专利名称：：利用水稻dna插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法
技术领域：
：本发明属于生物鉴别
技术领域：
，具体涉及一种鉴定籼稻和粳稻的方法。技术背景籼稻和粳稻是亚洲栽培稻(OyM犯riraL.)的两个最重要的遗传分化类群。典型的籼稻和典型的粳稻之间已形成了明显的生殖隔离，故在分类上通常将籼稻和粳稻作为两个亚禾中处理，艮卩茅山稻亚禾中(araft'rasubsp./"^o)禾口梗稻亚禾中(ara"rasubsp./a/wm'ca)。秈稻和粳稻在形态、生'理生化性状和品质方面都已经产生了较大的差异，在对不同生态环境的适应性方面也有所不同，籼稻适合于低纬度和低海拔的热带和亚热带环境，而粳稻更适合于高纬度和高海拔的冷凉环境。由于籼稻和粳稻的遗传分化以及这些特征特性，利用籼稻和粳稻进行有性杂交不仅可以产生很多新的遗传重组类型供育种家选择，进而培育出优异的水稻品种。而且，籼稻和粳稻之间的强大杂种优势，在杂交稻的培育中也具有重要的价值。因此对于籼稻和粳稻的准确鉴定，在水稻选育和遗传改良的育种材料和种质资源正确选用中具有非常重要的应用价值，至关重要，同时在水稻的进化和遗传研究中也具有重大的理论意义。由于籼稻和粳稻的不同类型在形态上和生理生化特征上有很大的变异，而且籼稻和粳稻品种之间存在着明显的有性杂交和遗传渐渗，导致一些中间类型的出现。虽然籼稻和粳稻的准确鉴定极为重要，但是一直以来，对籼稻和粳稻的准确鉴定都存在较大的问题。目前用来鉴定籼稻和粳稻最有效的常规方法是以形态鉴定为基础的"程氏指数法"，(包括六个性状桴毛、酚反应、穗节长、稻壳色、叶毛和谷粒长宽比)。这个方法的最大缺点一是由于形态性状受环境的影响较大而易导致检测的结果不准确；二是形态测量必须要栽种被测水稻样品，从播种到成熟一般需要3-5个月，耗时长；三是形态测量需要一定的样本群体，故需要较多的水稻样品；这样就大大影响了籼稻和粳稻鉴定的效率。
发明内容本发明的目的是提供一种精确和快速区分鉴定水稻的籼稻和粳稻的方法。本发明提出的鉴定水稻中籼稻和粳稻的方法，是一种利用插入或缺失(InDd)分子标记鉴定水稻品种的方法。具体来说是利用水稻亚种间DNA序列的特异性差异片断，设计扩增引物组合及其衍生物，对籼稻型等位基因(I)和粳稻型等位基因(J)频率(F,或巧)进行计算，并根据这差,员率来确定籼稻和粳稻的方法。本发明用于鉴定籼稻和粳稻的InDel特异引物一共有34对，具体如下:表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>27R10M17TGAACAATAAACCACAGAAGCACCCTTTATTCCCTCCTTTG28R10M30CCCTAAAAATAGAGCAACCTACCCATAATACTACCAATCAAC29R10M40GTCCCTAGGCCATCTCTTGGCGAATAGGGGTGGACAG30R11M23AAGGTTGACAAGGACAGAAGTCGCAGGAATGGATAAAA31R11M40AAGAAAAATATCTATTGAGGAGTGGGAGGACCATAAATGACGG32R12脂ATCATTTCAGCCTGTGCCAGCTTAATAGGGGGGACG33R12M27ATTTCATTGCCATCAGTTGTAATCTTCTATCCGTTCA34R12M43CCGCCGAGAAGAAACAAACCCAAGAACAGGATTACA从水稻植株的任何器官或组织(包括种子、幼苗、成株、茎、叶等)DN样品，并对样品DNA进行聚合酶链扩增。本发明使用的聚合酶链式扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可以使用而达到目的。PCR反应条件和程序如下(20pl体系)1)10xPCR缓冲液(含25mMMgCl2)2|il2)2.5mMdNTPMixture1如l3)10tiMPCR引物4)1UTaqDNAPolymerase0.2^15)DNA模板20ng6)ddH20(双蒸水)补足至20plPCR反应程序1)90-96°C预变性3-6分钟2)90-96。C变性35-50秒3)退火温度48-55°C，退火时间25-35秒4)70-75°C延伸35-45秒5)循环步骤为2)3)4)，36个循环6)70-75。C延伸8-13分钟。电泳检测4%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和改进的银染程序(200-400ml0.1MAgN03溶液中染色10-15分钟)检测PCR产物。含有水稻DNA的样品在前述合成引物组合(6-34对)时能分别在不同位点(引物对)上扩增出现籼、粳稻的不同基因型。水稻样品扩增的电泳产物为1)纯合籼稻型基因型(II),与基因组测序水稻品种93-11—致，2)纯合粳稻型基因型(JJ)，与基因组测序水稻品种日本晴一致，或3)籼-粳杂合基因型(U)，分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。从这34对引物可以任意抽取6-34对进行组合，均可对水稻样本进行鉴定。引物的数目越多，鉴定就越准确。基因频率的计算根据PCR产物的电泳结果和读取记录电泳结果中样品在各特异位点上的基因型结果，使用下述公式来计算样本各特异位点的平均籼稻型或粳稻型基因频率(Fi或巧)，其变化在0-100%之间F.=~^-^-籼稻型基因频率(％):'F.二~^-^——粳稻型基因频率(％):;27V式中《,为样本某一特异位点的纯合籼稻基因型，为样本某一特异位点的纯合粳稻基因型，为样本某一特异位点的籼-粳稻杂合基因型，iV为使用引物对的数目；籼稻和粳稻的确定根据检测样品中各特异位点(6-34)的平均基因频率(F,或巧)，确定水稻样品为籼稻或粳稻。具体判断标准如下基因频率(％)籼稻型(F》粳稻型(巧)水稻类型>9075~896卜7440~6026~39<101卜2526~3940~6061~74典型秈稻籼稻具粳稻血缘的籼稻中间类型11~2575~89粳稻<10>90典型粳稻本发明利用水稻全基因组特异位点上的InDd片段差异设计的特异引物，籼稻基因型、粳稻基因型和籼-粳稻杂合基因型的确定，以及籼稻型等位基因频率和粳稻型等位基因频率的计算来鉴定籼稻和粳稻，方法简便，准确性高，速度快。