专利名称：一种杂交瘤细胞单克隆制备的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种能够一步实现杂交瘤细胞筛选及单克隆化的培养制备的方法，属于生 物技术领域。
技术背景自1975年科学家Kohler和Milstein创建单克隆抗体(McAb)技术以来，该技术不断发展完 善，其应用亦日益广泛。融合细胞的克隆化，是获得分泌单一抗体细胞株的必要步骤.目前。 融合细胞克隆化的方法主要有下述几种-1. 有限稀释法这是目前各实验室通常采用的方法。即当细胞融合后，将融合细胞直 接接种在含HAT选择培养基的96或24孔板中，经ELISA检测出的阳性孔，在尽快时间内将 其细胞稀释到4-8细胞/ml(相当于0.4-0.8细胞/每孔)。从统计学角度看，这一稀释度可使 约36%的孔每孔含1个细胞，当细胞数长到10~50%孔底时，用ELISA检测，将检测出的阳 性孔按上述方法再克隆，直到90%以上单个细胞孔为抗体分泌阳性为止。有限稀释法基于 Poisson分布规律，因此准确地细胞计数是获得合适的稀释度的保证，这样才能提高单细胞 孔的比率。由于每孔中不止有一个融台细胞生长，为防止阳性克隆被抗体分泌阴性细胞的 过度生长所排挤，尽快克隆阳性细胞十分重要，但这难免会造成细胞死亡或染色体丢失。 理想的结果是照上述稀释度，有20~50%的孔中出现细胞生长。此外，液体培养基中成纤 维细胞生长旺盛，也会妨碍杂交细胞株的生长。用此法一般至少需2 3次亚克隆，由于需 要反复克隆再克隆，细胞培养的工作量大，操作繁琐，克隆效率低。操作歩骤繁琐,工作 量大，耗时长。2. 利用荧光激活的细胞分类器(FACS):这种方法可以选择健康活泼的阳性细胞进行 克隆化培养。但由于检测阳性细胞所需的抗原包被的荧光乳胶微珠的来源和质量所限，也 由于昂贵的设备所限，该法未能普及。3. 软琼脂半固体培养基法由于琼脂熔点较高(45 5(TC)，室温下操作容易凝固，使 其与细胞不易混匀，细胞分布不均，细胞生长受限，克隆挑选困难及不易检测等。发明内容本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种操作简单，培 养周期短，无需饲养细胞，易于一步实现细胞融合后杂交瘤细胞筛选及单克隆制备的方法。本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为(1 )配制2倍DMEM基础培养液取Dulbecco改良型培养基干粉即DMEM干粉10 15克，加纯水300 500毫升，加入3 5克碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用0.5 1.5摩尔 每升盐酸和0.5 1.5摩尔每升氢氧化钠调节pH至7.0 7.4，过滤除菌，制得2倍DMEM 基础培养液；(2) 配制L-谷氨酰胺母液称取L-谷氨酰胺1 10克，加纯水50-300毫升并加热至 完全溶解，除菌过滤，配制得浓度为200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液，按每管4毫升分装， 冷冻保存；(3) 配制^巯基乙醇母液取50 80微升^-巯基乙醇，加入到50-120毫升纯水中， 过滤除菌，配制得IO毫摩尔每升母液，冷冻保存；(4) 配制甲基纤维素水溶液称取0.6 2.4克4000cp甲基纤维素或羟丙基甲基纤维 素，量取纯水，分别在121 126 'C灭菌30分钟，无菌条件下量取17.5 70毫升已灭菌 纯水轻轻加入到甲基纤维素中，2 8'C低温条件下搅拌20 24小时；(5) HAT半固体培养基配制在步骤(4)配制的甲基纤维素水溶液中加入步骤(1) 配制的2倍DMEM基础培养液15 60毫升，加入歩骤(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.25 1毫升，加入步骤(3)配制的/3-巯基乙醇母液0.5 2毫升，再加入胎牛血清10 40毫 升，市售的100倍MEM非必需氨基酸0.5 2亳升，10000单位每毫升青霉素和10000 微克每毫升链霉素混合水溶液0.5 2毫升，加入市售的50倍次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶 溶液(即市售50倍HAT溶液)1 4毫升，2 8 'C搅拌3 6小时，即得到HAT半固体培养基，也即杂交瘤细胞单克隆化半固体培养基；(6) 融合后的细胞放置35~38 。C预培养16 24小时，然后用5 20毫升预热至35 38 'C的步骤(1)配制的2倍DMEM基础培养液混匀，加入人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 200-800纳克，再加入杂交瘤融合及克隆因子即HFCS0.5 2毫升，混匀，再与步骤(5) 配制的HAT半固体培养基轻轻混匀，35~38'C静置10 30分钟并排除气泡，分装到平皿并 于37 'C下5%的<:02条件下培养；(7) 培养9 14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中已长出肉眼可 见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至细胞培养板采用液体放大培 养，每孔移入l个克隆，待细胞长至满孔底l/2 2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择 阳性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。