专利名称：Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途和制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及Estp突变体蛋白、基因、重组载体及其用途 和制备方法。
背景技术：
拟除虫菊酯化合物为一种疏水酯类杀虫剂或毒素，是目前仅次于有机磷和氨基甲 酸酯农药的一类杀虫剂，约占世界杀虫剂的20%。广谱性菊酯类农药如氯氰菊酯、 甲氰菊酯、溴氰菊酯在现代农业中广泛应用，其残留对生态环境产生了一定的影响。 农药残留已成为突出的环境问题，越来越受到人们的关注。农药残留的去除方法主要 有生物降解、物理方法、化学方法等，其中生物降解是指通过生物(包括各种微生物、 植物和动物)的作用将大分子分解成小分子化合物的过程。生物降解因不带入二次污 染、条件温和，而越来越受到重视，已成为当前食品安全领域的研究热点。化学农药 的生物降解主要是通过微生物、降解酶、工程菌、植物来进行，其中降解酶往往比产 生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，而且酶的降解效果远胜于微生物本身， 尤其是在残留农药质量浓度低的情况下。
现在疏水酯类杀虫剂或毒素如拟除虫菊酯类农药的使用越来越为广泛，因而其残留 问题也凸显了出来。但到目前为止，发现的菊酯降解酶(pyrethroid-hydrolyzing esterase, Estp)—般是羧酸酯酶，但其对拟除虫菊酯农药的水解能力相当有限。因 此，寻找一种的酶蛋白和方法，能有效水解的疏水酯类杀虫剂或毒素，尤其是菊酯类 农药，显得愈发重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是一种具有有效降解疏水酯类杀虫剂或毒素活性的蛋 白。
为了解决上述问题
一方面，本发明公开了一种Estp突变体蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白
(a) 其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的蛋白；
(b) 至少与(a)中的氨基酸序列35 %同源性且具有水解的疏水酯类杀虫剂或毒 素活性的蛋白，除了氨基酸序列如SEQ ID N0.7所述的蛋白。
3其中所述Estp突变体蛋白与SEQ ID NO. l所述氨基酸序列具有50 %的同源性。 更优选地，该Estp突变体蛋白与SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列具有90 %的同源 性。
在实施方案里，本发明(b)中所述Estp突变体蛋白优选自氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ IDNO. 3所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO. 4 所述的蛋白、氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所述的蛋白、或氨基酸序列如SEQ ID NO. 6 所述的蛋白中之一，最优选为氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述的蛋白。
一方面，本发明公开了一种多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子编码本发明 所述Estp突变体蛋白。
一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的重组表达载体。
一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。
在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。
另一方面，本发明公开了一种本发明所述Estp突变体蛋白的制备方法，包括如下 步骤
① Estp突变体蛋白表达载体的构建；
② Estp突变体蛋白转化体的制备；
③ Estp突变体蛋白的表达；
Estp突变体蛋白的纯化。
另一方面，本发明公开了一种降解疏水酯类杀虫剂或毒素的组合物，包括本发明 所述Estp突变体蛋白和一种或多种可接受的载体。
另一方面，本发明公开了本发明所述Estp突变体蛋白在去除或降低疏水酯类杀虫 剂或毒素残留或污染方面的用途。
特别优选的疏水酯类杀虫剂或毒素是拟除虫菊酯。该拟除虫菊酯可以是I型拟除
虫菊酯或n型拟除虫菊酯。优选地，拟除虫菊酯是溴氰菊酯。
与现有的Estp蛋白比较，本发明所述的Estp突变体蛋白活性更高，能有效水解 地疏水酯类杀虫剂或毒素，并且稳定、易复性，可开发为工业应用低成本和高质量的 酶制剂。这为解决疏水酯类杀虫剂或毒素残留或污染提供了新的选择。
图1.纯化后不同Estp突变体蛋白的电泳图。
图2.不周Estp突变体蛋白对溴氰菊酯的降解效果。
具体实施例方式
下文将进一步详细讨论本发明的多个方面。
疏水酯类杀虫剂或毒素可以是任何具有疏水性质、包含酯基并对活的生物体具有一 定程度的毒性的分子。
拟除虫菊酯是除虫菊杀虫剂的合成类似物。例如，拟除虫菊酯包括(每种的常用名 与The Pesticide Manual (第12版) 一致)苄氯菊酯、睛二氯苯醚菊酯、溴氢菊酯、 氯氰菊酯、(x —氯氰菊酯、溴氰菊酯、醚菊酯、氯氟胺氰戊菊酯、杀灭菊酯、氟氯氰菊 酯、氟酯菊酯、氟胺氰菊酯、乙氰菊酯、氯氟氰菊酯、七氟苯菊酯、氟氯菊酯、四氟 菊酯、己体氟氰菊酯和氟溴醚菊酯。
I型拟除虫菊酯化合物(如苄氯菊酯)与II型拟除虫菊酯化合物的不同之处在于， II型化合物在苯氧基苄基部分的a—碳原子上具有氰基基团。II型拟除虫菊酯的一些 实例为氯氰菊酯、嗅氰菊酯和睛二氯苯醚菊酯。能用本发明的方法水解的拟除虫菊酯 杀虫剂的实例包括但不限于如下这些化合物3-苯氧基苄基(lRS)—顺，反一3—(2，
2 — 二氯乙烯基)一2,2 —二甲基环丙烷羧酸盐[苄氯菊酯)，a —氰基一3 —苯氧基 苄基一1一(4一乙氧苯基)_2,2 —二氯环丙烷羧酸盐[乙氰菊酯]，(RS) -01-氰基-3-苯氧基苄基(RS) -2- (4-氯苯)-3-异戊酸盐[杀灭菊酯]，(S)-a-氰基一3 —苯氧基苯 基(S) -2- (4 —氯苯)异戊酸盐[高氰戊菊酯]，a—氰基一3 —苯氧基苄基(S) —2 _ (4_2氟甲氧苯基)异戊酸盐[氟氰戊菊酯]，a —氰基一3 —苯氧基节基2— ( 2 一氯一4 一三氟甲基苯氨)异戊酸盐[氟胺氰菊酯]，(RS) —a—氰基一3 —苯氧基 苄基2，2，3,3 —四甲基环丙烷羧酸盐[甲氰菊酯]，3 —苯氧基苄基(1R) —顺，反 _菊酸盐[d—拟除虫菊酯]，(RS) — a—氰基一3 —苯氧基苄基(1R) —顺，反一 菊酸盐[cyfenothrin]， ( RS ) 3 —烯丙基一2—甲基一4 —环氧戊基一2 —烯炔基(1RS) 一顺，反一菊酸盐[丙烯除虫菊]，a—氰基一3 —苯氧基苄基(1R) —顺，反一3 —苯氧 基苄基(1R) —顺，反一3— (2,2 — 二氯乙烯基)一2,2 — 二甲基环丙烷羧酸盐[氯氰 菊酯]，(S) —a—氰基一3 —苯氧基苄基(1R) —顺一3— (2,2 —二溴乙烯基)—2,2 —二甲基环丙烷羧酸盐[溴氰菊酯]，(S)—a—氰基一3 —苯氧基苄基(1R) —顺—2,2 — 二甲基一3— (1 ,2,2,2 —溴乙基)环丙烷羧酸盐[氟胺氰菊酯]，3,4，5,6—四氢化 亚氨甲基(1RS)—顺，反一菊酸盐[胺菊酯]，5 —苯基一3 —氟一3 —呋喃甲基(1RS) 一顺，反一菊酸盐[灭虫菊]，a—氰基一4一氟一3 —苯氧基苄基(1R，反)2,2二甲基
3 (2，2 — 二氯乙烯基)环丙烷羧酸盐[氟氯氰菊酯]。 Estp突变体蛋白
蛋白的同源性百分比由GAP (Needleman和W皿sh,1 970)分析(GCG程序) 确定，其中参数gap creation penalty = 5 ， gap extension penalty = 0.3 。被分析.的序歹ll长度至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的 区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在 参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序 列长度至少为IOO个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个 氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP 分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选 地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列 的至少为500个氨基酸的区域进行测试。
此处使用的术语"Estp突变体蛋白"是指天然存在的Estp蛋白的突变体，优选为 Estp蛋白(ID: AAX93318)的突变体。相比于天然存在的Estp蛋白，Estp突变体蛋 白保留了至少一些对疏水酯类杀虫剂或毒素的水解活性。优选地，该突变体与它们起 源的天然存在的Estp蛋白相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然存 在的Estp蛋白的氦基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变 化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨 基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最 终的蛋白产品。