基于PCR扩增反应，利用籼-粳稻全基因组上34个位点上的InDel片段序列的差异和PCR反应的快速高效性，在短时间内能精确鉴定水稻样本的籼、粳属性。同时，由于本发明利用了来自水稻基因组不同染色体上的34个InDel位点，不仅能够准确鉴定典型的籼稻和典型的粳稻、籼稻和粳稻，而且还能够鉴定秈-粳分化程度不高的偏籼和偏粳的类型以及中间类型，大大提高了鉴定的精确度。本发明方法简便，效果快捷高效，有很好的推广应用前景。图1为水稻34个位点的电泳结果。图2为同一引物不同水稻品种的电泳结果。具体实施方式实施例1:利用InDel分子标记鉴定以"程氏指数法"为标准而确定的典型籼稻和典型粳稻水稻品种各10个。表l.实施例l鉴定实验材料:序水稻品种来源"程氏指数法"籼-粳基因InDel鉴定号(样品)鉴定结果频率(%)结果193-11中国籼稻100/0典型籼稻2日本晴曰本粳稻0/100典型粳稻3抚宁小白仁河北粳稻0/100典型粳稻4韦南红芒稻河北粳稻0/100典型粳稻诼鹿老租河北粳稻0/100典型粳稻6永年露水白河北籼稻100/0典型籼稻7密子晚上海粳稻0/100典型粳稻8苞麻糯上海粳稻0/100典型粳稻9江阴早江苏粳稻4/96典型粳稻10慢野稻江苏粳稻9/92典型粳稻11秃头糯稻江苏籼稻85/15籼稻12乌糯稻江苏粳稻6/94典型粳稻13雪里青浙江粳稻0/100典型粳稻14改良乌浙江籼稻94/6典型籼稻15三百粒头浙江粳稻9/91典型粳稻16紫红浙江籼稻96/4典型籼稻17迎秋糯安徽粳稻9/91典型粳稻18傍秋糯安徽籼稻91/9典型籼稻19秋前白安徽籼稻100/0典型秈稻20天坐早四川籼稻94/6典型籼稻使用反应体系如下PCR反应条件和程序如下(20|!1体系):1)10xPCR缓冲液(含25mMMgCl2)2(il2)2,5mMdNTPMixture1.6pl3)10laMPCR引物4)1UTaqDNAPolymerase0.2^il5)DNA模板20ng6)ddH20(双蒸水)补足至2(Hi1PCR反应程序1)94°C预变性4分钟2)94°C变性40秒3)退火温度52-58°C，退火时间30-45秒4)72。C延伸40秒5)循环步骤为2)3)4)，36个循环6)72°C延伸10分钟电泳检测4%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和改进的银染程序(200-400mlO.IMAgN03溶液中染色10-15分钟)检测PCR产物。含有水稻DNA的样品在权利要求1中合成引物组合(6-34对)时能分别在不同位点(引物对)上扩增出现籼、粳稻的不同基因型。水稻样品扩增的电泳产物为1)纯合籼稻型基因型(11)，与基因组测序水稻品种93-11—致；2)纯合粳稻型基因型(JJ)，与基因组测序水稻品种日本晴一致；或3)籼-粳杂合基因型(IJ)，分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。图1.不同稻水样品在R1M37位点的PCR和电泳结果。示与测序水稻品种"93-11"—致的纯合籼稻基因型(11)，与测序水稻品种"日本晴"一致的纯合粳稻基因型(JJ)，以及籼-粳稻杂合基因型(IJ)。各水稻不同样品的基因型读取和分析结果见附表-1(实施例l)，基因频率的计算结果以及水稻样品的籼-粳鉴定结果见表1。由上述实验结果可见，同一水稻样品在34个InDd特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型是不一样的，通过对所有特异位点基因型的读取记录和统计，可以计算出该样品在34个特异位点上的籼稻型和粳稻型等位基因频率(F/或巧)，最后由此确定样品属于籼稻或粳稻。对20个以"程氏指数法"所鉴定的水稻品种样本进行InDel分子标记检测的结果是基本一致的。实施例2:利用InDel分子标记鉴定未知秈、粳稻特性的水稻品种。从中国、孟加拉国、印度、日本、老挝、泰国和马来西亚等国随机抽取了20个样本来对其进行籼稻或粳稻的鉴定。表2.实施例2鉴定实验材料:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1174467日本29/71具籼稻血缘的粳稻1229457老挝24/76粳稻1378816老挝85/15籼稻1413305马来西亚37/63具籼稻血缘的粳稻1533212缅甸94/6典型籼稻1644494菲律宾24〃6粳稻178211泰国19/81粳稻1820256印度24/76粳稻1952285印度53/47中间类型2054026印度94/6典型籼稻使用反应体系如下PCR反应条件和程序如下(20^1体系):1)10xPCR缓冲液(含25mMMgCl2)2(il2)2.5mMdNTPMixture1.6|li13)10pMPCR引物lpl4)1UTaqDNAPolymerase0.2(il5)DNA模板20ng6)ddH20(双蒸水)补足至20plPCR反应程序1)94°C预变性4分钟2)94°C变性40秒3)退火温度52-58°C，退火时间30-45秒4)72°C延伸40秒5)循环步骤为2)3)4)，36个循环6)72°C延伸10分钟电泳检测4%聚丙烯酰胺变性凝胶电泳和改进的银染程序(200-400ml0.1MAgN03溶液中染色10-15分钟)检测PCR产物。含有水稻DNA的样品在权利要求1中合成引物组合(6-34对)时能分别在不同位点(引物对)上扩增出现籼、粳稻的不同基因型。水稻样品扩增的电泳产物为1)纯合籼稻型基因型(11)，与基因组测序水稻品种93-11—致，2)纯合粳稻型基因型(JJ)，与基因组测序水稻品种日本晴一致，或3)籼-粳杂合基因型(IJ)，分别具有籼稻型和粳稻型的电泳条带。各水稻不同样品的基因型读取和分析结果见附表2(实施例2)，基因频率的计算结果以及水稻样品的籼-粳鉴定结果见表2。图2.不同稻水样品在R1M37位点的PCR和电泳结果。示与测序水稻品种"93-11"一致的纯合籼稻基因型(II)以及与测序水稻品种"日本晴"一致的纯合粳稻基因型(JJ)。