专利名称：：hBAFF的单链抗体scFv及其在生产BAFF人源性单克隆抗体中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体涉及hBAFF的单链抗体scFv，以及其在BAFF人源性单克隆抗体制备中的应用。技术背景免疫系统的紊乱是许多疾病的主要发病原因，针对免疫系统重要分子的抗体可有效干预病理性免疫过程，成为治疗性单抗开发中极为活跃的领域。人B淋巴细胞激活因子(hBAFF)是1999年新发现的一种与人体免疫调控密切相关的细胞因子，属肿瘤坏死因子(TNF)超家族。作为B淋巴细胞发育的正调节因子，hBAFF在体内具有促进B淋巴细胞的分化，存活的作用，而过多的hBAFF可导致B淋巴细胞的过度活化，促使机体产生大量抗核抗体、抗ds-DNA抗体和抗SSA抗体等，从而导致炎症反应，诱发自身免疫性疾病。因此设法阻断BAFF的生物学活性对于这些自身免疫性疾病的治疗意义重大。目前,阻断hBAFF生物学作用的制剂主要有hBAFF的可溶性受体(为可溶性受体sTACI与Fc的融合蛋白)和抗-hBAFF抗体两类。在人类，针对SLE,FDA已正式批准美国HGSI公司研制的抗-hBAFF抗体LymphoStat-B进入III期临床实验阶段，从I期临床试验数据来看，LymphoStat-B显著地降低了SLE病人体内产生抗核抗体的CD20+B细胞数目，极大改善了病人的病情，而且几无副作用，同时，LymphoStat-B针对RA的II期临床试验也在开展。自身免疫疾病的治疗至今缺乏理想的办法，环孢菌素A是目前广泛使用的免疫抑制剂，但它的副作用和并发症——肾脏毒性、高血压和高血脂症也让医患人员极为头疼，因此LymphoStat-B显示了良好的商业应用前景。但我国目前关于hBAFF人源性单抗制备还处于空白阶段。原核表达体系缺少糖基化修饰系统无法生产治疗性糖蛋白，而利用淋巴瘤融合生产的单克隆抗体又容易引起人的免疫反应，真核细胞中，中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvaryCell,CHO)是目前治疗性重组糖蛋白的首选体系，是美国FDA认可用于药品生产的表达体系之一。CHO细胞具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子，同时减少免疫交叉反应。目前已有越来越多的药物蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，其中部分药物已投放市场，例如EPO、G-CSF等。但真核基因表达的产量往往很低，外源基因在CHO细胞内的扩增是提高外源基因表达水平的重要策略之一。二氢叶酸还原酶基因(dhfr)扩增系统最常用。DHFR可被叶酸类似物氨甲喋吟(MTX)所抑制，不断提高MTX浓度，进行性选择抗氨甲喋吟的细胞系，结果会导致与dhfr联在一起的外源基因的共扩增，其拷贝数可增加几百到几千倍。
发明内容本发明的目的是提供一种hBAFF的单链抗体scFv,以及其在生产BAFF人源性单克隆抗体中的应用。一种hBAFF的单链抗体scFv，其特征在于，其序列如SEQIDNO.1所示。上述hBAFF的单链抗体scFv能应用于生产BAFF人源性单克隆抗体。所说的hBAFF的单链抗体scFv在生产BAFF人源性单克隆抗体中的应用，具体包括以下步骤1)BAFF人源性单克隆抗体真核表达载体的构建将hBAFF的单链抗体scFv和人IgGlFc(hinge+CH2+CH3)cDNA序列连接，合成scFv-Fc，所说的scFv-Fc的序列如SEQIDNO.3;禾U用引物延伸技术将鼠IgGK链信号肽与scFv-Fc结合，并将得到的序列酶切后转入pcDNA3.0真核表达载体，表达质粒命名为pcDNA3.0/scFv-Fc;2)抗hsBAFF全人源性基因工程抗体scFv-Fc的稳定表达采用中华仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO/dhfr)，脂质体法将表达质粒pcDNA3.0/scFv-Fc和标志质粒pSV-dhfr，共转染入CHO/dhfr细胞；先利用G418筛选转染成功的克隆，接着利用不含次黄嘌呤和胸腺喷啶(H.T.)