专利名称：日本血吸虫超氧化物歧化酶基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因领域，具体地涉及一种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因、其
编码蛋白及应用。
背景技术：
血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病 的血吸虫有3种，g先日本血吸虫(Schistosoma j即onicum)，曼氏血吸虫(S. mansoni)和埃 及血吸虫(S. haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健 康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制血吸虫临床诊断试剂和抗 血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。 日本血吸虫作为寄生虫能在人体和动物体内存在很多年而不被宿主的免疫机制 杀死，与它的免疫逃避能力有关。其免疫逃避机制有抗原模拟、抗原伪装和免疫调节。其中 免疫调节指的是血吸虫的蛋白能够调节、干扰(主要是抑制)宿主的免疫系统，使其不能发 挥正常的免疫攻击效能，从而有利于血吸虫的生存。 血吸虫的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein, ESP)就是一类可以 发挥免疫调节作用的蛋白质。这些蛋白来自血吸虫的表皮和肠道上皮，或者是特化的排泄 /分泌器官。血吸虫各个虫期都产生这类蛋白。ESP是潜在药物靶点和疫苗分子，因为抑制 这些蛋白可以干扰血吸虫的免疫逃避机制从而增强宿主的免疫杀灭功能；ESP是潜在的诊 断分子，因为这些蛋白游离于宿主的血液中，可以很方便地用现有手段检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因的编 码蛋白。 本发明要解决的技术问题之三是提供上述种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因及 编码蛋白的应用。 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现 在本发明的一方面，提供了一种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因，包括具有 SEQID NO. 1 SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO. 3所示序列的蛋白；
所述的SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID N0.4所示序列的蛋白。在本发明的另一方面，提供了一种日本血吸虫超氧化物歧化酶，包括 具有SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的
置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白； 具有SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的 置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。
日本血吸虫超氧化物歧化酶能够专一性地清除生物氧化过程中产生的超氧化物 自由基，是生物抗氧化系统的重要酶类之一。在血吸虫，超氧化物歧化酶这类解毒分子有助 于血吸虫对抗宿主的先天性和获得性免疫攻击。血吸虫释放超氧化物歧化酶到宿主血液 中，可能起到干扰宿主免疫攻击的作用，保护血吸虫自身。因此，超氧化物歧化酶是潜在的 药靶，也是候选的诊断分子。 日本血吸虫超氧化物歧化酶是非典型的分泌蛋白，可以由血吸虫分泌到宿主血 液中，发挥免疫调控作用，我们用网上软件SecretomeP 2. 0 (http: 〃www. cbs. dtu. dk/ services/SecretomeP/)预测发现，超氧化物歧化酶的NN-score值为0. 660，说明日本血 吸虫的超氧化物歧化酶是非典型的分泌蛋白，即该蛋白的分泌不是通过蛋白N端的信号肽 (经典方式)，而是通过其他途径分泌出细胞。这说明在宿主血清中检测到血吸虫超氧化物 歧化酶不是偶然的。 本发明利用蛋白质组学手段，我们在国际上首次分析了日本血吸虫的体外提取的 ESP的组成成分。我们发现日本血吸虫的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)是 其ESP的主要成分之一，表明该蛋白可能在血吸虫的免疫调节、免疫逃避方面发挥重要作 用；同时，通过直接分析感染动物(兔子)的血液，发现该蛋白的确在宿主血液中也存在，这 也使它成为很好的诊断标记分子。 在本发明的另一方面，提供了日本血吸虫超氧化物歧化酶的用途，包括作为免疫 原，可应用于制备血吸虫疫苗；作为潜在的药物作用靶点，应用于筛选化学和其他种类药 物；作为特异性血吸虫抗原，应用于制备抗血吸虫抗体；日本血吸虫超氧化物歧化酶还可 应用于血清学诊断方面；日本血吸虫超氧化物歧化酶基因，可应用于基因治疗方面。
具体实施例方式
下面结合附图
和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l日本血吸虫排泌蛋白的分离和鉴定实验
