专利名称：：一种儿童学习能力基因分析检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因芯片检测产品，具体的说，涉及一种有关儿童学习能力基因分析检测的试剂盒。
背景技术：
：儿童学习能力障碍也称学习不能或学习困难，这些儿童没有感知和智能的缺陷，也非社会文化教育落后造成，主要是由于在听、说、读、写、推理计算和社会能力获取利用方面存在缺陷而导致的学习困难，包括诵读困难、书写计算不能和非语言性困难等。其中诵读困难较多见，常常读错或用语义相近字代替(语言障碍)或读对而拼写错(直观映象障碍)，或读的挺好，不解其意(理解障碍)。在诊断前测试智商时，往往在正常范围。其智力测验分数(IQ)大于70，但在学校的学习中却有严重困难。具体说，即在一门或几门主要课程(语文、数学等)的学习中有特殊障碍，常常达不到教学大纲规定的及格要求。学习困难的具体表现为注意力不集中；对读、写、算等方面的记忆差；写字时看一笔写一笔，做作业的时间拖得太长；等等。儿童学习能力产生障碍的产生原因非常多。主要包括内部因素(如生理、心理方面的因素)和外部因素(如学校、家庭、生活环境等方面的因素)两方面。事实上，在形成学习困难的过程中，这些因素可单独作用，也可能相互作用。一般而言，确定学习障碍主要由心理学专家进行，在几个方面来评估儿童的学习能力障碍性问题。但是众所周知，首先，心理测试发展历史有多年，但是其推广程度和民众接受程度，尤其在小城市和乡村，一直是偏低。所以愿意采用心理测试的人确定儿童学习能力障碍并不多。另外，心理学测试一方面对测试者要求高，另一方面对被测者的配合程度，精神状态有严格要求，否则容易得出错误结论。即心理测试的准确性受外界环境影响较大。人们希望有一种简便而客观的方法可以进行儿童学习能力测试。
发明内容为了可以简便而客观地对儿童学习能力进行测试，本发明提供一种儿童学习能力基因分析检测试剂盒，可以以儿童DNA样本为测试样本，对儿童学习能力的基因进行检测，从而判断其学习能力障碍是否是生理缺陷因素引起，有助于进一步治疗。该试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在荧光定量PCR仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。所述的预混PCR反应液含有SYBRgreenI，以及儿童学习能力分析基因KIAA0319和MRS2的两个基因突变位点的扩增引物；扩增引物为包含突变位点的上游引物和下游引物；针对KIAA0319基因突变位点的扩增引物为两个包含突变位点的上游引物和下游引物，序列如下上游引物F-KC5-TGGACTCAGAGGGGGCTGC-3上游引物F-KT5-GTGGACTCAGAGGGGGCTGT-3下游引物R-K3-CTGACACTCGTGACCCGAAAAGA-5针对MRS2基因突变位点的扩增引物为上游引物和两个包含突变位点的下游引物，序列如下上游引物F-M5-TGATACACATGTTGGGAGTATGTTAAT-3下游引物R-MT3-TTCCCTCAACGACAACCTTTTG-5下游引物R-MC3-CTCCCTCAACGACAACCTTTTG-5。上述的儿童学习能力基因分析检测试剂盒，其一优选例对扩增引物进行人为修饰，所述的修饰在于，在针对KIAA0319基因突变位点的上游引物的倒数第三个位置替换成错配的碱基T—A，所得到的上游引物序列为上游引物FA-KC5-TGGACTCAGAGGGGGCAGC-3上游引物FA-KT5-GTGGACTCAGAGGGGGCAGT-3。上述的儿童学习能力基因分析检测试剂盒，所述的阳性对照品有4个，分别包含如下的序列SEQ1:GGCATTAGAACCTACGAGATCAATTACAAGGATAASEQ2:AGGCATTAGAACCTACGAGATCAATTACAAGGATAASEQ3:ATGGAGTTGCTGTTGGAAAACTACTACCGATTGGCTGASEQ4:TATAGCATTCAGCTACCAGTGGAAAAGCTAGCCTTTGT上述的儿童学习能力基因分析检测试剂盒，所述的阴性对照品包含的序列为SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGG5AACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC本发明的使用不需要儿童本人到场，只需取其DNA样本，比如口腔样本，更有效保护对方隐私。不用问答形式，减轻患者的心理负担，以及人为因素对诊断结果的影响。可以对儿童学习能力进行简便而客观地分析，便于推广应用，有助于快速诊断儿童学习能力障碍的遗传因素。图l，图2，为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。该图的横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光值。图1中横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对,FA-KC+R-K，扩增样本所生成的扩增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为FA-KT+R-K这对引物扩增样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2。图2中横线3表示荧光域值；曲线3表示为引物对F-M+R-MT，扩增样本所生成的扩增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为C3;曲线4为F-M+1-1^这对引物扩增样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C4。