专利名称：一种β-羟基丁酸与β-羟基戊酸的共聚酯降解菌株及其选育方法
技术领域：
本发明属于生物材料，具体涉及一种可降解phbv( e -羟基丁酸与e -羟基戊酸的共聚酯) 的菌株以及该菌株的选育方法。
背景技术：
随着人类环保意识的加强，促使许多国家十分重视可降解塑料的研究与开发，各种可降 解塑料不断问世。目前已研究开发的生物降解聚合物主要是天然高分子、微生物合成高分子和人工合成高分子3大类。在众多可降解塑料中，完全生物可降解塑料作为治理或减轻一次 性塑料废弃物对环境造成污染的根本措施备受各国青睐。以3-羟基垸酸 (Polyhydroxyalkanoates. PHAs)为原料制造的新型塑料开发前景十分乐观。由微生物发酵制得的脂肪族聚酯PHBv(e-羟基丁酸与e-羟基戊酸共聚物)将聚羟基戊酸(poly-P-hydroxyvalerate， PHV)弓I入聚e-羟基丁酸(poly-P -hydroxybutyrate， PHB)主 链，形成PHBV共聚物，由PHB和1 24 。/。PHV组成，可改善PHB的粘度小，脆度高的缺点。随着phbv中e-羟基戊酸组分的增加，聚合物的劲度降低而韧性增加，且共聚物的熔点随e-羟基戊酸组分的增加而降低，使其较易进行热加工处理。phbv可在较低的温度下加工塑形， 避免了PHB的热降解问题。P朋V可通过微生物酶解和水解作用而发生降解，可广泛用于生产 医药材料和包装材料而不会对环境造成污染。直接以从自然界中筛选的菌种降解KfflV的速度比较慢，产生的raBv解聚酶的活性也比 较低。本发明是通过对可降解PHB的菌株进行紫外诱变，获得具有能稳定遗传的降解PHBV特 性的突变株。PHBV可被本发明的菌株产生的PHBV解聚酶水解而发生降解，产物为e-羟基丁 酸。菌株可应用于phbv材质的塑料制品的生物降解。发明内容本发明的目的是提供一种可降解phbv(e-羟基丁酸与e-羟基戊酸的共聚酯)的菌株及 其选育方法。本发明对可降解P朋的青霉菌株(已公开)进行紫外诱变处理，获得具有降解PHBV能 力的变异菌株。将具有降解PHB能力的青霉菌株接种到固体斜面培养基(组分为fflBV 0. 15%， MgS04 7H20 0.05%， NH4C12 0.1%， CaCl2.2H20 0.0005%， KH2P04 0.554%， Na2HP04 12H20 1.194%，琼脂2%， pH 6.8)上，培养至出现大量分生孢子；以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使分生孢子分散。显 微镜检査，使孢子浓度为106 107个/ml。灭菌平皿中装入分生孢子悬液，在磁力搅拌下用紫外灯照射，处理后的悬液在无菌室红 灯照射下适当稀释；取上述悬液涂布于固体平板培养基上，避光培养数日，选取单菌落，点植法培养，观察 并定期测量菌落周围水解透明圈的大小，初步筛选水解透明圈较大的菌株；根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入固体斜面培养基(组分 同上)，待长满后接入液体培养基(组分为PHBVO. 15%，MgS04 7H20 0. 05%，NH4C12 0. l%，CaCl2'2H20 0.0005%， KH2P04 0 . 5 54%， Na2HP0412H20 1. 194%， pH6.8)中，摇瓶培养，检测发酵液中WffiV 解聚酶的活力。采用紫外诱变筛选到的青霉(尸朋J'c^7i"瓜sp) DS9702-D10-06具有很强的PHBV降解能 力。菌株在液体培养基中，28。C摇瓶培养120h，其PHBV解聚酶的酶活力可达7 8U/ml。对 DS9702-D10-06菌株的PHBV降解产物进行质谱分析，结果如图2所示。在图中出现的明显的 分子量为104的质谱峰，对应的是PHB单体，即e-羟基丁酸。说明青霉(尸e加'c^ii"瓜sp) DS9702-D10-06对PHBV的产物为P -羟基丁酸。PHBV降解菌株的菌落颜色为灰绿色，气生菌丝为松絮状，形状为菌丝体，营养菌丝为 无色；菌丝有横隔膜，分生孢子梗顶端有不对称帚状分枝，分生孢子为椭圆形。具体分生孢 子梗的帚状分枝和分生孢子形态见图1。
图1为菌株的帚状枝及分生孢子图2为菌株对P朋V降解的产物的质谱分析图本发明的可降解raBV的微生物是属于青霉属(尸e加'cj7""瓜)的菌种，青霉(尸e加'cj7"'"瓜 sp) DS9702-D10-06，巳于2008年1月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京朝阳区大屯路)保藏，保藏号为CGMCC No. 2345。
具体实施方式