的MEM选择培养液，筛选dhfr阳性细胞克隆株；之后氨甲喋吟(MTX)浓度梯度增高，加压扩增外源基因，提高scFv-Fc表达量，经过多轮加压培养，筛选到scFv-Fc稳定、高效表达的细胞株；3)scFv-Fc的表达纯化将得到的高表达细胞株转入无血清培养基培养生产scFv-Fc;收集上清、离心，ProteinA亲和层析纯化蛋白，再将收集的蛋白于4'C对纯水透析16h，过滤除菌后，。在本发明中，我们利用噬菌体展示技术从全人源性抗体文库中筛选到自主知识产权具有阻断hsBAFF生物学活性的单链抗体片断scFv，单链抗体虽然具有分子小、穿透力强等优点，但其亲和力弱，在体内半寿期短，效应功能差。因此通过基因工程技术将人抗体IgGl恒定区Fc结构域引入单链抗体，不仅可使单链抗体具有双价抗原结合位点，又可赋予单链抗体介导ADCC和CDC的效应功能，从而改善单链抗体的性能，Fc效应区的引入使得构建的基因工程抗体分子更接近于天然抗体分子的结构，Fc区能与ProteinA或者ProteinG结合，这也方便了抗体分子的分离纯化。本实验还采用鼠IgK链的信号肽序列，成功构建了真核表达载体pcDNA3.0/scFv-Fc，通过脂质体法将表达质粒pcDNA3.0/scFv-Fc和标志质粒pSV-dhfr，共转染入CHO/dhfr细胞。通过不断给药加压筛选scFv-Fc稳定、高效表达的细胞株，并且对表达产物进行纯化鉴定，为hsBAFF全人源性基因工程抗体scFv-Fc的规模化生产打下了基础。本发明采取哺乳动物细胞株表达系统，所表达的糖基化蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子，同时减少免疫交叉反应。并且采用MTX作用于dhfr的基因扩增系统，从而使转染基因得到非常高水平的扩增和表达，通过长时间筛选得到的细胞株在无血清培养基中成长可以方便地生产抗体，并且易于纯化。因此，本发明利用hBAFF的单链抗体scFv生产BAFF人源性单克隆抗体，具有稳定、高效的优点，且可以针对人类自身免疫性疾病(SLE，RA等)的临床诊断试剂和潜在治疗效果的基因工程药物。图l是载体构建示意2是SDS-PAGE和Westernblotting检测纯化后的蛋白纯度以及是否形成同源二聚体图3是通过ELISA法检测scFv-Fc识别抗原的特异性图4是通过ELISA法检测scFv-Fc与抗原结合的亲和效率图5是以BAFF阳性表达细胞K-562为靶细胞，乳酸脱氢酶释放法检测scFv-Fc介导的细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity)图6是流式细胞法(FACS)检测scFv-Fc与跨膜表达BAFF全长的人淋巴细胞的抄A5口PI图7是通过ELISA法检测scFv和scFv-Fc静脉注射小鼠后在血清中的耐受时间的比较图8是MTT法比较scFv-Fc体外抑制hBAFF对人外周血B淋巴细胞的增殖作用具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。以下实施例中，pcDNA3.0购自Invitrogene公司；中华仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO/dhfr)和质粒pSV-dhfr由南京川博生物技术有限公司胡云龙博士馈赠；所说的人IgGlFc(hinge十CH2+CH3)cDNA的序列如SEQIDNO.2。实施例一BAFF人源性单克隆抗体的生产、纯化及鉴定1.BAFF人源性单克隆抗体真核表达载体的构建载体的构建如图l所示，通过over-lapPCR技术将scFv和Fc的基因序列拼合；利用引物延伸PCR技术，通过三次PCR将鼠IgK信号肽连接在scFv-Fc序列的氨基端；再将目的基因与pcDNA3.0质粒分别用MmiIII和五coRV内切酶进行酶切；将酶切产物用T4连接酶连接，将构建好的质粒命名为pcDNA3.0/scFv-Fc。具体是1.1根据通过PhageDisplay技术筛选的hBAFF的单链抗体scFv和人IgGlFc(hinge十CH2+CH3)cDNA序列设计如下引物PscFvl:5，GCGGAGGTGCAGCTGGTG3，PscFv2:5，G3XMC4r7TG4GTGCGGCCGC3，PFcl:5，CCCA4J7Ur7Ur04CAAAACTCACAC3'PFc2:5，GAAGCTGATATCTTATTTACCCGGGGAC3'伸拼接技术合成scFv-Fc。