专利名称：幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种幽门螺旋杆菌实时荧光聚合酶链式反应检测试剂盒。该试剂盒采用实时 荧光PCR反应对胃粘膜活检标本中幽门螺旋杆菌核酸进行定量检测，可用于幽门螺旋杆菌感 染的辅助诊断，指导临床用药以及进行流行病学回顾性研究等多个领域。
背景技术：
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种世界范围人类感染的病原菌，在人群 中具有较高的感染率，发达国家感染率在50%左右，发展中国家感染率可高达80%以上 (Jagadish C D and Nibedita Paul Epidemiolgy and Pathophysiology of Helicobacter pylori Infection in Children Indian Journal of Pediatrics, 2007,74:287-290. )。 Hp 在我国普通人群的感染率较高，达到50% 80%，并仍以每年1% 2%的速度增加，每年新 增感染病例超过1200万人。
幽门螺旋杆菌的传播方式主要有①粪-口传播，粪便中的HP是传染源，细菌经粪便排出 体外后污染了水源、食物等，再由它们来感染人类。粪-口传播多发生在发展中国家，可能与 饮用未烧开的水、多人公用厕所、饲养家禽、牲畜等因素有关；②口-口传播，是HP传播的另 一主要方式。寄居于口腔中的HP可能通过唾液传播给他人(Lee A ， Fox J G, Otto G，Dick EH , krakowka S. Transmission of Helicobacter SPP. A challenge to the dogma of fecal —oral spread. Epidemiol Infect ，1991 ，107 :99 109.)。使用筷子和公用盘子、母亲通 过咀嚼食物喂养幼儿、接吻等都可能引起HP的口-口传播；③经内窥镜传播，内窥镜是临床诊 断胃病的重要工具，因暴露于胃液及唾液，常用的胃镜及活检钳易被幽门螺旋杆菌污染。常 规清洗及用70%酒精消毒不能清除幽门螺旋杆菌，需用戊二醛浸泡方可杀灭。
由于部分Hp感染者会发展为慢性胃炎、十二脂肠肠炎、消化性溃疡、胃癌、粘膜相关性 淋巴瘤等疾病，WH0癌症中心于1994年将Hp列为第一类致癌因子(R印logle ， MI ， Glaser SL ， Haitt RA ， et al Biology sex as a risk factor for he2 licobacter pylori in fection in healthy young adultys AmJ Epidemiol ， 1995 ， 142 : 856 — 8631)。研究发现，慢性胃 炎患者的胃粘膜活检标本中他检出率可达80% 90%，而消化性溃疡患者更高，可达95%以上， 甚至接近100%。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，HP的检出率高低报道不一。研究还发现， 在自然人群中，初出生的新生儿血清中抗Hp-IgG水平很高，接近成人水平，并且在半年后迅 速下降，可能是新生儿从母体获得被动免疫抗体之故。
幽门螺旋杆菌的发现彻底改变了很多胃肠道疾病的基本理论。消化性溃疡一度是需要外
3科治疗的疾病，大量病人被施予胃切除术、旷置手术或是迷走神经切断术来治疗。1983年澳 大利亚科学家Wareen和Marshall发现并验证了幽门螺旋杆菌是引起消化道溃疡的的最主要 原因，同时意味着对于消化性溃疡的治疗，外科手术或长时间的药物维持不再是必须的。幽 门螺旋杆菌感染的精确诊断的意义有(1)可为医生治疗胃肠病人提供可靠的依据，指导临 床用药；(2)早期诊断、早期治疗，即根除Hp的预防治疗可明显降低胃炎、胃溃疡、十二脂 肠溃疡等疾病的发生率，另有报道指出根除Hp治疗的人群发生胃癌的危险性明显降低；(3) Hp的检测可用于监控胃肠道相关疾病的复发。
目前，临床上尚缺乏定量检测Hp感染的成品试剂盒。已有的Hp检测方法(1)组织切 片染色检查，将所取胃粘膜标本切片或涂片染色镜检Hp ，其特异性较高(95 % 100 %)，敏 感性依赖于观察者的经验与技术。(2)组织切片免疫组织化学染色检查，组织切片的免疫组 织化学染色，利用抗原抗体反应原理对Hp进行分子检测和形态检测。此法主要用于Hp致病 机理研究及鉴别Hp球形菌,一般不能作为常规的诊断手段。(3)细菌培养，Hp系微需氧菌， 对气体环境、温度以及培养基种类等均敏感,而培养结果亦受上述因素影响，临床不易推广。
