重组人胸腺素β16制备方法

专利名称：：重组人胸腺素β16制备方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域。
背景技术：
：胸腺素是一类家族多肽的统称，它们广泛存在于人体及动物体内。这些小分子多肽由40~45个氨基酸组成，家族成员间的序列高度保守，分子量大多在5kDa左右，是一类具有极性的多肽分子。根据家族成员各自的等电点差异，胸腺素可被分为a型、p型和Y型。其中，由于在各种生理生化过程中都起到重要的作用，(3型家族成员的作用及作用机制逐渐成为了近年来的研究热点之一。国外化学合成的胸腺素34应用于角膜修复和皮肤烧烫伤、溃疡修复等己经进入II期临床。但采用化学合成法，成本高，易造成环境污染。(3型家族的16个成员中，含量最多、组织分布最广的是胸腺素T(34，T卩4不但在调节免疫系统、神经系统功能和发育方面具有重要作用，还可调节肌动蛋白的聚合与分离。而最重要的，也是目前基础医学研究和临床应用研究均集中的方面一一血管再生作用,血管再生是创伤后愈合的前提条件。而丁(316是新近发现的家族成员，其研究尚不深入，且数据积累少，现已知其在功能域部分与Tp4具有高度的同源性，如下表所示。510152025303540一TP16aC"SDKPDLSEVEKFDRSKLKK潔EE隨LPSKET，QQEKECVQTSTP4aC邻KPDMAEIEKFDKSKL隨TETQEKiiPLPSKETIEQEKQAGES二者差异仅为一个氨基酸，而且二者在二级结构上并无明显差异，因此，对T(3化的性质及药理药效研究可以参照T(34的研究方法进行。
发明内容本发明的目的是采用基因工程技术制备重组胸腺素(316。本发明重组人胸腺素P16的氨基酸序列SEQIDNO:1。本发明sumo融合重组胸腺素P16的氨基酸序列SEQIDNO:2。本发明重组人胸腺素P16的原核表达制备方法是利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签，构建pET/SUMO-丁(316大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素316。本发明重组人胸腺素316的原核表达制备方法是利用GST作为表达重组蛋白的融合标签，构建了pGEX-T(3化大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素ei6。本发明重组人胸腺素e16的原核表达制备方法是利用pTW-TP16融合蛋白基因在大肠杆菌表达出CBD-inteinl-TP16-intein2-CBD融合蛋白，通过几丁质柱层析，温度及pH的改变即可诱导内含肽(intein)发生裂解，释放出目的蛋白T卩化。本发明重组人胸腺素P16的真核表达制备方法是a、利用毕赤酵母偏好的密码子合成丁(316基因，构建pPIC9K/T316工程菌；b、酵母工程菌培养采用甲醇诱导；c、重组人胸腺素(316的制备与纯化是收集上清，经Ni-chdatingSepharose亲和层析纯化蛋白，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。本发明重组人胸腺素ei6作为药物在皮肤烧烫伤、碱烧伤和溃疡的修复方面的应用。本发明重组人胸腺素316作为药物在角膜创伤修复方面的应用。本发明TP化作为胸腺素家族成员之一，在促进伤口愈合的作用中不同于市场上应用的或正在开发中的同功药物。丁(316不是生长因子，与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有以下几方面优点1)特异性地刺激上皮细胞移动，促进上皮细胞角化；2)特异性地刺激内皮细胞移动，促进血管形成；3)分子量很小，只有45个氨基酸(生长因子属大分子蛋白)，易在组织内扩散；4)结构相对简单，功能明确、特异，副作用小，可局部反复应用；5)多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样(如喷雾、透皮吸收等)，作用持续时间长，可减少用药次数；6)胸腺素(316能直接作用于细胞骨架系统，具有支持细胞结构稳定性的作用。7)T(34还与毛囊的发育有着密切关系，可促进毛囊干细胞的迁移、分化和胞外基质的重建，从而调节正常小鼠和大鼠的毛发生长。因此，对胸腺素|316在创伤愈合方面的研究有重大的临床意义，其应用前景十分广阔。