1.2根据鼠IgGK链和scFv-Fc序列设计如下引物:IgK信号肽plgKl:IgK信号肽plgK2:IgK信号肽与scFv互补区域plgK3:5，7UGG7TCC4GGr7UC^C7GGr04CGCGGCGGAGGTGCAGCTGGTG3，其中plgKl，plgK2和plgK3斜体部分为信号肽，plgKl含由ff/MdIH酶切位点和Kozak序列，plgK3含由与scFv互补区域。利用引物延伸技术合成信号肽之后，通过重叠拼接技术将信号肽与scFv-Fc结合并将得到的序列酶切后转入pcDNA3.0真核表达载体，表达质粒命名为pcDNA3.0/scFv-Fc。2.抗hsBAFF全人源性基因工程抗体scFv-Fc的稳定表达采用中华仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO/dhfr)。脂质体法将表达质粒pcDNA3.0/scFv-Fc和标志质粒pSV-dhfr，共转染入CHO/dhfr细胞；先利用G418筛选转染成功的克隆，接着利用不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶(H.T.)的MEM选择培养液，筛选dhfr阳性细胞克隆株；ELISA检测选择高表达的细胞株，继续培养，放弃低表达的细胞株。等到转染细胞长满平板，l:6接种于新的细胞培养皿，在低浓度MTX(0.0005(iM)加压下，待抗性基因克隆形成，说明细胞内的dhfr基因已经得到了表达，等到细胞长满平板，按照1:6接种于新的细胞培养皿，提高MTX浓度(0.002pM)进行下一轮加压筛选，如此经过7轮筛选，直到MTX增加到20pM。获得scFv-Fc稳定、高效表达的细胞株。3.表达产物的纯化经过长时间筛选之后，将得到的高表达细胞株转入无血清培养基(CHO-S-SFMII)在微量控制摇瓶(spinnerflask)中生产scFv-Fc。约1L培养后的上清被收集后离心(13000rpm，4。C20min)以去除细胞碎片。用lMNaOH调节上清液，使得pH值在7.5左右；利用BiologicLP层析系统，上清液以0.5ml/min流速上样至结合缓冲液(1MTris-HCl，pH7.5)预平衡的rProteinASepharoseFastFlow亲和层析柱(0.8cm,2cm);用结合缓冲液以0.5ml/min流速冲洗，至流出液0028()值到达基线；收样留以电泳；用洗脱缓冲液(0.05MGly-HCl，pH3.0)以0.5ml/min流速洗脱抗体，至流出液OD2肌值到达基线，每1ml作为一管，分步收集；立即用0.5ml中和缓冲液(1MTris-HCl，pH8.8)为溶液中和收集到的抗体溶液；将收集的靶蛋白于4'C对纯水透析16h，过滤除菌，-70°<:分装冷冻保存。4.SDS-PAGE及westernblot鉴定将lOpl样品分别加入等量含或不含P-巯基乙醇的2x上样缓冲液，恒压100V进行12%SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色显带分析。同样的样品在12%SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜，5%脱脂奶粉封闭后，加HRP偶联的羊抗人IgGlFc，37°C孵育lh，TMB显色(具体参照Currentprotocolinimmunologyunit8.10).结果显示scFv-Fc在还原条件下分子量为55kDa左右，而在非还原条件下通过二硫键形成类似于天然抗体的二聚体(图.2)。5.纯化的scFv-Fc的生物学活性鉴定5.1.用0.02M，pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将牛血清白蛋白(BSA)、人诱导增殖配体胞外可溶区片断(hsAPRIL)、鼠B淋巴细胞激活因子胞外可溶区片断(msBAFF)和人B淋巴细胞激活因子胞外可溶区片(hsBAFF)蛋白系列稀释至10pg/ml、lng/ml、0.1pg/ml和0.05pg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100pl，每个样品重复三孔，4'C包被过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