专利名称：Hla-dqb1基因分型dna微阵列芯片试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片试剂盒，
该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原DQB1 (HLA-DQB1)基因进行分型 检测。
背景技术：
HLA(Human leukocyte antigen,人类白细胞抗原)是人类主要组织相容性系统。组织相容性 是指不同个体间进行组织或器官移植时，供者和受者双方接受的程度。供受者组织不相容引 起的反应，被证实是一种免疫反应，它是由细胞表面同种异型抗原诱导的，这个代表个体特 异性的抗原称移植抗原或组织相容性抗原，其中起主要作用的抗原称主要组织相容性系统 (MHS)， HLA (人类白细胞抗原)就是人类的主要组织相容性系统。HLA基因复合体位于人 类第6号染色体6p21.3区域，具有高度单核苷酸多态性(SNPs)。 HLA存在多个基因座位， 每个基因座位有可以分为多种型别、亚型和等位基因。
HLA的生物学和医学意义包括免疫学反应、器官移植排除反应和疾病关联性等等。在疾 病关联性方面，研究发现HLA-DQB1的某些亚型与多种疾病存在密切的关联性， HLA-DQB1*0602的基因频率在Graves病合并2型糖尿病患者组中较健康对照组明显增加， 有很强的相关性，是Graves病合并2型糖尿病患者的易感基因；DQBl*020x等位基因频率 在I型银屑病患者中显著增高，DQBP020x等位基因与银屑病的家族遗传史及早发型银屑病 相关；DQBP03032和DQBP0602型儿童，幽门螺杆菌感染发展为慢性胃炎概率显著低于其 它基因型别，提示遗传保护因素的作用；DQBP0602基因为中国发作性睡病人群的易感基因， DQB"0401-0402基因为中国发作性睡病人群的保护基因，等等。
HLA-DQB1基因分型方法是从90年代开始发展起来的，目前主要包括PCR-SSP (PCR-序列特异性引物法)、PCR-SSOP (PCR-序列特异性寡核苷酸探针法)、SBT (测序法)、FCM (流式法)方法。这些方法目前被西方国家的少数企业垄断，我国处于空白状态，完全依赖 进口。同时，这些方法也存在一些技术问题，比如引物过多造成检测错误、探针杂交单一温 度造成特异性降低、检测通量过小等等。
DNA微阵列法是近几年发展起来的新型基因分型法，相比其它分型方法，具有高通量、 集约化、低成本、高准确性等特点，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。由于该技 术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上，所以一次可以对大量的生物分子进行检测分 析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量 等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的 应用价值，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序 (Sequencing by hybridization, SBH)等，为"后基因组计划"时期基因功能研究及现代医学科 学、医学诊断学的发展提供了强有力的工具。
本发明解决了我国目前HLA-DQB"分型检测试剂依赖进口以及目前检测方法上的弊端， 具有技术和价格双重优势，实际应用以后会产生经济和社会双重效益。
发明内容
本发明的目的是将DNA微阵列技术应用于HLA-DRQ1基因座位的基因分型检测，开发 了一种新型的基因分型检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案是针对HLA-DRQ1座位的第二外显子，设计一套特异性寡核 苷酸探针(表l)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制 IO个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片， 一张芯片可以检测IO个样本，再配以其它 必要的组份，如PCR引物(表2)，组成完整的试剂盒。实际检测时，取10份人基因组DNA 溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出人基因组HLA-DRQ1基因的第二外显 子单链CY3标记片段。取DNA微阵列芯片一张，在10个杂交区分别加入10种PCR产物 2ul和杂交液8ul。将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度设定为52'C，杂交时间 30分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对 扫描图像信号进行图像数据转换处理，经过分析产生样本基因型别结果。
本试剂盒采用DNA微阵列技术，可以大大提高检测通量，每张玻片可以制备用于检测 10个样本的DNA微阵列，是现有一般检测技术的10倍以上。本发明可用于HLA-DQB1基 因分型检测以及相关联疾病的筛査和辅助诊断。
表1寡核苷酸探针序列
名称序列(5' -3')碱基数
QlAACGGGACAGAGCGCGT17
Q2GCGTGCGGGGTGTGAC17
Q3TGCGTCTTGTAACCAGA17
Q4GCGTGCGTCTTGTGAGC17
Q5GCGTGCGTTATGTGACC17
5Q6GAGTACGCACGCTTCGA17
Q7GAGTACGCGCGCTTCGAC17
Q8TGTACCGCGCGGTGACG17
Q9CGGTGACGCCGCTGGGG17