图1是本发明融合蛋白目的基因(His-SUMO-TP16)经PCR反应进行拼接，反应示意图；图2是本发明融合蛋白目的基因(GST-TP16)经PCR反应进行拼接，反应示意图；图3是本发明兔角膜细胞培养基阴性对照组；图4是本发明兔角膜细胞16实验组；图5是本发明兔角膜细胞bFGF阳性对照组；图6是本发明重组胸腺素316促进家兔烫伤皮肤愈合第一天对昭."、、，图7是本发明重组胸腺素e16促进家兔烫伤皮肤愈合第九天对照；图8是本发明重组胸腺素e16促进家兔烫伤皮肤愈合第十五天对照；图6、图7、图8中A是TP16凝胶0.5ug/克；B是TPl6凝胶5ug/克；C是T016凝胶25ug/克；D是T凝胶100ug/克；E是TP16凝胶1ug/克；F是TP16凝胶10ug/克；G是TP16凝胶50ug/克；H是TP16凝胶200ug/克；J是凝胶基质阴性对照；M是bFGF凝胶5ug/ml;图9是本发明重组胸腺素P16促进家兔碱烧伤皮肤愈合第一天对照；图10是本发明重组胸腺素016促进家兔碱烧伤皮肤愈合第九天对照；图11是本发明重组胸腺素P16促进家兔碱烧伤皮肤愈合第十五天对照；图9、图10、图11中Al是0.5ug/克TP16;Bl是1ug/克TP16;Cl是2ug/克TP16;Dl是3ug/克e16;El是4ug/克TP16;Fl是5ug/克16;Gl是10ug/克TP16;Jl是基质阴性对照；Ml是5ug/克bFGF阳性对照；M2是bFGF复方阳性对照；图12是本发明原核表达DNA测序结果。具体实施例方式本发明的特点之一是利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签。即提供一种SUMO基因和T(316的基因形成融合蛋白，并且SUMO连接在丁(316基因的氨基端，构建了具有高表达量的融合蛋白(SUMO-T(316)。采用原核表达SUMO-T(B化融合蛋白，再用SUMO蛋白酶酶切后得到重组胸腺素(316单体，重组胸腺素P^单体与天然胸腺素(316序列一致，有望为广大患者提供优质价廉的药品。SUMO是泛素类蛋白家族的重要成员之一。SUMO首先以一种无活性的前体存在，通过SUMO酶即ULPs/SUSPs催化，特异地识别SUMO前体-COOH端保守的"G-G"序列水解产生。利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签具有如下优势(1)抗蛋白酶解。在细胞内，蛋白酶解受到严密调控，通过降解空闲或错误折叠的蛋白维持细胞的稳定性。宿主表达的重组蛋白很容易被当成空闲蛋白被酶解从而降低表达水平。SUMO融合表达时，可提高融合蛋白稳定性，促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。(2)增加重组蛋白表达量。蛋白表达的过程通常依赖于mRNA的稳定性、转录效率、转录调控等，SUMO作为融合标签修饰并融合表达蛋白，尤其是低分子量蛋白时，可提高融合蛋白的分子量，使其表达量明显增加。(3)促进蛋白正确折叠。￡."//表达系统由于缺乏蛋白折叠机制，很多蛋白表达时来不及正确折叠导致形成了包涵体。SUMO有一个高度疏水的核心作为一个蛋白折叠的成核位点，作标签融合表达时可促进蛋白间相互作用，改变蛋白的构象使其正确折叠，从而增强蛋白的可溶性。(4)能准确无误地切除融合标签。由于融合标签会影响重组蛋白的结构和功能，所以融合蛋白必须切除融合标签，通常采用化学或酶学方法，如Xa因子、凝血酶等。然而酶切融合蛋白有很多问题，产率低、蛋白沉淀、酶切条件复杂、蛋白酶昂贵等，此外还经常产生非意愿的N-端。和其他蛋白酶不同，SUMO酶识别SUMO标签的三级结构，因而能准确无误地切除，不会产生延伸的N-端，而切酶切条件很宽松。本发明的多核苷酸序列与适宜的载体连接，构建本发明的重组表达载体，可以根据需要转入的宿主细胞来选择适宜的载体。如可选择pET系列载体(包括pET-3a-d、pET-9a國d、pET-11a-d、pET-12a-c、pET國14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET陽19b、pET-20b、pET-21a國d、pET-22bpET-23a國d、pET-24a-d、pET-25b、pET-26b、pET-27b、pET-28a-c等pET-44a-c等)或pGEX系列(如pGEX-T、pGEX-X、pGEX-P系列)或酵母表达载体(如pPIC3、pPIC3K、pPIC9、pPIC9K、PHIL-D1)等。本发明也涉及到包括任何一种上述重组载体的宿主细胞。