(4) 14C、 13C尿素呼气实验、15N -尿氨排出实验、快速尿素酶实验有出现假阳性的可能。
(5) 血清Hp抗体检测、粪便Hp抗原检测即目前临床常用的Hp抗体检测试剂盒，它存在 以下缺陷a.由于系统免疫反应持续存在,检测过程尚不稳定，不易区分感染分期；b.与空肠 弯曲菌、胎儿弯曲菌等有血清交叉反应,不同个体菌株之间存在差异。因此，抗原制备、菌株 选择均影响检测结果；c.敏感性与特异性受年龄影响较大，30岁以上患者，血清学诊断不推荐 作为随访治疗结果的方法。
荧光PCR技术是一种直接检测核酸的分子生物学技术，具有灵敏度高，特异性好，操作 简单，能够早期检测病原体的优点。本发明根据荧光PCR的技术原理，针对HP特异性基因设 计了引物、探针，通过基因扩增达到定量检测HP的目的。本发明涉及的试剂盒具有较高的敏 感性和特异性并可检出细菌培养、组织学及快速尿素酶法不能发现的少量Hp (最少细菌数为 10 100个)，可灵敏地发现数量减少但并未真正根治的病人，并可对病人所感染的细菌进行 定量。可广泛用于幽门螺旋杆菌感染的辅助诊断，指导临床用药以及进行流行病学回顾性研 究等多个领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用实时荧光PCR技术定量检测胃粘膜活检标本中幽门螺旋 杆菌的试剂盒。
本发明在对GENEBANK上所有已知幽门螺旋杆菌核酸序列进行比对的基础上，寻找核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计幽门螺旋杆菌特异性的靶多核苷酸引物和探针。这些 引物和探针在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg"等的PCR 反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现体外核酸的循环扩增，从而达到快速、实时定量检 测幽门螺旋杆菌的目的。
本发明所涉及的试剂盒中主要包括1) DNA提取液、PCR反应管、HP阳性质控品、HP定 量参考品、阴性质控品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的一个优选实施方案是试剂盒中PCR反应管内含有PCR反应缓冲液、 一对HP特异 性的正、反向引物、 一条HP特异性的探针、UDG酶和Taq酶，其特征在于用于HP靶多核苷 酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5' - GTATTGAAGCGATGTTTCCTGAT - 3' (SEQ ID NO: 1)和5' - TTAAGAACAACTCACCAGGAACTAT -3' (SEQ ID NO: 2)，用于HP耙多核苷酸扩增和 监测体系的寡核苷酸探针的序列是5' - CCTGATGGGACCAAACTCGTAACCG - 3' (SEQ ID NO: 3)， 探针的两端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
本发明的另一个优选实施方案是PCR反应缓冲液由Tris-HCl(pH8.0)、 MgCl2、 KC1、甲酰 胺和dNTPs组成。
本发明的另一个优选实施方案是PCR扩增的条件为5(TC8分钟；93'C2分钟；93 °C 45秒，55°C 60秒，共IO个循环；93°C 30秒，55°C 45秒，共30个循环。
本发明的另一个优选实施方案是试剂盒中HP定量参考品为105 108COPieS/ml HP标准菌 株(ATCC编号43526)提取的DNA。将比浊法定量的HP标准菌株稀释至1 X 108copies/ml， 提取DNA后，用TE溶液将DNA分别稀释至105 108COpieS/ml作为试剂盒中定量参考品。所 有HP定量参考品与标本中提取的DNA同时进行扩增，PCR仪将根据l()5 10Bcopies/mlHP定 量参考品绘制出标准曲线，并依此对检测标本中幽门螺旋杆菌的感染量进行自动测定。
本发明的另一个优选实施方案是试剂盒中阴性质控品为纯化水，HP阳性质控品为定量为 lX106copies/ml HP标准菌株(ATCC编号43526)。试剂盒中两种质控品核酸的提取和检 测与待检标本同时进行，仅当HP阳性质控品检测呈阳性，阴性质控品检测呈阴性时，同批标 本的检测结果才有效。
