水稻株型基因及其应用的制作方法

专利名称：：水稻株型基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体的，本发明涉及一种新的水稻株型基因及其应用。
背景技术：
：亚洲栽培稻(Oo^as加VcO—水稻是由她的祖先普通野生稻(Oyzan^pogo")经过长期的人工选择驯化来的。最近美国学者克隆了控制野生稻的落粒基因幼4，该基因与水稻进化，控制着由野生稻的易落粒性驯化为较难落粒的栽培稻。野生稻具有匍匐生长、多分蘖的生长习性，这样的株型不利于密植和高产栽培。野生稻的这种不利株型被古代人们作为一种改良目标，进行人工选择和驯化，最终将野生稻的不利株型转变为直立、较少分蘖的栽培稻，这样的株型有利于密植、高产栽培。从野生稻的株型驯化成栽培稻的株型是水稻进化史上的最重要事件，但控制野生稻株型的相关基因至今还未见报道。由于株型特征关系到植物的密植、高产或外观，可对产量造成影响，因此本领域有必要研究调节植物株型的基因，从而为植物定向改良提供新的途径。
发明内容本发明的目的在于提供一种水稻株型相关的PA7蛋白，其编码基因，含有该编码基因的载体和细胞，及其应用。在本发明的第一方面，提供一种分离的PA7蛋白，该蛋白是(a)SEQIDNO:2氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO.2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)与SEQIDNO:2氨基酸序列有至少70。/。(较佳地80。/Q，更佳地90%，最佳地95%)相同性，且具有与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组-(i)编码所述的PA7蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码含有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白。在另一优选例中，该多核苷酸具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的第五方面，提供所述的PA7蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物的直立特性和/或分蘖特性；或用作鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物；或用于制备鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物；或用于作为转录激活因子，调控下游基因的表达。在另一优选例中，所述的PA7蛋白或其编码基因用于增加植物的分蘖数，或用于使植物匍匐生长。在另一优选例中，所述的植物是水稻。在本发明的第六方面，提供一种调节植物的直立特性和/或分蘖特性的方法，该方法包括调节所述植物中所述的PA7蛋白的表达或活性。在另一优选例中，提供一种增加植物的分蘖数或使植物匍匐生长的方法，所述方法包括提高所述植物中PA7蛋白的表达或活性。在另一优选例中，提供一种减少植物的分蘖数或使植物直立生长的方法，所述方法包括降低所述植物中PA7蛋白的表达或活性。在本发明的第七方面，提供一种鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物，所述的分子标记物是引物对，具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。在本发明的第八方面，提供一种所述的PA7或其编码基因的激动剂或拮抗剂。在本发明的第九方面，提供一种制备多分蘖或匍匐生长的植物的方法，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的PA7蛋白的编码序列；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(l)中的农杆菌接触，从而使所述PA7蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述PA7蛋白的编码序列的植物细胞、组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。在本发明的第十方面，提供一种鉴定植物(如植物种子)的直立特性和/或分蘖特性的方法，所述的方法包括步骤(sl)以所述植物的基因组DNA为模板，以具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物进行PCR扩增，获得扩增产物；(s2)将限制性内切酶WeI加入到所述的扩增产物中，分析酶切情况；其中，若扩增产物未被酶切，则所述植物具有多分蘖或匍匐生长的特性；若扩增产物被酶切，则所述植物具有少分蘖或直立生长的特性。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l显示了野生稻i^47基因序歹ij(A)及其编码的氨基酸序列(B)。图2显示了通过转基因方法将野生稻i^47基因片段导入栽培水稻品种中，转基因株系表现野生稻的株型。其中，对照为栽培稻品种"中花ll"，T781和T790是两个转入PA7的转基因株系。图3显示了PA7蛋白特异性地定位在细胞核中，提示/M7为转录因子基因。图4显示了通过分子标记选择将野生稻的/M7基因片段导入栽培稻品种(特青，TQ)中，培育的近等基因系NIL(/^7)表现野生稻的株型。具体实施方式本发明人经过广泛的研究，应用分子标记技术首次从野生稻中获得一种株型相关的基因，其为一种转录因子新基因，具有调控下游基因表达的作用，本发明人将之命名为水稻株型基因(/M7)。该基因的表达可使得水稻匍匐生长，且分蘖多；该基因的功能位点发生突变使蛋白失去功能后，水稻可直立生长，且分蘖少。因此该基因可以作为鉴定植物株型的分子标记，并且在植物株型控制和高产育种中具有广泛的应用前景。如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"分离的水稻株型蛋白"、"分离的PA7蛋白"或"分离的PA7多肽"是指PA7蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的普通技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化PA7蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。