
3. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法-环糊 精最佳浓度为2 3mmol/L。
4. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法重组白细胞介 素2有效浓度为20 50 U/ml。
5. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法在RPMI 1640 中添加25 mraol/L HEPES、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、50 pg/ml链霉素、 50 U/ml青霉素。
6. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法单个核细胞在 含有10y。自体血清的RPMI 1640培养液中，经甲基-e-环糊精预处理48 小时；再加重组白细胞介素2继续培养。
7. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法自然杀伤细胞 在体外扩增10 13天。
8. 根据权利要求1所述体外扩增自然杀伤细胞的方法自然杀伤细胞 的比例检测采用流式细胞术，CD3—/CD56+的为自然杀伤细胞，自然杀伤细 胞扩增的绝对值通过计数细胞总数结合流式细胞术检测自然杀伤细胞比 例计算获得。
全文摘要
本发明属于细胞免疫学技术领域，具体地说是一种体外大量优势扩增外周血自然杀伤细胞的方法。本发明包括以下步骤(1)从人、动物外周血分离单个核细胞；(2)单个核细胞悬浮在含5％～15％自体血清的RPMI 1640培养液中，经有效浓度为1～4mmol/L的甲基-β-环糊精预处理36～60小时；(3)加入重组白细胞介素2，在含5％新生牛血清与5％自体血清的RPMI 1640培养液中扩增培养10天以上。本发明的优点在于使用血样少、成本低；操作方便；扩增倍数高，能够在短期内将自然杀伤细胞扩增392-1752倍。
文档编号C12N5/06GK101314764SQ200810016899
公开日2008年12月3日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者吕合作, 李柏青 申请人:蚌埠医学院