由上述实验结果可见，同一水稻样品在34个InDel特异位点上表现出的籼稻和粳稻基因型是不一样的，通过对所有特异位点基因型的读取记录和统计，可以计算出该样品在34个特异位点上的籼稻型和粳稻型等位基因频率(F/或F》，最后由此确定样品属于籼稻或粳稻。对20个来源于不同国家和地区随机选取的20个未知水稻品种样品进行InDel分子标记检测的结果表明4个样品是典型籼稻，l个样品是典型粳稻，l个样品是籼稻，7个样品是粳稻，6个样品是具籼稻血缘的粳稻，l个样品是中间类型。<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>附表-2(实施例2).随机选择的20个来自不同国家和地区水稻样品的基因型确定结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、一种用于鉴定籼稻和粳稻的插入或缺失特异引物对，其特征在于长度为17-24bp的寡聚核苷酸及其衍生物序列，共34对，列表如下<tablesid="tabl0001"num="0001"><table><tgroupcols="4"><colspeccolname="c001"colwidth="11%"/><colspeccolname="c002"colwidth="17%"/><colspeccolname="c003"colwidth="36%"/><colspeccolname="c004"colwidth="35%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">编号</entry><entrymorerows="1">引物对名称</entry><entrymorerows="1">正向引物DNA序列(5’-3’)</entry><entrymorerows="1">反向引物DNA序列(5’-3’)</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">1</entry><entrymorerows="1">R1M7</entry><entrymorerows="1">ATTCCTGGTTCTACATTACTTA</entry><entrymorerows="1">CGCCTCACTAGAATATCGGA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">2</entry><entrymorerows="1">R1M30</entry><entrymorerows="1">AAGGGGCCCTAATTTATCTA</entry><entrymorerows="1">TGTTTACTTTGTTCTTGGACTG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">3</entry><entrymorerows="1">R1M37</entry><entrymorerows="1">ATAGTTCGCCATCGTCAT</entry><entrymorerows="1">ACACGCCATAGCAAGGAA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">4</entry><entrymorerows="1">R1M47</entry><entrymorerows="1">AATAGAATTACTGATGAAACCTTA</entry><entrymorerows="1">GCCCGTTACCGCTTATGT</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">5</entry><entrymorerows="1">R2M10</entry><entrymorerows="1">CCCAGTCTGCTGCCATCT</entry><entrymorerows="1">GAATGTATTTCAGTTCCAGTAAG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">6</entry><entrymorerows="1">R2M24</entry><entrymorerows="1">GGGCAACAACGGCTCTG</entry><entrymorerows="1">AGGGAATAAGGCGATACGG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">7</entry><entrymorerows="1">R2M26</entry><entrymorerows="1">GCAGCAAAGTGCGGAGTA</entry><entrymorerows="1">CAGGTGAATTGCCAATTT</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">8</entry><entrymorerows="1">R2M50</entry><entrymorerows="1">CCTGAAGGAAATGATAGCAATAG</entry><entrymorerows="1">GTTTTGTATGCTCTTCACTTGTC</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">9</entry><entrymorerows="1">R3M10</entry><entrymorerows="1">CCGAGTACCATTGCTTTC</entry><entrymorerows="1">CTGCCATAGTTACTGCTCTGTT</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">10</entry><entrymorerows="1">R3M23</entry><entrymorerows="1">TGCTTACAAGGGTCCAAT</