1).日本血吸虫成虫排泌产物的制备和蛋白提取 日本血吸虫成虫从感染动物体内分离出来后用PBS洗2次，大约800条成虫用 lmlPBS悬浮，10分钟后低速离心把上清吸出收集，重复10编，把上清合并。用丙酮沉淀上清 中的蛋白，溶解沉淀用50mM Tris-HCl(pH 8. 3) ， 5mM EDTA， ImM phenylmethylsulfonylflu oride(PMSF) ，0. 5% sodium dodecyl sulfate (SDS)and 0. 5mM DTT，0.5% SDS，超声促溶。
2).日本血吸虫排泌蛋白的酶解过程 排泌蛋白混合物用10mM DTT和55mM的碘乙酰氨处理，稀释后用胰酶酶解过夜。
3).日本血吸虫排泌蛋白酶解肽段的在线色谱分离和质谱鉴定
酶解产生的肽混合物，用真空将溶液体积抽减到30 。之后，每个组分的肽混合 物上样到一个反相捕获柱(C18，5iim，300 A，300iim i. dX5mm，LC Packings)，在20 ii 1/min 的流速下脱盐。然后这个捕获柱和一个分析用的75 iimX 150mm C18柱(LC Packings)相连 接，肽混合物就在200nl/min的流速下，从这个柱子上洗脱进入装有Protana NanoES的电喷雾离子源的QSTAR pulser i中。Agilent IIOO毛细液相系统(Agilent Technologies) 用来提供流动相A(O. 5%乙酸/水)和流动相B (0. 5%乙酸/乙腈)，线性梯度是60分钟内 5% B到50X B，30分钟内50XB到90XB，然后是在90XB停留15分钟。在分析柱后通 过一个不锈钢的两通(Valco Instrument)连接一个10-y m直径的PicoTip纳喷雾头(New Objective)，加上2500-3000伏的喷雾电压，以获得稳定的喷雾。MS/MS串联质谱谱图通过 信息依赖的采集(IDA)和任务-循环增强来记录。在每个测定扫描中，选取3-6个信号最 强、带2到3个电荷的离子，用滚动碰撞能量打碎，以获得串联质谱的信息。
4).日本血吸虫排泌蛋白的软件搜索鉴定 质谱搜索用的数据库，包括从11717个从公共数据库NCBI下载的日本血吸虫蛋白 质序列(时间是2008年10月16日)。搜索软件是MASCOT (htto: 〃www. matrixscience. com/, Matrix Science)。搜索参数为最大漏切点，3个；monoisotopic ;肽电荷数， +1/+2/+3 ;修饰，半胱氨酸carbamoylmethylation禾P methionine氧化。搜索结果合并后， 用下列标准进行过滤筛选1.对每一个串联质谱谱图的搜索结果列表，只提取排位在第一 个的结果，其他的则丢弃；2.搜索得到的肽段中如果有KR，KK，RK，RR等序列，则这个肽段丢 弃；3.搜索得到的肽段，长度在8个氨基酸以上的保留，小于8个氨基酸的丢弃；4.重复打 到的肽段，只计算其中分值最高的，把这些肽段分值加起来，做为蛋白的得分；5.蛋白的得 分超过60，就认为是可信的结果。低分的蛋白，手工检查后保留或者丢弃。匹配到宿主或者 牛胰酶、角蛋白的肽段，则丢弃。 同时进行反向蛋白质序列数据库的搜索。反向蛋白库是将日本血吸虫蛋白质序列 反转，保持长度、组成不变。根据正向库和反向库搜索得到的结果，确定假阳性率。计算方 法假阳性=2*(反向库肽段数)/(正向库肽段数+反向库肽段数)。假阳性控制在0%。
实施例2从感染动物血清中直接分析日本血吸虫的排泌蛋白 1.日本血吸虫尾蚴感染兔子，收集感染后第42天的动物血清。血清蛋白酶解后用 液相色谱-质谱分析蛋白质组成。质谱数据搜索日本血吸虫的蛋白质数据库，按照上述标 准筛选肽段。得到的肽段用Blast搜索兔子的基因/蛋白数据库(包括mRNA，EST，基因组 测序数据等)，去掉任何匹配的肽段，保证保留下来的肽段都是血吸虫特有的。然后利用肽 段，搜索得到相应的血吸虫蛋白序列。 2.蛋白丰度定量分析计算每个蛋白鉴定得到的质谱图总数(Spectra count, SC)，以此代表丰度高低。 实施例3日本血吸虫体外排泌蛋白的蛋白质组学鉴定结果 共鉴定出110个血吸虫蛋白。其中超氧化物歧化酶是丰度比较高的蛋白之一，SC 总数是17，肽段得分总和为797，共鉴定到该蛋白的6种肽段(表1)，蛋白序列的覆盖率是 32%。这说明，超氧化物歧化酶是日本血吸虫成虫排泌产物中的主要的蛋白成分之一。成虫 在宿主(如人)体内，其排泌产物必然释放到宿主的血液循环体系中，因此，检测血吸虫排 泌产物的存在，就可以检测血吸虫感染。而排泌产物中丰度高的蛋白，最容易被检出，因此， 超氧化物歧化酶是合适的临床诊断分子，可以利用现有的普及的方法如ELISA来很方便地 检测患者血样中的血吸虫特征蛋白。 表l.日本血吸虫超氧化物歧化酶(SJCHGC05613)的在体外排泌蛋白组中的质谱 鉴定结果
5
名称
g列S盖所有匹KJtt段 率(IS)得分总和 总数
;Sequence Snmmed Mnrse
(MS>
:scwe tf ill matched pcftiJes
Spectr i nnt
肽段
Peptide
駄段效