Q10CGGCCTGACGCCGAGTA17
QllCGGCCTAGCGCCGAGTA17
Q12CTGCCTGCCGCCGAGTA17
Q13CGGCCTGATCCCGAGTA17
Q14GGTGGCGTTCCGCGGGA17
Q15CGAGGTGGGGTACCGCG17
Q16CGGGACCGAGCTCGTGC17
Q17CGGGACCGAGCGCGTGC17
Q18CGGGCGGAGTTGGACAC17
QNGCTTCGACAGCGACGTG17
QPGCTTCGCCATCGACGTG17
QN, QP分别为阴性和阳性控制探针
表2引物序列
名称序列(5' -3')碱基数
PlGGGCCTGTGCTACTTCACCAA21
P2-lTCTCCTCTGCAGGATCCCGCG21
P2-2TCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG21
以下结合
本发明的具体实施。
图1 HLA-DQB1基因分型DNA微阵列杂交区和探针微阵列示意图
1芯片整体外观
2杂交区以及探针微阵列
具体实施例方式
本发明用下列实施例进行解释，目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。
实施例一
方法1: HLA-DQB1基因分型DNA微阵列PCR引物和寡核苷酸探针的设计和合成
6为了采用特异性PCR扩增HLA-DQB1基因座位的第2外显子，分别在第2外显子两端 设计特异性5'引物P1和3'引物P2-1， P2-l， P2-l， P2-1用CY3荧光标记。引物序列见表 2。
针对HLA-DQB1第2外显子基因序列的多态性，设计18种分型探针，见表1。 方法2: HLA-DRQ1基因分型DNA微阵列的制备
采用基因芯片自动点样仪，将18种分型探针和两种对照探针点制到玻片的特定区域，制 成DNA微阵列。
(1) 点样探针溶液将探针稀释到5XSSC、 0.05。/。SDS溶液中，终浓度为30uM;
(2) 点样矩阵(如图1)将探针点制在玻片上，每个探针横向重复3点点制在杂交区 内；杂交区分成10个。
实施例一采用HLA-DQB1基因分型用DNA微阵列芯片检测样本型别
取IO份已知基因型别的DNA样本，采用CY3标记的PCR引物，上下游引物1:30 (分 子数比)不对称PCR方法，PCR循环参数为94°C 5，； 94°C 30",58。C 30",72。C 30"，40个 循环；72°C 5，。
取一张微阵列玻片，分别取10种PCR产物各2ul加到芯片的10孔，再在各孔加入杂交 液(5xSSC) 8ul，芯片放到自动杂交洗涤仪的槽内，设定杂交温度52'C，杂交时间40分钟。 杂交后自动洗涤和风干。
采用GnenPix4100A扫描仪，扫描杂交信号，得到杂交结果扫描图，并将图像转换成数据。
采用分析软件，将以上数据自动分析转换成为各个样本的基因型别，检测结果与样本原 基因型别完全相符。见表3。
表3本次检测结果与样本原有基因型别的比较
样本编号原基因型别 (HLA-DRQ1*)本次试验结果 (HLA-DRQ1*)是否相符
010301, 06020301， 0602是
0202， 030202， 0302是
0302， 040302， 0403是
040604， 03030604， 0303是
050602， 03020602， 0302是060401， 050401， 05是
070301， 03020301， 0302是
0805， 030305， 0303是
0906， 0206， 02是
1002， 0602， 06是
实施例说明了本发明产品在检测通量方面的优势(一次检测IO个样木)和检测准确性方
面的可靠性(检测结果与原样本结果完全相符)。序列表
<110>中山大学达安基因股份有限公司
<120> HLA-DQB1基因分型DNA微阵列芯片试剂盒
<140> <141> <160>23
<210> 1 <211> 17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 1
AACGGGACAGAGCGCGT
<210>2 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 2
GCGTGCGGGGTGTGAC
<210> 3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 3
TGCGTCTTGTAACCAGA
<210>4 <2U>17 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 4
GCGTGCGTCTTGTGAGC
9<210>5 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 5
GCGTGCGTTATGTGACC
<210>6 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 6
GAGTACGCACGCTTCGA
<210>7 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 7
GAGTACGCGCGCTTCGAC
<210> 8 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 8
TGTACCGCGCGGTGACG
<210> 9 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 9
CGGTGACGCCGCTGGGG
<210> 10
10<211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 10