3mim用5%脱脂牛奶每孔加入200nl，37匸封闭2h;加入100pl1:1000稀释的HRP酶标记的羊抗人IgGlFc多克隆抗体，置37X:孵育1小时，然后洗涤；加入1:1000稀释的HRP酶标记的鼠抗His6tag的单抗(识别scFv)或者HRP酶标记的羊抗人IgGFc多克隆抗体(识别scFv-Fc和人IgGl)，置37'C孵育1小时，然后洗涤；于各反应孔中加入临时配制的OPD底物溶液100pi，室温反应20分钟；于各反应孔中加入2M硫酸50pi;在ELISA检测仪上490nm读数，以空白对照孔调零后测各孔OD值(图3)。结果显示，随着包被抗原hsBAFF浓度的升高，OD值剂量依赖性的增加，即使抗原浓度达到10吗/ml，scFv-Fc与BSA，hsAPRIL和msBAFF仍不能发生交叉反应。这些结果表明scFv-Fc具有特异性的抗原识别能力。5.2用碳酸盐包被缓冲液将hsBAFF蛋白稀释成两个系列系列1为固定hsBAFF蛋白浓度为10吗/ml，系列2为将hsBAFF蛋白梯度稀释至蛋白质含量分别为0.04|ag/ml、0.12fig/ml、0.4|ig/ml、1.2|ig/ml、3.6(ig/ml、11jag/ml、33|ig/ml、100pg/ml。与ELISA法检测scFv-Fc抗原识别特异性相同的步骤鉴定抗体的亲和效率。结果如图4A所示，随着scFv-Fc抗体浓度的梯度上升，OD值呈剂量依赖性的增加，但阴性对照抗体人IgGl浓度即使达到100ng/ml，hsBAFF与之反应也呈阴性；同时包被一系列抗原浓度，固定抗体浓度，结果如Fig.4B所示，随着hsBAFF浓度的梯度上升，OD值也剂量依赖性的增加，但浓度即使达到100ug/ml，hsBAFF与阴性对照抗体人IgGl的反应也呈阴性。这些数据表明相比于scFv单链抗体，scFv-Fc能够更好的识别hsBAFF抗原。5.3K-562人淋巴瘤细胞重悬于含10%小牛血清1640培养液中，调细胞浓度至lxl05/ml，即为备用的靶细胞。利用淋巴细胞分离液分离人外周血中的单核细胞作为效应细胞。将不同浓度效应细胞和靶细胞悬液各100pl加入96孔细胞培养板中，同时加入50pl不同浓度的scFv-Fc溶液，每份样本设3个重复孔,同时设靶细胞自然释放对照和最大释放对照，利用乳酸脱氢酶释放法，选择570nm在ELx800型酶标仪上测定光吸收」(absorbance)值，并计算杀伤效率。计算公式杀伤效率(％)=(实验组^值-自然释放对照X值)/(最大释放对照X值-自然释放对照^值)xlOO。结果如图5所示，重组融合蛋白scFv-Fc的Fc片断显示出了与天然抗体类似地由Fc片段所介导的抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependentcellularcytotoxicity)5.4将5xl05/mlK-562细胞用PBS清洗2遍后，加入2叱scFv-Fc孵育1小时，PBS洗涤2遍后加入FITC标记的羊抗人IgGFc单克隆抗体，通过流式细胞仪检测scFv-Fc与跨膜表达BAFF全长的人淋巴细胞的结合(图.6)。结果显示scFv-Fc可以与跨膜表达BAFF全长的人淋巴细胞的结合。5.5十六只雄性ICR小鼠分为两组，每组8只分别尾静脉注射scFv和scFv-Fc，分别于3、6、24、48和72小时釆取血样，通过上文描述的ELISA法检测scFv和scFv-Fc静脉注射小鼠后在血清中的耐受时间的比较(图7)。结果显示scFv在注射后24小时就无法在小鼠血清中被检测出，而scFv-Fc在注射后72小时仍然能够被检测到。此结果提示我们scFv-Fc大大延长了抗体在小鼠血清中的耐受时间。5.6利用淋巴细胞分离液分离人外周血淋巴细胞，之后用带有CD19抗体的磁珠分离B淋巴细胞，然后用含有10%小牛血清的RPMI1640稀释细胞到2xl05/ml制成细胞悬液。取细胞悬液加入96孔细胞培养板每孔100til，随后将细胞培养板放入37'C，含5%C02的细胞培养箱中适应性培养4h。