:Peptide 序列表 〈110〉上海人类基因组研究中心 〈120〉日本血吸虫超氧化物歧化酶基因、其编码蛋白及应用 〈130>NP-08-12788 〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>588 〈212>RNA 〈213〉日本血吸虫(Schistosoma japonicum) 〈400〉 1 acttctcaaa gccaaggtea aatgaaggct gtttgcgtte tgagtggttc ggctggtgtg 60 aaaggtgttg tcaattttec tcaggatect actgacggac ctgttcatet ccacggtgaa 120 ttcagtggac tcaagcccgg aaaacatggt ttccatgttc atgaatttgg tgatecaaca 180 aacggatgca cttcagccgg agcccatttt aatccaacte atcaagagca cggagctcca 240 朋tgategca ttcgacatgt tggtgacctg gga朋cgttg tegctectga tgacgga朋g 300 ggagtttecg atgcaactga caagtteate tctttgagtg gccctcattc aatcattggt 360 cgaactetgg ttettcatga aaatgaagat gatttgggcc gtggtgggca tgatcttegt 420 aaagteactg gcaatgctgg tggccgtgte gcttgtggtg tcateggttt ggccgctgat 480 tegactteat ttecgttctc aagtctgttc ttcttctteg tgttgtgatt attteaaaaa 540 ggatttcate tccttccatg caattggtea aateaaatte ttgateat 588 〈210>2 〈211>534 〈212>RNA 〈213〉日本血吸虫(Schistosoma japonicum) 〈400>2 aaagccaagg teaaatgaag gctgtttgcg ttetgagtgg ttcggctggt gtgaaaggtg 60 ttgtcaattt tectcaggat actectgacg gacctgttca tetccacggt gaattcagtg 120 gactcaagcc cggaaaacat ggtttccatg ttcatgaatt tggtgateca acaaacggat 180
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权利要求
一种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因，其特征在于包括具有SEQ ID NO.1～SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
2. 如权利要求l所述的日本血吸虫超氧化物歧化酶基因，其特征在于所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO. 3所示序列的蛋白；所述的SEQ IDNO. 2所示 的核苷酸序列编码具有SEQ ID N0.4所示序列的蛋白。
3. —种日本血吸虫超氧化物歧化酶，其特征在于包括具有SEQ ID N0.3所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、 缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白；具有SEQ ID N0.4所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、 缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。
4. 一种日本血吸虫超氧化物歧化酶在制备血吸虫疫苗中的应用。
5. —种日本血吸虫超氧化物歧化酶在筛选药物中的应用。
6. —种日本血吸虫超氧化物歧化酶在制备抗血吸虫抗体中的应用。
7. —种日本血吸虫超氧化物歧化酶在血清学诊断方面的应用。
8. —种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因在基因治疗方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种日本血吸虫超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白，日本血吸虫超氧化物歧化酶基因，包括具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；日本血吸虫超氧化物歧化酶，包括具有SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的蛋白、或由这些蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白。此外，本发明还公开了该日本血吸虫超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白的用途，本发明的日本血吸虫超氧化物歧化酶可应用于制备血吸虫疫苗、筛选药物、制备抗血吸虫抗体及血清学诊断方面，日本血吸虫超氧化物歧化酶基因可应用于基因治疗方面。
文档编号C12N15/53GK101748138SQ200810044089
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者冯正, 刘锋, 胡薇, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心