CGGCCTGACGCCGAGTA
<210> U <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 11
CGGCCTAGCGCCGAGTA
<210>2 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 12
CTGCCTGCCGCCGAGTA
<210> 13 <211>17 <212> DNA
<2i3>人」:序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 13
CGGCCTGATGCCGAGTA
<210> 14 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 14
GGTGGCGTTCCGCGGGA
<210> 15 <211>17<212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 15
CGAGGTGGGGTACCGCG
<210> 16 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 16
CGGGACCGAGCTCGTGC
<210> 17 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 17
CGGGACCGAGCGCGTGC
<210> 18 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 18
CGGGCGGAGTTGGACAC
<210> 19 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 19
GCTTCGACAGCGACGTG
<210> 20
<211>17
<212>DNA
12<213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作芯片杂交反应探针。 <400> 20
GCTTCGCCATCGACGTG
<210>21 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增引物。 <400> 21
GGGCCTGTGCTACTTCACCAA
<210> 22 <211>21 <212>DNA <213>人l序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增引物。 <400> 22
TCTCCTCTGCAGGATCCCGCG
<210>23 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增引物。 <400> 23
TCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG
1权利要求
1、一种DNA微阵列芯片检测试剂盒，用于对HLA-DQB1基因进行分型检测，该试剂盒将18种寡核苷酸探针，点制在玻片上，制成DNA微阵列芯片，配以3种引物以及其它组分，其特征在于所用的寡核苷酸探针序列分别为Q15’-AACGGGACAGAGCGCGT-3’Q25’-GCGTGCGGGGTGTGAC-3’Q35’-TGCGTCTTGTAACCAGA-3’Q45’-GCGTGCGTCTTGTGAGC-3’Q55’-GCGTGCGTTATGTGACC-3’Q65’-GAGTACGCACGCTTCGA-3’Q75’-GAGTACGCGCGCTTCGAC-3’Q85’-TGTACCGCGCGGTGACG-3’Q95’-CGGTGACGCCGCTGGGG-3’Q105’-CGGCCTGACGCCGAGTA-3’Q115’-CGGCCTAGCGCCGAGTA-3’Q125’-CTGCCTGCCGCCGAGTA-3’Q135’-CGGCCTGATGCCGAGTA-3’Q145’-GGTGGCGTTCCGCGGGA-3’Q155’-CGAGGTGGGGTACCGCG-3’Q165’-CGGGACCGAGCTCGTGC-3’Q175’-CGGGACCGAGCGCGTGC-3’Q185’-CGGGCGGAGTTGGACAC-3’。
2、根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片检测试剂盒，其特征还在于所使用的3种引物序列 分别为P1: 5 ， -GGGCCTGTGCTACTTCACCAA-3' P2-1: 5 ，-TCTCCTCTGCAGGATCCCGCG-3 ， P2—2:5，-TCGCCGCTGCAAGGTCGTGCG-3，。
3、 根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片检测试剂盒，其特征还在于采用18种寡核苷酸探 针，点制在玻片上，制成DNA微阵列，用于与样本PCR产物的杂交反应。
4、 根据权利要求1所述的DNA微阵列芯片检测试剂盒，其特征还在于试剂盒用于与HLA-UQB1 基因具有关联性的疾病筛査和辅助诊断检测。
全文摘要
本发明涉及一种临床检测用途的基因检测试剂盒，尤其是涉及DNA微阵列芯片检测试剂盒，该试剂盒能够高通量、高效率、高特异性对人类白细胞抗原DQB1(HLA-DQB1)基因进行分型检测。
文档编号C12Q1/68GK101487044SQ20081002588
公开日2009年7月22日 申请日期2008年1月18日 优先权日2008年1月18日
发明者何蕴韶, 帆 张, 明 李, 钢 程, 胡守旺 申请人:中山大学达安基因股份有限公司;广州达泰生物工程技术有限公司