专利名称：三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术的制作方法
技术领域：
本发明属于三疣梭子蟹微卫星DNA分子遗传标记技术，具体说是一种三疣 才炎子蟹ptssrl7孩i卫星DNA标记的冲全测技术。
技术背景本发明做出之前，国内外在其他蟹类中有相关的研究报道，Pamela C. Jensen等在对邓杰内斯蟹(^/7cer鹏^Wer)的研究中，设计了 99个孩吏卫星 引物，并对其中的9个进行了合成。在进一步的研究中，依据其扩增产物的多 态性情况、等位基因大小和是否易于计数等特点选取了 6个引物应用于进一步 的研究。利用尼龙膜杂交法，Masatsugu takhano等在锯缘青蟹(正蟮，Sc///a "rra&)中发现5个具有可变性的微卫星位点。David Gopurenko等在锯缘青 蟹(沙蟮，W"/Z7，0^3//7)的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规 方法，E. S Yap等在远海梭子蟹(A""/7i^ /7e/^/c^)中筛选到7个含有二 核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。0. Puebla等在蛛 雪蟹(C力/^7oece&s 中筛选出5个孩支卫星标记。H. S. AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(fr/oc力e/r ^// e/^h)基因组富集文库中筛选出9个 新的微卫星位点。B.貼nfling等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性 的微卫星位点。这些重要经济蟹类的微卫星DNA标记的开发，已应用于亲缘关 系鉴定、种群多样性研究中。目前在国内，除常玉梅等报道了中华绒螯蟹微卫星 DNA的筛选情况外，很少有蟹类微卫星方面的研究报道。至今为止，尚未见有 三疣梭子蟹微卫星DNA4企测技术方面的报道。4鼓卫星(microsatellites) 或称简单序歹寸重复(s imple sequence repeats ， SSR)是指由1~6个核苷酸组成的筒单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有 生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因 组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律 共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记， 并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质 鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。 发明内容本发明的目的是提出一种三疣梭子蟹ptssrl7微卫星DM标记的检测技术， 主要利用建立的三疣梭子蟹部分基因组文库中的ptssrl7的孩t卫星DNA序列， 使用Oligo (Version 6. 31)和Primer Premier (Version 5.00)软件在其核心 序列的两端设计相应的PCR引物，将引物序列合成后对三疣梭子蟹的个体进行 PCR检测，从而快速地检测三疣梭子蟹每个个体在此微卫星区的遗传变异，获 得该引物对三疣梭子蟹在p t s s r 17序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地 表现出每个个体的基因型。本发明的目的是通过以下技术方案实现的 一种三疣梭子蟹ptssrl7微卫星DNA标记的检测技术，其特征在于其技术操作程序为首先提取三疣梭子蟹 基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssrl7微卫星核 心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地 理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性 聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型， 从而获得三疣梭子蟹在ptssrl7核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。提取三疣梭子蟹基因组DNA，将其稀释为50ng/ jli 1,每个PCR反应中加入 2ja 1，反应总体积为25 m 1。ptssrl7微卫星核心序列的特异性引物序列分别为正链5，-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT—3，，负链3， —ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT—5' , 4吏用该 引物时的退火温度为54°C。PCR扩增的加样参数为每个PCR反应总体积为25 m 1,包括lOOng三疣梭 子蟹基因组DNA; 10X PCR Buffer, 2. 5jul; Mg + + 2. Ommol/L; Tag酶lu; dNTP各0. lmmol/L ;本发明的引物各0. 2 y mol/L;力a ddH20至25 n 1。使用该 引物时设置PCR仪的程序参数为94。C变性2min; 94°C40 sec, 54。Clmin, 72 °C， lmin， 25个循环；72。C延伸5 min, 4。CM呆存。PCR产物的检测将PCR产物在6°/。的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电 泳1 ~ 1. 5h进行分离。将胶板通过10°/。的水醋酸溶液20min —蒸馏水6min — 0. 1% 的硝酸银溶液25min-3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到三疣梭 子蟹在ptssrl7基因座位高度遗传变异的多态性图镨。应用该引物和所述的4支术方法，可以检测三疣4炎子蟹的每个个体在ptssr 17 微卫星核心区的遗传变异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图镨即可读出基因型，方 便、快捷、准确。其次，相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟 德尔遗传模式，呈共显性遗传，因此，可以区分个体是纯合子和杂合子状态。本发明适用于三疣梭子蟹群体遗传标记、系谱认证、遗传图谱构建等应用。 ptssrl7的PCR引物是本发明的核心，可在三疣梭子蟹总群检测中呈现高度遗 传变异的多态性。本发明技术具有以下优点(1)本发明可快捷的获得三疣梭子蟹的ptssrl7遗传标记基因座位呈现 高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出三疣梭子蟹 在此位点的每个个体的基因型；(2 )本发明主要应用于三疣梭子蟹群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱 的构建等。
图1本发明的ptssrl7引物对三疣梭子蟹20个个体的^全测图谱，编号1-20 是三疣梭子蟹的20个个体，M是DL2GG0标准分子量。
具体实施方式