如本文所用，术语"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构成(制成)"、"基本上由……构成"、和"由……构成"。如本文所用，所述的"多分蘖"的植物是指一种植物，其在适当的生长条件下生长至一定阶段(如成熟阶段)时，比在相同条件下生长的同类植物的分蘖数显著多(如多20%;较佳地多40%，更佳地多60%或更多)。所述的"少分蘖"的植物是指一种植物，其在适当的生长条件下生长至一定阶段时，比在相同条件下生长的同类植物的分蘖数显著少(如少20%;较佳地少40%，更佳地少60%或更少)。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括PA7蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的PA7蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语"PA7蛋白"指具有SEQIDNO:2序列的多肽。该术语还包括与SEQIDNO:2序列的蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-50个，较佳地l-30个，更佳地l-20个，最佳地1-10个，还更佳如l-8个或l-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括PA7蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与PA7蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗PA7蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。所述的同源序列是指具有与SEQIDN0:2序列有至少50%，较佳地至少60%，70%，80%，更佳地至少85%，90%,95%相同性的多肽。本发明还提供了其他多肽，如包含PA7蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了PA7蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有PA7蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约IOO个连续氨基酸，最佳地至少约150个连续氨基酸。本发明还提供PA7蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然PA7蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，"PA7蛋白保守性变异蛋白(多肽)"指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生，且保留与SEQIDNO:2序列的蛋白相同的功能。然而，在SEQIDNO:2序列的关键功能位点上氨基酸序列是保守的，例如SEQIDNO:2序列中第152位的氨基酸是Thr，其不能被Ser替换。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>本发明还提供了编码本发明PA7蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，但与SEQIDNO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，进一步较佳地至少80%，更佳地至少90%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC,0.1%SDS，60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1。/。Fico11，42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70%以上，较佳地至少80%以上，更佳地至少90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码PA7蛋白的多聚核苷酸。作为本发明的优选方式，提供一种鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物，所述的分子标记物是引物，所述引物可扩增PA7蛋白的关键功能位点区域的编码序列，从而可通过鉴定该编码序列得知植物的直立特性和/或分蘖特性。优选的，所述的引物具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。因此，一种鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的方法包括(sl)以所述植物的基因组DNA为模板，以具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物进行PCR扩增，获得扩增产物；(s2)将限制性内切酶￡7^1加入到所述的扩增产物中，分析酶切情况；其中，若扩增产物未被酶切，则所述植物具有多分蘖或匍匐生长的特性；若扩增产物被酶切，则所述植物具有少分蘖或直立生长的特性。观察扩增产物是否被酶切可通过常规的方法进行，一种简单的方法是利用凝胶电泳技术，通过观察酶切产物电泳后产生的条带数，从而得知是否发生有效的酶切，该技术是本领域人员熟知的。本发明的PA7蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或PA7蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984;224:1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的PA7蛋白。一般来说有以下步骤-(1).