在已经构建载体后，可以插入全部载体至适合的宿主细胞，以便扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核生物宿主细胞(例如Eco//)或者真核生物宿主细胞(例如酵母细胞、昆虫细胞、脊椎动物细胞)。本发明的特点之二是利用GST作为高效表达重组蛋白的融合标签。本发明的特点之三是利用CBD作为高效表达重组蛋白的融合标签。本发明的另一方面，提供含有本发明重组多肽的药物组合物，可以将本发明的重组多肽添加药学上可以接受的载体和/或赋形剂制备成药物组合物。本发明成功构建了重组胸腺素(316多肽，经体内外药效学试验证明，本发明的重组多肽可促进家兔碱烧伤和烫伤皮肤的修复、促进兔角膜细胞增殖，促进Balb/c3T3细胞增殖，其比活性为5.3X105IU/mg。实施例1:pET/SUMO-T316融合蛋白基因及其在大肠杆菌表达1.试剂与材料载体质粒pET3c由生物反应器与药物开发教育部工程研究中心惠赠，BL21(DE3)菌株由本室保存，His、SUMO、TP16基因由上海生物工程有限公司合成，DNA快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，e.z.N.ATMplasmidMiniKitI(IOO)质粒抽提试剂盒购自OMEGAbio-tek公司，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性内切酶AWeI、Bam//1购自宝生物工程(大连)有限公司。2.方法2.1寡核苷酸引物的设计与合成用大肠杆菌偏爱密码子设计SUMO和TP16的DNA序列，在上游引物内含有MfeI酶切位点和His标签，下游引物内含有S"m//I酶切位点和终止子。序列如下.-PrimersSF(S函O上)SUMO:GGAATTCCATATGCATCATCATCATCATCACG-3FlF2R2RlNdeIATGCATCATCATCATCATCACGGCATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATCATTGAGGCTCACAGAGAACAGATTGGTGGTACAGAGAACAGATTGGTGGTATGAGTGATAAGCCAGATCTTAGTGAAGTTGAAAAAGAATTAGTGAAGTTGAAAAAGAAGATCGCAGTAAGCTTAAAAAAACGAACACGGAAGAAAAATTTTTCTTGTTGAATCGTTTCTTTACTTGGCAGCGTGTTTTTTTCTTCCGTGTTCGTTTCGCGGATCCTTAACTCGTTTGAACACATTCTTTTTCTTGTTGAATCGTTTBamHI2.2PCR扩增2.2.1以F2与R2为上、下游引物，进行链延伸反应，反应条件为94。C变性5min后，缓慢降温至55°C(12°C/28sec)，加入TaKaRaPyrobestDNA聚合酶，然后72。C延伸5min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并命名为T1。2.2.2以F1与R1为上、下游引物，Tl为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94t:，30s;55°C，30s;72°C，30s，共30个循环，然后72。C延伸4min，最后冷却至4"。扩增完毕后，取5PlPCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为T2。2.2.3以SF和Rl为上、下游引物，SUMO和T2为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94"C，lmin;57°C，2min;72°C，lmin，共33个循环，然后72。C延伸10min，最后冷却至4。C。扩增完毕后，取5WPCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为HSTb。融合蛋白目的基因(His-SUMO-T316)经PCR反应进行拼接，反应示意图(图1)2.3重组质粒的构建将PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，经NdeI和BamHI双酶切后回收的DNA片段，与经NdeI和BamHI双酶切后的pET系列(pET3c或pET28a或pET42b等)质粒载体连接，转化适宜的大肠杆菌BL21菌株，通过酶切鉴定转化子。