专利名称：：一种遗骸核dna个体识别的新方法
技术领域：
：本发明涉及一种识别方法，特别是一种遗骸核DNA个体识别的新方法，该方法可以获得高质量的核DNA，解决了尸体毁损后遗骸的个体识别、性别鉴定、亲权鉴定，从而为司法侦破、审判、保险等提供科学依据。
背景技术：
：谋杀、碎尸、无名尸或火灾、爆炸、飞机坠毁等重大意外事故造成的多人遇难、尸体毁损，个人身体特征(面貌、指纹、衣着等)及身体软组织完全破坏，遗留物只有骨、牙等硬组织。传统的个体识别方法对碎尸、无名尸、白骨化等毁损尸体的认定多依靠残存皮纹、骨骼形态学等特征进行推断。虽然传统的方法能够提供信息，但不足以对碎尸、无名尸或火灾、爆炸、飞机坠毁等重大意外事故造成的多人遇难、尸体毁损进行完整的个体识别和分析。而这些事故的遗留物往往只有骨、牙等硬组织，很难通过传统的方法和遗传标记达到个体识别的目的。目前，针对人体硬组织的DNA提取方法，众多的实验室研究人员致力于最大程度提高DNA产量，同时将PCR反应抑制物降低到最小。常用的方法有有机溶剂法、盐析法、Chelex-lOO法及硅珠法。比较这些方法的提取、扩增效率和实际操作过程，硅珠法是简便、高效、低成本以及低污染的最佳选择。1、有机溶剂法通过酚-氯仿混合物萃取DNA溶液中的蛋白质类有机物质，而保留DNA于水相溶液中。适用所有生物检材，其提取DNA量比Chelex法和无机盐提取法多，且DNA分子结构完整，特别适合RFLP、测序等需要大分子DNA分析技术。1)所需试剂及仪器微型高速离心机速度15000r/min;37°C、56。C干热器96孔X4，可调温度5。C100。C±1°C;20ul、200ul、100ul微i移液器误差应少于lul;细胞溶解缓冲液(CLB):蔗糖、MgCl2、TritonX-100;蛋白溶解缓冲液(PLB):EDTANa，NaCl;氯仿异戊醇(24:1);饱和酚；蛋白酶K缓冲液蛋白酶K20mg/ml;70%酒精冷；无水乙醇冷；2)操作步骤參将lmlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入lml磷酸缓冲盐溶液(PBS)，混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37。C水浴温育lh。參将上述DNA提取液混悬白细胞，37。C水浴温育lh后，加入lmg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50'C水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。參反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿异戊醇(24:1)，上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。*加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗漆DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-2(TC冰箱保存备用。2、盐析法无机盐提取法是用醋酸钠通过盐析原理去除非核酸物质，主要用于血液与血痕、精液或精斑、毛发样本，其优点是提取DNA回收率高，DNA质量也好于Chelex-100方法。1)所需试剂及仪器微型高速离心机44孔，速度15000r/min;37°C、56。C干热器96孔X4，可调温度5°C100°C±1°C;20ul、200ul、100ul微量移液器:误差应少于lul;细胞溶解缓冲液(CLB):蔗糖、MgCl2、TritonX-100;蛋白溶解缓冲液(PLB):EDTANa，NaCl;20%SDS:SDS，H20;蛋白酶K缓冲液蛋白酶K20mg/ml;70%酒精:冷；无水乙醇冷；平衡盐缓冲液(ConditioningSalt);1XTE;2)操作步骤參吸取400ul细胞溶解缓冲液，加入100ul全血样本，加盖后，倒转混匀lmin。保证细胞溶解缓冲液与全血样本充分混合，使细胞膜完全破裂。參在微型高速离心机上1200r/min离心lmin，弃去上清液，收细胞核。