按上述方案，所述的半固体培养基在配制完成后短期内使用可置于2 8'C保存，若 长时间内不用，需冷冻保存。按上述方案，所述的平皿为直径35mm平皿或6孔细胞培养板。本发明所述的融合细胞也可采用需亚克隆的阳性细胞，用于杂交瘤细胞单克隆化半 固体培养基无需预培养。本发明所述的HAT在进行细胞亚克隆时需采用次黄嘌呤-胸腺嘧啶即HT代替。 本发明的优点是①培养基流动性较大但不致于影响细胞形成克隆，操作时不会凝 固，与细胞混合完全，挑选方便。②融合细胞呈集落生长，彼此分离，相互间不产生干扰 现象，不混杂。③每个克隆由单个细胞形成，因此不需要反复克隆即能获得纯一的抗体分 泌细胞株。④克隆数明显增多，获得率高。应用这种方法， 一次融合(108个小鼠脾细胞与 107个小鼠骨髓瘤SP2/0细胞)总共可得到900 1 500个克隆；而用有限稀释法，要达到同 样数量的克隆，约需接种230个96孔板才能实现。因而大大减轻了细胞培养工作量，实验周 期也显著縮短。⑤得到的杂交瘤细胞株稳定性强。⑥省去了制备饲养细胞的繁琐操作，大 大减少了污染危险。⑦有效的避免了因成纤维细胞生长而使杂交瘤细胞的生长受到抑制。
具体实施方式
实施例1(1) 2倍DMEM基础培养液配制取DMEM 13.4克，加纯水500毫升，加入3.8 克碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用1摩尔每升盐酸和1摩尔每升氢氧化钠调pH至7.2，过滤 除菌，制得2倍DMEM基础培养液。(2) L-谷氨酰胺母液配制称取L-谷氨酰胺(L-Glutamine,Invitrogen) 5.8克，加纯水 200毫升，加热至50 'C使完全溶解，除菌过滤，得到200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液， 按每管4毫升分装，放-2(TC保存。(3) /5-巯基乙醇母液配制取70微升^-巯基乙醇，加入100毫升纯水中，过滤除菌， 得到10毫摩尔每升0-巯基乙醇母液，-20 'C保存。(4) 甲基纤维素水溶液配制取4000cp甲基纤维素0.6克和超纯水25毫升于121 126'C灭菌30分钟，无菌条件下取12.5毫升已灭菌纯水轻轻加入到甲基纤维素中，4'C低 温条件下磁力搅拌24小时。(5) HAT半固体培养基配制向步骤(4)的最终溶液中加入步骤(1)配制的2 倍DMEM基础培养液16毫升，步骤(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.27毫升，步骤(3)配制的/3-巯基乙醇母液0.5毫升，胎牛血清12毫升，MEM非必需氨基酸0.5毫升，10000 单位每毫升青霉素加10000微克每毫升链霉素混合水溶液0.5毫升，市售50倍HAT溶液1毫升，4 'C磁力搅拌4小时。(6) 融合后细胞放置37'C预培养18小时，然后用5毫升预热至37 "的步骤1配制的终溶液混匀，加入人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 200纳克，HFCS 0.5毫升，混 匀后，与步骤5配制的HAT半固体培养基混合均匀，37 'C静置20分钟并排除气泡，分装 于平皿中，放置在37'C、 5%的C02条件下培养。(7) 培养9 14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中长出肉眼可见 的克隆集落,用微量移液器将克隆从该培养基中吸取,移至96孔细胞培养板液体放大培养， 每孔移入l个克隆。待长至满孔底1/2 2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳性孔 直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。实施例2(1) 2倍DMEM基础培养液配制取DMEM13.4克，加纯水500毫升，加入3.8克 碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用1摩尔每升盐酸和1摩尔每升氢氧化钠调pH至7.4，过滤除 菌，制得2倍DMEM基础培养液。(2) L-谷氨酰胺母液配制称取L-谷氨酰胺(L-Glutamine，Invitrogen) 2.9克，加纯 水100毫升，加热至52 TM吏完全溶解，除菌过滤，得到200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液， 按每管4毫升分装，放-2(TC保存。(3) /3-巯基乙醇母液配制取63微升/3-巯基乙醇，加入90毫升水溶液中，过滤 除菌，得到10毫摩尔每升/3-巯基乙醇母液，-20°(:保存。(4) 甲基纤维素水溶液配制取4000cp甲基纤维素0.6克和纯水25毫升于121 126'C灭菌30分钟，无菌条件下取12.5毫升已灭菌纯水轻轻加入到甲基纤维素中，4'C低 温条件下磁力搅拌24小时。