用本发明的编码PA7蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3),从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，PA7蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。一种适用的表达载体例如pCAMIA1301。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PA7蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞(尤其是非生殖植物细胞)等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术迸行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCh。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。重组的PA7蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗PA7蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组PA7蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激PA7蛋白功能的多肽分子。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用PA7蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测PA7蛋白的转录产物。本发明还涉及一种通过调节植物的直立特性和/或分蘖特性改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中/l47基因的表达或活性。促进还是抑制尸」7的表达或活性主要取决于植物所需改良的性状而定。当需要增加植物的分蘖数或使植物匍匐生长，可通过提高所述植物中i^7基因的表达或活性来实现；当需要减少植物的分蘖数或使植物直立生长的方法，则可通过降低所述植物中i^7基因的表达或活性来实现。增加i^7基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带PA7编码基因的表达构建物使植株过表达PA7;或可通过用强启动子驱动从而增强iM7基因或其同源基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该i^7基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。抑制A47基因表达的方法也是本领域周知的。例如，可通过反义或RNA干扰(RNAi)或基因敲除的技术来实现。作为本发明的一种优选方式，获得PA7高表达的植株的方法如下(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的PA7蛋白的编码序列；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(l)中的农杆菌接触，从而使所述PA7蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述PA7蛋白的编码序列的植物细胞、组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。本发明还包括PA7蛋白或其编码基因的拮抗剂或激动剂。由于PA7的拮抗剂或激动剂可调节PA7的活性或表达，因此，所述的PA7的拮抗剂或激动剂也可通过对PA7的影响来调节植物的直立特性和/或分蘖特性，从而达到使植物性状改良的目的。所述的PA7的拮抗剂是指任何可降低PA7蛋白的活性、降低PA7基因或蛋白的稳定性、下调PA7蛋白的表达、减少PA7蛋白有效作用时间、或抑制PA7基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为调节植物生长有用的物质。所述的PA7的激动剂是指任何可提高PA7蛋白的活性、维持PA7基因或蛋白的稳定性、促进PA7蛋白的表达、延长PA7蛋白的有效作用时间、或促进PA7基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为调节植物的直立特性和/或分蘖特性有用的物质。在本发明的一个实例中，提供了一种PA7基因，其全长的开放阅读框(ORF)序列如SEQIDNO:l所示，编码一个含有167个氨基酸的蛋白质(SEQIDNO:2)。野生稻和栽培稻中的序列分析表明，在栽培稻中7^7基因的编码区有二个碱基发生替换，其中一个引起蛋白序列上一个氨基酸的替换(SEQIDNO:2中第152位T—S)，从而引起由野生稻的株型进化为栽培稻的株型；通过转基因方法将野生稻的PJ7片段导入栽培稻中可恢复野生稻的株型。本发明的主要优点在于首次从野生稻中发现水稻株型基因(/M7)，该基因的揭示可以为水稻直立特性和/或分蘖特性的改良提供新的途径。本发明人的研究还表明，该基因是一种转录激活因子，从而其具有转录激活因子相关的特性，即可用于调控下游基因的表达。另外，/M7基因也将在其它植物包括小麦、玉米、高梁等的定向育种中起重要作用，具有广泛的应用前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。实施例1/M7基因的克隆栽培稻的祖先普通野生稻具有匍匐生长、多分蘖的株型，而亚洲栽培稻品种"特青"的株型为直立、较少分蘖。本发明人用海南野生稻作为供体亲本、用特青作为轮回亲本，构建杂交组合，并进行多代回交。用回交群体定位了一个控制野生稻株型的基因，命名为尸Z7。进一步利用图位克隆技术克隆了该基因。序列比较分析表明，野生稻与栽培稻特青在/^7基因的编码区存在2个碱基的变异，l个(第99位，在野生稻中为A，在栽培稻中为G)未造成氨基酸改变，而另1个(第454位，在野生稻中为A，在栽培稻中为T)变异造成一个氨基酸的替换，由野生稻的苏氨酸(T152)变为栽培稻的丝氨酸(S)，引起该基因的功能变异，从而引起由野生稻的株型进化为栽培稻的株型。野生稻株型的/^47基因的序列如SEQIDNO:l(图1A)所示，编码一个全新的功能未知的新蛋白，其序列如SEQIDNO:2(图1B)所示。进一步研究发现，在水稻基因组中没有PA7的同源拷贝。