entry><entrymorerows="1">GGAGGTGCCTACCAAGAG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">11</entry><entrymorerows="1">R3M30</entry><entrymorerows="1">AGGCTAAGTGAAGAAATAATAAG</entry><entrymorerows="1">CTCCGTATTCATTACTGGTTG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">12</entry><entrymorerows="1">R3M53</entry><entrymorerows="1">ACACTGGCTACGGCAAAG</entry><entrymorerows="1">TTTGTTCGGGAATAATGATGC</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">13</entry><entrymorerows="1">R4M13</entry><entrymorerows="1">TACACGGTAGACATCCAACA</entry><entrymorerows="1">ATGATTTAACCGTAGATTGG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">14</entry><entrymorerows="1">R4M17</entry><entrymorerows="1">AGTGCTCGGTTTTGTTTTC</entry><entrymorerows="1">GTCAGATATAATTGATGGATGTA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">15</entry><entrymorerows="1">R4M43</entry><entrymorerows="1">CTTGAACCTGAGTGAGTGG</entry><entrymorerows="1">CGATGAAAATGATGTCTA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">16</entry><entrymorerows="1">R5M13</entry><entrymorerows="1">GAGAAAGAGTGGAAGGAG</entry><entrymorerows="1">AGTATCGTCAGGAGGGTC</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">17</entry><entrymorerows="1">R5M30</entry><entrymorerows="1">CTCAATTTCACCCATCCC</entry><entrymorerows="1">CGCTCCGTCTCCAACCTC</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">18</entry><entrymorerows="1">R6M14</entry><entrymorerows="1">AAATGTCCATGTGTTTGCTTC</entry><entrymorerows="1">CATGTGTGGAATGTGGTTG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">19</entry><entrymorerows="1">R6M44</entry><entrymorerows="1">TTAGGAATAAAGGCTGGATA</entry><entrymorerows="1">TTACCGTTAATAGGTGGAA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">20</entry><entrymorerows="1">R7M7</entry><entrymorerows="1">ACCTTCCCTCCCCTTTTGAT</entry><entrymorerows="1">AACTTGGTCTTCCTGTTTTATTG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">21</entry><entrymorerows="1">R7M37</entry><entrymorerows="1">CAGCCCTAAATCTAAATACCC</entry><entrymorerows="1">ACGTTGAGACAGGCGAGC</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">22</entry><entrymorerows="1">R8M23</entry><entrymorerows="1">CCTATTCACTCTACCGACAT</entry><entrymorerows="1">GTTTAGTTCCCATTGCTTT</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">23</entry><entrymorerows="1">R8M33</entry><entrymorerows="1">CGAAAGAGGAGAGGGGTAGT</entry><entrymorerows="1">CGAAAACGAGAAACAAATA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">24</entry><entrymorerows="1">R8M46</entry><entrymorerows="1">CAGCAGAGTCCAGAGAAGAT</entry><entrymorerows="1">GCATAAGATGGCGAGTGA</