具体实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例l:试剂盒的制备。包括(1)探针的准备；(2)DNA抽提试剂；(3)预混反应液；(4)标准阳性对照；(5)标准阴性对照。(1)探针的准备；由通常的核苷酸引物合成仪合成。序列如下上游引物FA-KC5-TGGACTCAGAGGGGGCAGC-3上游引物FA-KT5-GTGGACTCAGAGGGGGCAGT-3。下游引物R-K3-CTGACACTCGTGACCCGAAAAGA-5上游引物F-M5-TGATACACATGTTGGGAGTATGTTAAT_3下游引物R-MT3-TTCCCTCAACGACAACCTTITG-5下游引物R-MC3-CTCCCTCAACGACAACCTTITG-5。使用前按每OD引物稀释为100"moL/L(即100pmol/ul)浓度的加水量，开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心l分钟，防止开盖时引物散失。使用前，将浓溶液稀释成工作液10pmol/ml后进行实验。(2)DNA抽提试齐U:试剂名称成分体积浓度缓冲液GASDS100ml0.5Mmol/L缓冲液GB画H100ml50mmol几缓冲液GD碳酸钠-丙酮100ml1Mmol/L缓冲液GW无水乙醇IO(M原液洗脱液Tris盐50ml10Mmol/L(3)预混PCR反应液预混反应液包括4种，每种内含一对上下游扩增引物，各对应一个基因型。按lml配比量计算，共同的成分配制为100uM的dNTP,20ul;500U/ulTaqDNAPolymerase20ul;2XQuantOneSt印SYBR1300ul;10uM的上游引物50ul;10uM的下游引物50ul;RNase-freeddH20860ul。管1的l对引物为-上游引物FA-KC5-TGGACTCAGAGGGGGCAGC_3下游引物R-K3-CTGACACTCGTGACCCGAAAAGA-5管2的l对引物为-上游引物FA-KT5-GTGGACTCAGAGGGGGCAGT-3。下游引物R-K3-CTGACACTCGTGACCCGAAAAGA-5管3的l对引物为上游引物F-M5-TGATACACATGTTGGGAGTATGTTAAT-3下游引物R-MT3-TTCCCTCAACGACAACCTTITG-5管4的1对引物为上游引物F-M5-TGATACACATGTTGGGAGTATGTTAAT-3下游引物R-MC3-CTCCCTCAACGACAACCTTTTG-5。(4)标准阳性对照标准阳性模板是含有KIAA0319和MRS2的两个基因中含突变核苷酸片段构成的Pucl8-T重组质粒，该重组质料转化大肠杆菌DH5a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到109C叩y/ul，一20。C保存。贮存存为103Copy/ul，使用浓度为105Copy/ul。标准阳性模板提供4种，每种浓度为105Copy/ul。序列如下:SEQ1:GGCATTAGAACCTACGAGATCAATTACAAGGATAASEQ2:AGGCATTAGAACCTACGAGATCAATTACAAGGATAASEQ3:ATGGAGTTGCTGTTGGAAAACTACTACCGATTGGCTGASEQ4:TATAGCATTCAGCTACCAGTGGAAAAGCTAGCCTTTGT(5)标准阴性对照标准阴性模板是含有拟南芥基因片断180个核苷酸构成的Pucl8-T重组质粒。该重组质料转化大肠杆菌DH5ci增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到103C叩y/ul，一20。C保存。贮存存为103C叩y/ul，使用浓度为105C叩y/ul。序列如下SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC实施例2:试剂盒的使用(1)样本的制备取样方式使用棉签在面颊内擦拭IO次。注意为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。a)处理材料将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400ul缓冲液GA。b)加入20ul蛋白酶K溶液，涡旋IO秒混匀，56'C放置60分钟，其间每15分钟涡旋混匀数次。c)加入400ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，70'C放置10分钟，此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。d)加200iU无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12,000rptn(13，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。f)向吸附柱CR中加入500yl缓冲液GD，12,000rpmfl3，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。g)向吸附柱CR中加入700yl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。