參在漩涡振动器上，利用残留少许上清液，振动使细胞核团块(pellet)散开，成为悬浮液。參加入100ul蛋白溶解液，充分混合，在微型高速离心机上12000r/min离心lmin，弃去上清液，尽量用滤纸吸干残留的上清液。參快速加入事先已准备好的消化反应液(Mastermix)每个样本llOul在干热器上65-C，培养20min，其中每个隔10min镇摇一次，时间lmin。參在微型高速离心机离心10s，在干热器100。C培育，时间8min。參在微型高速离心机12000r/min离心2min。DNA存于上清液中，可直接用于PCR扩增反应。3、Chelex-100法Chelex-100是一种化学螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲合力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，DNA游离。Chelex-100特别适用于微量生物样本的处理，方法简便快速，提取过程始终在同一管中进行，不用转移，可减少DNA的损失，操作步骤简化，减少了污染的机会。1)所需试剂和仪器灭菌双蒸水；5%的Chelex-lOO溶；56'C水浴；2)操作步骤參取血液100-300ul，置1.5ml离心管中，加灭菌双蒸水lml，振荡混匀，室温30min，或置冰箱-20°C5min。)10000r/min离心5min，弃上清，反复2-3次。參于沉淀中加入2001悬浮好的5%的Chelex-lOO溶液，56。C水浴2h或37'C水浴过夜。參振荡5-10秒，置100。C5-10min，取出振荡溶液5-10s。10000r/min5min，上清液即可作为PCR反应的DNA模板。Chelex-lOO处理模板仅适用于PCR反应，处理液不宜长期保存，如果保存的时间稍长，可将上清液转移至另一管中保存备用。一般在一周内使用，如果保存时间过长则会影响PCR扩增结果。
发明内容针对法医学应用领域中常见的谋杀、碎尸、无名尸或火灾、爆炸、飞机坠毁的等重大意外事故造成的多人遇难、尸体毁损，个人身体特征(面容、指纹、衣着等)及身体软组织完全破坏，遗留物质只有骨、牙齿等硬组织，致使辨认困难的难题，本发明的目的在于，利用骨骼、牙齿基因组DNA与血液DNA遗传标记的一致性理论，及骨和牙组织核DNA的稳定性和高度的多态性，提出一种运用骨牙组织核DNA分型进行遗骸核DNA个体识别的新方法，为遗骸鉴定开辟了崭新的解决途径。为实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案一种遗骸核DNA个体识别的新方法，其特征在于，按以下步骤进行步骤一，样本制备1)骨用高压灭菌砂纸抹去骨骼表面0.5mm厚层，254nni紫外线照射1小时防止外源性DNA污染；然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥，将骨片放入盛有液氮的研钵中，用电钻钻取骨粉备用；2)牙254nm紫外线照射1小时，然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥；取牙根牙骨质及牙髓腔内壁的骨粉备用；步骤二，骨、牙齿组织DNA分离和纯化1)取骨粉或牙粉置于1.5ml的Eppendorf可调液移管中，加1.Oml0.5MNa2EDTAPH8.0，25ul蛋白酶K，将Eppendorf可调液移管置于旋转混摇器上，室温混摇24小时；2)将样品置于56'C干热器上，室温继续消化2小时；3)离心13000rpm，5分钟；4)取上清液700ul移至另一洁净的试管中，加等体积的6MGuSCN，20ul二氧化硅悬浮液，室温摇匀2小时；5)离心13000rpm，20秒，弃上清液保留硅珠；6)用70%乙醇在-20C条件下，洗涤硅珠两次，每次离心13000rpm，时间20秒，弃上清液保留硅珠；7)用丙酮在-20C条件下，洗涤硅珠一次。每次离心13000rpm，时间20秒，弃上清液保留硅珠；8)将样品置于56'C干热器上，IO分钟烘干硅珠；9)用65ul灭菌去离子水悬浮硅珠，56°C15分钟洗脱DNA，每5分钟振摇一次；10)离心13000rpm，2分钟，将60ulDNA溶液转移至新管中，-20。