将适应性培养4h之后的细胞分为9组，每组3孔，这8组的设置如下1对照组2hsBAFF(2吗/ml)组3anti-IgM(2昭/ml)组4hsBAFF(2昭/ml)十anti-IgM(2吗/ml)组5hsBAFF(2ng/ml)十anti-IgM(2fig/ml)+hlgG1(10pg/ml)组6hsBAFF(2昭/ml)+anti-IgM(2吗/ml)+scFv-Fc(0.5吗/ml)组7hsBAFF(2昭/ml)十anti-IgM(2昭/ml)+scFv-Fc(1pg/ml)组8hsBAFF(2昭/ml)+anti-IgM(2|ag/ml)+scFv-Fc(5吗/ml)组9hsBAFF(2pg/ml)十anti-IgM(2吗/ml)+scFv-Fc(10pg/ml)组将相应剂量的hsBAFF与抗体加入细胞培养板内，将细胞培养板放入37°C、含5%C02的细胞培养箱中培养72h之后，每孔加入5mg/mlMTT溶液10pl，然后37°C孵育4h，然后每孔加入DMSO100^溶解沉淀物。选择570nm在ELX800型酶标仪上测定光吸收」值。结果如图8，hsBAFF在anti-IgM协调作用下能够强烈刺激B淋巴细胞增殖，如果同时加入一系列梯度稀释的scFv-Fc后，B淋巴细胞增殖梯度依赖型的受到抑制，尤其scFv-Fc达到2pg/ml时候，抑制程度最高，而人IgGl浓度即使在10^g/ml也不能抑制B淋巴细胞增殖。SEQUENCELISTING〈110〉南京师范大学<120>hBAFF的单链抗体scFv及其在生产BAFF人源性单克隆抗体中的应用<160>3〈210>1〈211〉723〈212〉cDNA〈213〉人(Homo)〈400〉1gcggcgg鄉tgcagctggtggsgtctggggg鄉cttggtseagectggggggtccctg60agactctcctgtgeaggetctggattcaccttcagtagctatgetatgeactgggUcgc120caggctccaggaaaaggtctggagtgggtatcagctattggtactggtggtggcacatsc180tatgcag已ctccgtgaagggccgattcaccacctccagag8caatgcc犯gaattccttg240tgaacagectg卿gccgaggacacggccgtgtattactgtgcaagaaag300atttctgagcettggggecaaggtaccctggtcaccgtctcgagtggtgg鄉cggttca360ggcggaggtggetctggeggtagtgeaetttcttctgagctgactcaggaccctgctgtg420tctgtggccttgggac卿cagtcaggatcacatgcc犯ggag已cagcctcagaagctat■tstgc犯gctggtaccagcag卿ccaggacaggcccctgtacttgtcatctatggt犯已540aacaaccggccctcagggatcccagaccgattctctggctccagctcagg^3C8CagCt600tccttgaccatcactggggctc已ggcgg犯g3tg鄉ctgactattactgtaactcccgg660gacagcagtg已taaccatgtatteggeggagggaegetgaccgtcct鄉tgcggcc720get723〈210〉2〈211〉696〈212〉c腿<213〉人(Homo)〈400〉2cccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggg60ggaccgtcagtcttcctcttcccccca^a<cccaaggacaccctcatgatctcccggacc120cctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagecacgaagsccctg已ggtcaagttcaac180tggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgecaagacaaagccgcggg已ggagcagtac240已ccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggc300agtgca鄉tctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaa3acc3tc360tccaaagccaaagggcageeccgag犯ccacaggtgtacaccctgcccccatecegggag420gagaitgscc已agaaCCElggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgac480atcgccgtggagtggg卿gcaatgggcag已ctacaagaccacgcctccc540gtgctggactccgacggctccttcttcctctatagc犯gctcaccatgg已caagagcagg600<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1、一种人B淋巴细胞激活因子的单链抗体scFv，其特征在于，有SEQIDNO.1所示的序列。2、权利要求1所说的人B淋巴细胞激活因子的单链抗体scFv,生产BAFF人源性单克隆抗体中的应用。3、根据权利要求2所说的应用方法，其特征在于，包括以下步骤(1)BAFF人源性单克隆抗体真核表达载体的构建将hBAFF的单链抗体scFv和人IgGlFc(hinge+CH2+CH3)cDNA序列连接，合成scFv-Fc，所说的scFv-Fc的序列如SEQIDN0.3;利用引物延伸技术将鼠IgGk链信号肽与scFv-Fc结合，并将得到的序列酶切后转入pcDNA3.0真核表达载体，表达质粒命名为pcDNA3.0/scFv-Fc;(2)抗hsBAFF全人源性基因工程抗体scFv-Fc的稳定表达采用中华仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株CHO/dhfr，脂质体法将表达质粒pcDNA3.0/scFv-Fc和标志质粒pSV-dhfr，共转染入CHO/dhfr细胞；先利用G418筛选转染成功的克隆，接着利用不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶的MEM选择培养液，筛选dhfr阳性细胞克隆株；之后氨甲喋吟浓度梯度增高，加压扩增外源基因，提高scFv-Fc表达量，经过多轮加压培养，筛选到scFv-Fc稳定、高效表达的细胞株；(3)scFv-Fc的表达纯化将得到的高表达细胞株转入无血清培养基培养生产scFv-Fc;收集上清、离心，ProteinA亲和层析纯化蛋白，再将收集的蛋白于4'C对纯水透析16h，过滤除菌后，-701:分装冷冻保存。4、根据权利要求3所说的应用方法，其特征在于，所说的步骤(1)具体是根据单链抗体scFv和人IgGlFc(hinge+CH2+CH3)cDNA序列设计如下引物PscFvl:5，GCGGAGGTGCAGCTGGTG3，PscFv2:5，G7CMC47YT04GTGCGGCCGC3'PFc1:5，CCC7TT7Ur04CAAAACTCACAC3'PFc2:5，GAAGCTGATATCTTATTTACCCGGGGAC3'其中PscFv2和PFcl斜体部分为互补区域，PFc2含由^BL酶切位点，利用重叠延伸拼接技术合成scFv-Fc;根据鼠IgGk链和scFv-Fc序列设计如下引物KozakIgK信号肽plgKl:IgK信号肽plgK2::IgK信号肽与scFv互补区域plgK3:5，TGGG7TCC4GGr7TC爿CTGGr04CGCGGCGGAGGTGCAGCTGGTG3，其中pIgKl，plgK2和pIgK3斜体部分为信号肽，PlgKl含由历'MdIII酶切位点和Kozak序列，plgK3含由与scFv互补区域；利用引物延伸技术合成信号肽之后，通过重叠拼接技术将信号肽与scFv-Fc结合并将得到的序列酶切后转入pcDNA3.0真核表达载体，表达质粒命名为pcDNA3.0/scFv-Fc。全文摘要本发明涉及基因工程领域，具体涉及hBAFF的单链抗体scFv，以及其在BAFF人源性单克隆抗体制备中的应用。所说的hBAFF的单链抗体scFv，其序列如SEQIDNO.1所示。所说的hBAFF的单链抗体scFv能应用于生产BAFF人源性单克隆抗体。本发明利用hBAFF的单链抗体scFv生产BAFF人源性单克隆抗体，具有稳定、高效的优点，且可以针对人类自身免疫性疾病(SLE，RA等)的临床诊断试剂和潜在治疗效果的基因工程药物。文档编号C12N15/13GK101240024SQ200810018940公开日2008年8月13日申请日期2008年2月1日优先权日2008年2月1日发明者张双全,萌曹申请人:南京师范大学