h)向吸附柱CR中加入500ul漂洗液PW，12,000rpra(~13，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液。i)将吸附柱CR放回收集管中，12,000卬m(13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗。j)将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(~13,400Xg)离心2分钟。重复一次。(2)实验过程a)按样品数n(样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液每管23ul分装于反应管中。b)将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照(务必振荡混匀数秒)各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应。c)PCR条件95°C10"6o°cr(3)结果分析与判断.a)定量检测SNP的判断标准当lACtl《1，判断为杂合型；当lACtl》5，判断为纯合型。如图，图1中横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对FA-KC+R-K,扩增样本所生成的扩增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为FA-KT+R-K这对引物扩增样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2;在图1中，-1《ACt《1，表示该样本为KIAA0319基因杂合型样本；图2中横线3表示荧光域值；曲线3表示为引物对F-M+R-MT,扩增样本所生成的扩增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为C3;曲线4为F-M+11(:这对引物扩增样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C4;在图2中，ACt》5，表示该样本为MRS2基因杂合型样本。b)结果分析检测结果分三种类型判断方式如下<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>图1和图2的结果表示基因型为KIAA0319CT+MRS2AA，是属于结果判断的第三种情况，显示识别和理解能力可能有损伤，需要结合其他的检查手段。可能有学习困难发生。〈110〉上海裕隆生物科技有限公司〈120〉一种儿童学习能力基因分析检测试剂盒〈歸13〈210〉1〈211〉19<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F-KC。<400>1tggactcagagggggctgc19<210〉2<211>20〈212〉纖〈213>人工序列〈220〉<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F-KT。〈400〉2gtggactcagagggggctgt20〈210〉3<211〉23<212>DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物R-K。<400〉3agaaaagcccagtgctcacagtc23〈210〉4〈211〉27<212>腿〈213〉人工序列<220〉〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F-M。<400>4tgatacacatgttgggagtatgttaat27〈210〉5〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物R-MT。〈400〉5gttttccaacagcaactccctt22〈210〉6〈211〉22〈212〉DNA<213>人工序列<220>.〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为下游引物R-MC。〈400〉6gttttccaacagcaactccctc22<210〉712〈211〉19〈212>難<213>人工序列〈220〉〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物上游引物FA-KC。〈400〉7tggactc卿gggggcagc19〈210〉8〈211〉20〈212〉腿〈213>人工序列<220〉〈223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童学习能力基因分析检测试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物上游引物FA-KT。