专利名称：一种干细胞无毒冻存液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于保存干细胞的冻存液。
技术背景干细胞移植己成为当今医学领域生物治疗应用研究的热点。为 了满足移植的需要，建立干细胞库，长期妥善保存干细胞，已引 起研究者们的广泛重视。干细胞的保存方法直接影响细胞的存活 率及移植后的效果。目前，临床上唯一可以实现干细胞长期保存的方法就是超低温保存。超低温保存是将生物标本冷冻至-80 -196'C的低温，利用细胞内新陈代谢减慢乃至停止的特性，从而实 现较长时间的保存。超低温保存过程具有几个关键性的环节，如 低温保护剂的选择与加入、冷冻方案、保存温度以及复温过程。 关于选用何种保护剂、如何降温并保存、以及如何复温等，尚未 存在统一的方案，还有待进一步研究。目前，干细胞的超低温保存主要有两种方法496'C程序冷冻 液氮保存和-8(TC低温冰箱直接保存。前者可以实现长期的安全保 存，但是程序降温过程耗时较长并且操作复杂；后者虽操作简单费用低，但不适合长期保存，同时还会受到停电的影响。低温保护剂是干细胞低温保存必不可少的添加剂，主要用于 抑制细胞内外冰晶的形成，保护细胞免受冷冻损伤。低温保护剂 可分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。渗透性保护剂多是一些小分子物质，如二甲基亚砜(DMSO)，可渗透进入细胞内部，抑制 细胞内结冰，保护细胞内部结构；非渗透性保护剂，如羟乙基淀 粉，主要用于抑制细胞外结冰，保护细胞膜。DMSO是干细胞保 存最常用的保护剂，10% DMSO可用于干细胞长期保存，5% DMSO联合6%羟乙基淀粉，也已经成功用于造血干细胞的移植。 尽管如此，干细胞对DMSO较为敏感，冷冻前和复温后，应尽可 能縮短与DMSO接触的时间。通常情况下，人们的做法是，干细 胞加入保护剂后迅速冷冻，复温后直接移植进入患者体内。然而， 临床研究表明，DMSO具有很高的毒副作用，通常使接受移植的 患者产生恶心、呕吐、腹痛等症状；除此，对心血管、呼吸系统、 中枢神经以及肾脏等也会产生副作用。解决这一问题的关键是减 少保护剂的毒副作用、提高复温后的细胞活性。因此，使用对人 体无毒的低温保护剂长期安全保存干细胞，具有极大的研究价值 和应用前景。发明内容本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种对人体 无毒，能长期安全保存干细胞的无毒冻存液。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案 一种干细胞无毒冻存液，每100毫升溶液中含有 聚乙烯醇 0.1 5克1，2-丙二醇 1 30克余量为水。其优选的比例是每100毫升溶液含有聚乙烯醇 1 5克 1，2-丙二醇10 20克 余量为水。本发明采用1，2-丙二醇(PE)为渗透性防冻剂，结合聚乙烯 醇(PVA)作为非渗透性保护剂用于低温保存干细胞。PVA作为非渗透性保护剂，可通过抑制细胞外溶液形成冰晶， 维持细胞内外渗透压差，从而达到保护细胞膜的目的。PVA用于 低温保存，具有以下优点1. 分子链上含有丰富的羟基，具有很强的水合能力；2. 分子量大，增加少量的PVA，就能使溶液的粘度增大，提高溶液的玻璃化转变温度；3. 在降温过程中，PVA能够延迟溶液结冰， 一旦溶液中形成冰 晶，PVA分子会吸附在冰晶表面，抑制其长大和重结晶的发生。4. PVA的重结晶抑制活性在复温过程中对于保护细胞膜发挥 重要的作用，原因是溶液在升温过程中，只要温度低于熔点，水 很容易形成冰晶，或者原有的冰晶很容易长大或者发生重结晶， 大冰晶的形成，对细胞膜造成的机械损伤是致命的。因此，PVA 的存在，能够阻止大冰晶的形成，降低对细胞膜的破坏，起到保 护细胞的作用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果-1. 与已公开的干细胞冻存液相比，本发明的冻存液同时含渗透 性和非渗透性低温保护剂，尤其采用聚乙烯醇为非渗透性防冻剂 组分，具有明显的阻止冰晶生长及抑止重结晶作用，可以有效形 成低温玻璃化冻存效果。2. 本发明的玻璃化冻存液体系同时考虑了保护剂的毒性、渗透 性、玻璃化能力、玻璃化稳定性以及升温降温速率等因素。所以 不只在降温过程中易于进入玻璃化状态，而且还能保证玻璃化溶 液在升温过程中的稳定性。而现有冻存技术中玻璃化溶液从低温 保存状态平稳复温到常温状态是较难实现的。3. 本发明的多组分冻存液具有简单而且通用的效果，适于各种细胞、组织及器官的玻璃化冻存。4. 单独使用渗透性或非渗透性保护剂不能满多方面的技术需 求，联合使用两类保护剂已是低温保存技术发展的趋势。本发明 的低温保护剂有望在安全保存干细胞的剂量范围内，对人体没有 毒性，复温后的干细胞无需去除保护剂，可以直接实施移植。