本发明所涉及的试剂盒可以对胃粘膜活检标本中的幽门螺旋杆菌进行定量检测。检测过 程和定量分析由仪器自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。经实 验检测，本试剂盒的检测灵敏度可以达到25copies，可用于幽门螺旋杆菌感染的早期辅助诊 断、流行病学中幽门螺旋杆菌感染的调査研究等多个领域。
本发明与现有技术相比，优点为①可对感染的幽门螺旋杆菌进行精确的定量，真实反 映出患者体内病原体拷贝数的高低和复制情况，有助于疾病的早期诊断，早期治疗，并可用于监测治疗效果；②荧光PCR技术针对病原体特异性核酸序列设计引物、探针，与血清学检 验所用的抗原片段相比，具有更高的特异性，避免了常规血清学检测中与其它相关病原体的 交叉反应；③闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境 污染； 操作简单，耗时少。从核酸提取到最后得到PCR结果，总共只需2小时左右，可用 于幽门螺旋杆菌感染的快速诊断。
图1显示试剂盒阴性质控品扩增曲线。图中的扩增曲线为不规则的折线，不呈S型。说 明检测过程中没有HP核酸的污染。
图2显示试剂盒HP阳性质控品扩增曲线。图中扩增曲线为S型曲线，且CT值〈27。说 明检测体系可以有效地扩增HP的核酸序列。
图3显示试剂盒4管HP定量参考品扩增曲线。
图4显示试剂盒Std curve窗口下的标准曲线。HP定量参考品的含量为105copieS/ml 108copies/ml，经PCR分析，绘制出的标准曲线斜率为一3. 518743,在Y轴截距为37. 158077， R2 = 0.996705。在阴、阳性参考品检测合格的前提下，说明定量结果有效。
图5显示试剂盒阴、阳性样本的扩增曲线。两个阴性样本扩增曲线不呈S型，且与荧光 检测阈值线没有交点，三个阳性样本的扩增曲线呈S型。
具体实施例方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 实施例1.幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒的组成
1. l提取试剂:DNA提取液:由NaOH、 Tris-HC1 (PH8.0)、 Chelex-100等组成。 1.2 PCR反应试剂组成见PCR反应管
1.3质控品:HP阳性质控品;阴性质控品；HP定量参考品(105copies/ml 108copies/ml HP 标准菌株提取的DNA)
实施例2.用幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒检测待检样本中幽门螺旋杆菌的感染
2. 1标本的采集、保存和运输
2. 1. 1适用标本类型胃粘膜组织活检标本。
2.1.2标本采集专业医师在胃镜直视下取可疑病变部位粘膜2 3块，置入无菌玻璃管， 密闭送检。2. 1.3标本保存和运送标本可立即用于测试，也可保存于-2(TC待测，保存期为12个月。 运送采用0'C冰壶。 2.2核酸提取
①取粘膜组织至1.5 ml离心管中，用眼科剪将组织剪碎；阴、阳性质控品解冻后混匀， 2000rpm离心30sec，分别取50ul至1. 5ml火菌离心管中；②加入50 u 1丽A提取液充分混 匀，IOO'C恒温处理10±1分钟;③12,000 rpm离心5分钟，备用。
处理过的样品可直接用于后续PCR检测或于-2(TC保存。若保存一个月以上，最好存于-70。C。
2.3 HP定量参考品的准备取出HP定量参考品，解冻后混匀，2000rpm离心30sec，置 冰上待用。
2.4荧光PCR检测取PCR反应管若丁，解冻待用。取处理后的样品(标本、阴性质控 品、HP阳性质控品)上清液2y 1加入PCR反应管中，4管HP定量参考品各2y 1加入PCR反 应管，8，000rpm离心数秒，放入仪器样品槽，参照仪器操作说明设定阴阳性质控品，HP定量 参考品和待检样本编号。
反应程序设定第一步50°C 8分钟；第二步93°C 2分钟；第三步93°C 45秒，55°C 60 秒，共10个循环；第四步93°C 30秒，55°C 45秒，共30个循环。荧光设置R印orterDye: FAM， Quencher Dye: TAMRA， Passive Reference: NONE,在第四步55。C收集荧光。
2.5结果分析根据HP定量参考品扩增曲线设置Baseline的start值、st叩值以及 Threshold的Value值(start值可以在1 10、 stop值可以在5 20、 Value值可以在0. 01 0.2范围选择)，使Stdcurve窗口下的标准曲线图达到最佳，即correlation数值介于一l. 0 一0.97。在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。