<400>8gtggactcagagggggcagt20〈210〉9〈211>192〈212〉DNA〈213〉人属(Homo)〈400>9tatgggtagctcagatggggtggactcagagggggctgtgctagtgggaggtgttgggat60gctgtgctctgtactccccggggtgactgtgagcactgggcttttctccacggtgactga120gctgagctccaggcttgccggaggaagactatgggaaggcattagaacctacgagatcaa180ttacaaggataa192〈210〉10〈211〉192〈212〉DNA〈213〉人属(Homo)13<400>10tatgggtagcgctgtgctctgctgagctccttacaaggattcagatggggtggactcagagggggctgcgctagtgggaggtgttgggat60gtactccccggggtgactgtgagcactgggcttttctccacggtgactga120aggcttgccggaggaagactatgggaaggcattagaacctacgagatcaa180aa192〈210〉11〈211〉194<212〉DNA〈213〉人属(Homo)〈400〉11acaaaggctagcttttccactggtagctgaatgctatatactaatttaggaagtttttgtGOcactaagtatatgatacacatgttgggagtatgttaattattttctcttttaattgaagt120gaaaagagcagtgctgggattgaccatgcagaagagatggagttgctgttggaaaactac180taccgattggctga194〈210〉12〈211〉194〈212〉DNA〈213〉人属(Homo)<400>12tcagccaatcggtagtagttttccaacagcaactccatttcttctgcatggtcaatccca60gcactgctcttttcacttcaatt朋aagagaaaataattaacatactcccaacatgtgta120tcatatacttagtgacaaaaacttcctaaattagtatatagcattcagctaccagtggaa180aagctagcctttgt194〈210〉13〈211〉180<212〉DNA〈213〉人属<400>13ttcgttattgaacttgggattatstttgca(Homo)aatcttgttttggttctcttgtgtggaatgcattgttcttgcttctctgg60atgatgacaaaaatacgatatctctaaggctaattgctgtgcggatgaaa120cgtcagtctgatcccattatgtatataacattsggagttggtgcstgctc180权利要求1.一种儿童学习能力基因分析检测试剂盒，其特征在于由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成；所述的预混PCR反应液含有SYBRgreenI，以及儿童学习能力分析基因KIAA0319和MRS2的两个基因突变位点的扩增引物；扩增引物为包含突变位点的上游引物和下游引物；针对KIAA0319基因突变位点的扩增引物为两个包含突变位点的上游引物和下游引物，序列如下上游引物F-KC5-TGGACTCAGAGGGGGCTGC-3上游引物F-KT5-GTGGACTCAGAGGGGGCTGT-3下游引物R-K3-CTGACACTCGTGACCCGAAAAGA-5；针对MRS2基因突变位点的扩增引物为上游引物和两个包含突变位点的下游引物，序列如下上游引物F-M5-TGATACACATGTTGGGAGTATGTTAAT-3下游引物R-MT3-TTCCCTCAACGACAACCTTTTG-5下游引物R-MC3-CTCCCTCAACGACAACCTTTTG-5。2.如权利要求l所述的儿童学习能力基因分析检测试剂盒，其特征在于对扩增引物进行人为修饰，所述的修饰在于，在针对KIAA0319基因突变位点的上游引物的倒数第三个位置替换成错配的碱基，所得到的上游引物序列为上游引物FA-KC5-TGGACTCAGAGGGGGCAGC-3上游引物FA-KT5-GTGGACTCAGAGGGGGCAGT-3。3.如权利要求l或2所述的儿童学习能力基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品有4个，分别包含如下的序列SEQ1:AGATCAATTACAAGGATAA;SEQ2:AGATCAATTACAAGGATAA:SEQ3:ACTACCGATTGGCTGA;SEQ4:AAAAGCTAGCCTTTGT。4.如权利要求1或2所述的儿童学习能力基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对照品包含的序列为SEQ5:TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTTGTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGATATGATGACAAAAATACGATATCTCTAAGGCTAATTGCTGTGCGGATGAAATATATTTGCACGTCAGTCTGATCCCATTATGTATATAACATTAGGAGTTGGTGCATGCTC。全文摘要本发明提供一种儿童学习能力基因分析检测试剂盒，可以简便而客观地对儿童学习能力进行测试。该试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。所述的预混PCR反应液含有SYBRgreenI，以及儿童学习能力分析基因KIAA0319和MRS2的两个基因突变位点的扩增引物。本发明克服了由心理学专家对儿童的学习能力障碍性进行评估时，对测试者要求高，又对被测者的配合程度，精神状态有严格要求，测试结果的准确性受人为因素影响大的缺点。以儿童DNA样本为测试样本，对儿童学习能力的基因进行检测，从而客观地判断其学习能力障碍是否是生理缺陷因素引起，有助于进一步治疗。文档编号C12Q1/68GK101619344SQ20081003997公开日2010年1月6日申请日期2008年7月1日优先权日2008年7月1日发明者汪宁梅,穆海东,飒黎申请人:上海裕隆生物科技有限公司