专利名称：基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法
技术领域：
本发明涉及生化医药技术领域，特别涉及一种生物传感器的制备方法。
技术背景纳米生物技术把纳米材料科学、物理学与生物技术有机结合，在基因治疗、 生物医学、生物纳米结构的构建及生物大分子结构与功能关系的研究方面具有重 要作用。碳纳米管(CNT)作为近十多年来崛起的一种新型纳米碳材料，由于其独 特的物理化学性质，如低密度、高比模量、高强度、良好砝电导性和温度传导性 能等，现已成为纳米技术中最热门的研究对象之一。近年来,碳纳米管的生物学 效应引起了人们的极大兴趣，以生物学应用为目的的探索研究正在迅速增多，逐 渐成为一个新的研究热点。碳纳米管用于修饰电极可以降低化学物质氧化还原反 应的过电位，改善生物分子氧化还原可逆性，其大比表面积有利于酶的固定化， 提高酶分子的相对活性，还能促进酶活性中"与电^面的电子传递。碳纳米管 的这些特性对于提高生物检测的灵敏度和稳定性具有重大意义，为生物传感器领 域开辟了广阔的前景。碳纳米管具有巨大的比表面积，同时其缺陷部位带有众多活性基团，许多有 机分子、包括生物分子或无机分子可以共价或非共价地方式结合于碳纳米管的表 面，对碳纳米管进行表面修饰或功能化。功能化的碳纳米管可以获得原始状态的 碳管所没有的性质。然而由于在其毒性问题上存在的争议，碳纳米管在生物领域 中的应用受到了一定限制。而目前在化学、生物、医学等领域研究比较广泛和成 熟的金属纳米颗粒，例如金或《艮，和半导体纳米颗粒^f艮多都具有良好的生物相容 性。如纳米金作为最稳定的重金属纳米粒子之一，具有高电子密度、介电特性和 催化作用，能与多种大分子结合，且不影响其生物活性。纳米二氧化钬还是一种 光催化剂，具有高活性、高稳定性的特点。治疗癌症的关键在于有效地早期诊治。目前确诊恶性肺瘤最有效的手段是病理诊断，但准确性往往受限于操作医生的工作经^^,早期病变容易漏诊、误诊。 如何寻找一种真正能够早期发现肿瘤并将其消灭于萌芽状态的方法，显得尤其迫 切，这已成为当今广大医药工作者研究的热门课题。X线、B超、CT、 NMRI是临床 常用的检测技术，但是分辨率不够高。日益成熟的纳米技术给临床医学提供了耳 目一新的检测手段。然而，因其处于起步阶段，还存在开发费用昂贵、指标及应 用范围不明确、缺乏明确同一的标识分子等诸多问题，作为常规手段广泛应用于 临床受到了限制。发明内容针对现有技术存在的分辨率不够高、开发费用昂贵的缺点，本发明提出了 一种集合不同纳米材料的优点制成复合纳米颗粒，同时与碳纤维纸结合制成基于复合纳米界面的生物传感器，这种生物传感器具有高灵敏度，可广泛应用于 生物分子识别和癌细胞检测等生物医学领域。本发明提供了一种基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，第一步，用 溶胶凝皎法在碳纳米管上制备碳纳米管复合颗粒；第二步，将第一步制得的碳纳 米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯溶于溶剂l-曱基-2-吡咯烷酮中，其中碳 纳米管复合颗粒占碳纳米管复合颗粒、导电碳黑和聚偏氟乙烯总质量的80% ~ 95°/ ，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，干燥后取出并按长4厘米，宽l厘米 的规格切开，以方便实验使用，也可以是别规格，所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法中所述的碳纳米管复合 颗粒可以为二氧化钛-碳纳米管复合颗粒或金-碳纳米管复合颗粒。其中所述的碳 纳米管为单壁碳纳米管或多壁碳纳米管。本发明的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其中所述的二氧化钛 -碳纳米管复合颗粒^T以是通过将异丙氧化钛[Ti (OC3H7)4]和碳纳米管按10-40: 60~90的质量比分别溶解于2-丙醇中，也可以采用其他的醇溶液如乙醇、丙醇、 f醇，之后混合均匀，通过溶胶凝胶法在碳纳米管上生长二氧化钬，最后蒸发除 去溶剂得到二氧化钛-碳纳米管复合颗粒。所述的金-碳纳米管复合颗粒是将 0. 5 ~ 4mg的碳纳米管溶于质量百分数为0. 