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables><tablesid="tabl0002"num="0002"><table><tgroupcols="4"><colspeccolname="c001"colwidth="11%"/><colspeccolname="c002"colwidth="17%"/><colspeccolname="c003"colwidth="36%"/><colspeccolname="c004"colwidth="35%"/><thead></column></row><row><column><entrymorerows="1">25</entry><entrymorerows="1">R9M10</entry><entrymorerows="1">CTTTGGATTCAGGGGGA</entry><entrymorerows="1">AACTTGAAACGGAGGCAG</entry></column></row></thead><tbody></column></row><row><column><entrymorerows="1">26</entry><entrymorerows="1">R9M42</entry><entrymorerows="1">CTATAAGACCAAAACGAAAACT</entry><entrymorerows="1">GAAAACCATTGTGTCACTGTA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">27</entry><entrymorerows="1">R10M17</entry><entrymorerows="1">TGAACAATAAACCACAGAAGCA</entry><entrymorerows="1">CCCTTTATTCCCTCCTTTG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">28</entry><entrymorerows="1">R10M30</entry><entrymorerows="1">CCCTAAAAATAGAGCAACCT</entry><entrymorerows="1">ACCCATAATACTACCAATCAAC</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">29</entry><entrymorerows="1">R10M40</entry><entrymorerows="1">GTCCCTAGGCCATCTCTTG</entry><entrymorerows="1">GCGAATAGGGGTGGACAG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">30</entry><entrymorerows="1">R11M23</entry><entrymorerows="1">AAGGTTGACAAGGACAGAAG</entry><entrymorerows="1">TCGCAGGAATGGATAAAA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">31</entry><entrymorerows="1">R11M40</entry><entrymorerows="1">AAGAAAAATATCTATTGAGGAGTG</entry><entrymorerows="1">GGAGGACCATAAATGACGG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">32</entry><entrymorerows="1">R12M10</entry><entrymorerows="1">ATCATTTCAGCCTGTGCC</entry><entrymorerows="1">AGCTTAATAGGGGGGACG</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">33</entry><entrymorerows="1">R12M27</entry><entrymorerows="1">ATTTCATTGCCATCAGTT</entry><entrymorerows="1">GTAATCTTCTATCCGTTCA</entry></column></row></column></row><row><column><entrymorerows="1">34</entry><entrymorerows="1">R12M43</entry><entrymorerows="1">CCGCCGAGAAGAAACAAA</entry><entrymorerows="1">CCCAAGAACAGGATTACA</entry></column></row></tbody></tgroup></column></row><table></tables>。全文摘要本发明属于生物鉴别
技术领域：
，具体为一种利用水稻NDA插入或缺失分子标记鉴定籼稻和粳稻的方法。本发明利用籼稻品种(93-11)和粳稻品种(日本晴)全基因组DNA序列的比对而获得InDel差异片段所设计的34对特异DNA引物。对目标水稻品种进行DNA提取、DNA片段扩增和电泳分离以及电泳图谱的分析和统计来鉴定籼稻和粳稻品种。具体而言，利用34对InDel引物组合，基于聚合酶链式反应和凝胶垂直板电泳获得的指纹图谱进行分析和统计，根据34个InDel位点上的籼稻型等位基因和粳稻型等位基因出现的平均频率(F<sub>i</sub>或F<sub>j</sub>)，计算出被测水稻样品的籼稻或粳稻特性。本发明需用检测样品量少，方法简便快捷，鉴定结果准确，具有良好的推广应用前景。文档编号C12Q1/68GK101323878SQ20081003711公开日2008年12月17日申请日期2008年5月8日优先权日2008年5月8日发明者卢宝荣,蔡星星申请人:复旦大学