将阳性转化子进行测序，获得正确序列和读码框的重组质粒，称为融合蛋白表达质粒pET/His-SUMO-TP16。上述含重组质粒pET/His-SUMO-TP16的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌，将工程菌BL21(DE3)/pET/His-SUMO-TP16用IPTG诱导，可表达出His-SUMO-T316融合蛋白。2.4种子菌的活化取-7(TC、8%甘油中保存的工程菌株以1:500接种到一级种子培养基中，37°C200rpm振荡培养4-6h。然后以1:50接种到二级种子培养基中，37°C200rpm过夜培养，待OD6。。吸收值到4-6左右时上罐。2.5高密度发酵培养30L发酵罐中加入15L发酵培养基，将发酵种子液按1:10(V/V)接种于30L发酵罐中，37"C培养。溶氧量控制在30%-60%左右，转数在300-800rpm，罐压控制在0.2bar左右；通过流加2N的HC1或4N的NaOH调节pH值至7.0;当发酵培养2h后开始流加葡萄糖补充碳源；接种发酵培养6h后开始加入终浓度0.8咖ol/L的IPTG进行诱导表达，30。C诱导培养约6h，OD柳)在35-38时结束。4°C10000rpm离心10min，将收集的菌体-7(TC冷冻保存。2.6破碎菌体按5-10ml溶液/g菌体的比例，用20mMPB-0.1MNaCl-lmMEDTApH8.0在冰浴下超声破碎，4。C20000rpm离心20分收集上清。2.7层析纯化将2.6得到的上清液过DEAESepharoseFF柱，用含不同浓度NaCl的20mMPB(pH8.0)缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰；再过HiSTrapFF柱，用含不同浓度咪唑的20mMPB(pH8.0)缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰；通过SephadexG-25柱脱盐，收集保存在25mMPB-O.25MNaCl-lmMDTT(pH8.0)缓冲液的融合蛋白。2.8融合蛋白的酶切和胸腺素P16的纯化将获得的融合蛋白样品用SUMO蛋白酶按合适的比例进行切割，30°C6h。酶切液过HiSTrapHP柱，收集含胸腺素016的流穿峰。再经过Superdex30凝胶层析，即可获得胸腺素P16。实施例2:pGEX/GST-TP16融合蛋白基因及其在大肠杆菌表达1.试剂与材料载体质粒pGEX-6P-l由吉林大学农学部惠赠，BL21(DE3)菌株由本室保存，His、SUMO、TP16基因由上海生物工程有限公司合成，DNA快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，e.z.N.ATMplasmidMiniKitI(IOO)质粒抽提试剂盒购自OMEGAbio-tek公司，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶和限制性内切酶I、1购自宝生物工程(大连)有限公司。2.方法2.1寡核苷酸引物的设计与合成用大肠杆菌偏爱密码子设计SUMO和TP16的DNA序列，在上游引物内含有5coRI酶切位点，下游引物内含有&/1酶切位点和终止子。序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.2PCR扩增:2.2.1以F2与R2为上、下游引物，进行链延伸反应，反应条件为94。C变性5min后，缓慢降温至55°CU2°C/28sec)，加入TaKaRaPyrobestDNA聚合酶，然后72。C延伸5min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并命名为T1。2.2.2以F与R1为上、下游引物，Tl为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94。C，30s;55°C，30s;72°C，30s，共30个循环，然后72。C延伸4min，最后冷却至4"C。扩增完毕后，取5WPCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为GT。2.2.3以YF和YR为上、下游引物，GT为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94。C，lmin;57°C，2min;72°C，lmin，共33个循环，然后72。