具体实施方式
实施例1将预先制备好的聚乙烯醇O.lg作为非渗透性防冻剂，将1,2-丙二醇30g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系， 加入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。实施例2将预先制备好的聚乙烯醇lg作为非渗透性防冻剂，将l，2-丙 二醇20g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加 入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。实施例3将预先制备好的聚乙烯醇2g作为非渗透性防冻剂，将l，2-丙 二醇30g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。 实施例4将预先制备好的聚乙烯醇2g作为非渗透性防冻剂，将l，2-丙 二醇5g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加 入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。实施例5将预先制备好的聚乙烯醇3g作为非渗透性防冻剂，将1，2-丙 二醇30g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加 入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。将预先制备好的聚乙烯醇3g作为非渗透性防冻剂，将l，2-丙 二醇lg作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加 入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。实施例7将预先制备好的聚乙烯醇4g作为非渗透性防冻剂，将l，2-丙 二醇20g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加 入水到该体系配成100ml溶液，即为千细胞无毒冻存液。实施例8将预先制备好的聚乙烯醇5g作为非渗透性防冻剂，将1，2-丙二醇10g作为渗透性防冻剂，两个组分混合即成PVA/PE体系，加 入水到该体系配成100ml溶液，即为干细胞无毒冻存液。
权利要求
1.一种干细胞无毒冻存液，其特征在于每100毫升溶液中含有聚乙烯醇 0.1～5克1，2-丙二醇 1～30克余量为水。
2. 如权利要求1所述的干细胞无毒冻存液，其特征在于每100毫升溶液 中含有-聚乙烯醇 1 5克 1，2-丙二醇 10 20克 余量为水。
全文摘要
本发明公开了一种干细胞无毒冻存液，其每100毫升溶液中含有聚乙烯醇0.1～5克，1，2-丙二醇1～30克，余量为水。本发明的冻存液同时含渗透性和非渗透性低温保护剂，尤其采用聚乙烯醇为非渗透性防冻剂组分，具有明显的阻止冰晶生长及抑止重结晶作用，可以有效形成低温玻璃化冻存效果。本发明的玻璃化冻存液体系同时考虑了保护剂的毒性、渗透性、玻璃化能力、玻璃化稳定性以及升温降温速率等因素。所以不只在降温过程中易于进入玻璃化状态，而且还能保证玻璃化溶液在升温过程中的稳定性。本发明的多组分冻存液具有简单而且通用的效果，适于各种细胞、组织及器官的玻璃化冻存。
文档编号C12N5/08GK101250499SQ20081002735
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者吕树申, 王海燕 申请人:中山大学