(5) HAT半固体培养基配制向步骤(4)的最终溶液中加入步骤(1)配制的2 倍DMEM基础培养液15毫升，步骤(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.25毫升，步骤(3) 配制的i3-巯基乙醇母液0.5毫升，胎牛血清10毫升，MEM非必需氨基酸1毫升，10000单 位每毫升青霉素加10000微克每亳升链霉素混合水溶液0.5毫升，市售50倍HAT溶液2毫升，4 'C磁力搅拌4小时。(6) 融合后细胞放置37'C预培养21小时，然后用10mL预热至37'C的步骤1配制的终溶液混匀，加入人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 400纳克，HFCS l毫升，混匀 后，与步骤5配制的HAT半固体培养基混合均匀，37'C静置20分钟并排除气泡，分装于 平皿中，放置在37'C、 5%的C02条件下培养。
(7)培养9 14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中长出肉眼可 见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板液体放大培 养，每孔移入l个克隆。待长至满孔底1/2 2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳 性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。 实施例3
(1) 2倍DMEM基础培养液配制取DMEM 13.4克，加纯水500亳升，加入3.8克 碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用1摩尔每升盐酸和1摩尔每升氢氧化钠调pH至7.2，过滤除 菌，制得2倍DMEM基础培养液。
(2) L-谷氨酰胺母液配制称取L-谷氨酰胺(L-Glutamine，Invitrogen) 8.7克，加纯 水150毫升，加热至50。C使完全溶解，除菌过滤，得到200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液， 按每管4毫升分装，放-2(TC保存。
(3) /3-巯基乙醇母液配制取77微升^巯基乙醇，加入110毫升水溶液中，过滤除 菌，得到IO毫摩尔每升^巯基乙醇母液，-201:保存。
(4) 甲基纤维素水溶液配制取4000cp甲基纤维素0.9克和纯水25毫升于121 126°C 灭菌30分钟，无菌条件下取12.5毫升己灭菌纯水轻轻加入到甲基纤维素中，4 'C低温条 件下磁力搅拌24小时。
(5) HAT半固体培养基配制向步骤(4)的最终溶液中加入步骤(1)配制的2倍 DMEM基础培养液16毫升，步骤(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.3毫升，步骤(3)配制 的/3-巯基乙醇母液0.6毫升，胎牛血清18毫升，MEM非必需氨基酸0.8毫升，10000单 位每毫升青霉素加10000微克每毫升链霉素混合水溶液0.5毫升，市售50倍HAT溶液1
毫升，4'C磁力搅拌4小时。
(6) 取需亚克隆的杂交瘤细胞用5毫升预热至37'C的步骤1配制的终溶液混匀，加入
人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 200纳克，HFCS 0.5毫升，混匀后，与步骤5配制 的HAT半固体培养基混合均匀，37'C静置20分钟并排除气泡，分装于平皿中，放置在37 'C、 5%的C02条件R咅养。
(7) 培养9 14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中长出肉眼可见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培养板液体放大培养， 每孔移入l个克隆，待长至满孔底1/2 2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳性孔 直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。
权利要求
1. 一种杂交瘤细胞单克隆制备的筛选方法，其特征在于(1)配制2倍DMEM基础培养液取Dulbecco改良型培养基干粉即DMEM干粉10～15克，加纯水300～500毫升，加入3～5克碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用0.5～1.5摩尔每升盐酸和0.5～1.5摩尔每升氢氧化钠调节pH至7.0～7.4，过滤除菌，制得2倍DMEM基础培养液；(2)配制L-谷氨酰胺母液称取L-谷氨酰胺1～10克，加纯水50-300毫升并加热至完全溶解，除菌过滤，配制得浓度为200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液，按每管4毫升分装，冷冻保存；(3)配制β-巯基乙醇母液取50～80微升β-巯基乙醇，加入到50-120毫升纯水中，过滤除菌，配制得10毫摩尔每升母液，冷冻保存；(4)配制甲基纤维素水溶液称取0.6～2.4克4000cp甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