C保存备用；步骤三，采用Bio-RAD凝胶成像分析系统对所得的DNA进行定量分析。本发明利用异硫氰酸胍存在条件下，二氧化硅颗粒与核酸特异性结合的原理分离核酸。通过对脱钙时间、蛋白酶使用量、提取体系所用试剂、消化时间及提取步骤地逐一优化，该方法具有高效、快速、稳定特点。在核心步骤——蛋白消化，这一步骤中，采用EDTA和PK对骨粉进行脱钙和蛋白消化同时进行，最大程度减少DNA分子丢失。与此同时，在整个提取过程中，该方法操作步骤简便，易于掌握，无需大型和特殊的仪器设备。提取骨胳、牙齿DNA过程仅需一天的时间就可以完成，骨粉用量为0.25g，能够在1.5ML的管内操作，易于提取过程标准化和省时。该方法重现性好，对同一样本进行盲测检验，结果可以达到高度的一致性。具体实施方式为了更清楚地了解本发明，申请人给出以下实例对不同组织及不同方法进行比较，对本发明方法进行进一步详细说明。本发明的原理是利用在异硫氰酸胍存在条件下，二氧化硅悬浮液的微粒特异捕获有机质溶液中的DNA分子，而得以分离生物检材的DNA，A260/A280多数在1.61.8之间，获得高质量遗骸核DNA样本。1、主要配制试剂1)0.5MNa2EDTAPH8.0;2)ProteinaseK(20ug/ul);3)6MGuSCN10ml;4)二氧化硅悬浮液将二氧化硅12g置于100ml去离子水中，充分混匀置于100ml量筒内室温沉降24小时；取上层溶液85ml加去离子水100ml，充分混匀置于100ml量筒内室温沉降5小时；取上层溶液85ml加120ul10MHCL，充分混匀；分装、高压灭菌(120°C，20分钟)备用。5)70%乙醇(-20。C);6)丙酮(-20。C);7)去离子水。2、样本制备1)骨用高压灭菌砂纸抹去骨骼表面0.5腿厚层，254nm紫外线照射l小时防止外源性DNA污染；然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥。将骨片放入盛有液氮的研钵中，用电钻钻取骨粉备用；2)牙254nm紫外线照射1小时，然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥。取牙根牙骨质及牙髓腔内壁的骨粉备用。3、骨、牙齿组织DNA分离和纯化1)取骨粉O.25g(牙粉0.lg)置于1.5mlEppendorf管中，加1.Oml0.5MNa2EDTAPH8.0，25ulProteinaseK(20ug/ul)。将Eppendorf管置于旋转混摇器上，室温混摇24小时。2)将样品置于56t:干热器上，室温继续消化2小时；3)离心13000rpm，5分钟；4)取上清液700ul移至另一洁净的试管中，加等体积的6MGuSCN，20ul二氧化硅悬浮液，室温摇匀2小时。5)离心13000rpm，20秒，弃上清液保留硅珠。6)用70%乙醇(-20°C)洗涤硅珠两次。每次离心13000rpm，20秒，弃上清液保留硅珠。7)用丙酮(-2CTC)洗涤硅珠一次。每次离心13000rpm，20秒，弃上清液保留硅珠。8)将样品置于56t:干热器上，IO分钟烘干硅珠。9)用65ul灭菌去离子水悬浮硅珠，56°C15分钟洗脱DNA，每5分钟振摇一次。10)离心13000rpm，2分钟，将60ulDNA溶液转移至新管中，-20。C保存备用。4、DNA定量凝胶定量采用Bio-RAD凝胶成像分析系统对所得的DNA进行定量分析。本发明的方法可以成功提取遗骸核DNA，并进行后续的基因分型。在凶杀、碎尸、白骨化、大规模灾难性事故中达到同一认定的目的。从1996年至今，该方法成功鉴定实际案例200起，对案件的侦破起到关键的作用。如在2005年海啸中中国救援小组承担的亲缘鉴定和个体识别任务，2006年邱兴华特大凶杀案等案件的侦破中，均发挥了巨大作用，收到了显著社会效益，同时也为研究不同民族起源及生物考古等开辟了新途径。实施例l:利用本方法比较不同环境和保存时间的骨、牙核DNA提取和分型效率。进行5组86例260年人类遗骸样本核DNA的提取，利用PMLociKit进行五位点的同步扩增反向打点杂交DNA分型研究。