户J7基因的全长ORF(openreading-frame)长度为504bp，编码167个氨基酸的蛋白。蛋白序列分析表明PA7蛋白为锌指蛋白，推测为一个转录因子，为了证明该推测，本发明人进行了亚细胞定位，将绿色荧光蛋白GFP与PA7常规方法融合构建35S::GFP-PA7载体，然后用基因枪轰击洋葱表皮细胞，用共聚焦显微镜观察荧光表达。结果如图3所示，可见PA7蛋白特异性地定位在细胞核中，提示PA7为转录因子。结合实施例5的转录激活活性分析实验进一步证实了PA7是一个转录因子基因。实施例2iM7的分子标记辅助选择育种实验本实施例中，根据/M7基因的序列，设计PCR寡核苷酸引物(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)，用Taq酶进行PCR扩增普通野生稻(海南野生稻)与亚洲栽培稻品种(特青或其它栽培稻品种)的DNA，用限制性内切酶5/iel酶切扩增产物，经过1。/。琼脂糖凝胶电泳检测普通野生稻与亚洲栽培稻品种之间存在的DNA多态性(差异)。如扩增产物电泳条带l条，则为野生稻品种；如扩增产物电泳条带2条，则为特青或其它栽培稻品种(酶切位点在SEQIDNO:l第99-105位)。因此该引物可以作为特异性鉴别野生稻尸^7基因与栽培稻/M7基因的分子标记。在野生稻与栽培稻品种的杂交后代群体中，用该分子标记可以快速地将携带/M7基因的个体挑选出，达到改良株型的目的。5'端寡核苷酸引物序列为(SEQIDNO:3):5'-TCTCCGCCGGTGGAGCTGTC-3';3'端寡核苷酸引物序列为(SEQIDNO:4):5'-GGAGGCGATGGGCATGGACG-3'。实施例3i^7水稻转基因实验本实施例采用表达载体pCAMBIA1301(购自CAMBIA)作为水稻转基因载体。该载体编码一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(KarO、潮霉素抗性基因(Hyg，、NOS基因的终止信号序列以及限制性内切酶克隆位点(MCS)。在限制性内切酶克隆位点可插入i^7基因组片段构建成转基因质粒。1./^7基因组片段的转基因质粒的构建在该实施例中，以野生稻基因组DNA为模板，用W7的DNA序列的5'和3'端的PCR寡核苷酸为引物(SEQIDNO:5和SEQIDNO:6)，用高保真T叫酶pfuTaq进行扩增，获得2.677kb的尸J7基因组片段扩增产物。将该扩增产物重组进PMD18-T载体上(TaKaRa，Japan),并对多个重组子进行测序，以验证序列的正确性。该重组的过渡质粒载体称为/^7-PMD。5'端寡核苷酸引物序列为(SEQIDNO:5):5'-GCCCGTTCGGATTTAAGTTCTA-3';3'端引物序列为(SEQIDNO:6):5,-GCCAGTCCCTATGTGGTGTTCT-3，。分别用尸Wl和尺戸I消化尸J7-PMD和载体pCAMIA1301,将iM7-PMD消化后的2.677kb目的片段连接到载体pCAMIA1301。连接物转化大肠杆菌菌株DH5a，在含有Kan(50)ag/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用PWl和^^I酶解挑选出有2.677kb片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建pCAMIA1301-尸」7质粒。2.P」7转化水稻pCAMIA1301-尸J7质粒通过冻融法导入农杆菌菌株EHA105(参见Hood，E.E.等，TransgenicRes.，1993，2，208-218)。每200|^1EHA105感受态细胞加0.5-lpg(约10nl)质粒DNA混匀，依次于冰上、液氮和37。C水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至lml，于28。C振摇培养2-4小时；取200pl涂布于含抗生素Kan(50pg/ml)的YEB平板上，28'C培养2-3天。长出的菌落在含抗生素Kan的YEB平板上划单菌，连续划3次。从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素Kan的YEB液体培养基中于28。C振摇培养过夜，第2天按1%接种量转接入50ml含抗生素Kan的AB液体培养基中所述的条件中，200rpm继续振摇培养至OD6。。为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4卩离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化栽培水稻品种"中花ll"的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70%乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:3混合，力B2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26土1。C、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26'C共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌W基因活化物，使用浓度为100nmol/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D2Sl(含Hyg25mg/l)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D2S2(含Hyg50mg/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MSoH培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T2代观察水稻株型表型，验证iM7基因功能。以上涉及的培养基参见《分子克隆实验室指南》。结果，通过转基因方法将野生稻的/M7基因组片段导入栽培稻品种中，获得了野生稻的株型，见图2，表明PA7是水稻株型相关的基因。实施例4将包含/^7的野生稻染色体片段导入特青的遗传背景中的影响本发明人选育了尸」7的近等基因系NIL(尸J7)，即将包含iM7的很短的野生稻染色体片段导入特青(TQ)的遗传背景中。