专利名称：乳腺癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体乳腺癌遗传易感性的试剂盒, 通过同时检测与乳腺癌密切相关的雌激素受体a基因(ER-a)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因(C0MT)、谷 胱tt肽硫转移酶Pl基因(GSTP1)、人乳腺癌易感基因1 (BRCA1)、人乳腺癌易感基因2 (BRCA2)上的单 核苷酸多态性位点基因型来评估个体乳腺癌遗传易感性。
背景技术：
乳腺癌是乳腺导管上皮细胞在各种内外致癌因素的作用下，细胞失去正常特性而异常增生，以致超过 自我修复的限度而发生癌变的疾病，临床以乳腺肿块为主要表现。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 有发病率高、具侵袭性、但病程进展缓慢、自然生存期长等特点。
乳腺癌是主要危害妇女身体健康的疾病，男性也可患乳腺癌，但男性患乳腺癌的机会比女性要少100 倍。乳腺癌的好发部位以乳房外上占多数。早期乳腺癌可无任何自觉症状，病变晚期可出现乳腺肿块，质 地硬韧，边界不甚清晰，无包膜感，推之移动性小，多数无明显疼痛，乳头出现回缩、偏位，乳头溢流黄 水或血水，癌性湿疹样改变。
.雌激素受体(ER)是一种配体依赖的转录因子，属于核受体超家族，在配体(如，雌激素)的结合作' 用下其构象发生改变，形成同源或异源二聚体，结合到含雌激素应答元件(estrogen response element, ERE)的启动子上，从而调节耙基因的表达。这是ER依赖配体的经典途径，后来又发现了 ER的另外三条途 径，即不依赖配体的途径，不依赖ERE的转录途径，和非转录信号途径。ER-a基因PvuII位点是第l号内 含子上的一个C/T多态位点(C397T)，该位点突变后能被限制性内切酶PvuII酶切。,.该多态位点的基因型有 CC(PP)、 CT(Pp)、 TT(pp)， p表示可被PvuII酶切。其中TT和CT被确定为风险金'因型，与乳腺癌的发病 有关。ER- a基因Xba I位点是第1号内含子上的一个G/A多态位点(G351A)，该位点突变后能被限制性内 切酶XbaI酶切。该多态位点的基因型有GG(XX)、 GA(Xx)、 AA(xx)， x表示可被Xbal酶切。其中M和GA 被确定为风险基因型，与乳腺癌的发病有关。ER-a的PvuII和XbaI基因多态性位点均位于基因的转录调 控区，因此这两处位点的突变对基因表达有一定影响，可上调基因表达。大量研究发现，ER-a基因的两 个多态位点(C397T和G351A)与乳腺癌易感性相关。当携带风险基因型(397TT/CT, 351M/GA)时，ER-a水平上调，增强TGF-a表达，从而促进细胞生长，乳腺癌发生风险上升。
乳腺癌的遗传易感因素中有相当一部分是与雌激素代谢调控相关的基因。天然的雌激素是ne雌二醇 (E2)。 E2与其它激素共同作用，具有促进乳腺上皮细胞增生功能。C0MT基因第4号外显子上的一个G/A 多态位点突变，导致其第158位密码子编码的氨基酸由Val变为Met。该位点的基因型有GG、 GA、 AA，其 中A等位基因与乳腺癌的发生有关，M基因型(即Met/Met基因型)被确定为乳腺癌风险基因型。C0MT 基因的Val、 Met等位基因分别与酶的高、低活性有关，且呈共显性遗传，即Val/Val基因型的酶具有高 活性，Val/Met基因型的酶具有中度活性，而Met/Met基因型的酶活性最低。Val/Val和Met/Met基因型 之间，酶活相差3-4倍。当携带风险基因型(Met/Met，即AA)时，C0MT酶活性下,降，影响了儿茶酚雌激 素的灭活，即儿茶酚雌激素增多，乳腺癌发生风险上升。 "
GSTPl是谷胱甘肽硫转移酶系(GSTs)家族中的一员，属于其中的pi类，主要存在于肺和胎盘中，具有 与GSTs其它成员相似的功能，即介导各类亲电子化合物，如药物、环境毒素、氧化链产物等，与谷胱甘 肽结合，进入下一步的代谢步骤，最终将这些物质排出体外。GSTP1基因第5号外显子上存在一个A/G多 态位点，引起第105位密码子编码氨基酸由lie变为Val。 11el05Val位点有多种表示方法，在NCBI数据 库中表示为A342G，在某些文献中又表示为A313G。该多态位点的基因型有M、 AG、 GG,其中GG(Val/Val) 基因型是乳腺癌的风险基因型。目前研究表明，11el05Val位点突变造成的氨基酸改变，影响到了 GSTP1 多肽晶体结构中亲电子结合位点氨基酸的空间距离和结构，从而影响蛋白亲电子结合位点与底物的结合， 基因功能因此降低，造成致癌物在体内的蓄积，最终易导致乳腺癌的发生。检测GSTP1 11el05Val位点的. 基因型，对于癌症发病的早期预警，癌症治疗的药物筛选以及预后都具有重要的作用。当携带GG(Val/Val) 风险基因型时，乳腺癌的患病风险增大。BRCA1基因编码一种核磷酸蛋白，该蛋白在维持基因组稳定和抑制肿瘤发生方面起重要作用。BRCA1基 因具有多种剪接方式，可产生不同长度和功能的mRNA片段及蛋白。具有正常生理功能的BRCA1能参与DNA 损伤的修复；作用于"细胞周期的检测点"，从而对细胞周期进行调控；并且能与RNA聚合酶II及转录活 化因子p53和c-町c相互作用，从而调节细胞的转录。BRCA1基因的1100delAT位点突变，是核苷酸序列 1100位上缺失AT，移码突变，导致了在密码子328位翻译终止，产生截短蛋白，BRCA1蛋白功能受到严重 影响。因此，当携带该突变基因型(一/一或AT/--)时，乳腺癌风险上升。BRCA1基因的589delCT位点 突变，是核苷酸序列589位上缺失CT，移码突变，导致了在密码子157位翻译终止，产生截短蛋白，BRCA1 蛋白功能受到严重影响。因此，当携带该突变基因型(一/一或CT/—)时，乳腺癌发生风险上升。BRCA1 基因的T5319A位点突变，是该基因核苷酸序列5319位上的T被A替换，导致密码子1734位编码氨基酸 由Phe变为Ser，为氨基酸错义突变。该突变可能影响BRCA1的功能，因此携带该k变基因型(AA或TA) 时，乳腺癌发生风险上升。
BRCA2是继BRCA1之后发现的家族性乳腺癌/卵巢癌易感基因。BRCA2在乳腺和甲状腺组织中高表达， 肺、卵巢和脾脏组织中其表达水平低下。该基因长度约为BRCA1的2倍，由27个外显子组成，其中外显 子11占全部编码序列的50%， mRNA长度约为10kb，其编码产物蛋白含3， 448个氨基酸。研究表明，BRCA2 与BRCA1蛋白在一个限制区域内(BRCA1的氨基酸1394-1474区和BRCA2的氨基酸1783-1863区)具有微 弱的相似性。BRCA2基因突变在男性乳腺癌患者中多有出现，大大提高了男性乳腺癌的发生风险，约为6%。 相反，携带BRCA1基因突变的男性却没有患乳腺癌的风险。无论男性还是女性，携带BRCA2基因突变的个 体发生胰腺癌及另外一些肿瘤的风险都有所提高。BRCA2基因的5950delCT位点突变，是核苷酸序列5950 位上缺失CT，位于第11号外显子。该突变为移码突变，导致了在密码子1909位翻译终止，产生截短蛋白。 当携带该突变基因型(一/一或CT/一)时，BRCA2功能受到影响，无法通过DNA修复方式来维持基因组遗 传信息的稳定，乳腺癌发生风险上升。