C延伸10min，最后冷却至4"C。扩增完毕后，取5WPCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为GTb。融合蛋白目的基因(GST-TP16)经PCR反应进行拼接，反应示意图(图2)2.3重组质粒的构建将PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，经I和1双酶切后回收的DNA片段，与经I和1双酶切后的pGEX系列(pGEX-4T-1或pGEX-5X-2或pGEX-6P-1等)质粒载体连接，转化适宜的大肠杆菌BL21菌株，通过酶切鉴定转化子。将阳性转化子进行测序，获得正确序列和读码框的重组质粒，称为融合蛋白表达质粒pGEX-TP16。上述含重组质粒pGEX-TP16的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌，将工程菌BL21(DE3)/pGEX-TP16用IPTG诱导，可表达出GST-TP16融合蛋白。2.4种子菌的活化取-7(TC、8%甘油中保存的工程菌株以1:500接种到一级种子培养基中，37°C200rpm振荡培养4-6h。然后以l:50接种到二级种子培养基中，37°C200rpm过夜培养，待OD6。Q吸收值到4-6左右时上罐。2.5高密度发酵培养30L发酵罐中加入15L发酵培养基，将发酵种子液按1:10(V/V)接种于30L发酵罐中，37'C培养。溶氧量控制在30%-60%左右，转数在300-800rpm，罐压控制在0.2bar左右；通过流加2N的HC1或4N的NaOH调节pH值至7.0;当发酵培养2h后开始流加葡萄糖补充碳源；接种发酵培养6h后开始加入终浓度lramol/L的IPTG进行诱导表达，37。C诱导后约4h结束。4°C10000rpm离心10min，将收集的菌体-7CTC冷冻保存。2.6破碎菌体按5-10ml溶液/g菌体的比例，用pH7.4的PBS在冰浴下超声破碎，4。C20000rpm离心20分收集上清。2.7层析纯化将2.6得到的上清液过GlutathioneSepharose4FF柱，用结合缓冲液PBS(pH7.4)平衡，用洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，10mM还原型谷胱甘肽pH8.0)进行洗脱，收集洗脱峰；通过SephadexG-25柱脱盐，收集保存在50mMTris-HCl-0.1MNaCl-lmMDTT-lmMEDTA(pH8.0)缓冲液的融合蛋白。2.7融合蛋白的酶切和胸腺素ei6的纯化将获得的融合蛋白样品用PreScission蛋白酶按合适的比例进行切害U，4°C12-16h。酶切液过GlutathioneSepharose4FF柱，收集含胸腺素P16的流穿峰。再经过Superdex30凝胶层析，即可获得胸腺素P16。实施例3:pTW-TPl6融合蛋白基因及其在大肠杆菌表达1.试剂与材料载体质粒pTWINl、表达菌株￡coBER2566、内切酶6"，I和几丁质购自NEB公司；TP16基因由上海生物工程有限公司合成，DNA快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，e.z.N.ATMplasmidMiniKitI(100)质粒抽提试剂盒购自OMEGAbio-tek公司，TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。2.方法2.1寡核苷酸引物的设计与合成用大肠杆菌偏爱密码子设计TP16的DNA序列如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2.2I)CR扩增2.2.1以F2与R2为上、下游引物，进行链延伸反应，反应条件为94。C变性5min后，缓慢降温至55°C(12°C/28sec)，加入TaKaRaPyrobestDNA聚合酶，然后72。C延伸5min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并命名为T1。2.2.2以F与R1为上、下游引物，Tl为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94。C，30s;55°C，30s;72°C，30s，共30个循环，然后72"C延伸4min，最后冷却至4X:。扩增完毕后，取5WPCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为GT。