具体是将海南野生稻与栽培稻品种特青杂交，再用特青作为轮回亲本连续进行4次回交，用分子标记从回交群体中选择出包含野生稻尸^7短片段的而遗传背景(基因型)为特青的近等基因系NIL(Pv47)(Nearlyisogenicline，NIL)。结果如图4所示，NIL(/M7)的株型类似野生稻，表明尸^7是控制野生稻株型的关键基因。因此，可以通过/l47的分子设计来改良水稻的株型，达到高产育种的目标，可见i^7基因在水稻株型和高产育种中具有广泛的应用前景。实施例5PA7的转录激活活性分析实验用MatchmakerGAL4酵母双杂交系统3(购自Clontech)对PA7的转录激活进行分析。构建阳性对照载体pAD，将pGADT7(Clontech)自带的NLS和AD用5flmM和^/I酶切后连到pGBKT7(Clontech)的5am/n和Sa/I位点上获得。然后用PCR方法(以SEQIDNO:7和SEQIDNO:8为引物)扩增PA7的全长ORF，构建至廿pGBKT7载体上的五caRI和尸M上，形成pGBKT7-PA7载体。5'端寡核苷酸引物序列为(SEQIDNO:7):5，-AAGAATTCATGGATCCCTCATCGGCTTC-3';3'端引物序列为(SEQIDNO:8):5'-AACTGCAGCTAGAGGCCGAGCTCGAGGA-3'。用同样方法分别构建PA7的N端和C端的载体。在编码N端l-69氨基酸的核苷酸序列两端设计引物(SEQIDNO:9和SEQIDNO:10)，进行PCR扩增，PCR产物插入到pGBKT7载体的内切酶五co/I和尸M位点上，构建pGBKT7-PA7-Nterminal载体。在编码C端70-167氨基酸的核苷酸序列两端设计引物(SEQIDNO:ll和SEQIDNO:12)，进行PCR扩增，PCR产物插入到pGBKT7载体的内切酶五co/I和i^I位点上，构建pGBKT7-PA7-Cterminal载体。5'端寡核苷酸引物序列为(SEQIDNO:9):5，-AAGAATTCATGGATCCCTCATCGGCTTC-3，；3'端引物序列为(SEQIDNO:10):5，-AACTGCAGGTGCGCGTTCTGGTGGCCGC-3'。5'端寡核苷酸引物序列为(SEQIDNO:11):5'-AAGAATTCCGGAAGGAGCGCGTCGCCGG-3，;3'端引物序列为(SEQIDNO:12):5，-AACTGCAGCTAGAGGCCGAGCTCGAGGA-3，。各种载体转化到酵母菌种AH109(购自Clontech)中，将生长过夜的菌种稀释，涂在缺Trp氨基酸或缺少三种氨基酸(-Trp/-His/-Ade)的SD培育基(分子克隆实验室指南)上，然后观测菌种生长情况，决定PA7的转录激活活性。结果显示，pGBKT7-PA7具有较强的转录激活活性，表明PA7是具有转录激活活性的转录因子。另外，只有PA7的C端也具有转录激活活性而PA7的N端却没有，表明PA7的转录激活域位于C端。实施例6PA7蛋白变体的功能采用常规的定点突变技术，本发明人将SEQIDNO:2所示的野生稻PA7氨基酸序列的第18位Leu替换为Ile，构成PA7蛋白变异体(PA7-M)。如前所述类似的方法，利用农杆菌将PA7-M编码基因导入栽培稻品种中，测定该转基因水稻的株型。结果发现，所述转基因水稻表现野生稻的株型。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>水稻株型基因及其应用<130〉082683<160〉12<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉504<212〉DNA<213〉普通野生稻(0ryzarufipogon)<400>1atggatccctcatcggcttcttggccggctccggcttctccgccggtggagctgtccctg60tccctgccggcggcggcggcgeigg肌ccgcgacgaggcagcgccgacggcgatcgtcgac120ggcaagc卿tgaggctgttcccgtgcctcttctgcgccaagacgttccgcaagtcgcag180gcgctcggcggccELccagaacgcgcaccggaaggagcgcgtcgccggcggcagctggaac240cccaacgtctacggcgscggcggcggatcagcgtccatgcccatcgcctcccatggcgtc300acggcggcggggagtagtacggcagccgacggccggtggtgcggcggcgctgccagcgac360gacgaca^cMcggcggcgcccatgccttccctcggctcaggctcggcggcgctcggcgcc420ggcgccggtttcgcttcgaccga犯ggggctctaccggcggcggcgtcgccggcgaggag棚cttgtcctcgagctcggcctctag504<210〉2<211〉167<212〉PRT<213>普通野生稻(Oryzarufipogon)<400>2MetAsp1GluLeuAlaAlaCysLeu50HisGin65ProAsnSerHisTrpCysProSerPro35PheAsnValGlyGlySerLeu20ThrCysAla丁yrVal100GlySerAlaSerTrp5SerLeuProAlaAlalieValAlaLysThr55HisArgLys70GlyAspGly85ThrAlaAlaAsp40PheGluGlyGlyProAla25GlyAla10AlaLysProAlaAlaArgGinValAlaAlaSerAspArgLysSerGin60ArgValAlaGly75GlySerAlaSer90SerSerThrAla105AspAspThrThrSerProProVal15AsnArgAspGlu30ArgLeuPhePro45AlaLeuGlyGlyGlySerTrpAsn80MetProlieAla95AlaAspGlyArg110AlaAlaProMet115120125ProSerLeuGlySerGlySerAlaAlaLeuGlyAlaGlyAlaGlyPhe130135140AlaSerThrGluArgGlySerThrGlyGlyGlyValAlaGlyGluGlu145150155160LeuValLeuGluLeuGlyLeu165<210>3<