下面通过实施例详细名又述本发明在三疣一麦子蟹ptssrl7孩史卫星核心序列 DNA分子遗传标记技术方法。首先提取三疣冲复子蟹基因组DNA并稀释备用；再4利用三疣梭子蟹基因组文库中的含有ptssrl7微卫星核心序列，在其序列两端 设计特异性引物；然后使用该51物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内 个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;险测； 利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得三疣梭子蟹在 ptssrl7核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
1、 三疣梭子蟹基因组DNA的提取取肌肉组织100mg,剪碎后iOv 1. 5ml 离心管中，加入pH8. 0的TE溶液(10mmol/L Tris-CI， 10画1/L EDTA ) 500 p 1,用研磨棒研磨。加入10 % SDS溶液25 ja 1 ，混匀。加入20mg/ml蛋白酶K 4jal，混勾，55。C消化2. 5 ~ 3h。重蒸酚i由^是两次，每次10min， 12000转/min 离心5min，耳又上清；酚氯仿(l: 1 )抽提一次，10min， 12000转/min离心 5min，取上清；氯仿抽提一次5min， 5000g离心5min,取上清。力口入1/25体 积的5mol/L NaCl溶液，混匀后再加入两倍体积的-20°C的无水乙醇沉淀DNA 15min;挑出的DNA,用70%的乙醇洗涤数十分钟，^f吏DNA干燥，用灭菌水500 M 1充分溶解后，定量将其稀释成50ng/ ja 1的浓度备用。
2、 微卫星引物的设计在三疣梭子蟹基因组文库基础上，利用微卫星DNA 两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度^f呆守性，在ptssrl7核心序列的 两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星DNA片段。由于微卫星核心 序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微 卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的主要依据。本发明的 ptssrl7微卫星核心序列区域两端的特异性引物序列为正链5，-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT-3，，负链3， -ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT-5，，使用该引 物时，其退火温度是54。C。
3、 PCR扩增
首先加样，加样量如下三疣^f麦子蟹基因组DNA (50ng/jjl) ， 2|il; 10X PCR Buffer, 2. 5jil; Mg + + (25mmol/L) , 2|il; Tag酶 (5u/y 1 ) ， 0.2 pl; dNTP (各2. 5mmol/L) ， 2 ju 1 ;本4支术的引物(各10Pmo1/ja 1) ， 2pl; 加灭菌水至25 iu 1。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为94。C变 性2min; 94。C40sec， 54。Clmin, 72。Clmin, 25个循环；72。C延伸5min， 4°C 保存。
4、 PCR产物的检测PCR反应结束后，将产物在8°/。的变性聚丙烯酰氨的凝 胶中进行电泳，电泳仪的功率为12瓦，电泳的时间在1 ~ 1. 5h左右，即可终止。 将胶板通过10%的水醋酸溶液20min —蒸馏水6min —0. 1%的硝酸银溶液25min —3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即得到如图l所示的多态性图谱。
权利要求
1、一种三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术，其特征在于其技术操作程序为首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr17微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr17核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
2、 按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssrl7微卫星DNA标记的4全测技术， 其特征在于提取三疣梭子蟹基因组DM,将其稀释为50ng/ m 1 ，每个PCR反应 中力口入2jul，反应总体积为25 ill 1。
3、 按照权利要求1所述的三疣梭子蟹pt ssr 17微卫星DNA标记的检测技术， 其特征在于其ptssrl7微卫星核心序列的特异性引物序列分别为正链5，-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT-3，，负《连3， -ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT-5'，使用该 引物时的退火温度为54°C。
4 、按照权利要求1所述的三疣梭子蟹pt s s r 17微卫星DNA标记的检测技术， 其特征在于其PCR扩增的加样参数为每个PCR反应总体积为25 ju 1,包括100ng 三疣一炎子蟹基因组DNA; 10X pcr Buffer, 2. 5 m 1; Mg + + 2. Ommol/L; Tag 酶lu; dNTP各0. lmmol/L ;本技术的引物各0. 2 jumol/L;加ddH20至25 jj 1; 使用该引物时设置PCR仪的程序参数为94 °C变性2min; 94 °C 40 sec, 54 °C 1 min, 72°C， lmin, 25个循环；72。C延伸5 min， 4。C保存。
5、按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssrl7微卫星DNA标记的检测技术， 其特征在于对PCR产物的检测将PCR产物在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W 恒功率电泳1 ~ 1. 5h进行分离；将胶板通过10°/。的冰醋酸溶液20min —蒸馏水 6min—0. 1%的硝酸4艮溶液25min—3%的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可 得到三疣梭子蟹在ptssrl7基因座位高度遗传变异的多态性图谱。
全文摘要
一种三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术，其特点是首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr17微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr17核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。可快捷的获得三疣梭子蟹的ptssr17遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出三疣梭子蟹在此位点的每个个体的基因型。主要应用于三疣梭子蟹群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
文档编号C12Q1/68GK101294217SQ200810017118
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者萍 刘, 宋来鹏, 健 李, 高保全 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所