2.2.3以PF和PR为上、下游引物，GT为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94。C，lmin;57°C，2min;72°C，lmin，共33个循环，然后72。C延伸10min，最后冷却至4"。扩增完毕后，取5WPCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为PTb。2.3重组质粒的构建将PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收的DNA片段，与经I酶切后的pTWINl质粒载体连接，转化适宜的大肠杆菌ER2566菌株，通过酶切鉴定转化子。将阳性转化子进行测序，获得正确序列和读码框的重组质粒，称为融合蛋白表达质粒pTW-TP162.4工程菌的构建、表达与发酵将重组质粒pTW-TP16转化至大肠杆菌ER2566构建工程菌，将工程菌ER2566/pTW-TP16用IPTG诱导，可表达出CBD-inteinl-T016-intein2-CBD融合蛋白。取-7(TC、8%甘油中保存的工程菌株以1:100接种到LB培养基中，37°C180rpm振荡过夜培养4-6h。然后以1:50接禾中妾U2XTB培养基(含100ug/mlAMP)中，37。C振荡培养至OD画为0,8-1.0，加入IPTG至终浓度0.45mmol/L，30。C诱导表达5h，4°C10000rpm离心10min，将收集的菌体-7(TC冷冻保存。2.5TP16制备、纯化及鉴定按10ml溶液/g菌体的比例，用缓冲液A(25mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，lmmol/LEDTA，pH8.5)悬浮菌体，在冰浴下超声破碎，4。C20000rpm离心20分，收集上清。用缓冲液A平衡几丁质柱，将菌体破碎上清过柱，用10倍柱体积的缓冲液A洗柱，去除杂蛋白；5倍柱体积的缓冲液B(25mmol/LTris-HCl，500mmol/LNaCl，lmmol/LEDTA，pH6.8)快速洗柱，改变柱内pH值至6.8，25"C放置反应16h，10倍柱体积的缓冲液B洗柱，5倍柱体积的含有40mmol/L巯基乙烷磺酸(MESNA)的缓冲液A快速洗柱，使MESNA在柱内分布均匀，4。C下放置反应16h，缓冲液A将胸腺素e16洗下来，在利用超滤管除去大分子量蛋白，G25柱过滤除盐，所制备的胸腺素P16经Tricine-SDS-PAGE鉴定。实施例4:Tei6基因在真核生物毕赤酵母中的表达1.试剂与材料毕赤酵母表达质粒pPIC9K、毕赤酵母GS115购字Invitrogen公司。质粒pMD-18T、￡coh'JM109、内切酶禾BEcoRI、SalI、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。TP16基因由上海生物工程有限公司合成，DNA快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司，e.Z.N.ATMplaSmidMiniKitI(100)质粒抽提试剂盒购自OMEGAbio-tek公司。2.方法2.1寡核苷酸引物的设计与合成用酵母偏爱密码子设计16的DNA序列如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2.2PCR扩增:2.2.1以JF2与JR2为上、下游引物，进行链延伸反应，反应条件为94。C变性5min后，缓慢降温至55°C(I2°C/28sec)，加入TaKaRaPyrobestDNA聚合酶，然后72。C延伸5min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测，并命名为jn。2.2.2以JF1与JR1为上、下游引物，JT1为模板进行PCR反应，反应条件为经94。C变性5min进入循环，循环条件为94。C，30s;55°C，30s;72°C，30s，共30个循环，然后72。C延伸4min，最后冷却至4"。扩增完毕后，取5|4PCR产物使用2.0%琼脂糖凝胶进行DNA电泳鉴定，并将产物命名为JTb。2.3克隆载体pMD-18T/TP16和表达载体pPIC9K/TP16构建将PCR扩增产物JTb经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，经5aWI和￡coRI双酶切后回收的DNA片段，与经和五coiI双酶切后的pMD-18T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态JM109。