表1遗骸样本保存情况及分组保存环境样本编号分组样本量保存时间(年)新鲜保存卜12112<10强碱煮沸13~44232<1045~6632210~2067~73420~45土埋保存74~86513>60结果显示不同处理保存状况遗骸的核DNA利用该方法可以得到良好的提取质量和分型效率。表2遗骸核DNA成功分型比例及DNA提取质量保存环境分组保存时间核DNA含量(M+/-SD)蛋白含量(M+/-SD)A260/A280(1.6~1.8)*基因分型成功率新鲜保存1<=10129.17(32.60)1.52(1.57)91.7%100%强碱煮沸2<=1061.00(26.00)0.87(0.93)51.4%65.7%310~2041.05(22.27)0.52(1.07)57.9%21.1%420~4531.43(10.29)1.52(0.95)28.6%0%土埋保存5>6072.69(6.97)1.10(0.99)46.2%100%实施例2:西安市碑林区分局提供1991年1月8日碑林区发生的一起碎尸案。经调查在此期间张某、蔡某之子失踪。经西安碑林区公安分局委托要求进行尸源个人识别。检材由于软组织完全腐败，因此送检碎尸残缺股骨一块，张某、蔡某静脉血各lmL采用EDTA抗凝。采用本方法进行骨骼核DNA提取，PMLociKit进行个体识别和基因分型。结果表3所示:表3遗骸样本保存情况及分组<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果显示PI总=6842229.54;RCP=99.99%。遗骸是张某、蔡某之子的概率为99.99%。权利要求1.一种遗骸核DNA个体识别方法，其特征在于，按以下步骤进行步骤一，样本制备1)骨用高压灭菌砂纸抹去骨骼表面0.5mm厚层，254nm紫外线照射1小时防止外源性DNA污染；然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥，将骨片放入盛有液氮的研钵中，用电钻钻取骨粉备用；2)牙254nm紫外线照射1小时，然后用冷的去离子水、乙醇、乙醚各振摇15分钟，取出干燥；取牙根牙骨质及牙髓腔内壁的骨粉备用；步骤二，骨、牙齿组织DNA分离和纯化1)取骨粉或牙粉置于1.5ml的Eppendorf可调液移管中，加1.0ml0.5MNa2EDTAPH8.0，25ul蛋白酶K，将Eppendorf可调液移管置于旋转混摇器上，室温混摇24小时；2)将样品置于56℃干热器上，室温继续消化2小时；3)离心13000rpm，5分钟；4)取上清液700ul移至另一洁净的试管中，加等体积的6MGuSCN，20ul二氧化硅悬浮液，室温摇匀2小时；5)离心13000rpm，20秒，弃上清液保留硅珠；6)用70％乙醇在-20℃条件下，洗涤硅珠两次，每次离心13000rpm，时间20秒，弃上清液保留硅珠；7)用丙酮在-20℃条件下，洗涤硅珠一次。每次离心13000rpm，时间20秒，弃上清液保留硅珠；8)将样品置于56℃干热器上，10分钟烘干硅珠；9)用65ul灭菌去离子水悬浮硅珠，56℃15分钟洗脱DNA，每5分钟振摇一次；10)离心13000rpm，2分钟，将60ulDNA溶液转移至新管中，-20℃保存备用；步骤三，采用Bio-RAD凝胶成像分析系统对所得的DNA进行定量分析。全文摘要本发明公开了一种遗骸(骨、牙)核DNA个体识别的新方法，其原理利用异硫氰酸胍存在的条件下，二氧化硅微粒与核DNA分子特异性的结合，同时用EDTA和PK对遗骸进行脱钙和蛋白消化，最大程度减少DNA分子丢失，达到最大效率分离核酸的目的。该方法和有机溶剂法、盐析法及Chelex-100法相比较，采用等量的骨粉，其DNA提取效率和质量高于以上方法。与此同时，在整个提取过程中，该方法操作步骤简便，易于掌握，无需大型和特殊的仪器设备。提取骨胳、牙齿DNA过程仅需一天的时间就可以完成，骨粉用量为0.25g，能够在1.5ML的管内操作，易于提取过程标准化和省时。该方法重现性好，对同一样本进行盲测检验，结果可以达到高度的一致性。文档编号C12Q1/68GK101225444SQ20081001740公开日2008年7月23日申请日期2008年1月25日优先权日2008年1月25日发明者巩五虎,娅托,李双顶,李生斌,郑海波申请人:西安交通大学