将具有降解PHB能力的青霉菌株接种到固体斜面培养基上，28。C培养6天至出现大量分 生孢子。以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，28。C振荡15min，使分生孢 子分散。显微镜检查，使孢子浓度为106 107个/1111。灭菌平皿中装有5ml分生孢子悬液，在磁力搅拌下用紫外灯(30W，照射距离10cm)照 射，照射时间为2(T80s，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释。取上述悬液0.2ml涂布于固体平板培养基上，避光培养3天，选取单菌落，点植法培养， 观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小。初步筛选合适菌株。根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入固体斜面培养基，待长 满后接入液体培养基中，28'C摇瓶培养120 h，检测发酵液中PHBV解聚酶的活力。fflBV解聚酶酶活的测定(比浊法)将PHBV粉末溶于氯仿中，所得溶液与十二烷基磺酸钠溶液混合，混合液经超声波处理 5min，制得PHBV乳化液，75。C加热90min除去氯仿，得到PHBV乳化液。以PHBV悬浮液为底物用分光光度法测定PHBV解聚酶的活力，取3ml PHBV乳化液置于 4(TC的恒温水浴中，待平衡后加入粗酶液lml，反应一定时间(2(T30min)后，于650nm波 长下测其吸光值。1个酶活单位定义为每分钟引起光吸收率降低0. 001 (A650nm)单位所需的 酶量。
权利要求
1、一种β-羟基丁酸与β-羟基戊酸的共聚酯降解菌株的选育方法，其特征是将具有降解PHB能力的青霉菌株接种到固体斜面培养基上，该固体斜面培养基组分为PHBV 0.15％，MgSO4·7H2O 0.05％，NH4Cl2 0.1％，CaCl2·2H2O 0.0005％，KH2PO4 0.554％，Na2HPO4·12H2O 1.194％，琼脂2％，pH 6.8，培养数日至出现大量分生孢子；以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，振荡，使分生孢子分散，显微镜检查，使孢子浓度为106~107个/ml；分生孢子悬液装在灭菌平皿中，在磁力搅拌下用紫外灯照射，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释；取上述悬液涂布于固体平板培养基上，避光培养数日，选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小，初步筛选水解透明圈较大的菌株；根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入上述固体斜面培养基，待长满后接入液体培养基中，该液体培养基组分为PHBV 0.15％，MgSO4·7H2O 0.05％，NH4Cl20.1％，CaCl2·2H2O 0.0005％，KH2PO4 0.554％，Na2HPO4·12H2O 1.194％，pH 6.8，摇瓶培养。
2、 按权利要求i所述的一种e-羟基丁酸与e-羟基戊酸的共聚酯降解菌株的选育方法，其特征是将具有降解PHB能力的青霉菌株接种到固体斜面培养基上，该固体斜面培养 基组分为PHBV 0. 15%, MgS04 7H20 0 . 05%， NH4C12 0.1%， CaCl2 2H20 0. 0005%， KH2P04 0. 554%， Na2HP0412H20 1.194%，琼脂2%， pH 6.8， 28'C培养5~7天至出现大量分生孢子;以无菌水冲洗，将分生孢子冲洗入装有玻璃珠的三角瓶中，28'C振荡15min，使分生孢 子分散，显微镜检査，使孢子浓度为1(Tl07个/ml;灭菌平皿中装有5ral分生孢子悬液，在磁力搅拌下用30W紫外灯照射，照射距离10cm， 照射时间为2(T80s，处理后的悬液在无菌室红灯照射下适当稀释；取上述悬液0.2ml涂布于固体平板培养基上，避光培养2 3天，选取单菌落，点植法培 养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小，初步筛选合适菌株；根据初筛结果，从固体平板培养基平皿中挑取需要的单菌落接入固体斜面培养基，培养 基组分同上，待长满后接入组分为PHBV 0.15%， MgS04 7H20 0 . 05%, NH4C12 0.1%， CaCl22H20 0. 0005%， KH2P04 0. 554%， Na2HP04'12H20 1. 194%， pH 6, 8液体培养基中，28。C摇瓶培养120 h。
3、 按权利要求i所述的选育方法选育的e-羟基丁酸与e-羟基戊酸的共聚酯降解菌株，该菌株为青霉(Penicillium. sp) DS9702-D10-06，已于2008年1月16日在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址北京朝阳区大屯路，保藏号为CGMCC No. 2345。
全文摘要
本发明属于生物材料，具体涉及一种可降解PHBV(β-羟基丁酸与β-羟基戊酸的共聚酯)的菌株以及该菌株的选育方法本发明对可降解PHB的青霉菌株进行紫外诱变处理，即接种到固体斜面培养基上培养、冲洗、振荡、磁力搅拌下用紫外灯照射、涂布于固体平板培养基上，避光培养，选取单菌落，点植法培养，观察并定期测量菌落周围水解透明圈的大小，初步筛选、单菌落接入固体斜面培养基、摇瓶培养。筛选到的青霉(Penicillium.sp)DS9702-D10-06具有很强的PHBV降解能力。其PHBV解聚酶的酶活力可达7~8U/ml。
文档编号C12R1/80GK101245365SQ200810050490
公开日2008年8月20日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日
发明者岩 王, 王战勇, 赵明明, 珊 陈 申请人:东北师范大学