1 ~ 3. 0%的氯金酸水溶液中，超声^ 均匀，边搅拌边加热至沐腾，然后加入质量分数0. 5 ~ 3. 0%的柠檬酸钠溶液继续 加热至溶液颜色术再变化，最后蒸发除去溶剂得到金-碳纳米管复合籁粒。有益效果实验研究结果表明本发明制成的复合纳米颗粒性质优良，具有高 灵敏性和高选择性。将复合纳米颗粒修饰在碳纤维上的方法简单，便于操作，在 碳纤维纸表面形成了 一层均匀致密的纳米颗粒薄膜，由此得到的基于复合纳米界 面的生物传感器能显著提高生物分子的检测灵敏度，电化学探针铁氰化钟在此上 的响应可达到修饰复合颗粒之前碳纤维上所得电流的十多倍，同时这种生物传感 器可以快速灵敏地检测和区分敏感与耐药等不同种类癌细胞，有利于肿瘤的早期 诊断和早期治疗。我们通过接触角检测和电化学分析研究了白血病敏感和耐药癌细胞在此界 面上的行为。研究结果表明，该纳米生物传感器能敏感地区分和检测不同癌细胞 的亲疏水性，显著加速电子传递速率，提高相关纳米生物电化学传感器的检測灵 敏度。在覆盖有白血病等细胞的复合纳米颗粒界面上，铁氰化钾等探针的电化学 性质与癌细胞覆盖前相比有着明显差异，峰电流显著增加，并且不同癌细胞之间 也有区别，从而达到快速检测和识别敏感和耐药不同种类癌细胞的目的。
下面结合
本发明的实施例。本发明保护范围不以实施例为限。 图1是碳纤維纸修饰复合纳米颗粒前后的扫描电子显微镜(SEM)图。图2是电化学探针在新型生物传感器上的循坏伏安图和脉冲伏要图。图3是覆盖白血病细胞前后，水滴在复合纳米界面上接触角图像。图4是电化学探针在覆盖有K562敏感和耐药细胞的生物传感器上的循环伏安图。
具体实施方式
本实验的碳纳米管购自深圳纳米港有限公司，2-丙醇、导电碳黑、聚偏氟乙烯、1-甲基-2-吡咯烷酮、氯金酸购自Sigma-Aldrich公司。实施例1 一种基于复合纳米界面的生物传感器的制备将异丙氧化钛和碳纳米管按30: 70的质量比分别溶解于2-丙醇溶液中，在 磁力搅拌机以1250转/分钟的速度的剧烈搅拌下，将异丙氧化钛溶液以约1~2 滴/秒的速度滴加到碳纳米管溶液中，用稀硫酸调节溶液pH值为3.0,室温下反应2-3小时后将反应产物离心分离，用蒸镏水反复清洗，最后通过蒸发除去溶 剂得到二氧化钛-碳纳米管复合颗粒。将二氧化钬-碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯按质量比85: 10: 5溶于溶剂1-甲基-2-吡咯烷酮中，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，放入真 空干燥箱中在12(TC下干燥24小时后取出碳纤维纸，按使用要求的规格切开即 得到新型纳米生物传感器。用扫描电子显微镜(SEM)表征所得到的生物传感器，图1 (a)为所使用基底碳纤维纸的表征图，当覆盖上二氧化钛-碳纳米管复合颗粒后，碳纤维表面形成了一层均匀致密的纳米颗粒薄膜，表面形貌如图l(b),由于纳米粒子处在原子簇和宏观物体交界的过渡区域，是一种典型的介观系统，它具有表面效应、小尺寸效应和量子隧道效应等许多奇特性质，因此纳米粒子修饰的界面具有高灵敏性和高选择性。实施例2 —种基于复合纳米界面的生物传感器的制备将异丙氧化钛和碳纳米管按10 - 40: 60 ~90的质量比分别溶解于乙醇溶液 中，在磁力搅拌机剧烈搅拌下，将异丙氧化钛溶液以约1~2滴/秒的速度緩慢滴 加到碳纳米管溶液中，用稀石克酸调节溶液pH值为3,室温下反应2 ~ 3小时后将 反应产物离心分离，用蒸馏水反复清洗，最后通过蒸发除去溶剂得到二氧化钛-碳纳米管复合颗粒。这其中异丙氧化钛和碳纳米管的质量比可以是10: 90-40: 60中的任一数值比如10: 90、 13: 87、 60: 40等。其中异丙氧化钛和碳纳米管 也可以溶解于丙醇或者丁醇中。将占二氧化钬-碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯总质量80% ~95%的二氧化钛-碳纳米管复合颗粒和导电碳黑以及聚偏氟乙烯溶乎溶剂1-曱基-2-吡咯烷酮中，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，放入真空干燥箱中在120'C卞干燥24小时后取出碳纤维纸，按使用要求的规格切开即得到新型纳米生物传感器。