发明内容
基于雌激素受体a基因(ER-a)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因(C0MT)、谷胱甘肽硫转移酶Pl基因 (GSTP1)、人乳腺癌易感基因l (BRCA1)、人乳腺癌易感基因2 (BRCA2)上的8个SNP位点多态性可用来 评估个体乳腺癌遗传易感性的基础上，本发明提供一种检测个体乳腺癌遗传易感性的试剂盒。 该试剂盒包括
检测ER-a基因上PvuII SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测ER- a基因上Xba I SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测COMT基因上Vall58Met SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测GSTP1基因上11el05Val SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测BRCA1基因上llOOdelAT SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； .检测BRCA1基因上589delCT SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测BRCA1基因上T5319A SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测BRCA2基因上5950delCT SNP多态性基因型的特异性引物对》特异性荧光探针对； 荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常輝的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，'fe异性荧光探针对可用 常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
10 X荧光定量PCR反应缓冲液8W，
25mM dNTP混合液0.8W，
25mM MgC12溶液4.8^1，
5units/W Taq DNA聚合酶0.
20MM特异性引物对每条引物各0.225W，
10PM特异性荧光探针对每条探针各0. 25W，去离子水42. 6W。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行8次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积10W，包含浓度为20ng/W的DNA模板2W、 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1W25mMdNTP 混合液、0.6ri 25mM MgCl2溶液、0. 025W (5unitsAa) Taq DNA聚合酶、20幽的有义引物和反义引物 各0.225W、 HM1的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25W，去离子水5.325W。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50'C、 2分钟，95'C、 IO分钟，进行60个循环的95'C、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根 据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体乳腺癌遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的ER-ci基因上PvuII SNP位点、ER-ct基因上Xba I SNP位点、COMT基因上Vall58Met SNP位点、GSTP1基因上11el05Val SNP位点、BRCA1基因上1100delAT SNP位点、BRCA1基因上589delCTSNP位点、BRCA1基因上T5319A SNP位点、BRCA2基因上5950delCT SNP 位点进行荧光定量PCR检测，确定这8个SNP位点的基因型。
步骤3:个体乳腺癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体乳腺癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者乳腺癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体乳腺癌遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体乳腺癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测雌激素受体α基因(ER-α)上PvuII SNP位点、雌激素受体α基因(ER-α)上Xba I SNP位点、儿茶酚氧位甲基转移酶基因(COMT)上Val158Met SNP位点、谷胱甘肽硫转移酶P1基因(GSTP1)上Ile105Val SNP位点、人乳腺癌易感基因1(BRCA1)上1100delAT SNP位点、人乳腺癌易感基因1(BRCA1)上589delCT SNP位点、人乳腺癌易感基因1(BRCA1)上T5319A SNP位点、人乳腺癌易感基因2(BRCA2)上5950delCT SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括10 X荧光定量PCR反应 缓冲液8(4, 25mMdNTP混合液0.8^1， 25raMMgC12溶液4. 8W， 5units/W Taq DNA聚合酶0.02^1， 20幽 特异性引物对每条引物各0.225W, IOMM特异性荧光探针对每条探针各0.25W,去离子水42.6W。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-2(TC 。
全文摘要
本发明公开了一种检测乳腺癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测雌激素受体α基因(ER-α)、儿茶酚氧位甲基转移酶基因(COMT)、谷胱甘肽硫转移酶P1基因(GSTP1)、人乳腺癌易感基因1(BRCA1)、人乳腺癌易感基因2(BRCA2)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与乳腺癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体乳腺癌遗传风险。
文档编号C12Q1/68GK101608225SQ20081003926
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司