本发明涉及的方面还包括Estp突变体蛋白类似物，在它们合成期间或合成后进行 了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保 护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上 等。这些修饰可以用来增加本发明Estp突变体蛋白的稳定性和/或生物活性。
Estp突变体蛋白的表达
本发明包括编码本发明的Estp突变体蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转 化体。
本发明中，使用的术语"转化体"(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。
本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的Estp突变体蛋白的方法。通过本 领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒 载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核 苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。 一般说来，多核苷酸和/或载体 可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、 兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CH0、 NS0和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如 L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992)和Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸 的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。
已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如， 可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚 体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。
含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化 产生的DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5'-核酸外切活性除去突出的Y-单链 末端，并用其聚合活性补平3'-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。 然后在能催化平端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段 与大摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA 区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中， 所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切 核酸酶位点的合成接头。
多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动 子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬 菌体久PL启动子、大肠杆菌lac、 trP 、 phoA、 tac启动子、SV40早期和晚期启 动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重 组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。 重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于 被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA, UGA或UAG)。
如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而 言的二氢叶酸还原酶、G418 、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其 它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括 但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵 母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞； 动物细胞，如CH0 ， COS , NSO ， 293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿 主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。
为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标 签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽转移酶(glutathiones-transferase, GST)、六聚组 氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A(protein A)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签 蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His.Tag与Ni-Chelating Sepharose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白 酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和Xa因子等，以获得可获得天然的目 标蛋白。
本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知 的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调 节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。 在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造 的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰 (如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白 质进行合乎需要的修饰和加工。
通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转 导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法 描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al. ， Basic Methods In Molecular Biology (1986)。
编码本发明的Estp突变体蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿 主中增殖。 一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入 质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导 至宿主细胞。
通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体 的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细 胞，使用如Southern ( 1975 ) J. Mol. Biol. 95, 503或Berent et al (1985) Biotech. 3， 208所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液 中蛋白质的存在。
通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的Estp突变体蛋白较 为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸 纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集 素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。
在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的Estp突变体 蛋白。在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的Estp突变体 蛋白，所述层析柱有Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance柱、Blue sepharose FF柱、Blue柱、Phenyl Sepharose FF柱、DEAES印harose FF 、 Ni-Chelating Sepharose FF柱或Methyl柱等。
另外，可使用国际
发明者杨柏成 申请人:上海普天欣生物技术有限公司