其中二氧化钛-碳纳米管复合颗粒的质量占二氧化钬-碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯总质量80% ~95%，寸以是80%、 85%或95%等。实施例3—种基于复合纳米界面的生物传感器的制备将0. 5 ~ 4mg碳纳米管溶子含0. 1 ~ 3. 0wty。的氯金酸(HAuCl4)水溶液中，超 声5分钟4吏其^L均匀，用二次蒸馏水稀释至lOOmL,用磁力搅拌器边搅拌边加 热至沸腾。然后加入4mL柠檬酸钠溶液继续加热5 ~ 10分钟，溶液颜色由浅黄色变为红棕色，至溶液颜色不再变化时，蒸发除去溶剂得到金-碳纳米管复合颗粒。 其中碳纳米管可以为0. 5 ， 4mg中的任一数值，比如0. 5rag、 1. 3mg或4mg。氯金 酸为0. 1 ~ 3. 0wt %的任一数值，比如0. 1 % 、 2. 3 %或者3. 0 % 。碳纳米管和氯 金酸溶液可以以{壬<可比例相混合。将金-碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯按质量比80: 10: IO溶于溶剂1-曱基-2-吡咯烷酮中，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，放入真空千燥箱中在120'C下干燥24小时后取出碳纤维纸，按使用要求的规格切开即得到新型纳米生物传感器。实施例4 一种基于复合纳米界面的生物传感器的制备将lmg碳纳米管溶于含0. 5wt'/。氯金酸(HAuCl4)水溶液中，超声5分钟使其 分散均匀，用二次蒸馏水稀释至lOOmL，用磁力搅拌器边搅拌边加热至沸腾。然 后加入4mL柠檬酸钠溶液继续加热7分钟至溶液颜色不再变化，最后蒸发除去溶 剂得到金-碳纳米管复合颗粒。将金-碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯按质量比95: 2.5: 2.5 溶于溶剂1-甲基-2-吡咯烷酮中，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，放入真空 干燥箱中在120。C下干燥24小时后取出碳纤維纸，按使用要求的规格切开即得 到新型纳米生物传感器。实施例5 —种基于复合纳米界面的生物传感器的制备将lnig碳纳米管溶于含lwty。氯金酸(HAuCl4)水溶液中，超声5分钟使其分 散均匀，用二次蒸馏水稀释至lOOmL，用磁力搅拌器边搅拌边加热至沐腾。然后 加入4mL柠檬酸钠溶液继续加热10分钟至溶液颜色不再变化，最后蒸发除去溶 剂得到金-碳纳米管复合颗粒。将金-碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯按质量比85: 10: 5溶于溶剂l-曱基-2-吡咯烷酮中，将此混合物均匀涂抹在碳纤維纸上，放入真空千燥箱中在12(TC下干燥24小时后取出碳纤维纸，按使用要求的规格切开即得到新型纳米生物传感器。实施例6化学探针在本发明的基于复合纳米界面的生物传感器上的电化学响应采用三电极体系，以银丝为参比电极，铂丝为辅助电极，分别以修饰复合纳 米颗粒前后的碳纤维纸为工作电极，用电化学方法研究铁氰化钾在复合纳米界面 上的电化学性质，发现该界面能显著加速电子传递速率，提高检测灵敏度。图 2 (a)和(b)分别为铁氰化钾在新型生物传感器上的循坏伏安和脉沖伏安图，其中 曲线1为碳纤维纸的、曲线2为生物传感器的，从图中可以看出与碳纤维纸相比， 铁氰化钾在复合纳米颗粒界面上的峰电流明显增强，同时峰位差减小，具有更高 的氧化还原可逆性，表明这种新型生物传感器能有效促进电子传递，具有高灵敏 性和高选择性。实施例7复合纳米界面在覆盖K562细胞前后表面亲疏水性质 基于复合纳米颗粒界面的生物传感器由于表面一层纳米颗粒薄膜，是一极其 疏水的界面如图3 (a)，限制了化学探针与传感器表面的接触，在覆盖上一层K562 细胞后，界面变得十分亲水如图3(b)，化学探针与传感器的接触面积也大大增 加。实施例8在新型生物传感器上K562敏感和耐药细胞的检测和区别 本实施例中，分别将K562敏感细胞和K562耐药细胞低速以lOOOrpm的速度， 离心10分钟后，取底部细胞沉淀10叱均匀涂抹在复合纳米粒子修饰的界面上， 室温千后形成了一层细胞膜。