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉3tctccgccggtggagctgtc〈210〉4<211〉20<212〉DM<213>人工序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400〉4ggaggcgatgggcatggacg<210〉5<211〉22〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>raise—feature<223〉引物<400>5gCCCgttCgg3ttt33gttCt3<210〉6<211〉22〈212〉DNA<213〉人工序列<220><221>misc—feature<223〉引物<400〉6gccagtccctatgtggtgttct<210〉7<211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉7aagaattcatggatccctcatcggcttc<210〉8<211〉28<212>腿<213>人工序列<220〉<221〉misc一feature<223〉引物<400〉8織tgcagctag鄉ccgagctcgagga<210〉9<211〉28<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉9aagaattcatggatccctcatcggcttc28<210>10<211〉28〈212〉DNA<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223〉引物<400〉10aactgcaggtgcgcgttctggtggccgc<210〉11<211〉28<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223>引物<400>11aagaattccggaaggagcgcgtcgccgg〈210〉12〈211〉28<212>腿<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223〉引物<400〉12asctgC3gctag3ggccgagctcgagga2828权利要求1.一种分离的PA7蛋白，其特征在于，该蛋白是(a)SEQIDNO2氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQIDNO2所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与SEQIDNO2氨基酸序列有至少70％相同性，且具有与SEQIDNO2所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。2.—种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组-(i)编码权利要求1所述的PA7蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。3.—种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。5.权利要求1所述的PA7蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于调节植物的直立特性和/或分蘖特性'，或用作鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物；或用于制备鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物；或用于作为转录激活因子，调控下游基因的表达。6.—种调节植物的直立特性和/或分蘖特性的方法，其特征在于，该方法包括调节所述植物中如权利要求1所述的PA7蛋白的表达或活性。7.—种鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物是引物对，具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。8.—种权利要求1所述的PA7或其编码基因的激动剂或拮抗剂。9.一种制备多分蘖或匍匐生长的植物的方法，其特征在于，它包括步骤(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求l所述的PA7蛋白的编码序列；(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(l)中的农杆菌接触，从而使所述P八7蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3)选择出转入所述PA7蛋白的编码序列的植物细胞、组织或器官；(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。10.—种鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(sl)以所述植物的基因组DNA为模板，以具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的引物进行PCR扩增，获得扩增产物；(s2)将限制性内切酶^el加入到所述的扩增产物中，分析酶切情况；其中，若扩增产物未被酶切，则所述植物具有多分蘖或匍匐生长的特性；若扩增产物被酶切，则所述植物具有少分蘖或直立生长的特性。全文摘要本发明公开了一种水稻株型蛋白及应用。所述的水稻株型蛋白是SEQIDNO2所示序列的蛋白或是与SEQIDNO2所示序列的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。本发明还公开了所述水稻株型蛋白的编码基因，含有所述编码基因的载体和宿主细胞。本发明的水稻株型蛋白可用于调节植物的直立特性和/或分蘖特性，还可用作鉴定植物的直立特性和/或分蘖特性的分子标记物。本发明的水稻株型蛋白在植物株型和高产育种中具有广泛的应用前景。文档编号C12N15/11GK101575366SQ20081003704公开日2009年11月11日申请日期2008年5月7日优先权日2008年5月7日发明者敏施,朱美珍,林鸿宣,键金,高继平申请人:中国科学院上海生命科学研究院