PCR筛选重组子，及做#1和￡"/1双酶切鉴定、测序。确定序列正确后，用^g/zz/￥I、双酶切质粒pMD-18T/TP16和空的表达载体pPIC9K，经2%琼脂糖电泳回收1^16目的片段；经1%琼脂糖电泳回收pPIC9K片段，再用T4-DNA连接酶连接以上两种回收片段，组成pPIC9K/TP16表达质粒。将表达质粒pPIC9K/T316转化大肠杆菌感受态JM109。提质粒，、EcoRl双酶切鉴定，测序。2.4转化酵母细胞确定测序正确后，质粒pPIC9K/TP16经1酶切，电击转化到组氨酸缺陷型酵母菌GS115中。用PCR法筛选MD平板上生长的阳性菌落，再用4mg/mlG418筛选，获得高拷贝阳性菌株。提取基因组DNA，用引物JF1和JR1，PCR鉴定外源基因整合。2.5T316蛋白的表达挑取高拷贝阳性菌落，接种于BMGY液体培养基中，28"C培养24h,OD6Qo=2-7，室温下离心5分(1500-3000rpm)，去掉上清后，沉淀细胞再转入BMGY液体培养基中，用0.6%甲醇诱导表达5-6天，每24h补加1次甲醇，收集上清，经Ni-chelatingSepharose亲和层析纯化蛋白，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。实施例5重组胸腺素e16生物学活性测定重组胸腺素316可促进Balb/c3T3细胞的增殖。采用MTT法，细胞为Balb/c3T3，测定时选用中国生物制品检定所提供的bFGF标准品，将对数增殖期的Balb/c3T3细胞按7000个细胞/100ul培养液/孔加入96孔板中，37"C5y。C02条件下培养24小时，再用含0.4%胎牛血清的1640液换液后使细胞饥饿培养24小时，将重组胸腺素I316按一定浓度4倍稀释后加入，每3孔为一平行组，继续培养48-72小时，加入20ulMTT(5mg/ml)后继续培养4小时，弃去培养液，每孔加入150ulDMSO，室温放置40分钟后，再在570nm测定光吸收值(OD)，作出对应的OD-bFGF浓度曲线，按以下公式计算，活性=翻謎羅5,麵廳x标准品单位X,a>vh#，t口i工标准品50。/。OD值的稀释倍数UPWMtl工样品稀释倍数。重组胸腺素e16的比活性为5.3X105IU/mg。实施例6重组胸腺素ei6药效学研究1.重组胸腺素P16的体外药效学研究1.1重组胸腺素316促进兔角膜细胞的增殖(1)将大耳白兔用空气栓塞法处死，用眼科剪刀取下角膜。将角膜置于含1000IU/ml青链霉素的D-Hanks液中，依次分别换液洗涤3次；角膜置于0.25。/。胰酶-0.02。/。EDTA-2Na中，37'C消化30分；无菌眼科镊子取出角膜，用眼科剪刀剪碎，放入6孔板中，待组织小碎片吸附在6孔板中后，加入3ml/孔自配培养基(20。/。胎牛血清-DMEM培养基-0.3M谷氨酰胺-1000IU/ml青链霉素)，37°C5%二氧化碳培养。(2)将培养成片的兔角膜细胞用0.25%胰酶消化后，收集兔角膜细胞，加适量的10。/。胎牛血清-DMEM培养基-0.3%谷氨酰胺-1000111/1111青链霉素培养基混匀，以100ul/孔接种到96孔板中，分成3组，第1组加入1OOul/孔的培养基作为阴性对照；第2组加入100u1/孔的5ug/mlTP16;第3组加入100ul/孔的10ug/mlbFGF作为阳性对照；结果16实验组和bFGF阳性对照组明显促进兔角膜的增殖。(见图3、图4、图5)2.重组胸腺素ei6体内药效学研究2.1重组胸腺素316促进家兔烫伤皮肤愈合将2kg左右的大耳白兔经脱毛剂硫化钡脱毛后，10%水合氯醛麻醉，在家兔脊椎两侧用铁片烫成2.5cm2的烧伤创面各3个，隔日涂给0.5ug/g、lug/g、5ug/g、10ug/g、25ug/g、50ug/g、100ug/g、200ug/g规格的重组胸腺素(316凝胶和阳性对照药(5ug/克bFGF凝胶剂)以及凝胶基质阴性对照。结果15天后lug/克和5ug/克的愈合最好，基质对照未愈合。(见图6)2.2重组胸腺素e16促进家兔碱烧伤皮肤愈合。将2kg左右的大耳白兔经脱毛剂硫化钡脱毛后，10%水合氯醛麻醉，用5NNaOH制成2.5cm2的碱烧伤创面，隔日涂给0.5ug/g、1ug/g、2ug/g、3ug/g、4ug/g、5ug/g、10ug/g、不同规格的重组胸腺素(316凝胶剂和阳性对照药(5ug/克bFGF凝胶剂)以及凝胶基质阴性对照。