采用三电极体系，以银丝为参比电极，柏丝为辅助 电极，分别以覆盖有K562敏感和耐药细胞前后的复合纳米颗粒界面为工作电极， 用电化学方法测得铁氰化钾在不同界面上的循坏伏安图即图4，其中线条a是未 覆盖细胞时铁氰化钾在新型生物传感器上的循环伏安图，线条b和c分别为覆盖 有K562耐药和敏感细胞后铁氰化钾的循坏伏安图。在覆盖有K562敏感和耐药细 胞的复合纳米颗粒界面上，由于覆盖前后界面性质发生了变化，铁氰化钾的电化 学性质与细胞覆盖前相比有着明显差异。从图中T以看出铁氰化钾的峰电流与未 覆盖细胞之前相比增大很多，并且不同细胞之间也有区别。K562耐药细胞，由 于其细胞表面P-糖蛋白(P-gp)的过度表达，与敏感细胞相比更容易吸附在疏 水界面上，从而阻碍了铁氰化钾的电子传递，因此峰电流比覆盖了 K562敏感细 胞后所得到的要小，由此就可以达到快速检测和识别敏感和耐药不同种类癌细胞 的目的，从而达到对肿瘤的早期诊断。
权利要求
1.一种基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其特征在于第一步，用溶胶凝胶法在碳纳米管上制备碳纳米管复合颗粒；第二步，将第一步制得的碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯溶于溶剂1-甲基-2-吡咯烷酮中，其中碳纳米管复合颗粒占碳纳米管复合颗粒、导电碳黑和聚偏氟乙烯总质量的80％～95％，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，干燥后即得到基于复合纳米界面的生物传感器。
2. 根据权利要求1所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其特征 在于第一步中制备的碳纳米管复合颗粒为二氧化钛-碳纳米管复合颗粒或金-碳纳米管复合颗粒。
3. 根据权利要求2所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其特征 在于碳纳米管为单壁碳纳米管或多壁碳纳米管。
4. 冲艮据权利要求2所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其特征 在于所述的二氧化钛-碳纳米管复合颗粒是通过将异丙氧化钛和碳纳米管按 10 - 40: 60 ~ 90质量比分别溶解于低级醇中，之后混合均匀，通过溶胶凝胶法 在碳纳米管上生长二氧化钛，最后蒸发除去溶剂得到二氧化钛-碳纳米管复合颗 粒的。
5. 根据权利要求4所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其特征 在于所述的醇溶液为2-丙醇、乙醇、丙醇、丁醇。
6. 根据4又利要求2所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，其特征 在于所述的金-碳纳米管复合颗粒是将0. 5 ~ 4mg的碳纳米管溶于质量百分数为 0, 1~3. 0%的氯金酸水溶液中，超声*均匀，边搅拌边加热至淬腾，然后加入 质量分数0. 5 ~ 3. 0%的柠檬酸钠溶液继续加热至溶液颜色不再变化为红棕色，最 后蒸发除去溶剂得到4r"碳纳米管复合颗粒。
全文摘要
本发明属于生物传感器领域，本发明提供了一种基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法，第一步，在用溶胶凝胶法在碳纳米管上制备碳纳米管复合颗粒；第二步，将第一步制得的碳纳米管复合颗粒、导电碳黑、聚偏氟乙烯溶于溶剂1-甲基-2-吡咯烷酮中，其中碳纳米管复合颗粒占碳纳米管复合颗粒、导电碳黑和聚偏氟乙烯总质量的80％以上，将此混合物均匀涂抹在碳纤维纸上，干燥后取出并按需要切开，以方便实验使用，也可以是别规格。所述的基于复合纳米界面的生物传感器的制备方法中所述的碳纳米管复合颗粒可以为二氧化钛-碳纳米管复合颗粒或金-碳纳米管复合颗粒。其中所述的碳纳米管为单壁碳纳米管或多壁碳纳米管。这种生物传感器灵敏度高。
文档编号C12Q1/00GK101261267SQ200810023890
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月18日 优先权日2008年4月18日
发明者刘善京, 晖 姜, 朴秀吉, 琴 沈, 王雪梅, 郭大东, 陈宝安 申请人:东南大学