素，量取纯水，分别在121～126℃灭菌30分钟，无菌条件下量取17.5～70毫升已灭菌纯水加入到甲基纤维素中，2～8℃低温条件下搅拌20～24小时；(5)HAT半固体培养基配制在步骤(4)配制的甲基纤维素水溶液中加入步骤(1)配制的2倍DMEM基础培养液15～60毫升，加入步骤(2)配制的L-谷氨酰胺母液0.25～1毫升，加入步骤(3)配制的β-巯基乙醇母液0.5～2毫升，再加入胎牛血清10～40毫升，市售的100倍MEM非必需氨基酸0.5～2毫升，10000单位每毫升青霉素和10000微克每毫升链霉素混合水溶液0.5～2毫升，加入市售的50倍次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶溶液1～4毫升，2～8℃搅拌3～6小时，即得到HAT半固体培养基，也即杂交瘤细胞单克隆化半固体培养基；(6)融合后的细胞放置35～38℃预培养16～24小时，然后用5～20毫升预热至35～38℃的步骤(1)配制的2倍DMEM基础培养液混匀，加入人类碱性成纤维细胞生长因子200-800纳克，再加入杂交瘤融合及克隆因子即HFCS0.5～2毫升，混匀，再与步骤(5)配制的HAT半固体培养基轻轻混匀，35～38℃静置10～30分钟并排除气泡，分装到平皿并于37℃下5％的CO2条件下培养；(7)培养9～14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中已长出肉眼可见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。
2. 按权利要求l所述的杂交瘤细胞单克隆制备的筛选方法，其特征在于所述的 平皿为直径35mm平皿或6孔细胞培养板。
3. 按权利要求1或2所述的杂交瘤细胞单克隆制备的筛选方法，其特征在于(1) 2倍DMEM基础培养液配制取DMEM 13.4克，加纯水500毫升， 加入3.8克碳酸氢钠并充分搅拌溶解，用1摩尔每升盐酸和1摩尔每升氢氧化钠 调pH至7.2，过滤除菌，制得2倍DMEM基础培养液；(2) L-谷氨酰胺母液配制称取L-谷氨酰胺5.8克，加纯水200毫升，加热 至5(TC使完全溶解，除菌过滤，得到200毫摩尔每升L-谷氨酰胺母液，按每管 4毫升分装，放-20 'C保存；(3) /3-巯基乙醇母液配制取70微升i3-巯基乙醇，加入100毫升纯水中， 过滤除菌，得到IO毫摩尔每升P-巯基乙醇母液，-20。C保存；(4) 甲基纤维素水溶液配制取4000cp甲基纤维素0.6克和超纯水25毫 升于121 126'C灭菌30分钟，无菌条件下取12.5毫升已灭菌纯水轻轻加入到甲 基纤维素中，4 。C低温条件下磁力搅拌24小时；(5) HAT半固体培养基配制向步骤4的最终溶液中加入步骤1配制的2 倍DMEM基础培养液16毫升，步骤2配制的L-谷氨酰胺母液0.27毫升，步骤3 配制的/ -巯基乙醇母液0.5毫升，胎牛血清12毫升，MEM非必需氨基酸0.5毫 升，10000单位每毫升青霉素加10000微克每毫升链霉素混合水溶液0.5毫升， 市售50倍HAT溶液1毫升，4 "C磁力搅拌4小时；(6) 融合后细胞放置37 'C预培养18小时，然后用5毫升预热至37 'C的步骤1 配制的终溶液混匀，加入人类碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 200纳克，HFCS 0.5毫升，混匀后，与步骤5配制的HAT半固体培养基混合均匀，37 'C静置20分 钟并排除气泡，分装于平皿中，放置在37'C、 5%的(:02条件下培养；(7) 培养9 14天，其间不得将平皿或培养板拿出培养箱观察，待皿中长出 肉眼可见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至96孔细胞培 养板液体放大培养，每孔移入l个克隆，待长至满孔底1/2 2/3时，吸取培养上 清进行阳性检测，选择阳性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生 产。
全文摘要
本发明涉及一种能够一步实现杂交瘤细胞筛选及单克隆化的培养制备的方法，该方法包括先配制杂交瘤细胞单克隆化半固体培养基，将融合后的细胞加入人类碱性成纤维细胞生长因子，再加入杂交瘤融合及克隆因子，混匀，与半固体培养基轻轻混匀，分装到平皿并于37℃下5％的CO<sub>2</sub>条件下培养；待皿中已长出肉眼可见的克隆集落，用微量移液器将克隆从该培养基中吸取，移至细胞培养板采用液体放大培养，每孔移入1个克隆，待细胞长至满孔底1/2～2/3时，吸取培养上清进行阳性检测，选择阳性孔直接放大冻存，进一步进行抗体特性鉴定或腹水生产。本发明操作简单，培养周期短，无需饲养细胞，易于一步实现细胞融合后杂交瘤细胞筛选及单克隆制备。
文档编号C12Q1/02GK101270380SQ200810047640
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月8日 优先权日2008年5月8日
发明者丁小霞, 俊 姜, 奇 张, 文 张, 李培武, 谢立华, 陈小媚 申请人:中国农业科学院油料作物研究所