结果17天后5ug/克和10ug/g的T(316与5ug/克bFGF效果最好，基质对照未愈合。(见图7)序列表<110〉长春博泰医药生物技术有限责任公司〈120>sumo融合重组胸腺素016<130〉<160>1〈170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉151〈212〉PRT<213〉人(human)〈400〉1Met1GluAsnLysGly65GinlieLeuThrLysHisAlaLeuThr50LysAlaGluSerHisLysLys35ThrGluAspAlaGlu115GluGlu130GluCys145HisPro20ValProMetGinHis100ValLysValHis5GluSerLeuAspThr85ArgGluAsnGinHisValAspArgSer70ProGluLysThrThrHisLysGlyArg55LeuGluGinGluLeu135Ser150GlyProSer40LeuArgAsplieAsp120ProMetGlu25SerMetPheLeuGly105ArgSerSer10ValGluGluLeuAsp90GlySerLysAspLyslieAlaTyr75MetMetLysGluSerProPhePhe60AspGluSerLeuThr140GluGluPhe45AlaGlyAspAspLys125lieValThr30LysLyslieAsnLys110LysGinAsn15HislieArgArgAsp95ProThrGinGinlieLysGinlie80lieAspAsnGlu<110>长春博泰医药生物技术有限责任公司<120〉重组胸腺素ei6<130〉〈160〉1<170〉Patentlnversion3.3<210>2<211>45<212〉PRT<213>人(human)〈400〉1MetSerAspLysProAspLeuSerGluValGluLysGluAspArgSer151015LysLeuLysLysThrAsnThrGluGluLysAsnThrLeuProSerLys202530GluThrlieGinGinGluLysGluCysValGinThrSer35404权利要求1、重组人胸腺素β16的氨基酸序列SEQIDNO1。2、sumo融合重组胸腺素ei6的氨基酸序列SEQIDNO:2。3、重组人胸腺素ei6的原核表达制备方法，其特征在于利用SUMO作为高效表达重组蛋白的融合标签，构建pET/SUMO-T(316大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素P16。4、重组人胸腺素P16的原核表达制备方法，其特征在于利用GST作为表达重组蛋白的融合标签，构建了pGEX-T^6大肠杆菌原核表达体系制备重组人胸腺素P16。5、重组人胸腺素ei6的原核表达制备方法，其特征在于利用pTW-TP16融合蛋白基因在大肠杆菌表达出CBD-inteinl-T316-intein2-CBD融合蛋白，通过几丁质柱层析，温度及pH的改变即可诱导内含肽(intein)发生裂解，释放出目的蛋白T(316。6、重组人胸腺素P16的真核表达制备方法，其特征在于a、利用毕赤酵母偏好的密码子合成T^6基因，构建pPIC9K/TP16工程菌；b、酵母工程菌培养采用甲醇诱导；c、重组人胸腺素卩16的制备与纯化是收集上清，经Ni-chdatingSepharose亲和层析纯化蛋白，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。7、重组人胸腺素P16作为药物在皮肤烧烫伤、碱烧伤和渍疡的修复方面的应用。8、重组人胸腺素P16作为药物在角膜创伤修复方面的应用。全文摘要一种重组人胸腺素β16的制备方法，属于生物工程领域。本发明的目的是采用基因工程技术制备重组胸腺素β₁₆。本发明重组人胸腺素β16的氨基酸序列SEQIDNO1。本发明Tβ₁₆作为胸腺素家族成员之一，在促进伤口愈合的作用中不同于市场上应用的或正在开发中的同功药物。Tβ₁₆不是生长因子，与各种生长因子相比在治疗伤口愈合上有许多优点。文档编号C12N15/70GK101602803SQ20081005081公开日2009年12月16日申请日期2008年6月11日优先权日2008年6月11日发明者冯秀萍,迅朱,杜柏榕,威马申请人:长春博泰医药生物技术有限责任公司