2.6结果判定
a. 阴性质控品FAM检测通路荧光信号无增长，无典型S型扩增曲线；(参见附图l)
b. HP阳性质控品增长曲线呈S型曲线，且定值范围为8Xl(f 4Xl(f基因拷贝/ml (参 见附图2)
c. HP定量参考品4管参考品增长曲线均呈S型，Ct值〈27，且0.97《IH《1;(参见附图3， 4)。
以上要求需要同时满足，否则本次实验无效，需重新进行。 2.7试验结果的计算
2. 7. 1如果FAM检测通路荧光信号无增长，无典型S型曲线，则判样品的HP DNA总含量小于 检测灵敏度。
72.7.2如果FM1荧光信号增幅明显，扩增曲线呈典型S型曲线且Ct值^27，则按以下方法判 断
若样品的C〈1.00E+004，则该样品的HP DNA总含量〈5X1(^基因拷贝；
若样品的1.00E十004《C《1.00E+008，则该样品的HP DNA总含量=C/20基因拷贝；
若样品的C〉1.00E+008，则该样品的HP DNA总含量〉5Xl(f基因拷贝。如果需要精确定
量结果，可将样品提取的DNA用阴性质控品稀释到线性范围后再检测。则该样品的HP DNA总
含量=(C/20 X稀释倍数)基因拷贝。
2.7.3如果FAM荧光信号增幅明显，扩增曲线呈典型S型扩增曲线，但CT值〉27，则认为该 样品处于灰度区，需复检进行确定。序列表
<110〉中山大学达安基因股份有限公司
<120>幽门螺旋杆菌核酸定量检测试剂盒
〈140〉
<141>
<160>3
<210> 1 〈211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220>
〈223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 1
gtattgaagcgatgtttcctgat
<210> 2 〈211> 25 〈212〉 ■ <213>人工序列 〈220〉
<223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2
tt3agaacaactc3ccaggaactat
<210> 3 〈211〉 25<212> DNA 〈213〉人工序列 〈220〉
〈223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400〉 3
cctgatgggaccaaactcgtaaccg
权利要求
1、一种对幽门螺旋杆菌进行定量的PCR检测试剂盒，该试剂盒包括1)DNA提取液、PCR反应管、HP阳性质控品、HP定量参考品、阴性质控品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中PCR反应管由PCR反应缓冲液、一对HP特异性的正、反向引物、一条HP特异性的探针和Taq酶组成，其特征在于用于HP靶多核苷酸扩增的正向和反向引物的序列分别是5′GTATTGAAGCGATGTTTCCTGAT-3′和5′-TTAAGAACAACTCACCAGGAACTAT-3′。
2、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR反应管中用于HP靶多核苷酸扩增和监测 体系的寡核苷酸探针的序列是5' - CCTGATGGGACCAAACTCGTAACCG - 3'，探针的两端分别结 合有荧光发生基团和荧光淬灭基团。
3、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于PCR扩增的条件为50°C 8分钟；93°C 2 分钟；93 °C 45秒，55°C 60秒，共10个循环；93°C 30秒，55 °C 45秒，共30个循环。
全文摘要
本发明涉及一种幽门螺旋杆菌实时荧光聚合酶链式反应检测试剂盒。本试剂盒能对胃粘膜活检标本中幽门螺旋杆菌进行定量检测。试剂盒的检测方法操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，可广泛用于幽门螺旋杆菌感染的辅助诊断，指导临床用药以及进行流行病学回顾性研究等多个领域。
文档编号C12Q1/68GK101608210SQ20081002887
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月18日 优先权日2008年6月18日
发明者何蕴韶, 明 李, 王方金, 钢 程, 颖 陈 申请人:中山大学达安基因股份有限公司